專利名稱：胚胎修飾動物及其產(chǎn)生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從處理的胚胎以高效產(chǎn)生可繁殖的動物的方法，其中胚胎在產(chǎn)生基因修飾動物如基因剔除小鼠時表現(xiàn)出種系傳遞。更具體來說，當(dāng)產(chǎn)生全能細(xì)胞如胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)時，本發(fā)明涉及從全能細(xì)胞產(chǎn)生動物的方法，其中全能細(xì)胞是通過回交、細(xì)胞融合、線粒體注射、前核置換、體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移等導(dǎo)入所需要類型的線粒體DNA或用所需要類型的線粒體DNA取代而制備的。特別地，當(dāng)動物品種為小鼠時，本發(fā)明涉及高效產(chǎn)生可繁殖的近交種系嵌合小鼠的方法，其改善了出生率和新生兒的存活率。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過上述任何一種方法產(chǎn)生的可繁殖的小鼠，其中線粒體DNA是適應(yīng)型線粒體DNA，它是沒有核線粒體不相容性發(fā)生的基因型，并且全能細(xì)胞可傳遞到種系中。
背景技術(shù)：
通常認(rèn)為，產(chǎn)生嵌合小鼠的技術(shù)早于產(chǎn)生所謂的靶基因小鼠例如基因除剔小鼠技術(shù)。利用ES細(xì)胞產(chǎn)生的嵌合小鼠被證實可傳遞到種質(zhì)系。同樣地下述胚胎干細(xì)胞已被證實可傳遞到種質(zhì)系，即利用從C57BL/6小鼠和CBA小鼠的雜交種中建立的胚胎干細(xì)胞系TT2細(xì)胞，和從小鼠的129次代品系中建立的胚胎干細(xì)胞系，其中次代品系是非標(biāo)準(zhǔn)品系(有三種標(biāo)準(zhǔn)品系的小鼠BALB/c，C57BL/6和C3H)。因此，為了在表型分析或基因功能分析中作為實驗動物等而使用嵌合小鼠，需要通過回交法將產(chǎn)生的小鼠(基因修飾小鼠)中的靶基因修飾導(dǎo)入到近交小鼠中。特別地，這要求復(fù)雜的過程，包括利用雜種品系或非標(biāo)準(zhǔn)品系的胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生基因修飾胚胎干細(xì)胞，用這種細(xì)胞產(chǎn)生種系嵌合小鼠，然后獲得的異源型基因修飾小鼠(通常使用雄性小鼠)與標(biāo)準(zhǔn)品系近交小鼠反復(fù)回交將，產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)品系的近交小鼠。
相反地，已嘗試通過從近交小鼠建立胚胎干細(xì)胞來直接產(chǎn)生近交品系的種系嵌合小鼠。然而，盡管有報告稱從如上所述的近交鼠例如C57BL/6中得到的胚胎干細(xì)胞中獲得種系嵌合小鼠，但還沒有在實際中應(yīng)用。目前，已利用了如上所述的雜種品系。因此，為獲得種系嵌合小鼠而獲取優(yōu)良的近交小鼠的胚胎干細(xì)胞是十分困難的。
另外，據(jù)說個體發(fā)生僅僅利用胚胎干細(xì)胞是根本不可能的。
同時，四倍體援救法已作為從胚胎干細(xì)胞選擇性產(chǎn)生嵌合小鼠的方法(Nagy A等人，Development 110，815-821，1990)。這種方法的基礎(chǔ)是認(rèn)識到四倍體細(xì)胞發(fā)育成胎盤，而且當(dāng)它們被注射進(jìn)四倍體受精卵時僅僅ES細(xì)胞能發(fā)育成個體。這種技術(shù)稱為四倍體援救法。然而，根據(jù)關(guān)于比較和驗證四倍體援救法和核轉(zhuǎn)移技術(shù)的最近報道，大多數(shù)新生兒出生后死于呼吸障礙，而且當(dāng)利用BALB/c鼠建立ES細(xì)胞時，通過四倍體援救法僅獲得一個近交嵌合小鼠(Eggan K等人，PNAS98，6209-6214，2001)。而且，關(guān)于利用體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)產(chǎn)生克隆小鼠，也已報道所獲得的近交小鼠，大多數(shù)新生兒出生后死于呼吸障礙，而且通過利用雜種小鼠的細(xì)胞核能夠獲得可養(yǎng)活的新生克隆小鼠(Wakayama T等人，Nature 394，369-374，1998；Wakayama T等人，PNAS 96，1484-1498，1999；Humpherys D等人，Science 296，95-97，2001)。如上所述，即使沒有觀察到明顯的異常，通過四倍體援救法而僅從近交小鼠的ES細(xì)胞產(chǎn)生的嵌合小鼠和從近交小鼠的體細(xì)胞核而獲得的克隆小鼠，許多情況下都會因為呼吸障礙而死亡。除小鼠之外，當(dāng)動物品種被改變成哺乳動物時會發(fā)生這種問題。
此外，成功產(chǎn)生常規(guī)的基因剔除小鼠是利用來源于從雜種品系或小鼠129次代品系、非標(biāo)準(zhǔn)品系的ES細(xì)胞獲得的種系嵌合體，但不是來自近交小鼠的ES細(xì)胞。極少報道利用來源于近交小鼠的ES細(xì)胞，可以產(chǎn)生嵌合小鼠。還沒有相關(guān)的報道。在大多數(shù)成功的例子中沒有報道種系傳遞，因此基本上不可能獲得種系嵌合小鼠。如上所述，四倍體援救法已被認(rèn)為是唯一的辦法來解決近交嵌合小鼠的產(chǎn)生中的問題。然而，通過這種方法獲得的大多數(shù)新生兒在出生后立即死于呼吸障礙(Eggan K等人，PNAS 98，6209-6214，2001)。這樣，不可能真正獲得可繁殖的嵌合小鼠。
發(fā)明概述在上述背景下，我們已集中地研究了來源于處理的胚胎的動物例如可繁殖的嵌合動物的產(chǎn)生。具體地說，我們研究了嵌合小鼠的產(chǎn)生，其中線粒體DNA是適應(yīng)型(通過線粒體DNA沒有核線粒體不相容性，例如野生型線粒體DNA發(fā)生)和全能細(xì)胞可傳遞到種質(zhì)中。
具體地，本發(fā)明的目的是高效獲得來源于處理的胚胎的動物，如可繁殖嵌合動物，尤其是近交嵌合動物，更為具體的是近交嵌合小鼠個體。特別地，本發(fā)明目的是建立產(chǎn)生以下動物的方法源自全能細(xì)胞的近交嵌合動物，其中的全能細(xì)胞如ES細(xì)胞來自通過四倍體援救法獲得的嵌合動物的產(chǎn)生過程中利用的近交動物；及近交嵌合動物，特別是近交嵌合小鼠，而避免近交嵌合小鼠在出生后立即死于呼吸障礙。
具體地，在通過四倍體援救法獲得嵌合動物的產(chǎn)生過程中，本發(fā)明的目的是提供交效產(chǎn)生以下動物的方法源自來源于所用近交動物的全能細(xì)胞如ES細(xì)胞的近交嵌合動物；及可繁殖的近交嵌合動物，特別是近交嵌合小鼠，而尤其避免了近交嵌合小鼠在出生后立即死于呼吸障礙。
本發(fā)明的第二個目的是提供可繁殖的近交嵌合小鼠，它來源于處理的胚胎，例如通過如上產(chǎn)生方法獲得的嵌合動物，它們在出生后立即由于呼吸障礙的死亡率特別低，其中線粒體DNA是適應(yīng)型線粒體DNA，而且全能細(xì)胞能傳遞到種系中。
此外，本發(fā)明的第三個目的涉及用于產(chǎn)生來源于處理的胚胎的動物的全能細(xì)胞，特別是胚胎干細(xì)胞。
本發(fā)明中的全能細(xì)胞意指能夠分化成任一種類細(xì)胞的未分化細(xì)胞，這種細(xì)胞的例子包括胚胎干細(xì)胞和核轉(zhuǎn)移胚胎。
本發(fā)明的特征涉及產(chǎn)生上述來源于處理的胚胎的可繁殖動物，特別是可繁殖的種系嵌合動物的方法；通過這種方法產(chǎn)生的可繁殖嵌合動物，尤其是嵌合小鼠和可繁殖的近交嵌合小鼠；和用于這種方法的全能細(xì)胞。
具體地，本發(fā)明為能應(yīng)用到來源于處理的胚胎的動物，特別是作為基因修飾小鼠如所謂基因剔除小鼠的產(chǎn)生結(jié)果而獲得的嵌合小鼠的方法。本方法特征在于它包括將適應(yīng)型線粒體DNA導(dǎo)入到受體細(xì)胞中或用適應(yīng)型線粒體DNA取代受體細(xì)胞線位體DNA，或利用其中宿主胚胎的線粒體DNA已被導(dǎo)入或用適應(yīng)型線粒體DNA取代的細(xì)胞。在這種情況中，可以利用其中導(dǎo)入適應(yīng)型線粒體DNA的全能細(xì)胞和未處理的宿主胚胎、未處理的全能細(xì)胞和其中導(dǎo)入適應(yīng)型線粒體DNA的宿主胚胎、其中導(dǎo)入適應(yīng)型線粒體DNA的全能細(xì)胞和其中導(dǎo)入適應(yīng)型線粒體DNA的宿主胚胎等。這樣產(chǎn)生的嵌合動物具有適應(yīng)型線粒體DNA。這種適應(yīng)型線粒體DNA的例子包括野生型來源的線粒體DNA和野生型小鼠的Musmusculus musculus型DNA。當(dāng)來源于全能細(xì)胞例如ES細(xì)胞的種系嵌合動物產(chǎn)生于近交動物和特別是完全來源于ES細(xì)胞的嵌合小鼠產(chǎn)生時，其中線粒體DNA被導(dǎo)入或取代的全能細(xì)胞例如近交小鼠的ES細(xì)胞被用于注射進(jìn)四倍體受精卵。通過種方式，可以避免獲得的近交嵌合小鼠在出生后由于呼吸障礙而立即死亡等問題，因而能夠高效地產(chǎn)生可繁殖的近交嵌合小鼠。
至今，當(dāng)通過四倍體援救法利用近交小鼠的ES細(xì)胞而選擇性產(chǎn)生近交嵌合小鼠時，大多數(shù)獲得的嵌合小鼠出生后立即死于呼吸障礙。實際上不可能通過四倍體援救法獲得可繁殖的嵌合小鼠。有人提出異常DNA甲基化模式的存在是造成通過四倍體援救法獲得的大多數(shù)新生兒出生后死于呼吸障礙的原因(Dean W等人，Development125，2237-2282，1998)。除這個原因之外，我們首次證實線粒體DNA和核DNA之間的不相容性也是原因之一。因此，通過將來源于近交小鼠的ES細(xì)胞的線粒體DNA轉(zhuǎn)換成野生型小鼠的線粒體DNA以便DNA能適應(yīng)核DNA，這樣能夠避免出生后的立即死亡。當(dāng)我們在近交動物(小鼠)中應(yīng)用這種技術(shù)時，能夠有效產(chǎn)生種系嵌合小鼠。我們相信如果適應(yīng)型線粒體DNA被導(dǎo)入到由胚胎處理產(chǎn)生的動物中，在克隆動物和常規(guī)的雙倍體嵌合動物中也具有這種類似的效果。
本發(fā)明提供如下方法、通過這種方法產(chǎn)生的來源于處理的胚胎的動物，特別是嵌合動物以及全能細(xì)胞。
1.產(chǎn)生動物的方法，該動物來源于源自全能細(xì)胞的處理的胚胎，包括使用其中導(dǎo)入適應(yīng)于核DNA的適應(yīng)型線粒體DNA的細(xì)胞。
2.如第1項產(chǎn)生動物的方法，其中來源于源自全能細(xì)胞的處理的胚胎的動物是嵌合動物。
3.如第2項產(chǎn)生動物的方法，其中嵌合動物是近交嵌合動物。
4.上述第1-3項中任一項的產(chǎn)生動物的方法，包括使用其中導(dǎo)入適應(yīng)型線粒體DNA的全能細(xì)胞和未處理的宿主胚胎、未處理的全能細(xì)胞和其中導(dǎo)入適應(yīng)型線粒體DNA的宿主胚胎、或其中導(dǎo)入適應(yīng)型線粒體DNA的全能細(xì)胞和其中導(dǎo)入適應(yīng)型線粒體DNA的宿主胚胎。
5.如第4項產(chǎn)生動物的方法，包括使用四倍體受精卵作為動物的宿主胚胎和全能細(xì)胞作為其中導(dǎo)入適應(yīng)型線粒體DNA的細(xì)胞。
6.根據(jù)四倍體援救法的上述第5項產(chǎn)生動物的方法，包括將其中導(dǎo)入適應(yīng)型線粒體DNA的全能細(xì)胞注射到四倍體受精卵的胚泡中。
7.上述第1-6項中任一項的產(chǎn)生動物的方法，其中具有導(dǎo)入的適應(yīng)型線粒體DNA細(xì)胞是由于到代而具有適應(yīng)型線粒體DNA的細(xì)胞。
8.利用具有與供體細(xì)胞的核DNA相適應(yīng)的適應(yīng)型線粒體DNA的受體卵母細(xì)胞，通過核轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生克隆個體的方法。
9.根據(jù)上述第1-8項中任一項的產(chǎn)生動物的方法，其中核-線粒體不相容性導(dǎo)致出生后立即出現(xiàn)的呼吸障礙。
10.根據(jù)上述第1-9項中任一項的產(chǎn)生動物的方法，其中適應(yīng)型線粒體DNA是源自野生型的線粒體DNA。
11.上述第1-10中任一項的產(chǎn)生動物的方法，其中所述動物是小鼠。
12.根據(jù)上述第1-11項中任一項的產(chǎn)生動物的方法，其中用所需要的線粒體DNA取代線粒體DNA的方法是回交法或前核取代法。
13.根據(jù)上述第9-12項中任一項的產(chǎn)生動物的方法，其中所需要的線粒體DNA是野生型小鼠Mus musculus musculus型的線粒體DNA。
14.可繁殖的嵌合動物，所述動物由上述第1-13任一項的方法所產(chǎn)生，其中線粒體DNA被導(dǎo)入適應(yīng)型DNA或用適應(yīng)型DNA取代，而且全能細(xì)胞可傳遞到種系中。
15.上述第14項的動物，其中動物是小鼠。
16.用于產(chǎn)生可繁殖的遺傳性處理的動物的全能細(xì)胞，其中線粒體DNA中已被導(dǎo)入適應(yīng)型DNA或用適應(yīng)型DNA取代，適應(yīng)型DNA，而其特征可傳遞到種系中。
17.上述第16項的全能細(xì)胞，其中與核DNA的適應(yīng)性降低了出生后立即出現(xiàn)的呼吸障礙。
18.上述第16或17項的全能細(xì)胞，其中適應(yīng)型線粒體DNA已作為線粒體DNA被導(dǎo)入。
19.上述第18項的全能細(xì)胞，其中適應(yīng)型線粒體DNA是野生型小鼠Mus musculus musculus型的線粒體DNA。
20.上述第16-19項中任一項的胚胎干細(xì)胞，其中遺傳性處理的動物是小鼠。
本發(fā)明最佳實施方式通過本發(fā)明方法獲得源自處理的胚胎的動物，優(yōu)選通過用全能細(xì)胞例如胚胎干細(xì)胞或近交動物的核轉(zhuǎn)移胚胎經(jīng)四倍體援救法而獲得。因此，根據(jù)本發(fā)明獲得的動物基本上是近交動物，其中大多數(shù)細(xì)胞包括種系細(xì)胞是源自所使用的近交動物的全能細(xì)胞。而且，由于所使用的近交動物的全能細(xì)胞例如胚胎干細(xì)胞的線粒體DNA，預(yù)先用那些野生型品種的線粒體DNA通過前核取代等方法作了取代，獲得的嵌合動物沒有立即死于出生后的呼吸障礙而能生長。因此，能夠有效地獲得可繁殖嵌合動物，而且可用于基因功能分析或作為實驗動物的近交動物能夠直接從獲得的種系嵌合動物中獲取。因此，因為無需消耗時間的重復(fù)和復(fù)雜的雜交來產(chǎn)生近交動物，因而該方法非常有用。這種近交動物可以是任何動物，只要已報道用它們通常能產(chǎn)生嵌合體。特別優(yōu)選的是近交動物。這種動物優(yōu)選為哺乳動物，進(jìn)一步優(yōu)選為嚙齒動物，尤其優(yōu)選為小鼠。
來源于這些動物的全能細(xì)胞例如胚胎干細(xì)胞可由公知方法制備，然后用于本發(fā)明中。利用來源于小鼠的胚胎干細(xì)胞的具體實施方式
將在下面闡述。按通常理解，用于本發(fā)明的動物品種不僅僅局限于小鼠。
制備源自小鼠的線粒體DNA取代的胚胎干細(xì)胞是根據(jù)上述常規(guī)技術(shù)通過線粒體DNA的細(xì)胞內(nèi)替換而獲得。近交小鼠的線粒體DNA取代可產(chǎn)生近交小鼠(在許多情況中，近交小鼠屬于標(biāo)準(zhǔn)品系例如C57BL/6、C3H或BALB/c)，其中具有所需要類型的線粒體DNA，這是由于通過回交法、核轉(zhuǎn)移法等進(jìn)行取代，然后建立小鼠的ES細(xì)胞，進(jìn)而獲得具有線粒體被取代了的ES細(xì)胞，該ES細(xì)胞可用于本發(fā)明。當(dāng)C57BL/6近交小鼠與Mus musculus musculus野生型小鼠通過回交法反復(fù)雜交12次或更多次時，得到的B6-mtMus近交小鼠中的C57BL/6近交小鼠的線粒體DNA已被那些野生型小鼠的Mus musculus musculus型線粒體DNA所取代。從這種小鼠，可以建立其中適應(yīng)型鼠的Musmusculus musculus型DNA取代了線粒體DNA的胚胎干細(xì)胞。
同時，當(dāng)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(McGrath J&Solter D，J Exp Zool，228，355-362，1983)使用前核取代法時，mdx近交小鼠的前核階段受精卵的雄性和雌性前核被移植到具有野生型鼠的Mus musculusmusculus型線粒體的的摘除了細(xì)胞核的前核階段受精卵中。通過電脈沖實現(xiàn)核融合，培育受精卵，然后將受精卵移植到小鼠輸卵管中以便個體發(fā)生，因而產(chǎn)生了其中線粒體DNA被Mus musculus musculus型的線粒體DNA取代的mdx-mtMus近交小鼠。類似地，其中線粒體DNA被野生型的線粒體DNA取代的胚胎干細(xì)胞可用這種小鼠來建立。
為建立ES細(xì)胞，通過這種方式從近交小鼠中搜集胚泡階段的胚胎，如從B6-mtMus或mdx-mtMus中收集，然后通過標(biāo)準(zhǔn)方法就能建立ES細(xì)胞(Evans MJ&Kaufman MK，Nature 292，154-156，1981)。
將通過上述方法獲得的具有預(yù)期特征的ES細(xì)胞注射進(jìn)受精卵的胚胎中，優(yōu)選為已分裂為兩個胚泡階段的四倍體受精卵的四倍體胚胎，進(jìn)而產(chǎn)生一種嵌合小鼠。
胚泡階段的四倍體胚胎通過ICR小鼠自然交配獲得，其中ICR小鼠已用同品系雄性小鼠進(jìn)行超數(shù)排卵誘導(dǎo)處理，從已證實堵塞的小鼠個體中通過沖冼輸卵管而收集后期2-細(xì)胞階段胚胎，進(jìn)而通過電脈沖法進(jìn)行融合處理以制備四倍體胚胎，然后在M16培養(yǎng)基或CZB培養(yǎng)基中培養(yǎng)該胚胎。從選定的B6-mtMus或mdx-mtMus近交小鼠制備ES細(xì)胞利用微量注射器例如加壓微操縱器而將其注射進(jìn)所獲得的胚泡階段的胚胎中。接下來，將獲得的已被注射ES細(xì)胞的胚泡階段胚胎移植進(jìn)經(jīng)過雜交和證實堵塞后2.5天的受體ICR小鼠的子宮中。分娩前的晚上(懷孕后18.5天的晚上)，通過剖腹產(chǎn)術(shù)取出嵌合小鼠胎兒，進(jìn)行復(fù)蘇。確認(rèn)胎兒能夠活動后，按事先準(zhǔn)備好的哺育母鼠對它們進(jìn)行飼養(yǎng)。這樣獲得的大多數(shù)新生兒(嵌合體)能夠自發(fā)呼吸，且?guī)缀跎L正常沒有畸形。對如此培育的嵌合小鼠，將來自ES細(xì)胞的所有細(xì)胞，包括種系細(xì)胞，均進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明這種小鼠能再生成預(yù)期動物，且能進(jìn)一步繁殖。
實施例本發(fā)明通過下述實施例進(jìn)行詳細(xì)描述。然而這些實施例僅在于闡明本發(fā)明，而本發(fā)明不受這些實施例所限制。
實施例1具有取代的線粒體DNA的近交小鼠的產(chǎn)生(1)通過回交法產(chǎn)生具有由Mus musculus musculus-型線粒體DNA所取代的近交B6-mtMus和B6-GFP-mtMus
通過8周齡雄性C57BL/6J近交小鼠與8周齡雌性Mus musculusmusculus野生型小鼠雜交獲得雌鼠(8周齡)。獲得的雌鼠又與8周齡雄性C57BL/6J近交小鼠進(jìn)行回交。通過12次或更多次的重復(fù)雜交，產(chǎn)生B6-mtMus近交小鼠，其中線粒體DNA被Mus musculus musculus型的線粒體DNA所取代。此外，通過巢式PCR(Nested-PCR)方法(Kaneda H等人，PNAS 92，4542-4546，1995)分析了其中的線粒體DNA，以證實DNA被Mus musculus musculus型的DNA取代。
此外，雌性B6-mtMus(N18)小鼠與雄性B6-GFP#4小鼠(Ichida等人，)雜交，而產(chǎn)生B6-GFP-mtMus小鼠。
(2)通過前核取代法產(chǎn)生近交疾病模型小鼠C57BL/10J-mdx-mtMus(mdx-mtMus)對3周齡雌性mdx近交疾病模型小鼠(C57BL/10-mdx)和具有3周齡野生型小鼠的Mus musculus musculus型線粒體DNA的3周齡雌性雜交小鼠(由♀BALB-mtMus+♂C57BL/6產(chǎn)生的雜種小鼠(CBF1-mtMus))進(jìn)行超數(shù)排卵誘導(dǎo)處理(給予每只小鼠5IU/0.05ml的懷孕母驢血清促性腺激素(PMSG)，48小時后給予每只小鼠5IU/0.05ml的人絨毛膜促性腺激素(hCG))。雌性雜種小鼠與8周齡雄性ICR小鼠生活在一起以進(jìn)行自然交配。在給予hCG之后24小時，搜集卵以制備前核階段的受精卵。用所獲得的前核階段受精卵，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(McGrath J&Solter D，J.Exp.Zool.228，355-362，1983)進(jìn)行前核取代。具體地，將前核階段受精卵的雄性和雌性前核(pronuclei)、來源于上述的C57BL/10-mdx近交疾病模型小鼠的供體受精卵導(dǎo)入到被摘除細(xì)胞核的前核階段受精卵中，該受體受精卵來源于上述具有野生型小鼠的Mus musculus musculus型線粒體DNA的CBF1-mtMus雜交小鼠。通過電脈沖進(jìn)行核融合之后，卵在補(bǔ)充有0.1mM EDTA的M16培養(yǎng)質(zhì)(94.59mM NaCl，4.78mM KCl，1.71mM CaCl2，1.19mM KH2PO4，1.19mM MgSO4，25.07mM NaHCO3，23.28mM乳酸鈉、0.33mM丙酮酸鈉，1g/L葡萄糖，4g/L BSA，100IU/mL青霉素和50Hg/mL鏈霉素)中，于37℃和5％CO2-5％O2-90％N2條件下培養(yǎng)過夜，然后移植到小鼠輸卵管中。共16個受精卵(每個子宮8個卵)被移植到假懷孕0.5天的雌性ICR小鼠輸卵管中(雌性小鼠與輸精管被結(jié)扎的雄性小鼠雜交，在第二天，確認(rèn)堵塞，這天的中午被定為假懷孕0.5天)。結(jié)果，獲得了3只雌性和2只雄性幼鼠。所獲得的3只雌性小鼠(8周齡或更大)作為起始與雄性mdx(C57BL/10-mdx)小鼠生活在一起，由此獲得第二代小鼠。類似地，第二代雌性小鼠與雄性mdx小鼠雜交，由此獲得第三代小鼠。通過PCR-RFLP方法對所獲得的第三代小鼠的線粒體DNA加以驗證。在D-環(huán)內(nèi)設(shè)計通用探針(探針產(chǎn)生查閱Kaneda H等人，PNAS 92，4542-4546，1995)5’-AATTATTTTCCCCAAGC-3’(序列表中的SEQ ID NO1)和5’-AGAAGAGGGGCA TTG-3’(序列表中的SEQ IDNO2)。通過擴(kuò)增獲得262bp片段，用Dral限制性酶處理，然后驗證非裂解的Mus musculus馴化型DNA和Mus musculus musculus型DNA裂解成122-bp的片段和140-bp的片段。證實了所獲得第三代小鼠的線粒體DNA已被Mus musculus musculus型的線粒體DNA所取代，因此產(chǎn)生了近交疾病模型小鼠C57BL/10J-mdx-mtMus(mdx-mtMus)。
實施例2來自具有取代的Mus musculus musculus型線粒體DNA的近交小鼠的ES細(xì)胞的產(chǎn)生實施例1(1)獲得的具有取代的Mus musculus musculus型線粒體DNA的近交雌性B6-mtMus(N15)小鼠與雄性C57BL/6小鼠自然雜交。每只小鼠個體的子宮在證實發(fā)生堵塞后第3天，向其中灌注M2培養(yǎng)基，然后收集20個胚泡階段的胚胎。利用獲得的胚胎，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法建立ES細(xì)胞(Evans MJ&Kaufman MK，Nature 292，154-156，1981)。具體地，將先前獲得的胚胎逐個地轉(zhuǎn)移到4孔板中的飼養(yǎng)細(xì)胞上，該4孔板上分配有ES培養(yǎng)基(80％(v/v DMEM，20％(w/v)FCS、1％(v/v)100mM丙酮酸鹽溶液(Gibco Cat.11360-370)、1％(v/v)100×非必需氨基酸溶液(Gibco Cat.11140-027)、1mM巰基乙醇(Sigma，Cat.No.M-6250)和103U/mL LIF)。胚胎然后在37℃和5％CO2-5％O2-90％N2條件下培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第5天，挑選已生長的ICM細(xì)胞聚集體。用0.125％胰蛋白酶/0.1mM EDTA進(jìn)行處理以分散細(xì)胞，然后將這些細(xì)胞在新制備的4孔板上的飼養(yǎng)細(xì)胞上進(jìn)行接種和培養(yǎng)。在第二代，僅僅挑選出類似ES細(xì)胞的集落，然后通過相同于第一次的方法在新的4孔板上進(jìn)行接種和培養(yǎng)。在第3代，整個孔用胰蛋白酶/EDTA處理，然后這些細(xì)胞在新的3.5cm培養(yǎng)平板上進(jìn)行接種，由此獲得能生長較好的2個品系。能夠到達(dá)這個階段的細(xì)胞可穩(wěn)定地生長，所以這些細(xì)胞作為細(xì)胞系于低溫貯藏。
進(jìn)而，通過類似操作，利用從實施例1(2)獲得的近交疾病模型小鼠mdx-mtMus所獲得的6個胚泡階段的胚胎而建立了4個品系的ES細(xì)胞，它們具有取代的Mus musculus musculus型線粒體DNA。
對從上述2個小鼠品系建立的ES細(xì)胞的線粒體DNA進(jìn)行鑒定，確證屬于Mus musculus musculus型。
實施例3四倍體胚泡階段胚胎的制備施以超數(shù)排卵誘導(dǎo)處理的ICR小鼠與相同品系的雄性小鼠自然交配。給予人絨毛膜促性腺激素(hCG)44-46小時后證實小鼠個體發(fā)生堵塞，通過試管灌注法收集晚期2-細(xì)胞階段的胚胎。這樣獲得的晚期2-細(xì)胞階段的胚胎在0.3M甘露醇中通過直接電流脈沖進(jìn)行融合處理(用由FUJIHIRA生產(chǎn)的Goku，脈沖條件為18V，50和999μsec為間隔，分別進(jìn)行3次)，由此制備成四倍體胚胎。挑選四倍體胚胎，然后在37℃，5％CO2的空氣條件下于M16培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，因而得到四倍體胚泡階段的胚胎。
實施例4通過四倍體援救法產(chǎn)生嵌合小鼠(1)從所述B6-mtMus近交小鼠中制備的ES細(xì)胞(性別雄性)，利用加壓微操縱器將其注射到實施例3獲得的四倍體胚泡階段的胚胎中。一個四倍體胚泡階段的胚胎中注射大約10至15個ES細(xì)胞。共對76個四倍體胚泡階段的胚胎進(jìn)行了注射。ES細(xì)胞成功注射的71個四倍體胚泡階段的胚胎在堵塞被確證后2.5天，移植到4個ICR小鼠受體的子宮中。在分娩前的晚上(懷孕后18.5天的晚上)，通過剖腹產(chǎn)術(shù)取出嵌合小鼠胎兒，然后進(jìn)行復(fù)蘇。在確認(rèn)胎兒能夠活動后，按事先準(zhǔn)備好的哺育母鼠對它們進(jìn)行飼養(yǎng)。13個由此獲得的雄性新生兒沒有表現(xiàn)出畸形并能自發(fā)進(jìn)行呼吸，其中4只小鼠生長正常。
實施例5通過四倍體援救法產(chǎn)生嵌合小鼠(2)從選好的mdx-mtMus近交疾病模型小鼠中制備ES細(xì)胞(性別雄性)，通過加壓微操縱器注射到實施例3制備的四倍體胚泡階段的胚胎中。每個四倍體胚泡階段的胚胎中注射大約10至15個ES細(xì)胞。共對108個四倍體胚泡階段的胚胎進(jìn)行了注射。ES細(xì)胞成功注射的89個四倍體胚泡階段的胚胎在堵塞被確證后2.5天，移植到5個ICR小鼠受體的子宮中。在分娩前的晚上(懷孕后18.5天的晚上)，通過剖腹產(chǎn)術(shù)取出嵌合小鼠胎兒，然后進(jìn)行復(fù)蘇。在確認(rèn)胎兒能夠活動后，按事先準(zhǔn)備好的哺育母鼠對它們進(jìn)行飼養(yǎng)。19個由此獲得的雄性新生兒幾乎沒有表現(xiàn)出畸形并能自發(fā)進(jìn)行呼吸，其中11只小鼠生長正常。
實施例6通過四倍體援救法產(chǎn)生嵌合小鼠(3)從選好的mdx-mtMus近交疾病模型小鼠中制備ES細(xì)胞(性別雌性)，通過加壓微操縱器注射到實施例3制備的四倍體胚泡階段的胚胎中。每個四倍體胚泡階段的胚胎中注射大約10至15個ES細(xì)胞。共對75個四倍體胚泡階段的胚胎進(jìn)行了注射。ES細(xì)胞成功注射的75個四倍體胚泡階段的胚胎在堵塞被確證后2.5天，移植到3個ICR小鼠受體的子宮中。在分娩前的晚上(懷孕后18.5天的晚上)，通過剖腹產(chǎn)術(shù)取出嵌合小鼠胎兒，然后進(jìn)行復(fù)蘇。在確認(rèn)胎兒能夠活動后，按事先準(zhǔn)備好的哺育母鼠對它們進(jìn)行飼養(yǎng)。12個雌性新生兒當(dāng)中的8個沒有表現(xiàn)出畸形并自發(fā)進(jìn)行呼吸。7只小鼠由于飼養(yǎng)不當(dāng)而死亡或被受體鼠殺死。剩余的1只幼鼠生長正常。
實施例7通過四倍體援救法產(chǎn)生的嵌合小鼠繁殖性能的確證從得自實施例1中制得的近交疾病模型mdx-mtMus的ES細(xì)胞制備的兩個雄性嵌合小鼠與2個正常的雌性mdx-小鼠進(jìn)行雜交，因此獲得38個新生兒。這些小鼠沒有表現(xiàn)出畸形并且生長平穩(wěn)。而且，所有這些小鼠的每一個體均表現(xiàn)出典型的mdx(C57BL/10-mdx)近交疾病模型小鼠的特性。因此，可以確證按本發(fā)明方法獲得的嵌合小鼠在未來子代中能繁殖生產(chǎn)正常幼鼠。
工業(yè)實用性實施本發(fā)明可以得到可繁殖的嵌合動物，特別是近交嵌合動物，進(jìn)而尤其是能夠有效獲得近交嵌合小鼠個體。尤其是，實施本發(fā)明能有效的產(chǎn)生近交動物而避免了由于在分娩后近交動物呼吸障礙導(dǎo)致的死亡，尤其在來源于全能細(xì)胞如ES細(xì)胞的嵌合小鼠或來源于近交動物的核轉(zhuǎn)移胚胎，該近交動物是用于通過四倍體援救法獲得的嵌合動物的產(chǎn)生過程中。因此獲得的嵌合小鼠是可繁殖的近交小鼠，它具有適應(yīng)于核DNA的線粒體DNA，而且全能細(xì)胞可被傳遞到種系中。
序列表<110>Nagao，Yasumitsu；Imai，Hiroshi；Horii，TakuroTotsuka，Yoshikazu<120>源自處理的胚胎的動物及其產(chǎn)生方法<130>PH-2203-PCT<150>JP 2002-51302<151>2002-2-27<160>2<210>1<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>1aattattttc cccaagc17<210>2<211>15<212>DNA<213>人工序列<400>2agaagagggg cattg 1權(quán)利要求
1.產(chǎn)生動物的方法，該動物來源于源自全能細(xì)胞的處理的胚胎，包括使用其中導(dǎo)入適應(yīng)于核DNA的適應(yīng)型線粒體DNA的細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的產(chǎn)生動物的方法，其中來源于源自全能細(xì)胞的處理的胚胎的動物是嵌合動物。
3.權(quán)利要求2的產(chǎn)生動物的方法，其中嵌合動物是近交嵌合動物。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的產(chǎn)生嵌合動物的方法，包括使用其中導(dǎo)入適應(yīng)型線粒體DNA的全能細(xì)胞和未處理的宿主胚胎、未處理的全能細(xì)胞和其中導(dǎo)入適應(yīng)型線粒體DNA的宿主胚胎、或其中導(dǎo)入適應(yīng)型線粒體DNA的全能細(xì)胞和其中導(dǎo)入適應(yīng)型線粒體DNA的宿主胚胎。
5.權(quán)利要求4的產(chǎn)生動物的方法，包括使用四倍體受精卵作為動物的宿主胚胎和全能細(xì)胞作為其中導(dǎo)入適應(yīng)型線粒體DNA的細(xì)胞。
6.根據(jù)四倍體援救法的權(quán)利要求5的產(chǎn)生動物的方法，包括將其中導(dǎo)入適應(yīng)型線粒體DNA的全能細(xì)胞注射到四倍體受精卵的胚泡中。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的產(chǎn)生嵌合動物的方法，其中具有導(dǎo)入的適應(yīng)型線粒體DNA的細(xì)胞是由于取代而具有適應(yīng)型線粒體DNA的細(xì)胞。
8.利用具有與供體細(xì)胞的核DNA相適應(yīng)的適應(yīng)型線粒體DNA的受體母卵細(xì)胞，通過核轉(zhuǎn)移以產(chǎn)生克隆個體的方法。
9.權(quán)利要求1-8中任一項的產(chǎn)生動物的方法，其中核-線粒體不相容性導(dǎo)致出生后立即出現(xiàn)的呼吸障礙。
10.權(quán)利要求1-9中任一項的產(chǎn)生動物的方法，其中適應(yīng)型線粒體DNA是源自野生型的線粒體DNA。
11.權(quán)利要求1-10中任一項的產(chǎn)生動物的方法，其中所述動物是小鼠。
12.權(quán)利要求1-11中任一項的產(chǎn)生動物的方法，其中用所需要的線粒體DNA取代線粒體DNA的方法是回交法或前核取代法。
13.權(quán)利要求9-12中任一項的產(chǎn)生動物的方法，其中所需要的線粒體DNA是野生型小鼠Mus musculus musculus型的線粒體DNA。
14.可繁殖的嵌合動物，所述動物由權(quán)利要求1-13任一項的方法所產(chǎn)生，其中線粒體DNA被導(dǎo)入適應(yīng)型DNA或用適應(yīng)型DNA取代，而且全能細(xì)胞可傳遞到種系中。
15.權(quán)利要求14的動物，其中所述動物是小鼠。
16.用于產(chǎn)生可繁殖的遺傳性處理的動物的全能細(xì)胞，其中線粒體DNA是適應(yīng)型線粒體DNA，而其特征可傳遞到種系中。
17.權(quán)利要求16的全能細(xì)胞，其中與核DNA的適應(yīng)性降低了出生后立即出現(xiàn)的呼吸障礙。
18.權(quán)利要求16或17的全能細(xì)胞，其中適應(yīng)型線粒體DNA已作為線粒體DNA被導(dǎo)入。
19.權(quán)利要求18的全能細(xì)胞，其中適應(yīng)型線粒體DNA是野生型小鼠Mus musculus musculus型的線粒體DNA。
20.權(quán)利要求16-19中任一項的胚胎干細(xì)胞，其中遺傳性處理的動物是小鼠。
全文摘要
本發(fā)明涉及高效產(chǎn)生可繁殖的動物的方法，所述方法使用具有通過轉(zhuǎn)移或取代而導(dǎo)入其線粒體DNA中的與核DNA相容的線粒體DNA(如野生型DNA)的全能細(xì)胞；和由該方法產(chǎn)生的動物。當(dāng)全能細(xì)胞是源自近交品系小鼠的ES細(xì)胞時，優(yōu)選采用的方法是四倍體援救法。在嵌合動物的產(chǎn)生過程中，通過回交法、核取代法等用野生型線粒體DNA取代來自所使用動物的全能細(xì)胞的線粒體DNA，然后將其注射到四倍體受精卵中。因此，產(chǎn)生了可繁殖的近交品系嵌合動物，而避免了使得動物在出生后由于立即出現(xiàn)的呼吸障礙等導(dǎo)致的死亡危險性。所獲得的可繁殖的近交品系嵌合動物可用于基因功能分析、動物實驗等而無需復(fù)雜的近交品系操作。
文檔編號A01K67/027GK1650007SQ03809519
公開日2005年8月3日 申請日期2003年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月27日
發(fā)明者長尾恭光, 今井裕, 堀居拓郎, 戶塚義和 申請人:長尾恭光, 今井裕, 堀居拓郎, 戶塚義和