專利名稱：核酸構(gòu)建體及其生產(chǎn)改良的種子油組合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組核酸分子、構(gòu)建體以及與脂肪酸合成途徑中對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行協(xié)同調(diào)節(jié)相關(guān)的其它物質(zhì)。本發(fā)明特別涉及在脂肪酸合成途徑中能夠促進(jìn)某些基因表達(dá)同時(shí)又能夠抑制另一些基因表達(dá)的相關(guān)的物質(zhì)，本發(fā)明也涉及整合這些物質(zhì)的植物，特別是整合這些構(gòu)建體的植物，這樣的植物具有改良的種子油組合物。
背景技術(shù)：
植物油用途廣泛，通過生物合成或天然植物來源獲得新的植物油組合物以及獲得這些油組合物的改良方法是需要的，根據(jù)油用途的不同，需要各種不同的脂肪酸成分。植物特別是其種子中合成大量油的品種是食用油和工業(yè)油的重要來源，種子油幾乎都是由甘油三酯組成，其中的脂肪酸被酯化到甘油的三個(gè)羥基上。
大豆油通常含有約16-20％的飽和脂肪酸13-16％的棕櫚酸酯和3-4％的硬脂酸，參見Gunstone et al.，The Lipid Handbook，Chapman &Hall，倫敦(1994)。為了滿足市場(chǎng)的需求，大豆油已經(jīng)經(jīng)過不同的培育方法進(jìn)行了改良，但是還沒有一種大豆油能夠滿足不同消費(fèi)者的需求，如色拉油、烹調(diào)油和煎炸油的消費(fèi)者以及生物柴油和生物潤(rùn)滑油的工業(yè)市場(chǎng)。以往的大豆油或者是太昂貴或者是缺乏某種關(guān)鍵的食物品質(zhì)如氧化穩(wěn)定性、誘人的烹調(diào)香味或不飽和脂肪酸含量，或者是缺乏某種重要的生物柴油品質(zhì)如適宜的氮氧化物排放量或?qū)涞哪褪苄曰蛘呤堑蜏貢r(shí)的流動(dòng)性。
較高等的植物通過普通的代謝途徑來合成脂肪酸-脂肪酸合酶(FAS)途徑，該途徑發(fā)生在脂質(zhì)體中；在植物細(xì)胞中，β-酮脂?；?ACP合酶是FAS途徑中重要的限速酶，其具有幾種類型。β-酮脂?；?ACP合酶I催化鏈延長(zhǎng)至棕櫚酰ACP(C16:0)，而β-酮脂?；?ACP合酶II催化鏈延長(zhǎng)至硬脂酰-ACP(C18:0)，β-酮脂酰基-ACP合酶IV是β-酮脂?；?ACP合酶II的變異體，也能夠催化脂肪鏈延長(zhǎng)至18:0-ACP。在大豆中，F(xiàn)AS的主要產(chǎn)品是16:0-ACP和18:0-ACP，18:0-ACP去飽和形成的18:1-ACP是由位于脂質(zhì)體內(nèi)的可溶性δ-9去飽和酶(也稱作“硬脂酰-ACP去飽和酶”)催化完成，見Voelker et al.，52Annu，Rev，植物生理，植物分子生物學(xué).335-61(2001)。
脂質(zhì)體內(nèi)的FAS和δ-9去飽和酶的產(chǎn)物，16:0-ACP，18:0-ACP和18:1-ACP在特異的硫酯酶(FAT)作用下脫羥基。植物中的硫酯酶依據(jù)基因序列的同一性和酶底物的選擇性分為兩個(gè)基因家族，第一家族，F(xiàn)ATA，包括長(zhǎng)鏈的?；?ACP硫酯酶，其主要對(duì)18:1-ACP有活性；第二家族的酶，F(xiàn)ATB，通常以16:0-ACP(棕櫚酰-ACP)，18:0-ACP(硬脂酰-ACP)和18:1-ACP(油?；?ACP)作為底物。這樣的硫酯酶在植物的重新的脂肪酸生物合成時(shí)對(duì)決定脂肪酸鏈的長(zhǎng)度起重要作用，因此這些酶對(duì)于脂肪酰成分的各種改進(jìn)物的供應(yīng)是有用的，特別是關(guān)于種子貯備油中各種脂肪酰基的相對(duì)含量。
FATA和FATB的反應(yīng)產(chǎn)物，游離脂肪酸，離開脂質(zhì)體，又轉(zhuǎn)變成其各自的?；?CoA酯，?；?CoAs是脂質(zhì)生物合成途徑的底物(Kennedy途徑)，該途徑發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中，負(fù)責(zé)膜脂質(zhì)的形成以及構(gòu)成種子油三甘油酯的生物合成。在ER中還有其它膜結(jié)合去脂肪酶，該酶能夠進(jìn)一步對(duì)18:1去飽和形成多不飽和脂肪酸，一種δ-12去飽和酶(FAD2)催化一雙鍵插入18:1中形成亞油酸(18:2)，一種δ-15去飽和酶(FAD3)催化一雙鍵插入18:2，形成亞麻酸(18:3)。
許多復(fù)雜的生化途徑已進(jìn)行了遺傳學(xué)調(diào)控，通常是抑制單個(gè)基因或使單個(gè)基因過表達(dá)。對(duì)植物遺傳調(diào)控潛能的進(jìn)一步開發(fā)將集中在對(duì)某一途徑中的多個(gè)基因進(jìn)行協(xié)同調(diào)控方面。許多方法已經(jīng)被采用以在某種植物中轉(zhuǎn)入基因包括有性雜交、再轉(zhuǎn)換、共轉(zhuǎn)化以及使用相關(guān)的轉(zhuǎn)基因。含有部分相關(guān)基因序列的轉(zhuǎn)基因嵌合體能夠用來協(xié)同抑制多個(gè)植物內(nèi)源性基因，模擬病毒蛋白多聚體的構(gòu)建體能夠?qū)⒍鄠€(gè)編碼基因同時(shí)導(dǎo)入植物細(xì)胞中，參見一篇綜述，Halpin et al.，植物分子生物學(xué)，47295-310(2001)。
因此，理想的植物表型需要一或多種基因的表達(dá)以及并發(fā)的另一或另一些基因的表達(dá)的減少。因而，有必要利用單一的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體，同時(shí)使植物中的一或多種基因過表達(dá)，而使另一或一些基因的表達(dá)抑制或下調(diào)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種或一些核酸分子，該分子導(dǎo)入細(xì)胞或組織時(shí)能夠抑制、至少是部分減少、減少、實(shí)質(zhì)性減少或有效降低至少一種或多種內(nèi)源性FAD2、FAD3或FATB RNAs的表達(dá)，同時(shí)又能共表達(dá)、同時(shí)表達(dá)或協(xié)同產(chǎn)生一種或多種RNAs或蛋白，該RNAs或蛋白轉(zhuǎn)錄自或由β-酮脂?；?ACP合酶I、β-酮脂酰基-ACP合酶IV或CP4 EPSPS編碼，給植物細(xì)胞和用相同基因轉(zhuǎn)化的植物和種子提供來自轉(zhuǎn)化植物的油和其它產(chǎn)品。
本發(fā)明也提供一種重組的核酸分子，該分子由兩部分DNA序列構(gòu)成，第一組DNA序列在宿主細(xì)胞表達(dá)時(shí)能夠抑制至少一種、優(yōu)選兩種基因的內(nèi)源性表達(dá)，該基因選自由FAD2、FAD3和FATB基因組成的組；第二組DNA序列在宿主細(xì)胞表達(dá)時(shí)能夠提高至少一種基因的內(nèi)源性表達(dá)，該基因選自由β-酮脂?；?ACP合酶I基因，β-酮脂酰基-ACP合酶IV基因和δ-9去飽和酶基因組成的組。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種重組核酸分子，該分子包含第一組DNA序列，其在宿主細(xì)胞表達(dá)時(shí)能夠形成一種dsRNA構(gòu)建體并能夠抑制至少一種，優(yōu)選兩種，基因的內(nèi)源性表達(dá)，該基因選自由FAD2、FAD3和FATB基因組成的組，而且第一組DNA序列包括第一非編碼序列，其表達(dá)的第一RNA序列呈現(xiàn)與FAD2基因的非編碼區(qū)至少90％的同一性，和反義序列，該反義序列表達(dá)第一反義RNA序列，該反義的RNA序列與第一RNA序列形成雙鏈的RNA分子；第二非編碼序列表達(dá)第二RNA序列，該RNA序列與FAD3基因的非編碼區(qū)有至少90％同一性，和第二反義序列，該反義序列表達(dá)第二反義RNA序列，它與第二RNA序列形成雙鏈RNA分子；該重組核酸分子所包含的第二組DNA序列在宿主細(xì)胞表達(dá)時(shí)能夠提高至少一種基因的內(nèi)源性表達(dá)，該基因選自由β-酮脂?；?ACP合酶I基因，β-酮脂?；?ACP合酶IV基因和δ-9去飽和酶基因組成的組。
本發(fā)明提供用這些重組核酸分子轉(zhuǎn)化植物的方法，該方法包括產(chǎn)生一種轉(zhuǎn)化植物的方法，該轉(zhuǎn)化植物的種子中油酸含量增高、飽和脂肪酸含量降低、多不飽和脂肪酸含量降低，此方法包括步驟(A)用重組核酸分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，該核酸分子包括第一組DNA序列，其在宿主細(xì)胞表達(dá)時(shí)能夠抑制至少一種、優(yōu)選兩種基因的內(nèi)源性表達(dá)，該基因選自由FAD2、FAD3和FATB基因組成的組；和第二組DNA序列，其在宿主細(xì)胞表達(dá)時(shí)能夠提高至少一種基因的內(nèi)源性表達(dá)，該基因選自由β-酮脂酰基-ACP合酶I基因，β-酮脂酰基-ACP合酶IV基因和δ-9去飽和酶基因組成的組；和步驟(B)培育該轉(zhuǎn)化植物，與有相似的遺傳背景但缺乏重組核酸分子的植物種子相比，該轉(zhuǎn)化植物的種子中油酸含量增高、飽和脂肪酸含量降低、多不飽和脂肪酸含量降低。
本發(fā)明進(jìn)一步提供用重組核酸分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法，該方法包括改變植物細(xì)胞中油組合物的方法，其包括步驟(A)用重組核酸分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，該核酸分子包括第一組DNA序列，其在宿主細(xì)胞表達(dá)時(shí)能夠抑制至少一種、優(yōu)選兩種基因的內(nèi)源性表達(dá)，該基因選自由FAD2、FAD3和FATB基因組成的組；和第二組DNA序列，其在宿主細(xì)胞表達(dá)時(shí)能夠提高至少一種基因的內(nèi)源性表達(dá)，該基因選自由β-酮脂?；?ACP合酶I基因，β-酮脂酰基-ACP合酶IV基因和δ-9去飽和酶基因組成的組；和(B)培育所述植物細(xì)胞，其條件是第一組DNA序列和第二組DNA序列的轉(zhuǎn)錄起始，該植物細(xì)胞所含的油組合物與有相似遺傳背景但缺乏重組核酸分子的植物細(xì)胞相比發(fā)生了變化。
本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)化植物，該植物含有一種重組的核酸分子，該重組核酸分子包括第一組DNA序列，其在宿主細(xì)胞表達(dá)時(shí)能夠抑制至少一種、優(yōu)選兩種基因的內(nèi)源性表達(dá)，該基因選自由FAD2、FAD3和FATB基因組成的組；和第二組DNA序列，其在宿主細(xì)胞表達(dá)時(shí)能夠提高至少一種基因的內(nèi)源性表達(dá)，該基因選自由β-酮脂?；?ACP合酶I基因，β-酮脂?；?ACP合酶IV基因和δ-9去飽和酶基因組成的組。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種結(jié)有種子的轉(zhuǎn)化大豆植物，其中種子的油組合物包含55-80％重量百分比的油酸、10-40％重量百分比的亞油酸，6％或小于6％重量百分比的亞麻酸和2-8％重量百分比的飽和脂肪酸，以及進(jìn)料、植物部分和來源于植物的種子。
本發(fā)明還提供一種大豆種子，種子的油組合物包含55-80％重量百分比的油酸、10-40％重量百分比的亞油酸，6％或小于6％重量百分比的亞麻酸和2-8％重量百分比的飽和脂肪酸。還提供了一種大豆種子，其油組合物含有65-80％重量百分比的油酸、10-30％重量百分比的亞油酸，6％或小于6％重量百分比的亞麻酸和2-8％重量百分比的飽和脂肪酸。本發(fā)明還提供了包括油組合物的大豆制品，所述油組合物包含69-73％重量百分比的油酸、21-24％重量百分比的亞油酸，0.5-3％重量百分比的亞麻酸和2-3％重量百分比的飽和脂肪酸。
本發(fā)明提供的粗大豆油的油組合物包括55-80％重量百分比的油酸、10-40％重量百分比的亞油酸，6％或小于6％重量百分比的亞麻酸和2-8％重量百分比的飽和脂肪酸。本發(fā)明提供的另一種粗大豆油的油組合物包括65-80％重量百分比的油酸、10-30％重量百分比的亞油酸，6％或小于6％重量百分比的亞麻酸和2-8％重量百分比的飽和脂肪酸。


附圖1-4分別描述了列舉的核酸分子構(gòu)型；附圖5和6分別描述了列舉的第一組DNA序列的構(gòu)型；和附圖7-15分別描述了本發(fā)明的核酸分子。
發(fā)明詳述核酸序列的描述SEQ ID NO1是FAD2-1A內(nèi)含子1的核酸序列。
SEQ ID NO2是FAD2-1B內(nèi)含子1的核酸序列。
SEQ ID NO3是FAD2-1B啟動(dòng)子核酸序列。
SEQ ID NO4是FAD2-1A基因組克隆的核酸序列。
SEQ ID NO5&6分別是FAD2-1A 3’UTR和5’UTR的核酸序列。
SEQ ID N07-13分別是FAD3-1A內(nèi)含子1，2，3A，4，5，3B和3C的核酸序列。
SEQ ID NO14是FAD3-1C內(nèi)含子4的核酸序列。
SEQ ID NO15是部分FAD3-1A基因組克隆的核酸序列。
SEQ ID NO16&17分別是FAD3-1A 3′UTR和5′UTR的核酸序列。
SEQ ID NO18是部分FAD3-1B基因組克隆的核酸序列。
SEQ ID NO19-25分別是FAD3-1B內(nèi)含子1，2，3A，3B，3C，4和5的核酸序列。
SEQ ID NO26&27分別是FAD3-1B 3′UTR和5’UTR的核酸序列。
SEQ ID NO28是FATB基因組克隆的核酸序列。
SEQ ID NO29-35分別是FATB內(nèi)含子I、II、III、IV、V、VI和VII的核酸序列SEQ ID NO36&37分別是FATB 3′UTR和5′UTR的核酸序列。
SEQ ID NO38是Cuphea pulcherrima KAS I基因的核酸序列SEQ ID NO39是Cuphea pulcherrima KAS IV基因的核酸序列SEQ ID NO40&41分別是蓖麻(Ricinus communis)和希蒙得木(Simmondsia chinensis)δ-9去飽和酶基因的核酸序列。
定義“ACP”是指?；d體蛋白部分，“改良的種子油組合物”是指來自于本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)化植物的種子油組合物，相對(duì)于來自有相似遺傳背景但沒有被轉(zhuǎn)化的植物的種子油組合物，其改變或改善了其脂肪酸水平。“反義抑制”是指由于導(dǎo)入一種反義RNA分子而導(dǎo)致的基因特異性沉默。
“一種以上物質(zhì)例如mRNA或蛋白的共表達(dá)”是指在重疊時(shí)間域內(nèi)在同一細(xì)胞或組織中的一種物質(zhì)與另一種物質(zhì)同時(shí)表達(dá)?！耙环N以上物質(zhì)的協(xié)同表達(dá)”是指當(dāng)來自相同物質(zhì)的轉(zhuǎn)錄物和蛋白產(chǎn)物在共享或使用同一個(gè)啟動(dòng)子時(shí)有一種以上物質(zhì)共同表達(dá)。一種核酸序列的“互補(bǔ)鏈”是指其全長(zhǎng)序列的互補(bǔ)鏈。
“共抑制”通常是指由于一種同源正義構(gòu)建體的表達(dá)而使特異的內(nèi)源性基因或基因家族的表達(dá)水平，通常是指RNA的水平，下降，該同源正義構(gòu)建體在內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄時(shí)能夠使同一條鏈上的mRNA轉(zhuǎn)錄，見Napoli et al植物細(xì)胞2279-289(1990)；van der Krol etal.，植物細(xì)胞2291-299(1990)?！按执蠖褂汀笔侵敢环N從大豆種子中提取的大豆油，雖然它可能已經(jīng)被脫膠，但還沒有被提煉、加工或混合。
在本文中當(dāng)指蛋白和核酸時(shí)，“獲得”是指直接或間接從已知蛋白或核酸中獲得蛋白或核酸，(直接的例子如當(dāng)獲得一種已知蛋白或核酸的序列時(shí)制備具有與已知蛋白或核酸序列相似、至少部分相似序列的蛋白或核酸)(間接的例子如從與已知蛋白或核酸相關(guān)的組織中獲得蛋白或核酸)。從一已知蛋白或核酸中獲得蛋白和核酸的其它方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
“dsRNA”、“dsRNAi”、“RNAi”都是指由于能夠形成雙鏈RNA分子的構(gòu)建體的導(dǎo)入而誘導(dǎo)的基因特異性沉默?！癲sRNA分子”和“RNAi分子”都是指雙鏈RNA分子，該RNA分子在導(dǎo)入一個(gè)細(xì)胞和組織時(shí)能夠至少部分減少細(xì)胞和組織細(xì)胞中mRNA的水平。
“外顯子”指該術(shù)語的通常含義，即指核酸分子，通常是指DNA，的一個(gè)片段，它編碼被表達(dá)蛋白的全部或部分。
“脂肪酸”是指游離脂肪酸和脂肪?；盎颉笔侵敢欢魏怂嵝蛄校撔蛄邪c基因產(chǎn)物的表達(dá)相關(guān)的5’端啟動(dòng)子區(qū)域、任意的內(nèi)含子、外顯子區(qū)域以及與基因產(chǎn)物表達(dá)相關(guān)的3’或5’端非翻譯區(qū)?！盎虺聊笔侵富虮磉_(dá)的抑制或基因表達(dá)的下調(diào)。
“基因家族”是指某種生物中的兩個(gè)或更多的基因，它們編碼具有相似功能屬性的蛋白。“基因家族成員”是指在植物遺傳物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的基因家族中的任意基因，例如“FAD2基因家族成員”是指在植物遺傳物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的任意FAD2基因。一個(gè)有兩個(gè)成員的基因家族的的例子是FAD2-1和FAD2-2?；蚣易暹€可以按照核酸序列的相似性進(jìn)一步進(jìn)行分類。一個(gè)基因家族的成員在基因編碼區(qū)優(yōu)選有至少60％，更優(yōu)選至少70％，再優(yōu)選至少有80％的核酸序列相同。
“異源性”意味著非天然在一起。一種“高油酸大豆種子”是指一種種子，其油組合物中有大于75％的油酸。
如果作為人為調(diào)控的結(jié)果，一種核酸分子被插入到細(xì)胞或生物體，無論如何間接，都稱為核酸分子被“導(dǎo)入”。導(dǎo)入核酸分子的實(shí)例包括，但并不限于，通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、注射和發(fā)射方式導(dǎo)入細(xì)胞的核酸和通過偶聯(lián)、胞飲和吞噬的方式導(dǎo)入生物體的核酸。
“內(nèi)含子”是常規(guī)意義的術(shù)語，意思是核酸分子的一個(gè)片段，通常指DNA片段，它不對(duì)表達(dá)蛋白的全部或部分進(jìn)行編碼，在內(nèi)源性條件下，它轉(zhuǎn)錄成RNA分子，該RNA分子在翻譯為蛋白質(zhì)之前要被剪切出內(nèi)源性RNA。一種“內(nèi)含子dsRNA分子”和一種“內(nèi)含子RNAi分子”都是指一種雙鏈的RNA分子，其在導(dǎo)入細(xì)胞或組織內(nèi)時(shí)能夠至少部分的減少組織細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的mRNA的水平，該組織或細(xì)胞內(nèi)的雙鏈RNA分子顯示出與該組織或細(xì)胞的基因中的內(nèi)含子足夠的同一性以降低含有內(nèi)含子序列的mRNA的水平。
“低飽和度”的油組合物包含3.6％-8％的飽和脂肪酸。
“中等油酸的大豆種子”是指一種種子，在其種子的油組合物中含有50％-85％的油酸。
術(shù)語“非編碼”是指核酸分子的序列，它對(duì)表達(dá)蛋白的全部或部分不進(jìn)行編碼，非編碼序列包括但并不限于內(nèi)含子、啟動(dòng)子，3’端非翻譯區(qū)(3’UTRs)，和5’端非翻譯區(qū)(5’UTRs)。
可操作地與一種或多種核酸序列連接的啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)一種或多種核酸序列的表達(dá)，包括多順反子構(gòu)型中的多編碼或非編碼核酸序列。
“被生理性連接的”核酸序列是指發(fā)現(xiàn)于單個(gè)核酸分子中的核酸序列。“植物”包括整個(gè)植物、植物器官(例如葉、莖、根等)、種子、植物細(xì)胞及其后代。術(shù)語“植物細(xì)胞”包括，但不限于，種子的懸浮培養(yǎng)液、胚芽、分生組織區(qū)、愈合組織、葉、根、芽、配子體、孢子體和小孢子母細(xì)胞。“植物啟動(dòng)子”包括但不限于，植物病毒啟動(dòng)子、來源于植物的啟動(dòng)子、能夠在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的合成啟動(dòng)子，其促進(jìn)mRNA表達(dá)。
“多順反子基因”或“多順反子mRNA”是指含有轉(zhuǎn)錄核酸序列的任意基因或mRNA，該核酸序列應(yīng)答于多個(gè)表達(dá)基因。由此可見這樣的多順反子基因或mRNA含有應(yīng)答于內(nèi)含子、5’UTRs、3’UTRs或其組合的序列；重組的多順反子基因或mRNA可能含有，并不限于，應(yīng)答于來源于一個(gè)基因和來自于另一個(gè)基因的一種或多種內(nèi)含子的一種或多種UTRs序列。
“種子特異性啟動(dòng)子”是指一個(gè)啟動(dòng)子它優(yōu)先的或?qū)ｉT的在種子中呈現(xiàn)活性?！皟?yōu)先活性”是指啟動(dòng)子的活性，該啟動(dòng)子的活性在種子中的表現(xiàn)實(shí)際上要高于其它植物組織、器官或細(xì)胞器?！胺N子特異性”包括但不限于種子糊粉層、胚乳和/或胚芽中的活性。
“正義內(nèi)含子抑制”是指基因沉默，它是由正義內(nèi)含子或其片段的導(dǎo)入而誘導(dǎo)的。正義內(nèi)含子抑制描述于Fillatti的PCT專利WO01/14538A2中。多種物質(zhì)例如mRNA或蛋白的“同時(shí)表達(dá)”是指一種物質(zhì)與另一種物質(zhì)同時(shí)表達(dá)，這樣的表達(dá)只能部分覆蓋并且也能夠發(fā)生于不同組織或不同水平。
“總油水平”是指脂肪酸的總聚集量不限定脂肪酸的類型?！稗D(zhuǎn)基因”是指與導(dǎo)入組織中的基因表達(dá)相關(guān)的核酸序列，轉(zhuǎn)基因包括，但不限于，生物體中的內(nèi)源性基因或非自然發(fā)生的基因?！稗D(zhuǎn)基因植物”是指任何一種植物，它穩(wěn)定的整合了一種轉(zhuǎn)基因以一種便于來源于植物的轉(zhuǎn)基因以有性或無性的方式傳遞的方法。
“零飽和”油組合物包括低于3.6％的飽和脂肪酸。
在本文中指蛋白和核酸時(shí)，用普通的大寫字母，例如“FAD2”代表酶、蛋白、多肽或肽；用斜體大寫字母，例如“FAD2”用于指核酸，包括，但不限于，基因、cDNA、和mRNAs。一個(gè)細(xì)胞或生物體含有一個(gè)多基因家族，這些基因編碼某一特異酶，跟在基因術(shù)語后面的大寫字母(A、B、C)用來表示家族的成員，例如，F(xiàn)AD2-1A是一個(gè)不同于FAD2-1B的基因家族成員。
在本文中，任何范圍的限定都包括該范圍的端點(diǎn)除非另有說明。
物質(zhì)本發(fā)明的物質(zhì)將優(yōu)選有“生物活性”的物質(zhì)，生物活性是關(guān)于結(jié)構(gòu)屬性，例如核酸分子能夠與另一個(gè)核酸分子雜交的能力，或關(guān)于一個(gè)蛋白能夠與一個(gè)抗體(或與另一個(gè)分子進(jìn)行結(jié)合競(jìng)爭(zhēng))結(jié)合的能力。選擇性地，這樣的屬性可以是催化性的包括這樣的物質(zhì)能夠調(diào)節(jié)某一化學(xué)反應(yīng)或應(yīng)答。這樣的物質(zhì)優(yōu)選“基本純的”。用在此處的術(shù)語“基本純的”是指從與之正常相關(guān)的內(nèi)環(huán)境中的所有其它分子中選擇一個(gè)分子。優(yōu)選“基本純的”分子是指制備過程中的優(yōu)勢(shì)種類?！盎炯兊摹狈肿映^(不包括出現(xiàn)在天然混合物中的溶劑)60％，75％，優(yōu)選超過90％，更優(yōu)選超過95％從其他分子中游離。術(shù)語“基本純的”不包含出現(xiàn)在天然環(huán)境條件中的分子。
本發(fā)明的物質(zhì)也可以是重組的。此處，術(shù)語“重組”是指任何物質(zhì)(例如包括但不限于DNA，肽)它間接來自于一個(gè)核酸分子的人為操作；也可以認(rèn)為本發(fā)明的物質(zhì)可以用便于識(shí)別該物質(zhì)的物質(zhì)來標(biāo)識(shí)，例如熒光標(biāo)記、化學(xué)標(biāo)記和/或改良基質(zhì)。
本發(fā)明的物質(zhì)包括核酸分子，該核酸分子包括DNA序列，它在全長(zhǎng)上與植物編碼區(qū)或非編碼區(qū)或者是與與植物編碼區(qū)或非編碼區(qū)互補(bǔ)的序列相比至少有50％、60％或70％的同一性，優(yōu)選DNA序列，其在全長(zhǎng)上與植物編碼區(qū)或非編碼區(qū)或者是與與植物編碼區(qū)或非編碼區(qū)互補(bǔ)的序列相比有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的同一性。
“同一性”是本領(lǐng)域所熟知的，是指兩個(gè)或多個(gè)多肽序列之間或兩個(gè)或多個(gè)核酸序列之間的關(guān)系，經(jīng)序列比較后決定；在本領(lǐng)域中，“同一性”也指多肽之間或核酸分子序列之間的序列相關(guān)程度，由這些序列的堿基匹配程度決定；“同一性”可以根據(jù)已知的方法容易地計(jì)算出，這些方法包括，但不限于，描述于Computer MolecularBiology，Lesk編輯，牛津大學(xué)出版，紐約1993；BiocomputingInfornatics and Genome Projects，Smith編輯，Academic出版，紐約1988；Computer Analysis of Sequence Data，第一部分，Griffin和Griffin編輯，Humana出版，新澤西，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，Academic出版1987；Sequence Analysis Primer，Gribskov和Devereux編輯，Stockton出版，紐約1991；和Carillo和Lipman，SIAM J，應(yīng)用數(shù)學(xué)，481073，1988。
為了計(jì)算測(cè)試序列之間的最大匹配程度設(shè)計(jì)了決定同一性的方法，而且決定同一性的方法以免費(fèi)獲得程序的方式編撰?？捎糜跊Q定兩個(gè)序列之間同一性的計(jì)算機(jī)程序包括，但不限于，GCG，一組含有五個(gè)BLAST的程序，其中三個(gè)用于核酸序列的查詢(BLASTN，BLASTX和BLASTX)，兩個(gè)用于蛋白序列的查詢(BLASTP和TBLASTN)。BLASTX程序可以從NCBI和其它來源免費(fèi)獲得，例如BLAST年刊，Altschulet al.，NCBI NLM NIH，Bethesda，MD 20894，；Altschul et al.，分子生物學(xué)雜志，215403-410(1990)，著名的Smith Waterman法則也可用于計(jì)算同一性。
多肽序列比較參數(shù)通常包括AlgorithmNeedleman and Wunsch，分子生物學(xué)雜志，48443-453(1970)；Comparison matrixBLOSSUM62from Hentikoff and Hentikoff，proc.Natl，Acad.Sci.USA8910915-10919(1992)；Gap Penalty12；Gap Length Penalty4.與這些參數(shù)應(yīng)用的程序可以從Medison，Wisconsind遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組(“GCG”)以“差異”程序免費(fèi)獲得，上述參數(shù)與no penalty forend gap是肽比較的缺省參數(shù)。
核酸序列比較的參數(shù)包括AlgorithmNeedleman and Wunsch，分子生物學(xué)雜志，48443-453(1970)；比較基質(zhì)配對(duì)-+10；不配對(duì)＝0；差異penalty50；Gaplength penalty3。在本文中，“％同一性”在核酸分子序列比較時(shí)將上述參數(shù)作為缺省參數(shù)決定。來自于GCG的“差異程序其版本是10.2。
本發(fā)明核酸序列的子集包括核酸分子片段?！昂怂岱肿悠巍笔侵敢欢屋^大的核酸分子，其由足夠含量的或其大部分是由較大的核酸分子組成，或者是其包括少量的寡聚核苷酸，含有從大約第15位到大約第400位的鄰近的核苷酸，更優(yōu)選大約第15位到第45位的鄰近核苷酸，大約第20位到第45位的鄰近核苷酸，大約第15位到第30位的鄰近核苷酸，大約第21位到第30位的鄰近核苷酸，大約第21位到第25位的鄰近核苷酸，大約第21位到第24位的鄰近核苷酸，大約第19位到第25位的鄰近核苷酸，或大約第21位的鄰近核苷酸。核酸分子片段的相當(dāng)一部分或?qū)嶋H上是大部分由植物的編碼或非編碼區(qū)組成，或選擇性地含有較小的寡聚核苷酸。在優(yōu)選實(shí)施例中，一個(gè)片段顯示出與植物編碼區(qū)或非編碼區(qū)100％的同一性。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，一個(gè)片段包含一部分較大的核酸序列。在另一方面，一個(gè)核酸分子片段含有本發(fā)明核酸分子的至少15，25，50或100個(gè)鄰近核苷酸的核苷酸序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，一個(gè)核苷酸分子含有植物編碼區(qū)或非編碼區(qū)的至少至少15，25，50或100個(gè)鄰近核苷酸的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明核酸分子的DNA序列可能包含不同于那些編碼多肽或蛋白片段的序列，這是由于多肽中保守的氨基酸變異，因此編碼多肽的核酸序列由于保守變異可能有序列的差異。在本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明的一種或多種核酸分子在核酸序列上不同于那些本文中給出的專門序列，它們的一種或多種密碼子被編碼最初被編碼的氨基酸的保守替代物的密碼子替換。
本發(fā)明的物質(zhì)也包括核酸分子，該核酸分子編碼本發(fā)明多肽的至少約有相鄰的10個(gè)氨基酸的區(qū)域，優(yōu)選至少約有相鄰的25、40、50、100或125個(gè)氨基酸的區(qū)域。由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性，不同的核苷酸密碼子可用于編碼一特異的氨基酸。一個(gè)宿主細(xì)胞呈現(xiàn)一種優(yōu)選的密碼子使用方式。結(jié)構(gòu)核苷酸序列優(yōu)選由特異宿主細(xì)胞的密碼子使用方式構(gòu)建，這通常有助于提高轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中結(jié)構(gòu)核苷酸序列的表達(dá)。上述任一核苷酸和氨基酸序列可以被修飾以體現(xiàn)含有該密碼子的宿主細(xì)胞或組織的優(yōu)選密碼子的使用方式。因此，本發(fā)明多肽的一個(gè)鄰近10個(gè)氨基酸區(qū)域可以由許多不同的核苷酸序列編碼，在植物中，結(jié)構(gòu)核酸序列的改進(jìn)以體現(xiàn)最佳密碼子的使用方式描述于美國(guó)專利5,689,052。
本發(fā)明的物質(zhì)包括核酸分子，例如，但不限于，在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明的核酸分子包含序列SEQ ID NO19，20，21，22，23，25，32，33，34，或35或其片段或其互補(bǔ)鏈的內(nèi)含子序列。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，核酸分子包括核酸序列，該序列導(dǎo)入細(xì)胞或組織時(shí)能夠在同時(shí)表達(dá)、共表達(dá)或協(xié)調(diào)表達(dá)另一RNA或蛋白時(shí)抑制RNA或蛋白的產(chǎn)生。在本發(fā)明的一個(gè)方面，核酸分子含有一個(gè)核酸序列，當(dāng)其導(dǎo)入細(xì)胞或組織時(shí)，能夠抑制、至少部分減少、減少，實(shí)質(zhì)上減少或有效降低內(nèi)源性FAD2，F(xiàn)AD3和/或FATB RNA的表達(dá)，而同時(shí)能夠共表達(dá)、同時(shí)表達(dá)或協(xié)同表達(dá)β-酮脂?；?ACP合酶I、β-酮脂酰基-ACP合酶IV、δ-9去飽和酶和/或CP4 EPSPS RNA或蛋白。
通過降低植物細(xì)胞中的FAD2和/或FAD3的含量，可以獲得百分含量降低的多不飽和脂肪酸例如亞油酸酯(C18:2)和十八碳三烯酸甘油酯(C18:3)。改變脂肪庫中所整合的三甘油酯能夠同樣的影響植物細(xì)胞中的油組合物，因此，F(xiàn)AD2和/或FAD3表達(dá)量的降低可能導(dǎo)致單不飽和脂肪酸例如油酸(C18:1)含量的降低。當(dāng)植物細(xì)胞中的FATB含量降低時(shí)，可以使飽和脂肪酸如棕櫚酸酯或硬脂酸酯含量降低，因此，F(xiàn)ATB表達(dá)量的降低會(huì)導(dǎo)致不飽和脂肪酸例如油酸(C18:1)的含量增加。FAD2，F(xiàn)AD3和FATB表達(dá)的同時(shí)抑制反而會(huì)導(dǎo)致FAS途徑向有18個(gè)碳原子長(zhǎng)度的單不飽和脂肪酸例如油酸(C18:1)的全面升高的方向驅(qū)動(dòng)，見美國(guó)專利5,955,650。
通過提高植物細(xì)胞中的β-酮脂?；?ACP合酶I(KASI)和/或β-酮脂?；?ACP合酶IV(KASIV)的含量，可以降低16:0-ACP的百分含量，提高18:0-ACP的百分含量。較大量的18:0-ACP與一種或多種FAD2，F(xiàn)AD3和FATB的同時(shí)抑制相結(jié)合時(shí)有助于油組合物向油酸酯(C18:1)全面提高的方向驅(qū)動(dòng)。通過提高植物細(xì)胞中的δ-9去飽和酶的含量，可以提高不飽和脂肪酸的百分含量，結(jié)果全面降低了硬脂酸和總飽和脂肪酸的含量。
這些升高的和降低的酶表達(dá)的結(jié)合可以被調(diào)控以生成這樣的脂肪酸成分，包括油，其油酸水平升高，亞油酸、十八碳三烯酸甘油酯、硬脂酸酯、和/或棕櫚酸酯水平降低，所有飽和脂肪酸水平的降低。在植物中基因表達(dá)的提高可以通過將體外復(fù)制的基因編碼序列導(dǎo)入植物細(xì)胞實(shí)現(xiàn)或優(yōu)選將體外復(fù)制的植物基因組中基因編碼序列整合入植物細(xì)胞。過表達(dá)可以通過提高調(diào)節(jié)機(jī)制的活性來實(shí)現(xiàn)，該調(diào)節(jié)機(jī)制提交基因的表達(dá)，例如基因表達(dá)的上調(diào)。
植物細(xì)胞中CP4 EPSPS的導(dǎo)入使得植物細(xì)胞對(duì)草甘膦有了耐受性，這因而提供了一種確認(rèn)是否成功轉(zhuǎn)化的便利方法，即通過篩選對(duì)草甘膦的耐受性。
植物細(xì)胞中基因表達(dá)的抑制也稱為基因沉默，發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平，有各種方法可以抑制宿主細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性序列的表達(dá)包括，但不限于，反義抑制、共同抑制、核酶、正義和反義結(jié)合(雙鏈RNAi)、啟動(dòng)子沉默和DNA結(jié)合蛋白例如鋅指蛋白(見WO 98/53083和WO 01/14538)。這些機(jī)制與DNA或RNA水平的核酸同一性相關(guān)。在植物中，雙鏈RNA分子能夠誘導(dǎo)序列特異性沉默?；虺聊ǔＪ侵钢参镏械碾p鏈RNA(dsRNAi)，caenorhabditis elegans和動(dòng)物中的RNA干擾或RNAi，以及真菌中的quelling。
在優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的核酸分子包括第一組DNA序列，每一序列都呈現(xiàn)與植物中表達(dá)基因的一種或多種編碼或非編碼序列的足夠的同一性，它能夠有效降低、實(shí)質(zhì)上減少或至少部分降低mRNA的轉(zhuǎn)錄水平或蛋白水平，該蛋白質(zhì)由來自于獲得的編碼序列或非編碼序列的基因編碼或由目標(biāo)非編碼序列同源的基因編碼，和第二組DNA序列，其序列顯示出與植物表達(dá)基因足夠的同原性，它能夠至少部分促進(jìn)、提高、促進(jìn)或?qū)嵸|(zhì)上促進(jìn)mRNA的轉(zhuǎn)錄水平或被編碼蛋白的水平。
在本文中，某一物質(zhì)例如蛋白或mRNA數(shù)量或水平的降低是由于相關(guān)細(xì)胞或組織缺乏能夠誘導(dǎo)該物質(zhì)的DNA序列而導(dǎo)致的降低。例如“至少部分降低”意味著降低至少25％，“實(shí)質(zhì)性降低”意味著降低至少75％，以及“有效量的減少”意味著減少了95％以上，所有這些物質(zhì)含量或水平的降低都是由于相關(guān)細(xì)胞或組織缺乏誘導(dǎo)該物質(zhì)的DNA序列。
在本文中，某一物質(zhì)例如蛋白或mRNA含量或水平的增加或提高意思是其水平或含量高于在植物細(xì)胞或組織中具有相似遺傳背景但缺乏導(dǎo)入的編碼該蛋白或mRNA的核酸分子的物質(zhì)的含量或水平，例如“至少部分提高”意味著提高至少25％，“實(shí)質(zhì)性提高”意味著提高至少100％，所有這些物質(zhì)含量或水平的提高都與具有相似遺傳背景但缺乏導(dǎo)入的編碼該蛋白或mRNA的核酸分子的植物細(xì)胞或組織中的該物質(zhì)的含量或水平有關(guān)。
當(dāng)對(duì)某一物質(zhì)的水平進(jìn)行比較時(shí)，這樣的比較優(yōu)選在相似遺傳背景的生物體之間進(jìn)行，優(yōu)選的，相似遺傳背景是指這些被比較的生物體有50％或更多，優(yōu)選75％或更多，甚至優(yōu)選90％或更多的核酸遺傳物質(zhì)的序列相同。
在另一個(gè)優(yōu)選方面，相似遺傳背景是指被比較的生物體是植物，該植物除通過植物轉(zhuǎn)染技術(shù)最初導(dǎo)入的遺產(chǎn)物質(zhì)外其它基因是相同的。某一物質(zhì)含量或水平的測(cè)定是通過適宜的方法進(jìn)行的，非限制性實(shí)施例包括mRNA轉(zhuǎn)錄水平的比較，蛋白肽水平和/或表型，特別是油含量。在本文中，mRNA轉(zhuǎn)錄包括加工和未加工的mRNA轉(zhuǎn)錄，蛋白或肽包括有或沒有經(jīng)過翻譯后修飾的蛋白或肽。
第一組DNA序列是編碼序列，內(nèi)含子序列，3’UTR序列，5’UTR序列，啟動(dòng)子序列，以及其它非編碼序列和上述序列的組合。第一組DNA序列編碼一種或多種序列該序列在被表達(dá)時(shí)能夠選擇性的減少其中之一或兩種蛋白和轉(zhuǎn)錄物，編碼蛋白和轉(zhuǎn)錄物的基因選自由FAD2，F(xiàn)AD3和FATB組成的組。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，第一組的DNA序列能夠表達(dá)反義RNA，單個(gè)反義序列可以與一個(gè)轉(zhuǎn)錄物相連或不與單個(gè)轉(zhuǎn)錄物相連。在進(jìn)一步的優(yōu)選實(shí)施例中，第一組DNA序列是生理性的連接序列，它能夠表達(dá)單個(gè)dsRNA分子。在另一個(gè)不同的優(yōu)選實(shí)施例中，第一組DNA序列能夠表達(dá)正義共抑制RNA，其中單個(gè)的正義序列可以連接于一個(gè)轉(zhuǎn)錄物中或在不連接的單個(gè)轉(zhuǎn)錄物中。第一組DNA序列的實(shí)例描述于詳述的B部分和實(shí)施例中。
第二組DNA序列編碼一種或多種序列，該序列在表達(dá)時(shí)能夠提高一種或兩種蛋白和轉(zhuǎn)錄物，其由選自如下的基因編碼β-酮脂酰基-ACP合酶I(KASI)和/或β-酮脂?；?ACP合酶IV(KASIV)，δ-9去飽和酶和CP4 EPSPS。第二組的DNA序列可以是生理性的連接序列，第二組DNA序列的實(shí)施例描述于詳述的第C和第D部分。
因此，本發(fā)明提供了改變脂肪酸成分和含有這些成分的化合物例如油、石蠟和脂肪的方法。本發(fā)明也包括在植物宿主細(xì)胞中生產(chǎn)特異脂肪酸的方法，這些方法采用本文描述的表達(dá)盒用于植物宿主細(xì)胞的FAS途徑的改進(jìn)。
B第一組DNA序列在本發(fā)明的一個(gè)方面，核酸分子包括第一組DNA序列，當(dāng)其導(dǎo)入細(xì)胞或生物體內(nèi)時(shí)表達(dá)一種或多種序列，該序列能夠有效降低、實(shí)質(zhì)性減少或至少部分減少mRNA的轉(zhuǎn)錄或由一種或多種基因編碼的蛋白質(zhì)的水平，優(yōu)選包括目標(biāo)內(nèi)源性基因、植物基因和非病毒性基因。在本發(fā)明的一個(gè)方面，基因是指FAD2，F(xiàn)AD3或FATB基因。
在一個(gè)方面，本發(fā)明的核酸分子包括DNA序列，此序列與來自植物基因的一種或多種編碼或非編碼序列呈現(xiàn)足夠的同一性，當(dāng)其導(dǎo)入植物細(xì)胞或植物進(jìn)行表達(dá)時(shí)，能夠有效的降低、實(shí)質(zhì)性減少或至少部分減少mRNA的轉(zhuǎn)錄或由所得到的編碼或非編碼序列編碼的蛋白水平。第一組的DNA序列編碼RNA序列或RNA片段，其顯示出與所抑制基因的編碼區(qū)或非編碼區(qū)有至少90％，優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少98％，最優(yōu)選至少100％的同一性，這些百分同一性可以是與一個(gè)核酸片段。
優(yōu)選的，非編碼序列是指3’UTR，5’UTR或來自植物基因的植物內(nèi)含子，更優(yōu)選，非編碼序列是指啟動(dòng)子序列，3’UTR，5′UTR或來自植物基因的植物內(nèi)含子，內(nèi)含子可以位于外顯子中間或位于植物基因的5’或3’UTR內(nèi)。
第一組DNA序列可以被涉及用于表達(dá)dsRNA構(gòu)建體，正義抑制RNA構(gòu)建體，或反義RNA構(gòu)建體或任意的其它抑制性構(gòu)建體以達(dá)到預(yù)期的效果，當(dāng)其被導(dǎo)入植物細(xì)胞或植物時(shí)。這樣的DNA序列可以是核酸分子片段。在一個(gè)優(yōu)選方面，dsRNA構(gòu)建體包括外顯子序列，但是該外顯子并不與植物外顯子的足夠部分相對(duì)應(yīng)，不能有效的降低、實(shí)質(zhì)性減少或至少部分減少mRNA轉(zhuǎn)錄物或蛋白的水平。
植物內(nèi)含子可以是來自內(nèi)源性或?qū)牖虻娜我庵参飪?nèi)含子，這些內(nèi)含子的核酸分子可以有多個(gè)來源，包括但不限于數(shù)據(jù)庫例如EMBL和Genbank，這些數(shù)據(jù)庫可以從因特網(wǎng)ebi.ac.uk/swisprot/、expasy.ch/、embl-heidelberg.de/、和ncbi.nlm.nih.gov獲得。這些內(nèi)含子的核酸序列也可以從例如GENSCAN程序獲得，但不限于，該程序可以從因特網(wǎng)的mit.edu/GENSCAN.html.獲得。
其它內(nèi)含子也可以通過這樣的方法獲得，包括但不限于，用一個(gè)已知的外顯子或內(nèi)含子序列的探針篩查基因組文庫，用與其相應(yīng)的cDNA序列比較基因組序列或通過與來自其它生物體如擬南芥的內(nèi)含子對(duì)比克隆內(nèi)含子如大豆內(nèi)含子，另外，內(nèi)含子的其它核酸序列對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。上述描述的方法也可以用于獲得其它非編碼序列，包括，但不限于，啟動(dòng)子序列，3’UTR序列和5’UTR序列。
“FAD2”、“δ12去飽和酶”或“ω-6-去飽和酶”基因編碼一種酶(FAD2)，該酶能夠催化雙鍵插入脂肪酸部分從羧基端起第12位處，術(shù)語“FAD2-1”習(xí)慣指FAD2基因，該基因在種子組織中以特異的方式自然表達(dá)，術(shù)語“FAD-2-2”習(xí)慣指FAD2基因，該基因(a)不同于FAD2-1基因，(b)能夠在多種組織包括種子中自然表達(dá)。有代表性的FAD2序列包括，但不限于，描述于美國(guó)專利10/176,149中，申請(qǐng)于2002年6月21日以及序列SEQ ID Nos1-6中。
“FAD3”，“δ15去飽和酶”或“ω-3-去飽和酶”基因編碼一種酶(FAD3)，該酶能夠催化雙鍵插入脂肪酸部分從羧基端起第15位處，術(shù)語“FAD3-1”習(xí)慣指FAD3基因家族成員，該基因能夠在多種組織包括種子中自然表達(dá)，有代表性的FAD3序列包括，但不限于，描述于美國(guó)專利10/176,149中，申請(qǐng)于2002年6月21日以及序列SEQ ID Nos7-27中。
“FATB”或“棕櫚?；?ACP-硫酯酶”基因編碼酶(FATB)，該酶能夠催化位于棕櫚酰-ACP的panthothene輔基的碳-硫硫酯鍵發(fā)生水解，這是其優(yōu)選反應(yīng)。其它脂肪酸-ACP硫酯酶的水解也可以被該酶催化。有代表性的FATB序列包括，但不限于，美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)文件No.60/390,185，申請(qǐng)于2002年6月21日，Nos.5,955,329；5,723,761；5,955,650和6,331,664中提出的序列以及序列SEQ IDNos28-37。
C第二組DNA序列在本發(fā)明的一個(gè)方面，核酸分子包括第二組DNA序列，該序列在導(dǎo)入細(xì)胞或生物體時(shí)，能夠部分提高，增加，增強(qiáng)或?qū)嵸|(zhì)性增強(qiáng)mRNA的轉(zhuǎn)錄水平或由一種或多種基因編碼的蛋白水平。在本發(fā)明的一個(gè)方面，基因可以是植物基因。在本發(fā)明的另一方面，基因可以是截短基因，該截短基因能催化由全基因催化的反應(yīng)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，基因是β-酮脂酰基-ACP合酶I、β-酮脂酰基-ACP合酶IV、δ-9去飽和酶或CP4 EPSPS基因。
本發(fā)明的基因可以是任何基因、或者是內(nèi)源性的或?qū)氲幕?。這些基因的核酸序列可以有多種來源，包括，但不限于，數(shù)據(jù)庫例如EMBL和Genbank，這些數(shù)據(jù)庫可以從因特網(wǎng)ebi.ac.uk/swisprot/、expasy.ch/、embl-heidelberg.de/和ncbi.nlm.nih.gov獲得。這些內(nèi)含子的核酸分子也可以從例如GENSCAN程序獲得，但不限于，該程序可以從因特網(wǎng)的mit.edu/GENSCAN.html.獲得。
其它基因也可以通過這樣的方法獲得，但不限于，這樣的方法包括用已知的外顯子或內(nèi)含子序列的探針篩查基因組文庫，通過與來自其它組織如擬南芥的基因?qū)Ρ群罂寺』?。另外，基因的其它核酸序列?duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。其它基因可以，例如但并不限于，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增并用于本發(fā)明的實(shí)施例中，另外，基因的其它核酸序列對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。
為此目的可以使用核酸自動(dòng)合成儀以合成核酸分子，該分子含有細(xì)胞或生物體中發(fā)現(xiàn)的序列，在合成時(shí)，核酸分子可被用于定義一對(duì)引物，該因?yàn)橥ㄟ^PCR擴(kuò)增以獲得第一個(gè)基因的期待的核酸分子或片段。
“KASI”或“β-酮脂?；?ACP合酶I”基因編碼酶(KASI)，該酶能夠催化脂肪?；糠盅娱L(zhǎng)至棕櫚酰-ACP(C16:0)。有代表性的KASI序列包括，但不限于，美國(guó)專利No 5,475,099和PCT公布的WO 94/10189以及SEQ ID No38的序列。
“KASI”或“β-酮脂?；?ACP合酶IV”基因編碼酶(KASIV)，該酶催化中等鏈?；?ACPs的縮和以及提高18:0-ACP的生成。有代表性的KASI序列包括，但不限于，那些在PCT公布的WO 98/46776和SEQ ID NO39D序列。
“δ-9去飽和酶”或“硬脂酰-ACP去飽和酶”或“ω-9去飽和酶”基因編碼酶，該酶能夠催化雙鍵插入脂肪酸部分從羧基端起第9位處。本發(fā)明優(yōu)選的δ-9去飽和酶是植物或藍(lán)細(xì)菌δ-9去飽和酶，更優(yōu)選δ-9去飽和酶是發(fā)現(xiàn)于如下生物體組成的組，即紅花(cartharmus，tinctorius)，蓖麻(ricinus communis)，希蒙得木(simmonsia chinensis)，和蕓苔(Brassica campestri)。有代表性的δ-9去飽和酶序列包括，但不限于，美國(guó)專利No.5,723,595和SEQ ID Nos 40-41的序列。
“CP4 EPSPS”或“CP4 5-烯醇丙酮酰基莽草酸-3-磷酸酯合酶”基因編碼一種酶(CP4 EPSPS)，該酶能夠賦予植物細(xì)胞或由此產(chǎn)生的植物對(duì)草甘膦產(chǎn)生一定程度的耐受性。CP4 EPSPS序列可以是來自于根癌農(nóng)桿菌(tumefaciens sp.)的CP4 EPSPS序列。CP4或其變異體或其合成形式描述于美國(guó)專利No 5,633,435中，有代表性的CP4 EPSPS序列包括，但不限于，公開于美國(guó)專利Nos 5,627,061和5,633,435中的序列。
D重組載體和構(gòu)建體本發(fā)明的一種或多種核酸構(gòu)建體可用于植物的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染中，產(chǎn)物如轉(zhuǎn)錄物或蛋白的水平可以通過生物體例如植物來升高或降低或定位于該生物體的專門的器官或組織。例如產(chǎn)物的水平可以在一種或多種植物的組織和器官中被升高或降低，包括，但不限于，根，塊莖、干(Stems)、葉、莖(Stalks)、果實(shí)、漿果、堅(jiān)果、樹皮、莢、種子和花，優(yōu)選的器官是種子，例如外源性遺傳物質(zhì)可以被轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，植物細(xì)胞發(fā)育成一個(gè)完整的個(gè)體、有性或無性植物或植物部分。
外源性遺傳物質(zhì)是指任意的遺傳物質(zhì)，或者是天然發(fā)生的或者是來自于能夠被插入任意生物體的渠道。這些外源性遺傳物質(zhì)包括，但不限于，核酸分子和本發(fā)明的構(gòu)建體，外源性遺傳物質(zhì)可以通過DNA載體或?yàn)榇四康脑O(shè)計(jì)的構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞，這種載體的設(shè)計(jì)通常是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)(參見植物分子生物學(xué)A Laboratory Mannual，Clark(ed)，springer，New York(1997))。
構(gòu)建體或載體可以包括在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子或植物啟動(dòng)子以表達(dá)所選擇的核酸分子。眾多在植物細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子已記載于文獻(xiàn)中，CaMV35S和FMV啟動(dòng)子優(yōu)選用于植物中。優(yōu)選的啟動(dòng)子是CaMV35S和FMV35S啟動(dòng)子的增強(qiáng)或復(fù)制型。Odell et al.，自然313810-812(1985)；美國(guó)專利No 5,378619；其它的可使用的啟動(dòng)子描述于美國(guó)專利5,391,725；5,428,147；5,447,858；5,608,144；5,608,144；5,614,399；5,633,441；5,633,435；和4,633,436中。
特別優(yōu)選的啟動(dòng)子也可以用于在種子或果實(shí)中表達(dá)本發(fā)明的核酸分子，實(shí)際上，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所用的啟動(dòng)子是種子特異性啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子的實(shí)例包括來自于napin(Kridl et al種子科學(xué)研究，1209-219(1991))、菜豆球蛋白、硬脂酰-ACP去飽和酶、7Sα、7sα’(Chen et al.，Proc Natl Acad Sci 838560-8564(1986))，USP，arcelin和oleosin基因的5’調(diào)節(jié)區(qū)域，在種子中表達(dá)的優(yōu)選啟動(dòng)子是7Sα、7sα’napin和FAD2-1A啟動(dòng)子。
構(gòu)建體或載體也可以包括其它的遺傳元件，包括但不限于，3’轉(zhuǎn)錄終止子、3’多腺苷酸化信號(hào)、其它非翻譯核酸序列、轉(zhuǎn)送或目標(biāo)序列、可選擇的或可篩選的標(biāo)記物、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和操縱子。構(gòu)建體或載體也包括無啟動(dòng)子基因，該基因在插入時(shí)使用內(nèi)源性啟動(dòng)子。
用于植物轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的核酸分子可以是本發(fā)明的任意的核酸分子，本發(fā)明并不只限于列舉的實(shí)施例。列舉的核酸分子已描述于詳述的A部分，進(jìn)一步的非限制列舉核酸分子描述于下文和附圖1-4以及實(shí)施例中。
涉及附圖，本發(fā)明的核酸分子實(shí)例表示在附圖1-4中，如上所述，核酸分子由(a)第一組核酸序列和(b)第二組核酸序列組成，這些序列位于一種或多種T-DNA區(qū)域，每一組序列都被右邊界和左邊界限定，在T-DNA區(qū)域內(nèi)，轉(zhuǎn)錄的方向由箭頭所示。所述的核酸分子的DNA序列可以按單順反子或多順反子構(gòu)型排列，優(yōu)選構(gòu)型包括第一組DNA序列和第二組DNA序列位于單一的T-DNA區(qū)域內(nèi)的構(gòu)型。
在每一個(gè)列舉的實(shí)施例中，第一組DNA序列包括一種或多種序列，當(dāng)其表達(dá)時(shí)，能夠選擇性的減少相應(yīng)的蛋白和轉(zhuǎn)錄物中的一個(gè)或二者都減少，蛋白和轉(zhuǎn)錄物由選自FAD2，F(xiàn)AD3和FATB組成的組中的基因編碼，優(yōu)選第一組DNA序列中的每一個(gè)序列在表達(dá)時(shí)能夠抑制不同基因的表達(dá)，包括，但不限于，不同基因家族的成員。這些序列也可以包括編碼序列、內(nèi)含子序列、3’UTR序列、5’UTR序列、其它非編碼序列和上述序列的組合。第一組DNA序列可以以任意適合的方式表達(dá)，包括作為dsRNA構(gòu)建體、正義共抑制構(gòu)建體或作為一個(gè)反義構(gòu)建體。第一組DNA序列可操作地與至少一種啟動(dòng)子相連以驅(qū)動(dòng)該序列的表達(dá)，該啟動(dòng)子可以是植物中任意的有功能的啟動(dòng)子或任意的植物啟動(dòng)子，優(yōu)選的啟動(dòng)子包括，但不限于，napin啟動(dòng)子、7Sα啟動(dòng)子、7sα’啟動(dòng)子和arcelin啟動(dòng)子或FAD2-1A啟動(dòng)子。
第二組DNA序列包括編碼序列，每一個(gè)編碼序列都是在表達(dá)時(shí)能夠提高相應(yīng)蛋白或轉(zhuǎn)錄物中的一種或兩種的DNA序列，該蛋白和轉(zhuǎn)錄物由選自由AKSI，KASIV，δ-9去飽和酶和CP4 EPSPS組成的組中的基因編碼。每一種編碼序列都與一個(gè)啟動(dòng)子相連，該啟動(dòng)子可以是植物中任意的有功能的啟動(dòng)子或任意的植物啟動(dòng)子。用于第二組DNA序列的優(yōu)選啟動(dòng)子是FMV啟動(dòng)子和/或種子特異性啟動(dòng)子。優(yōu)選的種子特異性啟動(dòng)子包括，但不限于，napin啟動(dòng)子、7Sα啟動(dòng)子、7sα’啟動(dòng)子、arcelin啟動(dòng)子、δ-9去飽和酶啟動(dòng)子或FAD2-1A啟動(dòng)子。
在附圖1和2描述的實(shí)施例中，第一組DNA序列在表達(dá)時(shí)能夠形成dsRNA分子，它能夠抑制相應(yīng)蛋白和轉(zhuǎn)錄物中的一種或二者的表達(dá)，相應(yīng)蛋白或轉(zhuǎn)錄物由選自由FAD2，F(xiàn)AD3和FATB構(gòu)成的組中的基因編碼或轉(zhuǎn)錄。附圖1描述的第一組DNA序列包括三個(gè)非編碼序列，每一個(gè)非編碼序列表達(dá)一個(gè)RNA序列(未表示)，其與由FAD2，F(xiàn)AD3和FATB構(gòu)成的組中的基因的非編碼區(qū)有同一性。非編碼區(qū)序列每一個(gè)都能夠表達(dá)一種RNA序列，其顯示出與由FAD2，F(xiàn)AD3和FATB構(gòu)成的組中的基因的非編碼區(qū)有至少90％的同一性。第一組DNA序列也包括三個(gè)反義序列，每一個(gè)反義序列表達(dá)一種反義RNA序列(未顯示)，能夠與各自相應(yīng)的RNA序列形成一種雙鏈RNA分子(以非編碼序列表達(dá))。
非編碼序列通過一個(gè)間隔區(qū)序列從反義序列分離開來，優(yōu)選的間隔區(qū)序列是能夠促進(jìn)dsRNA分子的形成，這些間隔區(qū)序列的實(shí)例包括Wesley et al，supra，and Hamilton et al.，植物雜志.，15737-746(1988)中提出的間隔區(qū)序列，在一優(yōu)選方面，間隔區(qū)序列能夠形成一發(fā)夾結(jié)構(gòu)如在Wesley et al，supra，中描述的結(jié)構(gòu)，在本文中特別優(yōu)選的間隔區(qū)序列是植物內(nèi)含子或其部分，一個(gè)特別優(yōu)選的植物內(nèi)含子是可剪切的內(nèi)含子，可剪切的內(nèi)含子包括，但不限于，選自下列內(nèi)含子組成的組中的內(nèi)含子，即PDK內(nèi)含子、FAD3-1A或FAD3-1B內(nèi)含子#5、FAD3內(nèi)含子#1、FAD3內(nèi)含子#3A、FAD3內(nèi)含子#3B、FAD3內(nèi)含子#3C、FAD3內(nèi)含子#4、FAD3內(nèi)含子#5、FAD2內(nèi)含子#1和FAD2-2內(nèi)含子。優(yōu)選的可剪切內(nèi)含子包括，但不限于，選自由下列內(nèi)含子組成的組FAD3內(nèi)含子#1、FAD3內(nèi)含子#3A、FAD3內(nèi)含子#3B、FAD3內(nèi)含子#3C、FAD3內(nèi)含子#5。其它優(yōu)選的可剪切內(nèi)含子包括，但不限于，一個(gè)長(zhǎng)度大約為0.75kb至大約為1.1kb的能夠促進(jìn)RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)的可剪切內(nèi)含子。一個(gè)特別優(yōu)選的可剪切內(nèi)含子的非限制性實(shí)例是FAD3內(nèi)含子#5。
在附圖1中，核酸分子包括兩個(gè)T-DNA區(qū)域，每一個(gè)都有左右邊界的限制，第一個(gè)T-DNA區(qū)域包括與啟動(dòng)子操作性相連的第一組DNA序列，第一個(gè)T-DNA區(qū)域進(jìn)一步包括第二組DNA序列的第一部分，該部分又包括與第一編碼序列操作性連接的第一啟動(dòng)子和與第二編碼序列操作性相連的第二啟動(dòng)子。第二個(gè)T-DNA區(qū)域包括第二組DNA序列的第二部分，它包括一個(gè)與第三編碼序列操作性相連的第三啟動(dòng)子。在附圖2描述的優(yōu)選實(shí)施例中，核酸分子包括一個(gè)單一的T-DNA區(qū)域，并且有左右邊界的限制，第一組和第二組DNA序列都位于單一的T-DNA區(qū)域內(nèi)。
在附圖1和2表示的dsRNA表達(dá)實(shí)施例中，序列的順序與所列舉和描述的序列順序相比可以發(fā)生改變，但是非編碼序列和反義序列優(yōu)選圍繞間隔區(qū)序列排列，這樣在表達(dá)時(shí)第一非編碼序列能夠與第一反義序列雜交，第二非編碼序列能夠與第二反義序列雜交，以及第三非編碼序列能夠與第三反義序列雜交，因此形成了一個(gè)單一的dsRNA分子。優(yōu)選非編碼序列在與啟動(dòng)子相關(guān)的正義方向，反義序列在與啟動(dòng)子相關(guān)的反義方向。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，非編碼序列、反義序列和編碼序列的數(shù)量以及其在T-DNA區(qū)域的各種相關(guān)位置都可以以適當(dāng)方式改變。
關(guān)于附圖3和4，列舉的核酸分子包括一個(gè)受左右邊界限制的T-DNA區(qū)域，第一組和第二組DNA序列位于此區(qū)域。第一組DNA序列與啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)操作性地連接，第二組DNA序列包括一個(gè)與第一編碼序列操作性連接的第一啟動(dòng)子和與第二編碼序列操作性連接的第二啟動(dòng)子以及與第三編碼序列操作性連接的第三啟動(dòng)子。轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)可以是在植物內(nèi)有功能的任意轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)或任意的植物轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)包括，但不限于，pea Rubisco E93′序列，Brassica napin 3′序列，tml 3′序列和nos 3′序列。
在附圖3描述的實(shí)施例中，第一組DNA序列在表達(dá)時(shí)能夠形成正義共抑制構(gòu)建體，它能夠抑制一種或多種蛋白或轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)，該蛋白或轉(zhuǎn)錄物由選自FAD2，F(xiàn)AD3和FATB構(gòu)成的組中的基因編碼或獲得。第一組DNA序列包括三個(gè)非編碼序列，每一個(gè)非編碼序列表達(dá)一個(gè)RNA序列(未表示)，其顯示出與FAD2，F(xiàn)AD3和FATB構(gòu)成的組中的基因的非編碼區(qū)有同一性，非編碼序列每一個(gè)都表達(dá)一個(gè)RNA序列其顯示出與FAD2，F(xiàn)AD3和FATB構(gòu)成的組中的基因的非編碼區(qū)有至少90％的同一性，第一組DNA序列內(nèi)的非編碼序列的順序與本文所列舉和所描述的序列順序相比可以發(fā)生改變，但是非編碼序列安排在與啟動(dòng)子相關(guān)的正義方向。
附圖4描述的實(shí)施例，其第一組DNA序列在表達(dá)時(shí)能夠形成反義構(gòu)建體，該反義構(gòu)建體能夠抑制一種或多種蛋白或轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)，蛋白或轉(zhuǎn)錄物由選自由FAD2，F(xiàn)AD3和FATB構(gòu)成的組中的基因編碼或獲得。第一組DNA序列包括三個(gè)反義序列，每一個(gè)反義序列表達(dá)一個(gè)反義RNA序列(未表示)，其顯示出與FAD2，F(xiàn)AD3和FATB構(gòu)成的組中的基因的一種或多種非編碼區(qū)有同一性，反義序列每一個(gè)都表達(dá)一個(gè)反義RNA序列其顯示出與FAD2，F(xiàn)AD3和FATB構(gòu)成的組中的基因的一種或多種非編碼區(qū)有至少90％的同一性，第一組DNA序列內(nèi)的反義序列的順序與本文所列舉和所描述的序列順序相比可以發(fā)生改變，但是反義序列安排在與啟動(dòng)子相關(guān)的反義方向。
如上所述的核酸分子是優(yōu)選的實(shí)施例，它取得了本發(fā)明的目的、特征和好處。本發(fā)明無意限制于所列舉的實(shí)施例。在核酸分子中第一組和第二組DNA序列的序列安排并不限制于所列舉和所描述的序列安排，而是為了獲得本發(fā)明的目的、特征和好處可以改變，正如在其它附圖中所列舉和描述的。
E轉(zhuǎn)基因生物體及其生產(chǎn)方法本發(fā)明的任何核酸分子和構(gòu)建體都可以以長(zhǎng)久或短暫的方式導(dǎo)入植物或植物細(xì)胞，本發(fā)明優(yōu)選的核酸分子和構(gòu)建體描述在上述的詳述的A到D部分以及實(shí)施例中。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例是指生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的方法，該方法通常包括這樣的步驟，選擇一種合適的植物或植物細(xì)胞，用重組的載體轉(zhuǎn)化該植物或植物細(xì)胞，獲得一種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，植物或細(xì)胞是/或來自于與食用和工業(yè)用植物油的生產(chǎn)相關(guān)的植物，特別優(yōu)選的是溫帶含油種子農(nóng)作物，感興趣的植物包括，但不限于，油菜籽(canola and high erucic acidvarieties)、玉米、大豆、crambe、芥末、蓖麻子、花生、芝麻、棉花、亞麻子、紅花、油棕、亞麻、向日葵和椰子。本發(fā)明適用于單子葉植物類和雙子葉植物類，也將適用于新的和/或改進(jìn)的轉(zhuǎn)化和調(diào)節(jié)技術(shù)。
將DNA轉(zhuǎn)化入植物細(xì)胞的方法和技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，而且通過將核酸分子轉(zhuǎn)化入細(xì)胞的任何方法對(duì)本發(fā)明來說都是適宜的，非限制性的適宜方法的實(shí)例包括化學(xué)方法，物理方法例如顯微注射法、電融合法、基因槍法、微粒轟擊法、真空滲入法，病毒載體和受體介導(dǎo)機(jī)制，其它細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法也被使用包括，但不限于，通過將DNA直接轉(zhuǎn)入花粉的方式將DNA轉(zhuǎn)入植物中，或?qū)NA直接注射入植物的生殖器官的方式或?qū)NA直接注射入未成熟的胚芽細(xì)胞中，然后再水化干燥的胚芽的方式。
根癌農(nóng)桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是一種廣泛用于將基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞的應(yīng)用系統(tǒng)，參見Fraley et al生物技術(shù)3629-635(1985)Rogerset al.，酶學(xué)方法，153253-277(1987)，被轉(zhuǎn)移的DNA區(qū)域通過邊界序列限定，介入性DNA通常被插入到植物基因組中，參見Spielmann et al.，生物.基因.遺傳物質(zhì)205-34(1986)?？紤]到方便操作，當(dāng)前的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體能夠在E.Coli和根癌農(nóng)桿菌中復(fù)制，參見Klee et al.，In植物DNA感染物質(zhì)，Hohn and Schell(eds)，Springer-Verlag，New York，179-203(1985)。
來自單一植物原生質(zhì)轉(zhuǎn)化體或來自各種被轉(zhuǎn)化的外植體的植物的再生、發(fā)育和培養(yǎng)是本領(lǐng)域所熟知的，參見Maliga et al.，植物分子生物學(xué)方法，Cold Spring Harbor Press(1995)；Weissbach andWeissbach，植物分子生物學(xué)方法，Academic press，San Diego CA(1988)。本發(fā)明的植物可以是育種過程的一部分或來自育種過程，也可以使用白花色甙來再生，生產(chǎn)單性生殖植物的方法是本領(lǐng)域所熟知的，見美國(guó)專利5,811,636。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的植物包括核酸序列，當(dāng)其表達(dá)時(shí)能夠選擇性地減少FAD2、FAD3和/或FATB蛋白水平，和/或FAD2、FAD3和/或FATB轉(zhuǎn)錄錄水平，該植物能夠與本發(fā)明的另一種植物匹配，另一種植物包括核酸序列，當(dāng)其表達(dá)時(shí)能夠過表達(dá)另一種酶，優(yōu)選的其它酶選自下列酶組成的組，即β-酮脂酰基-ACP合酶I、β-酮脂?；?ACP合酶IV、δ-9去飽和酶和CP4 EPSPS。
F本發(fā)明的產(chǎn)物本發(fā)明的植物可以以整體或部分的方式使用，優(yōu)選的植物部分包括生殖或儲(chǔ)備部分，術(shù)語“植物”部分在本文中包括，但不限于，種子、胚乳、胚珠、花粉、根、塊莖、干、葉子、莖、果實(shí)、漿果、堅(jiān)果、樹皮、莢、種子和花，在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施例中，植物部分是指種子。
本發(fā)明所述的任意植物或植物部分都可以經(jīng)過加工生產(chǎn)為給料(Feedstock)、食物、蛋白或油制品，用于此目的的特別優(yōu)選的植物部分是種子，在一優(yōu)選實(shí)施例中，給料、食物、蛋白或油制品被設(shè)計(jì)用于牲畜、魚或人類或其任意組合。生產(chǎn)給料、食物、蛋白和油產(chǎn)品的方法是本領(lǐng)域所熟知的，參見美國(guó)專利4,957,748；5,100,679；5,219,596；5,936,069；6,005,076；6,146,669；和6,156,227。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，蛋白產(chǎn)品是一種高蛋白制品，這樣的高蛋白制品優(yōu)選含有大于5％w/v，更優(yōu)選含有10％w/v，甚至優(yōu)選15％w/v的蛋白含量。
在優(yōu)選的油制品中，油制品是一種高油制品，其來自本發(fā)明的所述植物或植物部分的油含量大于5％w/v，更優(yōu)選大于10％w/v，甚至優(yōu)選大于15％w/v的油含量。在一優(yōu)選實(shí)施例中，油制品是一種液體其體積大于1，5，10或50升。本發(fā)明提供產(chǎn)自本發(fā)明植物的油或通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的油，這樣的油呈現(xiàn)提高的氧化穩(wěn)定性，而且這樣的油是所得產(chǎn)物的次要或主要成分。
而且，這樣的油可以與其它油混合。在一優(yōu)選實(shí)施例中，產(chǎn)自本發(fā)明植物的油或通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的油構(gòu)成任意產(chǎn)品超過0.5％、1％、5％、10％、25％、50％、75％或90％(體積或重量)油組合物。在另一個(gè)實(shí)施例中，油組合物可以被混合并構(gòu)成混合物中大于10％、25％、35％、50％或75％的體積。產(chǎn)自本發(fā)明植物的油與一種或多種有機(jī)溶劑或石油餾出物混合。
植物的種子可以放置在容器內(nèi)，在此處，容器是指能夠盛放這些種子的任意器具，一個(gè)容器優(yōu)選能盛放大于約500，1,000，5,000，或25,000粒種子，其中至少約10％、25％、50％、75％或100％的種子來自本發(fā)明的植物。本發(fā)明也提供能盛放大約10,000，優(yōu)選約20,000，更優(yōu)選大約40,000粒種子的容器，其中大于大約10％，優(yōu)選大于25％，更優(yōu)選大于50％，更加優(yōu)選大約75％或90％的種子是來自于本發(fā)明植物的種子。本發(fā)明也提供一種能盛放大于大約10kg、優(yōu)選大約25kg、更優(yōu)選大約50kg的種子，其中大于大約10％，優(yōu)選大于25％，更優(yōu)選大約50％，更加優(yōu)選大于75％或90％的種子是來自于本發(fā)明植物的種子G油組合物對(duì)于許多的油應(yīng)用，其飽和脂肪酸水平優(yōu)選小于8％重量，更優(yōu)選小于約2-3％重量，飽和脂肪酸有較高的溶點(diǎn)，這是許多應(yīng)用中所不期望的。當(dāng)作為給料(feedstock)用于燃料時(shí)，飽和脂肪酸在低溫時(shí)出現(xiàn)渾濁，而且?guī)聿畹牡蜏亓鲃?dòng)性，例如對(duì)于燃料來說，流點(diǎn)和冷濾點(diǎn)。含有低水平飽和脂肪酸的油產(chǎn)品是消費(fèi)者和食品工業(yè)所優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈儽徽J(rèn)為是較健康的和/或按照FDA規(guī)則被貼上“無飽和脂肪”的標(biāo)簽。還有，對(duì)于食品的應(yīng)用如色拉油，低飽和油減少或降低了對(duì)使油成為冬天不凝固之油的需求。在生物柴油和潤(rùn)滑油的應(yīng)用方面，含有低飽和脂肪酸的油賦予了提高的低溫流動(dòng)特性和在低溫時(shí)不會(huì)發(fā)生渾濁的特性。
調(diào)控某一特殊油生理特性的因素是復(fù)雜的，在室溫狀態(tài)，棕櫚酸、硬脂酸和其它飽和脂肪酸呈典型的固態(tài)，相反對(duì)于不飽和脂肪酸來說，其呈現(xiàn)液態(tài)，因?yàn)轱柡椭舅嵩谄漉；溕蠜]有雙鍵，在溫度升高時(shí)能夠?qū)ρ趸饔帽３址€(wěn)定，在人造黃油和巧克力配方中飽和脂肪酸是重要的成分，但在許多食品應(yīng)用方面，降低飽和脂肪酸的應(yīng)用則是期望的。
油酸有一個(gè)雙鍵，但其在高溫時(shí)依然能夠保持相對(duì)的穩(wěn)定，含有高水平油酸的油適宜烹調(diào)和需要加熱的操作。最近推薦多使用含有高水平油酸的油，因?yàn)橛退犸@示出較低血液中低密度脂蛋白(LDLs)的水平同時(shí)又不影響高密度脂蛋白(HDLs)的水平。但是對(duì)油酸含量的一些限制也是期望的，因?yàn)楫?dāng)油酸在高溫降解時(shí)，會(huì)產(chǎn)生味道不佳的化合物同時(shí)降低了亞油酸在氧化后產(chǎn)生的誘人味道。Neff et al.，JAOCS，771303-1313(2000)；Warner et al.，農(nóng)業(yè)、食物化學(xué)雜志，49899-905(2001)。優(yōu)選的油含有65-85％重量或低于此含量的油酸以限制食品應(yīng)用時(shí)如煎炸油或煎炸食物的不佳味道。其它優(yōu)選的油含有大于55％重量的油酸以提高氧化穩(wěn)定性。
亞油酸是食物中主要的不飽和脂肪酸而且是人體的必需營(yíng)養(yǎng)素，它也是許多食物的理想成分因?yàn)樗羌逭ㄊ澄镲L(fēng)味劑物質(zhì)例如2，4癸二烯醛的主要前體物質(zhì)，能使煎炸食物味道較好，但是在加熱時(shí)亞油酸的穩(wěn)定性受限。優(yōu)選的食物油其亞油酸的含量大于10％重量以提高理想煎炸食品風(fēng)味物質(zhì)的形成，也可以是25％重量或低于此含量以減少異味的形成。亞油酸也有低膽固醇的特性，由于飲食過量會(huì)降低機(jī)體細(xì)胞對(duì)抗氧化損傷的能力，從而加大了心血管疾病的危險(xiǎn)性。Toborek et al.，Am J Clin J 75119-125(2002).參見脂肪食物的風(fēng)味化學(xué)，editors D.B Min&T.H.Smouse，Amoil Chem.Soc.，Champaign IL(1989)。
亞油酸與油酸相比有較低的熔點(diǎn)，能夠進(jìn)一步改善低溫流動(dòng)性，這在生物柴油和生物潤(rùn)滑劑應(yīng)用方面是期望的。有廣泛用途的優(yōu)選油其亞油酸含量為30％重量或低于此重量，因?yàn)閬営退岬难趸饔孟拗屏思逭ㄓ?、食物、給料、燃料和潤(rùn)滑劑等產(chǎn)品的保質(zhì)期和使用期，參見脂肪、油和乳化劑的生理特性，ed.N.Widlak，AOCS press(1999)；Erhan & Asadauskas，來自植物油、工業(yè)作物和產(chǎn)品中的潤(rùn)滑油basestocks，11277-282(2000)。還有，牛給料中的高水平的亞油酸會(huì)導(dǎo)致不期望的奶牛牛乳中高含量的亞油酸以及由此導(dǎo)致的差的氧化穩(wěn)定性和口味。Timmons et al.，奶?？茖W(xué)雜志842440-2449(2001)。較有用的油組合物中亞油酸的含量為10-25％重量。
亞麻酸也是人類食物中的重要成分，用于合成長(zhǎng)鏈脂肪酸的ω-3家族和前列腺素。但是它的雙鍵對(duì)氧化是高度易感性的，這樣含有高水平亞油酸的油暴露于空氣中時(shí)，特別在高溫時(shí)會(huì)很快變質(zhì)。當(dāng)這些油在用于食品之前進(jìn)行部分的氫化作用是必需的以抑制加熱時(shí)異味和惡臭的形成，但是氫化作用會(huì)產(chǎn)生不利健康的反式脂肪酸它們會(huì)導(dǎo)致心血管疾病。為了獲得改進(jìn)的氧化穩(wěn)定性和減少對(duì)氫化油的需要，優(yōu)選的油其亞麻酸含量是或小于8％，6％或小于6％、4％或小于4％重量，更優(yōu)選在本發(fā)明的油中其亞麻酸的含量是總脂肪酸含量的0.5-2％重量。
本發(fā)明的油可以是混合油、合成油或在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，油是來自于有適宜油組合物的含油種子中。在一優(yōu)選實(shí)施例中，油是一種大豆油。油可能是粗制油例如粗制的大豆油，也可能是加工油例如精煉油、脫色油、除臭油和/或冬天不凝固油。在本文中“精煉”是指將天然的或加工的脂肪或油去除雜質(zhì)的過程，也可以是經(jīng)過將脂肪或油用腐蝕性蘇打處理，然后離心、用水漂洗、真空加熱完成。“脫色”是指處理脂肪或油以去除或減少脂肪或油中有色物質(zhì)的含量。脫色可以用活性或硅藻土處理來完成。“除臭”是指將導(dǎo)致終產(chǎn)品異味或臭味的成分從脂肪或油中去除，可以通過使用高真空和過熱蒸汽脫色來完成?！笆钩蔀槎觳荒讨汀笔侵笍挠椭腥コ柡透视王サ倪^程，可以通過冷凍和去除油中脂肪的固化部分來完成。
本發(fā)明優(yōu)選的油是含有低飽和的油組合物或零飽和的油組合物。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的油含有提高的油酸水平、降低的飽和脂肪酸水平和降低的多不飽和脂肪酸水平。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，其油是一種大豆油。本文中的脂肪酸含量或脂肪酸水平都是指重量百分含量。
在第一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的油優(yōu)選含有下列油組合物即55-80％油酸、10-40％亞油酸、6％或小于6％的亞麻酸、2-8％飽和脂肪酸；更優(yōu)選含有55-80％油酸、10-39％亞油酸、4.5％或小于4.5％亞麻酸、3-6％飽和脂肪酸；更加優(yōu)選55-80％油酸、10-39％亞油酸、3.0％或小于3.0％亞麻酸、2-3.6％飽和脂肪酸。
在第二個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的油優(yōu)選含有65-80％油酸、10-30％亞油酸、6％或小于6％亞麻酸、2-8％飽和脂肪酸；更優(yōu)選65-80％油酸、10-29％亞油酸、4.5％或小于4.5％亞麻酸、3-6％飽和脂肪酸；更加優(yōu)選65-80％油酸、10-29％亞油酸、3％或小于3％亞麻酸、2-3.6％飽和脂肪酸。
在其它實(shí)施例中，油酸的百分含量是50％或大于50％；55％或大于55％；60％或大于60％；65％或大于65％；70％或大于70％；75％或大于75％；80％或大于80％；或者是50-80％；55-80％；55-75％或55-65％；65-80％；65-75％；65-70％；或69-73％。本發(fā)明油中油酸的適宜百分含量也包括這樣的范圍其中下限選自下列的百分?jǐn)?shù)50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、或80％；上限選自下列的百分?jǐn)?shù)60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、或90％。
在這些其它實(shí)施例中，本發(fā)明油中亞油酸的百分含量的范圍是10-40％；10-39％；10-30％；10-29％；10-28％；10-25％；10-21％；10-20％；11-30％；12-30％；15-25％；20-25％；20-30％；或21-24％；本發(fā)明油中亞油酸的適宜百分含量范圍也包括這樣的范圍其中下限選自下列百分?jǐn)?shù)10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30％；上限選自下列百分?jǐn)?shù)20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40％。
在這些其它實(shí)施例中，本發(fā)明油中亞麻酸的含量是10％或小于10％；9％或小于9％；8％或小于8％；7％或小于7％；6％或小于6％；5％或小于5％；4.5％或小于4.5％；4％或小于4％；3.5％或小于3.5％；3％或小于3％；2.5％或小于2.5％；2％或小于2％；或者是0.5-2％；0.5-3％；0.5-4.5％；0.5-6％；3-5％；3-6％；3-8％；1-2％；1-3％；或1-4％，在這些其它實(shí)施例中，本發(fā)明的油組合物中飽和脂肪酸的含量是15％或小于15％；14％或小于14％；13％或小于13％；12％或小于12％；11％或小于11％；10％或小于10％；9％或小于9％；8％或小于8％；7％或小于7％；6％或小于6％；5％或小于5％；4％或小于4％；3.6％或小于3.6％；或者是2-3％；2-3.6％；2-4％；2-8％；3-15％；3-10％；3-8％；3-6％；3.6-7％；5-8％；7-10％；10-15％。
本發(fā)明的油特別適合用作烹調(diào)和煎炸油，由于其降低的多不飽和脂肪酸含量使得本發(fā)明的油不需要典型油的進(jìn)一步工藝，因?yàn)槠錄]有討厭的氣味和有色的物質(zhì)。而且該油的低飽和脂肪酸含量改善了油的低溫流動(dòng)特性，而且避免了加熱儲(chǔ)存油以防結(jié)晶或固化的需要。改善的低溫流動(dòng)性還提高了當(dāng)煎炸食品離開煎炸油時(shí)油從煎炸食品材料內(nèi)的排出，因此獲得了低脂肪食品。參見Bouchon et al.，食物科學(xué)雜志，66918-923(2001)。該油中低水平的亞麻酸在煎炸中是特別有用的以降低異味。
該油也特別適合作為色拉油(在華氏40-50度冰箱內(nèi)能保持清澈的油)，由于其低飽和脂肪酸含量和適宜的亞油酸含量，其在冰箱溫度下具有改善的透明度，減少或降低了在其作為色拉油使用之前使其成為不凝固油的需要。
而且，該油的適宜的油酸含量和低亞麻酸含量使其非常適合用于生產(chǎn)起酥油(shortening)、人造黃油和其它半固體植物脂肪用于食品材料。這些脂肪的生產(chǎn)典型的包括不飽和油的氫化，例如大豆油、玉米油或蕓苔油。該油的提高的氧化穩(wěn)定性和風(fēng)味穩(wěn)定性是指它不需要進(jìn)一步的氫化，而其它傳統(tǒng)的植物油需要?dú)浠?dāng)其用于人造黃油和起酥油時(shí)，因而減少了工藝費(fèi)用和不利健康的反式異構(gòu)體的生成。
本發(fā)明的油也適宜用于給料(feedstock)以生產(chǎn)生物柴油，特別是因?yàn)橛么擞椭圃斓纳锊裼途哂懈纳频牡蜏亓鲃?dòng)性、改善的燃燒質(zhì)量(十六烷數(shù)目)、改善的氧化穩(wěn)定性和降低的氧化氮排放量。生物柴油是一種選擇性的柴油燃料通常包括飽和、單不飽和和多不飽和C16-C22脂肪酸的甲基酯。十六烷的數(shù)目是燃燒質(zhì)量的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)-十六烷數(shù)目越高，引擎中燃料的燃燒延遲時(shí)間越短。生物柴油燃料的ASTM標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則要求的最少十六烷數(shù)目是47。
在傳統(tǒng)的柴油發(fā)動(dòng)機(jī)中使用生物柴油與使用石油柴油燃料相比導(dǎo)致了污染物的實(shí)質(zhì)性減少例如硫酸鹽、一氧化碳、顆粒物質(zhì)，在校車上使用生物柴油能夠極大地減少孩子們暴露于有毒柴油尾氣中。限制使用100％傳統(tǒng)生物柴油作燃料是因?yàn)閭鹘y(tǒng)大豆生物柴油的濁點(diǎn)高(2℃)與2號(hào)柴油(-16℃)相比。參見Dunn et al.，油化學(xué)的最新研究進(jìn)展.，131-56(1997)。用本發(fā)明油制備的生物柴油有提高的(降低的)流點(diǎn)和冷濾點(diǎn)，也可以混合使用以改善生物柴油的低溫特性，該生物柴油由便宜的但高飽和的脂肪制成，例如動(dòng)物脂肪(動(dòng)物脂、豬油、雞脂肪)和棕櫚油。生物柴油也可以與石油柴油以任何比率混合。
生物柴油通常是通過提取、過濾和精練大豆油獲得以去除游離脂肪和磷脂，然后用甲醇對(duì)油進(jìn)行酯交換以形成脂肪酸甲酯，參見US No5,891,203。最終的大豆甲酯就是通常所指的“生物柴油”，本發(fā)明的油也可以用作沒有甲酯形成的柴油燃料，例如用乙縮醛與該油混合，參見US No 6,013,114。由于其改善的低溫流動(dòng)性和氧化穩(wěn)定性，本發(fā)明的油也適宜用作潤(rùn)滑劑和柴油燃料的添加劑，參見US Nos5,888,947；5,454,842；和4,557,734。
大豆，本發(fā)明的油也適宜用作各種豆制品，該豆制品由整個(gè)大豆制作，例如豆奶、大豆堅(jiān)果奶油、natto和tempeh，以及經(jīng)過加工的大豆和大豆油制作的豆制品，包括大豆、大豆粉、大豆蛋白濃縮物、大豆蛋白分離物、稠化的大豆蛋白濃縮物、氫化的大豆蛋白、植脂稀奶油、烹調(diào)油、色拉油、起酥油、卵磷脂。
整個(gè)大豆蛋白也是可食用的而且通常以未加工的方式、烤制的方式出售，或作為菜用大豆。通過浸泡、磨碎整個(gè)大豆的方法生產(chǎn)的豆奶在噴霧干燥后經(jīng)過加工形成大豆乳酸、大豆乳酪、豆腐或腐竹。該大豆或油能夠適用于這些和其它的豆制品因?yàn)樗母纳频难趸€(wěn)定性、降低的異味前體物質(zhì)和它的低飽和脂肪酸含量。
下列的實(shí)施例用于說明本發(fā)明但不做任何形式的限制。
實(shí)施例實(shí)施例1 抑制型構(gòu)建體1A FAD2-1構(gòu)建體FAD2-1A內(nèi)含子(SEQ ID NO1)以正義和反義的方向克隆入表達(dá)載體pCGN3892，該載體pCGN3892含有大豆7S啟動(dòng)子和豌豆rbcS3′，然后兩個(gè)基因融合物被分別連接到pCGN3892，含有CP4EPSPS基因的載體被FMV啟動(dòng)子調(diào)控，最終的表達(dá)構(gòu)建體(pCGN5469和pCGN5471)用于轉(zhuǎn)化大豆。
在質(zhì)粒pCGN5468(含有大豆7S啟動(dòng)子，在正義方向與FAD2-1A內(nèi)含子融合，和豌豆rbcS3′)或pCGN 5470(含有大豆7S啟動(dòng)子，在反義方向與FAD2-1A內(nèi)含子融合，和豌豆rbcS3′)中，F(xiàn)AD2-1B內(nèi)含子(SEQ ID NO2)分別在正義和反義方向與FAD2-1A內(nèi)含子的3′末端融合。然后，最終的內(nèi)含子重組融合體分別導(dǎo)入pCGN9372，一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4 EPSPS基因的載體，最終的表達(dá)構(gòu)建體(pCGN5485，F(xiàn)AD2-1A&FAD2-1B正義內(nèi)含子和pCGN5486，F(xiàn)AD2-1A&FAD2-1B反義內(nèi)含子)用于轉(zhuǎn)化大豆。
1B FAD3-1構(gòu)建體FAD3-1A內(nèi)含子#1、#2、#4和#5(分別為SEQ ID NOs7、8、10和11)，F(xiàn)AD3-1B內(nèi)含子#3C(SEQ ID NO23)和#4(SEQ IDNO24)在正義和反義方向分別導(dǎo)入pCGN3892。pCGN3892含有大豆7S啟動(dòng)子和豌豆rbcS3′，這些融合體連接到pCGN9372，一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的用于轉(zhuǎn)染大豆的CP4 EPSPS基因的載體，最終的表達(dá)構(gòu)建體(pCGN5455，F(xiàn)AD3-1A正義內(nèi)含子#4；pCGN5459，F(xiàn)AD3-1A反義內(nèi)含子#4；pCGN5456，F(xiàn)AD3正義內(nèi)含子#5；pCGN5460，F(xiàn)AD3-1A反義內(nèi)含子#5；pCGN5466，F(xiàn)AD3-1A反義內(nèi)含子#2；pCGN5473反義內(nèi)含子#1)用于大豆的轉(zhuǎn)染化1C FatB構(gòu)建體大豆的FATB內(nèi)含子II序列(SEQ ID NO30)以FATB部分基因組克隆作為模板通過PCR技術(shù)擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增按照如下程序操作1個(gè)循環(huán)，95℃10分鐘；25個(gè)循環(huán)，95℃30秒、62℃30秒、72℃30秒；1個(gè)循環(huán)，72℃7分鐘。PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)品長(zhǎng)854bp，在兩端點(diǎn)含有重新設(shè)計(jì)的限制位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物通過PCR引物5′末端的XhoI位點(diǎn)在正義方向直接克隆到表達(dá)試劑盒pCGN3892，Xhol位點(diǎn)與PCR引物的5′末端連接形成pMON70674，載體pCGN3892含有大豆的7S啟動(dòng)子和豌豆的rbcS3′，pMON70674然后被NotI切割并導(dǎo)入pMON41164，一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因的載體，最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，pMON70678，通過根癌農(nóng)桿菌方式用于轉(zhuǎn)化大豆。
建立兩個(gè)含有大豆FATB內(nèi)含子II序列(SEQ ID NO30)的其它表達(dá)構(gòu)建體，pMON70674用NotI切割并連接到pMON70675，含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4 EPSPS基因和由napin啟動(dòng)子調(diào)控的KASIV基因，最終形成pMON70680，表達(dá)載體pMON70680然后用SnaBI切割并與在正義方向由7S啟動(dòng)子調(diào)控的加州希蒙得木(jojoba)δ-9去飽和酶基因(SEQ ID NO41)的基因融合物相連，表達(dá)構(gòu)建體pMON70680和Pmon70681以根癌農(nóng)桿菌方式轉(zhuǎn)化大豆。
ID 重組構(gòu)建體建立含有第一組DNA序列的各種排列的表達(dá)構(gòu)建體。第一組DNA序列可以是那些描述過的任意序列或者是附圖5和6中列舉過的任一序列或者是其它組的DNA序列其含有正義和反義FAD2，F(xiàn)AD3和FATB非編碼區(qū)的任意組合以致它們能夠形成dsRNA構(gòu)建體、正義共抑制構(gòu)建體、反義構(gòu)建體或前述的各種組合。
附圖.5(a)-(c)描述了幾種第一組DNA序列，按照本發(fā)明它們能夠表達(dá)正義共抑制構(gòu)建體或反義構(gòu)建體，它們的非編碼序列描述于下表1和2中，非編碼序列可以是單一的序列、序列的重組(例如5′UTR與3′UTR連接)或上述的任意組合。為了表達(dá)正義共抑制構(gòu)建體，所有的非編碼序列都是正義序列，為了表達(dá)反義構(gòu)建體，所有的非編碼序列都是反義序列。附圖.5(d)描述了一種第一組DNA序列，按照本發(fā)明它能夠表達(dá)正義和反義構(gòu)建體。
附圖.6(a)-(c)描述了幾種第一組DNA序列，按照本發(fā)明它們能夠表達(dá)dsRNA構(gòu)建體或反義構(gòu)建體，它們的非編碼序列描述于下表1和2中，描述于附圖6中的第一組DNA序列含有幾對(duì)正義和反義序列，這些序列按一定順序排列以致，如由第一個(gè)正義序列表達(dá)的RNA能夠與由第一個(gè)反義序列表達(dá)的反義RNA形成一個(gè)雙鏈的RNA，例如，參考附圖6(a)和列舉的組合No.1(表1)，第一組DNA序列包含一個(gè)正義FAD2-1序列，一個(gè)正義FAD3-1序列，一個(gè)反義FAD2-1序列和一個(gè)反義FAD3-1序列，兩個(gè)反義序列相應(yīng)于正義序列以致第一組DNA序列的表達(dá)產(chǎn)物能夠彼此形成一個(gè)雙鏈RNA，正義序列通過一個(gè)間隔區(qū)序列可以從反義序列中分離出來，優(yōu)選的間隔區(qū)序列是能夠促進(jìn)dsRNA分子形成的序列，這些間隔區(qū)序列的實(shí)例包括在Wesleyet al.，supra，和Hamilton et al.，植物雜志.，15737-746(1988)中提出的序列，啟動(dòng)子是指在植物中有功能的任意啟動(dòng)子或任意的植物啟動(dòng)子。適宜啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例描述于詳細(xì)說明的D部分。
使用各種DNA操作技術(shù)將第一組DNA序列以正義或反義方向插入一個(gè)表達(dá)構(gòu)建體，如果適宜的限制性位點(diǎn)出現(xiàn)在DNA序列中，通過限制性內(nèi)切酶的消化和與構(gòu)建體連接的方式，該構(gòu)建體在一種或多種可獲得的克隆位點(diǎn)被消化，它們被插入到表達(dá)構(gòu)建體中；如果適宜的限制性位點(diǎn)沒有出現(xiàn)在DNA序列中，那么構(gòu)建體的DNA或者是DNA序列要通過各種有利于將DNA序列克隆到構(gòu)建體中的方式進(jìn)行修飾，修飾DNA的方式的實(shí)例包括PCR、合成接頭或適配子連接反應(yīng)、體外定點(diǎn)誘變、突出的5′或3′末端的補(bǔ)平或削平以及類似的方法。修飾DNA的這些以及其它方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。
表1

表2

實(shí)施例2 組合構(gòu)建體在附圖7-15中，啟動(dòng)子用箭頭表示，編碼序列(包括編碼區(qū)和非編碼區(qū))用五邊形表示，指向轉(zhuǎn)錄的方向，正義序列用正常的文本標(biāo)識(shí)，反義序列用顛倒的文本標(biāo)識(shí)。在這些附圖中所用的縮寫包括7Sa＝7Sa啟動(dòng)子；7Sa’＝7Sa’啟動(dòng)子；Br napin＝Brassica napin啟動(dòng)子；FMV＝FMV啟動(dòng)子；ARC＝arcelin啟動(dòng)子；RBCE93’＝Rubisco E9終止信號(hào)；Nos3’＝nos終止信號(hào)；TML3’＝tml終止信號(hào)；napin3’＝napin終止信號(hào)；‘3(在與FAD或FAT相同的盒里)＝3’UTR；5’(在與FAD或FAT相同的盒里)＝5’UTR；Cr＝Cuphea pulcherrima；Gm＝大豆；Rc＝蓖麻；FAB2＝硬脂酰去飽和酶基因的FAB2等位基因；以及Intr或Int＝內(nèi)含子2A dsRNA構(gòu)建體附圖7-9描述了本發(fā)明的核酸分子，其中第一組DNA序列能夠表達(dá)dsRNA構(gòu)建體，在附圖7-9中描述的第一組DNA序列包含數(shù)對(duì)相關(guān)的正義和反義序列并順序排列以致例如由第一正義序列表達(dá)的RNA能夠與第一反義序列表達(dá)的RNA形成雙鏈RNA，正義序列可以與反義序列相鄰也可以通過間隔區(qū)序列與反義序列分離開來，如附圖9所示。
第二組DNA序列包含編碼序列，每一個(gè)編碼序列是一個(gè)DNA序列，它所編碼的序列在被表達(dá)時(shí)能夠提高由選自KASI，KASIV，δ-9去飽和酶和CP4 EPSPS基因所組成的組的基因編碼的蛋白和轉(zhuǎn)錄物或者二者之一，每一個(gè)編碼序列都與一個(gè)啟動(dòng)子相連，該啟動(dòng)子可以是植物中有功能的任意啟動(dòng)子或者是任意的植物啟動(dòng)子，也可以是FMV啟動(dòng)子，napin啟動(dòng)子，7S(7Sa或7Sa’)啟動(dòng)子，arcelin啟動(dòng)子，δ-9去飽和酶啟動(dòng)子或者FAD2-1A啟動(dòng)子。
參看附圖7，大豆FAD2-1內(nèi)含子1(SEQ ID NO1或2)，F(xiàn)AD3-1A3′UTR(SEQ ID NO16)，和FATB 3′UTR(SEQ ID NO36)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物在正義和反義方向直接克隆，并通過一個(gè)可連接的大豆FAD3-1A內(nèi)含子5(SEQ ID NO11)分離開來，通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，該產(chǎn)物克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4 EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。含有由Brassica napin啟動(dòng)子調(diào)控的C.Pulcherrima KAS IV基因(SEQ ID NO39)和Brassicanapin 3′終止序列的載體和含有由大豆FAD2啟動(dòng)子調(diào)控的Rcommunis δ-9去飽和酶(FAB2)基因(SEQ ID NO40)和nos 3′終止序列的載體用適宜的限制性酶切割然后轉(zhuǎn)入pMON41164中，最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，pMON68539，描述于附圖7中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
大豆FAD2-1內(nèi)含子1(SEQ ID NO1或2)、FAD3-1A內(nèi)含子4(SEQ ID NO10)和FATB內(nèi)含子II(SEQ ID NO30)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)處包括再工程化的限制性位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物在正義和反義方向直接克隆，并通過一個(gè)可剪切的大豆FAD3-1A內(nèi)含子5(SEQ ID NO11)分離開來，通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，該產(chǎn)物克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后該載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E93′終止序列的載體。最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，pMON68540，描述于附圖7中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
大豆FAD2-1內(nèi)含子1(SEQ ID NO1或2)，F(xiàn)AD3-1A內(nèi)含子4(SEQ ID NO10)和FATB內(nèi)含子II(SEQ ID NO30)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物在正義和反義方向直接克隆，并通過一個(gè)可剪切的大豆FAD3-1A內(nèi)含子5(SEQ ID NO11)分離開來，通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，該產(chǎn)物克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后載體被NotI切割并轉(zhuǎn)pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E93′終止序列的載體。含有由Brassica napin啟動(dòng)子調(diào)控的C.Pulcherrima KAS IV基因(SEQ ID NO39)和Brassica napin 3′終止序列的載體用適宜的限制性酶切割然后轉(zhuǎn)入pMON41164中，最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，pMON68544，描述于附圖7中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
大豆FAD2-1內(nèi)含子1(SEQ ID NO1或2)，F(xiàn)AD3-1A內(nèi)含子4(SEQID NO10)，F(xiàn)ATB內(nèi)含子II(SEQ ID NO30)和FAD3-1B內(nèi)含子4(SEQID NO24)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物在正義和反義方向直接克隆，并通過一個(gè)可剪切的大豆FAD3-1A內(nèi)含子5(SEQ ID NO11)分離開來，通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，該產(chǎn)物克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。含有由Brassica napin啟動(dòng)子調(diào)控的C.Pulcherrima KAS IV基因(SEQ ID NO39)和Brassica napin 3′終止序列的載體用適宜的限制性酶切割然后轉(zhuǎn)入pMON41164中，最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，pMON68544，描述于附圖7中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
大豆FAD2-1內(nèi)含子1(SEQ ID NO1或2)，F(xiàn)AD3-1A內(nèi)含子4(SEQID NO10)，F(xiàn)ATB內(nèi)含子II(SEQ ID NO30)和FAD3-1B內(nèi)含子4(SEQID NO24)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物在正義和反義方向直接克隆，并通過一個(gè)可剪切的大豆FAD3-1A內(nèi)含子5(SEQ ID NO11)分離開來，通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，該產(chǎn)物克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，pMON68546，描述于附圖7中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
參看附圖8，大豆FAD2-1內(nèi)含子1(SEQ ID NO1或2)，F(xiàn)AD3-1A3′UTR(SEQ ID NO16)，和FATB 3′UTR(SEQ ID NO36)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物在正義和反義方向直接克隆，并通過一個(gè)可剪切的大豆FAD3-1A內(nèi)含子5(SEQ ID NO11)分離開來，該產(chǎn)物通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml3′終止序列的載體中，然后載體被NotI切割并轉(zhuǎn)pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E93′終止序列的載體。最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，pMON68536，描述于附圖8中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
大豆FAD2-1內(nèi)含子1(SEQ ID NO1或2)，F(xiàn)AD3-1A 3′UTR(SEQID NO16)，和FATB 3′UTR(SEQ ID NO36)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物在正義和反義方向直接克隆，并通過一個(gè)可剪切的大豆FAD3-1A內(nèi)含子5(SEQ ID NO11)分離開來，通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，該產(chǎn)物克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，含有由大豆FAD2啟動(dòng)子調(diào)控的R communis δ-9去飽和酶(FAB2)基因(SEQ ID NO40)和nos 3′終止序列的載體用適宜的限制性酶切割并連接到tml 3′終止序列的上游，然后載體用NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，pMON68537，描述于附圖8中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
大豆FAD2-1內(nèi)含子1(SEQ ID NO1或2)，F(xiàn)AD3-1A 3′UTR(SEQID NO16)，和FATB 3′UTR(SEQ ID NO36)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物在正義和反義方向直接克隆，并通過一個(gè)可剪切的大豆FAD3-1A內(nèi)含子5(SEQ ID NO11)分離開來，通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，該產(chǎn)物克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。含有由Brassica napin啟動(dòng)子調(diào)控的C.pulcherrimaKAS IV基因和Brassica napin3′終止序列的載體用適宜的限制性酶切割然后轉(zhuǎn)入到pMON41164，最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，pMON68538，描述于附圖8中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
參看附圖9，大豆FAD2-1 3′UTR(SEQ ID NO5)，F(xiàn)ATB 3′UTR(SEQ ID NO36)，F(xiàn)AD3-1A 3′UTR(SEQ ID NO16)，和FAD 3-1B3′UTR(SEQ ID NO26)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物在正義和反義方向直接克隆，并通過一個(gè)可剪切的大豆FAD3-1A內(nèi)含子5(SEQ IDNO11)分離開來，通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，該產(chǎn)物克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，pMON80622，描述于附圖9中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
大豆FAD2-1 3′UTR(SEQ ID NO5)，F(xiàn)ATB 3′UTR(SEQ ID NO36)和FAD3-1A3′UTR(SEQ ID NO16)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物在正義和反義方向直接克隆，并通過一個(gè)可剪切的大豆FAD3-1A內(nèi)含子5(SEQ ID NO11)分離開來，通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，該產(chǎn)物克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，pMON80623，描述于附圖9中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
大豆FAD2-1 5′UTR-3′UTR(SEQ ID NOs6和5，連接在了一起)，F(xiàn)ATB 5′UTR-3′UTR(SEQ ID NOs37和36，連接在了一起)，F(xiàn)AD3-1A3′UTR(SEQ ID NO16)，和FAD3-1B5′UTR-3′UTR(SEQ IDNOs27和26，連接在一起)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，PCR產(chǎn)物在正義和反義方向直接克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，05，描述于附圖9中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
大豆FAD2-1 5′UTR-3′UTR(SEQ ID NOs6和5，連接在了一起)，F(xiàn)ATB5′UTR-3′UTR(SEQ ID NOs37和36，連接在了一起)，F(xiàn)AD3-1A3′UTR(SEQ ID NO16)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，PCR產(chǎn)物在正義和反義方向直接克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。含有由Brassica napin啟動(dòng)子調(diào)控的C.pulcherrima KAS IV基因(SEQ ID NO39)和Brassicanapin3′終止序列的載體用適宜的限制性酶切割然后轉(zhuǎn)入到pMON41164，最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，06，描述于附圖9中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
2B 正義共抑制構(gòu)建體附圖10-13描述了本發(fā)明的核酸分子，其中第一組DNA序列能夠表達(dá)正義共抑制構(gòu)建體。第二組DNA序列包含編碼序列，每一個(gè)編碼序列都是DNA序列，當(dāng)其所編碼的序列在被表達(dá)時(shí)能夠提高由選自KASI，KASIV，δ-9去飽和酶和CP4 EPSPS基因所組成的組的基因編碼的蛋白和轉(zhuǎn)錄物或者二者之一，每一個(gè)編碼序列都與一個(gè)啟動(dòng)子相連，該啟動(dòng)子可以是植物中有功能的任意啟動(dòng)子或者是任意的植物啟動(dòng)子，也可以是FMV啟動(dòng)子，napin啟動(dòng)子，7S(7Sa或7Sa’)啟動(dòng)子，arcelin啟動(dòng)子，δ-9去飽和酶啟動(dòng)子或者FAD2-1A啟動(dòng)子。
參看如圖10，大豆FAD2-1內(nèi)含子1(SEQ ID NO1或2)，F(xiàn)AD3-1C內(nèi)含子4(SEQ ID NO14)，F(xiàn)ATB內(nèi)含子II(SEQ ID NO30)，F(xiàn)AD3-1A內(nèi)含子4(SEQ ID NO10)，和FAD3-1B內(nèi)含子4(SEQ ID NO24)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，PCR產(chǎn)物在正義方向直接克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和豌豆Rubisco E93′終止序列的載體中，然后載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，pMON68522，描述于附圖10中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
大豆FAD2-1內(nèi)含子1(SEQ ID NO1或2)，F(xiàn)AD3-1A內(nèi)含子4(SEQ ID NO10)，F(xiàn)AD3-1B內(nèi)含子4(SEQ ID NO24)和FATB內(nèi)含子II(SEQ ID NO30)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物在正義方向直接通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。含有由Brassica napin啟動(dòng)子調(diào)控的C.Pulcherrima KAS IV基因(SEQ ID NO39)和Brassicanapin 3′終止序列的載體和含有由大豆FAD2啟動(dòng)子調(diào)控的Rcommunis δ-9去飽和酶(FAB2)基因(SEQ ID NO40)和nos 3′終止序列的載體用適宜的限制性酶切割然后轉(zhuǎn)入pMON41164中，最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，pMON80614，描述于附圖10中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
大豆FAD2-1內(nèi)含子1(SEQ ID NO1或2)，F(xiàn)AD3-1A3′UTR(SEQID NO16)和FATB3′UTR(SEQ ID NO36)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物在正義方向直接通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，pMON68531，描述于附圖10中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
大豆FAD2-1內(nèi)含子1(SEQ ID NO1或2)，F(xiàn)AD3-1A3′UTR(SEQID NO16)和FATB3′UTR(SEQ ID NO36)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，PCR產(chǎn)物在正義方向直接克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。含有由Brassica napin啟動(dòng)子調(diào)控的C.Pulcherrima KAS IV基因(SEQ ID NO39)和Brassica napin 3′終止序列的載體和含有由大豆FAD2啟動(dòng)子調(diào)控的Rcommunis δ-9去飽和酶(FAB2)基因(SEQ ID NO40)和nos 3′終止序列的載體用適宜的限制性酶切割然后轉(zhuǎn)入pMON41164中，最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，pMON68534，描述于附圖10中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
大豆FAD2-1內(nèi)含子1(SEQ ID NO1或2)，F(xiàn)AD3-1A 3′UTR(SEQID NO16)和FATB3′UTR(SEQ ID NO36)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，PCR產(chǎn)物在正義方向直接克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4 EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。一個(gè)含有由大豆FAD2啟動(dòng)子調(diào)控的Rcommunis δ-9去飽和酶(FAB2)基因(SEQ IDNO40)和nos 3′終止序列的載體用適宜的限制性酶切割然后轉(zhuǎn)入pMON41164中，最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，pMON68535，描述于附圖10中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
參看附圖11，大豆FAD2-13’UTR(SEQ ID NO5)，F(xiàn)AD3-1A3′UTR(SEQ ID NO16)和FATB 3′UTR(SEQ ID NO36)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，PCR產(chǎn)物在正義方向直接克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml3′終止序列的載體中，然后載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，Pmon80605，描述于附圖11中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
大豆FAD2-13′UTR(SEQ ID NO5)，F(xiàn)AD3-1A3′UTR(SEQ ID NO16)和FATB3′UTR(SEQ ID NO36)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，PCR產(chǎn)物在正義方向直接克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。一個(gè)含有由Brassica napin啟動(dòng)子調(diào)控的C.Pulcherrima KAS IV基因(SEQ ID NO39)和Brassica napin 3′終止序列的載體用適宜的限制性酶切割然后轉(zhuǎn)入pMON41164中，最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，PMON80606，描述于附圖11中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
大豆FAD2-1 3′UTR(SEQ ID NO5)，F(xiàn)AD3-1A3′UTR(SEQ ID NO16)和FATB3′UTR(SEQ ID NO36)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，PCR產(chǎn)物在正義方向直接克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。一個(gè)含有由大豆FAD2啟動(dòng)子調(diào)控的Rcommunis δ-9去飽和酶(FAB2)基因(SEQ ID NO40)和nos3′終止序列的載體用適宜的限制性酶切割然后轉(zhuǎn)入pMON41164中，最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，PMON80607，描述于附圖11中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
大豆FAD2-1 3′UTR(SEQ ID NO5)，F(xiàn)AD3-1A 3′UTR(SEQ ID NO16)和FATB3′UTR(SEQ ID NO36)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，PCR產(chǎn)物在正義方向直接克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。含有由Brassica napin啟動(dòng)子調(diào)控的C.Pulcherrima KAS IV基因(SEQ ID NO39)和Brassicanapin3′終止序列的載體和含有由大豆FAD2啟動(dòng)子調(diào)控的Rcommunis δ-9去飽和酶(FAB2)基因(SEQ ID NO40)和nos 3′終止序列的載體用適宜的限制性酶切割然后轉(zhuǎn)入pMON41164中，最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，pMON80614，描述于附圖11中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
參考附圖12，大豆FAD2-1 3′UTR(SEQ ID NO5)，F(xiàn)ATB 3′UTR(SEQ ID NO36)和FAD3-1A 3′UTR(SEQ ID NO16)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，PCR產(chǎn)物在正義方向直接克隆到含有大豆7Sα啟動(dòng)子和tml3′終止序列的載體中，然后載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，pMON80629，描述于附圖12中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
大豆FAD2-1內(nèi)含子1(SEQ ID NO1或2)，F(xiàn)AD3-1A內(nèi)含子4(SEQ ID NO10)，F(xiàn)ATB內(nèi)含子II(SEQ ID NO30)和FAD3-1A內(nèi)含子4(SEQ ID NO10)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，PCR產(chǎn)物在正義方向直接克隆到含有大豆7Sα啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，pMON81902，描述于附圖12中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
大豆FAD2-1 5′UTR-3′UTR(SEQ ID NOs6和5，連接在一起)，F(xiàn)AD3-1 5′UTR-3′UTR(SEQ ID NOs17和16連接在一起，或者27和26連接在一起)，F(xiàn)ATB 5′UTR-3′UTR(SEQ ID NOs37和36連接在一起)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物在正義方向直接通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，相似地，F(xiàn)AD3-1PCR產(chǎn)物在正義方向直接通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法克隆到含有大豆7Sα啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，F(xiàn)ATB PCR產(chǎn)物在正義方向直接克隆到含有arcelin啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后這些載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，01，描述于附圖12中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
大豆FAD2-1 5′UTR-3′UTR(SEQ ID NOs6和5，連接在一起)，F(xiàn)AD3-1 5′UTR-3′UTR(SEQ ID NOs17和16連接在一起，或者27和26連接在一起)，F(xiàn)ATB5′UTR-3′UTR(SEQ ID NOs37和36連接在一起)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法FAD2-1PCR產(chǎn)物在正義方向直接克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，相似地，通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，F(xiàn)AD3-1PCR產(chǎn)物在正義方向直接克隆到含有大豆7Sα啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，F(xiàn)ATB PCR產(chǎn)物在正義方向直接克隆到含有arcelin啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后這些載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。一個(gè)含有由Brassicanapin啟動(dòng)子調(diào)控的C.Pulcherrima KAS IV基因(SEQ ID NO39)和Brassica napin 3′終止序列的載體用適宜的限制性酶切割然后轉(zhuǎn)入pMON41164中，最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，02，描述于附圖12中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
參看附圖13，大豆FAD2-1 5′UTR-3′UTR(SEQ ID NOs6和5，連接在一起)，F(xiàn)ATB5′UTR-3′UTR(SEQ ID NOs37和36連接在一起)，F(xiàn)AD3-1A3′UTR(SEQ ID NO16)和FAD3-1B5′UTR-3′UTR(SEQID Nos27和26連接在一起)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，PCR產(chǎn)物在正義方向直接克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后這些載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。一個(gè)含有由Brassicanapin啟動(dòng)子調(diào)控的C.Pulcherrima KAS IV基因(SEQ ID NO39)和Brassica napin 3′終止序列的載體用適宜的限制性酶切割然后轉(zhuǎn)入pMON41164中。最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，07，描述于附圖13中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
大豆FAD2-1內(nèi)含子1(SEQ ID NO1或2)通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，PCR產(chǎn)物在正義方向直接克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中。大豆FATB5′UTR-3′UTR(SEQ ID NOs37和36連接在一起)，F(xiàn)AD3-1A 3′UTR(SEQ ID NO16)和FAD3-1B5′UTR-3′UTR(SEQ ID Nos27和26連接在一起)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，PCR產(chǎn)物在正義方向直接克隆到含有大豆7Sα啟動(dòng)子和tml3′終止序列的載體中，然后這些載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E93′終止序列的載體。一個(gè)含有由Brassica napin啟動(dòng)子調(diào)控的C.Pulcherrima KAS IV基因(SEQ ID NO39)和Brassica napin 3′終止序列的載體用適宜的限制性酶切割然后轉(zhuǎn)入pMON41164中，最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，09，描述于附圖13中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
2C 反義構(gòu)建體附圖14描述了本發(fā)明的核酸分子，其中第一組DNA序列能夠表達(dá)反義構(gòu)建體，附圖15描述了本發(fā)明的核酸分子，其中第一組DNA序列能夠表達(dá)正義和反義構(gòu)建體的組合。第二組DNA序列包含編碼序列，每一個(gè)編碼序列是一個(gè)DNA序列，它所編碼的序列在被表達(dá)時(shí)能夠提高由選自KASI，KASIV，δ-9去飽和酶和CP4 EPSPS基因所組成的組的基因編碼的蛋白和轉(zhuǎn)錄物或者二者之一，每一個(gè)編碼序列都與一個(gè)啟動(dòng)子相連，該啟動(dòng)子可以是植物中有功能的任意啟動(dòng)子或者是任意的植物啟動(dòng)子，也可以是FMV啟動(dòng)子，napin啟動(dòng)子，7S(7Sa或7Sa’)啟動(dòng)子，arcelin啟動(dòng)子，δ-9去飽和酶啟動(dòng)子或者FAD2-1A啟動(dòng)子。
參看附圖14，大豆FAD2-1 3′UTR(SEQ ID NO5)，F(xiàn)ATB 3′UTR(SEQ ID NO36)，F(xiàn)AD3-1A 3′UTR(SEQ ID NO16)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，PCR產(chǎn)物在反義方向直接克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后這些載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，pMON80615，描述于附圖14中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
大豆FAD2-1 3′UTR(SEQ ID NO5)，F(xiàn)ATB 3′UTR(SEQ ID NO36)，F(xiàn)AD3-1A 3′UTR(SEQ ID NO16)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，PCR產(chǎn)物在反義方向直接克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后這些載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。一個(gè)含有由Brassicanapin啟動(dòng)子調(diào)控的C.Pulcherrima KAS IV基因(SEQ ID NO39)和Brassica napin 3′終止序列的載體用適宜的限制性酶切割然后轉(zhuǎn)入pMON41164中，最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，pMON80616，描述于附圖14中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
大豆FAD2-1 3′UTR(SEQ ID NO5)，F(xiàn)ATB3′UTR(SEQ ID NO36)和FAD3-1A3′UTR(SEQ ID NO16)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，PCR產(chǎn)物在反義方向直接克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后這些載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。一個(gè)含有由大豆FAD2啟動(dòng)子調(diào)控的R communis δ-9去飽和酶(FAB2)基因(SEQ IDNO40)和nos3′終止序列的載體用適宜的限制性酶切割然后轉(zhuǎn)入pMON41164中，最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，pMON80617，描述于附圖14中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
大豆FAD2-1 3′UTR(SEQ ID NO5)，F(xiàn)ATB3′UTR(SEQ ID NO36)和FAD3-1A3′UTR(SEQ ID NO16)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，PCR產(chǎn)物在反義方向直接克隆到含有大豆7Sα啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后該載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，pMON80630，描述于附圖14中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
大豆FAD2-15′UTR-3′UTR(SEQ ID NOs6和5，連接在一起)，F(xiàn)ATB5′UTR-3′UTR(SEQ ID NOs37和36連接在一起)，F(xiàn)AD3-1A3′UTR(SEQ ID NO16)和FAD3-1B5′UTR-3′UTR(SEQ ID Nos27和26連接在一起)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，PCR產(chǎn)物在正義方向直接克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，然后該載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E93′終止序列的載體。一個(gè)含有由Brassica napin啟動(dòng)子調(diào)控的C.Pulcherrima KAS IV基因(SEQ ID NO39)和Brassica napin 3′終止序列的載體用適宜的限制性酶切割然后轉(zhuǎn)入pMON41164中最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，08，描述于附圖14中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
參看附圖15，大豆FAD2-1 5′UTR-3′UTR(SEQ ID NOs6和5，連接在一起)，F(xiàn)AD3-1A5′UTR-3′UTR(SEQ ID NOs17和16連接在一起)和FATB 5′UTR-3′UTR(SEQ ID NOs37和36連接在一起)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，PCR產(chǎn)物在正義和反義方向直接克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，額外的大豆7Sα啟動(dòng)子位于正義和反義序列之間，然后該載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，03，描述于附圖15中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
大豆FAD2-15′UTR-3′UTR(SEQ ID NOs6和5，連接在一起)，F(xiàn)AD3-1A5′UTR-3′UTR(SEQ ID NOs27和26連接在一起)和FATB5′UTR-3′UTR(SEQ ID NOs37和36連接在一起)序列通過PCR擴(kuò)增形成PCR產(chǎn)物，該產(chǎn)物在兩個(gè)端點(diǎn)都包含再工程化的限制性位點(diǎn)。通過將XhoI位點(diǎn)設(shè)計(jì)到PCR引物5′末端的方法，PCR產(chǎn)物在正義和反義方向直接克隆到含有大豆7Sα’啟動(dòng)子和tml 3′終止序列的載體中，額外的大豆7Sα啟動(dòng)子位于正義和反義序列之間，然后該載體被NotI切割并轉(zhuǎn)入pMON41164中，即一個(gè)含有由FMV啟動(dòng)子調(diào)控的CP4EPSPS基因和豌豆Rubisco E9 3′終止序列的載體。一個(gè)含有由Brassica napin啟動(dòng)子調(diào)控的C.Pulcherrima KAS IV基因(SEQ ID NO39)和Brassica napin 3′終止序列的載體用適宜的限制性酶切割然后轉(zhuǎn)入pMON41164中，最終的基因表達(dá)構(gòu)建體，04，描述于附圖15中并采用本文所描述的方法用于轉(zhuǎn)化。
如上所述的核酸分子是優(yōu)選的實(shí)施方案，能夠獲得本發(fā)明的目的、特點(diǎn)和益處，但是這并不意味著本發(fā)明僅限于列舉的實(shí)施方案。第一組和第二DNA序列的核酸排列方式并不限于所列舉和所描述的排列方式，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的、特點(diǎn)和益處可以以任意適宜的方式改變，這種改變列舉于相應(yīng)的附圖中以及概括于權(quán)利要求中。
實(shí)施例3 植物轉(zhuǎn)化與分析通過前述的方法包括McCabe et al.，生物/技術(shù)，6923-926(1988)或土壤桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，實(shí)施例1和2的構(gòu)建體被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)入大豆(如Asgrow品種A4922或Asgrow品種A3244或Asgrow品種A3525)。轉(zhuǎn)化的大豆植物通過在含有草甘膦的培養(yǎng)基上選擇來鑒定，來自于用構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的大豆品系種子的脂肪酸組合物用氣相色譜分析。此外這些構(gòu)建體中的任何一個(gè)可以含有其它有興趣的序列以及啟動(dòng)子的不同組合。
對(duì)于某些用途，在發(fā)育的種子中檢測(cè)改進(jìn)的脂肪酸組合物，而在其它情況下，例如油組合物的分析，脂肪酸改進(jìn)的檢測(cè)在FAS途徑晚期進(jìn)行，或?qū)χ舅峤M合物較小改進(jìn)的檢測(cè)，優(yōu)選對(duì)成熟種子來源的脂肪酸或油進(jìn)行分析，進(jìn)一步優(yōu)選特定種子的油和/或脂肪酸含量的分析，特別是檢測(cè)分離的R1種子中油的改進(jìn)。在本文中，R0是指經(jīng)本文所描述的轉(zhuǎn)化/再生過程發(fā)育的植物和種子，R1是指由轉(zhuǎn)基因R0種子發(fā)育的植物和種子。
用實(shí)施例2的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的大豆品系種子中脂肪酸組合物的確定。將轉(zhuǎn)基因大豆組和對(duì)照大豆組的各1/10種子用組織勻漿器(ProScientific)分別進(jìn)行研磨以進(jìn)行油提取，來自研磨大豆種子的油用1.5ml含有triheptadecanoin(0.50mg/ml)的正庚烷提取，過夜，200ul的提取油的等分部分通過在純甲醇中添加500μl甲醇鈉衍生為甲基酯。衍生反應(yīng)在50℃進(jìn)行20分鐘，同時(shí)加入500μl 10％(w/v)氯化鈉和400μl正庚烷終止反應(yīng)，用正庚烷提取的終產(chǎn)物脂肪酸甲酯在Hewlett-Packard 6890GC型(Palo Alto，CA)上通過氣相層析法(GC)進(jìn)行分離，GC配有Supelcowax 250柱(30m，0.25mm id，0.25微米膜厚)(Supelco，Bellefonte，PA)。柱溫在注入時(shí)為175℃，溫度以40℃/min的速度從175℃升到245℃然后降回175℃。注入器和檢測(cè)器的溫度分別為250℃和270℃。
實(shí)施例4 具有改進(jìn)的生物柴油特性的合成燃料油制備含有下列脂肪酸甲酯混合物的合成燃油肪酸組合物73.3％油酸，21.4％亞油酸，2.2％棕櫚酸，2.1％亞麻酸和1.0％硬脂酸(都以重量計(jì))。純化的脂肪酸甲酯購(gòu)自Nu-Chek Prep，Inc.，Elysian，MN，USA，組合物中十六烷的數(shù)目和燃燒延遲時(shí)間由Southwest研究所通過燃燒質(zhì)量測(cè)試器(“IQT”)613(Southwest研究所，San Antonio，Texas，USA)測(cè)試。
IQT由一個(gè)電子加熱的恒定容量燃燒室，一個(gè)燃油注入系統(tǒng)和一個(gè)用于控制操作過程、記錄資料和提供對(duì)該資料進(jìn)行解釋的計(jì)算機(jī)組成。燃油注入系統(tǒng)包括一個(gè)燃油注入噴嘴，該噴嘴形成進(jìn)入燃燒室的入口，燃油噴嘴中的一個(gè)針狀升降感受器探測(cè)進(jìn)入燃燒室的燃油流速，連接到燃燒室上的一個(gè)壓力轉(zhuǎn)換器檢測(cè)汽缸壓力和燃燒室內(nèi)的壓力。IQT的基本功能是檢測(cè)從燃油注入燃燒室開始至燃燒開始的時(shí)間，燃燒室內(nèi)的熱力學(xué)條件被精確控制以提供對(duì)燃燒延遲時(shí)間的連續(xù)測(cè)量。
對(duì)于十六烷數(shù)量和燃燒延遲時(shí)間的檢測(cè)，將被測(cè)燃油用5微米的濾器過濾，燃油貯池、注入管道和噴嘴都用霧化氮?dú)馇逑矗加唾A池然后用無紡絨布擦試，一部分被測(cè)燃油用于注滿燃油貯池、注入管道和噴嘴，貯池用被測(cè)燃油充滿并將所有氣體從系統(tǒng)排出，貯池加壓至50psig，該方法基本由在高壓下注入燃燒室數(shù)量精確的被測(cè)燃油組成，燃燒室通過空氣控制達(dá)到理想的壓力和溫度。檢測(cè)過程由決定燃油注入開始至燃燒開始之間的時(shí)間組成，即通常所述的燃燒延遲時(shí)間。這種決定基于所測(cè)的針升降和燃燒室的壓力，通常的十六烷評(píng)定程序要求設(shè)定殼溫為567.5℃，氣體壓力為2.1Mpa。
在操作開始之日，使已知注入延遲的燃油在IQT燃燒瓶中運(yùn)行，以確保設(shè)備在正常參數(shù)運(yùn)行。然后運(yùn)行被測(cè)的合成燃油，最后再運(yùn)行已知燃油以驗(yàn)證該系統(tǒng)沒有發(fā)生變化。一旦燃油貯池與燃油注入泵相連，PC控制器的測(cè)試程序便開始運(yùn)行，該計(jì)算機(jī)控制著所有的程序包括空氣的充填、燃油的注入和廢氣的排放，燃燒實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行32次。
燃燒延遲時(shí)間是指從燃油注入開始至燃燒開始之間的時(shí)間，該延遲時(shí)間由針升降和氣缸內(nèi)的壓力參數(shù)決定。注入針的升起作為注入開始的信號(hào)，由于燃油氣化的冷卻效應(yīng)，會(huì)使得氣缸壓力輕微下降。燃燒開始被定義為氣缸壓力的恢復(fù)時(shí)間-由于燃燒壓力升高至燃油注入之前的壓力。
然后根據(jù)整合到數(shù)據(jù)采集和壓縮軟件中的校準(zhǔn)曲線，用所測(cè)的燃燒延遲時(shí)間來決定十六烷數(shù)量。校準(zhǔn)曲線，由作為燃燒延遲時(shí)間函數(shù)的十六烷數(shù)量組成，是通過使用基本參照燃油和NEG檢測(cè)燃油的混合物獲得。關(guān)于被測(cè)燃油其在環(huán)境溫度下是液體，校準(zhǔn)曲線以至少一種已知十六烷數(shù)量的檢測(cè)燃油為日?；鶞?zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)(Ryan，“燃燒延遲的理化特性與十六烷數(shù)量的相關(guān)性”，SAE Paper 852103(1985)；Ryan，“由常規(guī)容量燃燒高壓瓶決定的柴油燃燒特性”，SAE Paper870586(1986)；Ryan，“便攜式燃油十六烷″品質(zhì)監(jiān)測(cè)器的發(fā)展”，Belvoir Fuels and Lubricants Research Facility Report No.227，五月(1992)；Ryan，“用于柴油點(diǎn)燃和燃燒的引擎和常規(guī)容量瓶的研究”，SAE Paper 881616(1988)；和Allard et al.，“由燃燒質(zhì)量檢測(cè)器(“IQT”)決定的柴油燃燒質(zhì)量”，SAE Paper 961182(1996)。在表3中，合成油組合物顯示了其適宜作為生物柴油使用的十六烷數(shù)量和燃燒延遲時(shí)間，但并不限于此。
表3

1名稱為Check-High的燃油是一校準(zhǔn)燃油，它的十六烷數(shù)量是49.3±0.5，在合成的測(cè)試燃油運(yùn)行前后要用該校準(zhǔn)燃油來校正。
用ASTM D程序測(cè)定合成油的密度(ASTM D-4052)、濁點(diǎn)(ASTMD-2500)、流點(diǎn)(ASTM D-97)和冷凝點(diǎn)(IP309/ASTM D-6371)，ASTM D程序購(gòu)自ASTM，100 Barr Harbor Drive，West Conshohocken，PA，USA。這些測(cè)試結(jié)果列于表4，在表4中列舉了合成油組合物適宜作為生物柴油的數(shù)據(jù)，但不限于此。
表4

通過計(jì)算基于生物的燃料的不飽和水平來估算氮氧化物排放水平，即通過測(cè)量燃油密度間接計(jì)算估計(jì)的排放水平或直接測(cè)量估計(jì)的排放水平。也有可獲得的標(biāo)準(zhǔn)程序來直接測(cè)量氧化氮的排放水平。據(jù)估計(jì)合成油與由傳統(tǒng)的大豆油制備的脂肪酸甲基酯相比有較低的氧化氮排放水平，這種估計(jì)是基于合成油中所有的不飽和物的水平。油雙鍵的含量越高，例如不飽和程度越高，氮氧化物排放率越高，有123個(gè)雙鍵的油與含有153個(gè)雙鍵的傳統(tǒng)大豆油的比較列于表5。
表5

據(jù)國(guó)家再生能源委員會(huì)，合同No ACG-8-17106-02最后報(bào)告生物柴油組合物對(duì)ADDC系列60柴油引擎排放率的影響，(2000-06)，生物柴油組合物的硝酸排放率通過公式y(tǒng)＝46.959x-36.388來估計(jì)，其中y是氧化物排放率克/brake馬力小時(shí)；x是生物柴油的密度。該公式基于在包括16種生物柴油的檢測(cè)時(shí)硝酸排放率的回歸分析，檢測(cè)使用1991標(biāo)度，生產(chǎn)系列60型Detroit柴油公司發(fā)動(dòng)機(jī)。
合成油的密度由Southwest研究所通過ASTM D4052方法測(cè)定，表4中的結(jié)果用于上述方程式中以預(yù)測(cè)硝酸排放值4.89g/bhp-h，這一結(jié)果與對(duì)照的大豆油進(jìn)行比較，國(guó)家再生能源委員會(huì)的報(bào)告給出了對(duì)照組大豆生物柴油(甲基大豆酯IGT)的密度和硝酸排放率，對(duì)照生物柴油的密度是0.8877g/mL，同時(shí)給出了計(jì)算出的硝酸排放率5.30g/bhp-h，這個(gè)計(jì)算的排放值與硝酸排放的實(shí)驗(yàn)值5.32g/bhp-h相似，與對(duì)照組相比，合成油組合物顯示了改進(jìn)的數(shù)值，適于用作生物柴油，但不限于此。
實(shí)施例5 獲得健康血清脂質(zhì)水平的最適宜脂肪酸組成通過具有膽固醇降低特性的植物組成來鑒定與傳統(tǒng)大豆油相比對(duì)血脂水平具有較好效果的脂肪酸組成(例如較低的LDL-膽固醇和較高的HDL膽固醇)，基于27個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)的公布方程用于比較使用新油組合物者和使用傳統(tǒng)大豆油者血清脂質(zhì)水平。
表6顯示了血脂水平的變化結(jié)果，其中30％的來自于碳水化合物的食物能量用脂類代替，結(jié)果表明在飲食中當(dāng)用大豆油代替碳水化合物時(shí)，在血脂水平方面具有令人滿意的效果。這種血脂組成的改進(jìn)可能是由于降低了飽和脂肪酸含量，使總脂肪酸中亞油酸含量達(dá)到10-30％，優(yōu)選約15-25％。當(dāng)亞油酸的含量低于總脂肪酸的10％時(shí)，與對(duì)照大豆油相比新組合物能夠提高LDL-膽固醇，即使飽和脂肪酸的含量降低至總脂肪酸的5％。當(dāng)亞油酸的比率升高時(shí)，組合物提高血清HDL水平的能力降低，因此優(yōu)選的亞油酸成分約占總脂肪酸含量的15-25％。
表6

序列表<110>孟山都技術(shù)有限公司<120>核酸構(gòu)建體及其生產(chǎn)改良的種子油組合物的方法<130>16518.098<150>US 60/365,794<151>2002-03-21<150>US 60/390,185<151>2002-06-21<160>41<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>420<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FAD2-1A內(nèi)含子1<400>1gtaaattaaa ttgtgcctgc acctcgggat atttcatgtg gggttcatca tatttgttga 60ggaaaagaaa ctcccgaaat tgaattatgc atttatatat cctttttcat ttctagattt120cctgaaggct taggtgtagg cacctagcta gtagctacaa tatcagcact tctctctatt180gataaacaat tggctgtaat gccgcagtag aggacgatca caacatttcg tgctggttac240tttttgtttt atggtcatga tttcactctc tctaatctct ccattcattt tgtagttgtc300attatcttta gatttttcac tacctggttt aaaattgagg gattgtagtt ctgttggtac360atattacaca ttcagcaaaa caactgaaac tcaactgaac ttgtttatac tttgacacag420<210>2<211>405<212>DNA
<211>405<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FAD2-1B內(nèi)含子1<400>2gtatgatgct aaattaaatt gtgcctgcac cccaggatat ttcatgtggg attcatcatt 60tattgaggaa aactctccaa attgaatcgt gcatttatat tttttttcca tttctagatt120tcttgaaggc ttatggtata ggcacctaca attatcagca cttctctcta ttgataaaca180attggctgta ataccacagt agagaacgat cacaacattt tgtgctggtt accttttgtt240ttatggtcat gatttcactc tctctaatct gtcacttccc tccattcatt ttgtacttct300catatttttc acttcctggt tgaaaattgt agttctcttg gtacatacta gtattagaca360ttcagcaaca acaactgaac tgaacttctt tatactttga cacag405<210>3<211>1704<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FAD2-1B啟動(dòng)子<400>3actatagggc acgcgtggtc gacggcccgg gctggtcctc ggtgtgactc agccccaagt 60gacgccaacc aaacgcgtcc taactaaggt gtagaagaaa cagatagtat ataagtatac120catataagag gagagtgagt ggagaagcac ttctcctttt tttttctctg ttgaaattga180aagtgttttc cgggaaataa ataaaataaa ttaaaatctt acacactcta ggtaggtact240tctaatttaa tccacacttt gactctatat atgttttaaa aataattata atgcgtactt300
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<223>FAD2-1A基因組克隆<400>4cttgcttggt aacaacgtcg tcaagttatt attttgttct tttttttttt atcatatttc 60ttattttgtt ccaagtatgt catattttga tccatcttga caagtagatt gtcatgtagg120aataggaata tcactttaaa ttttaaagca ttgattagtc tgtaggcaat attgtcttct180tcttcctcct tattaatatt ttttattctg ccttcaatca ccagttatgg gagatggatg240taatactaaa taccatagtt gttctgcttg aagtttagtt gtatagttgt tctgcttgaa300gtttagttgt gtgtaatgtt tcagcgttgg cttcccctgt aactgctaca atggtactga360atatatattt tttgcattgt tcattttttt cttttactta atcttcattg ctttgaaatt420aataaaacaa aaagaaggac cgaatagttt gaagtttgaa ctattgccta ttcatgtaac480ttattcaccc aatcttatat agtttttctg gtagagatca ttttaaattg aaggatataa540attaagagga aatacttgta tgtgatgtgt ggcaatttgg aagatcatgc gtagagagtt600taatggcagg ttttgcaaat tgacctgtag tcataattac actgggccct ctcggagttt660tgtgcctttt tgttgtcgct gtgtttggtt ctgcatgtta gcctcacaca gatatttagt720agttgttgtt ctgcatataa gcctcacacg tatactaaac gagtgaacct caaaatcatg780gccttacacc tattgagtga aattaatgaa cagtgcatgt gagtatgtga ctgtgacaca840acccccggtt ttcatattgc aatgtgctac tgtggtgatt aaccttgcta cactgtcgtc900
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agttttgcaa gccactacca cccttatgct cccatatatt ctaaccgtga gaggcttctg 2280atctatgtct ctgatgttgc tttgttttct gtgacttact ctctctaccg tgttgcaacc 2340ctgaaagggt tggtttggct gctatgtgtt tatggggtgc ctttgctcat tgtgaacggt 2400tttcttgtga ctatcacata tttgcagcac acacactttg ccttgcctca ttacgattca 2460tcagaatggg actggctgaa gggagctttg gcaactatgg acagagatta tgggattctg 2520aacaaggtgt ttcatcacat aactgatact catgtggctc accatctctt ctctacaatg 2580ccacattacc atgcaatgga ggcaaccaat gcaatcaagc caatattggg tgagtactac 2640caatttgatg acacaccatt ttacaaggca ctgtggagag aagcgagaga gtgcctctat 2700gtggagccag atgaaggaac atccgagaag ggcgtgtatt ggtacaggaa caagtattga 2760tggagcaacc aatgggccat agtgggagtt atggaagttt tgtcatgtat tagtacataa 2820ttagtagaat gttataaata agtggatttg ccgcgtaatg actttgtgtg tattgtgaaa 2880cagcttgttg cgatcatggt tataatgtaa aaataattct ggtattaatt acatgtggaa 2940agtgttctgc ttatagcttt ctgcctaaaa tgcacgctgc acgggacaat atcattggta 3000atttttttaa aatctgaatt gaggctactc ataatactat ccataggaca tcaaagacat 3060gttgcattga ctttaagcag aggttcatct agaggattac tgcataggct tgaactacaa 3120gtaatttaag ggacgagagc aactttagct ctaccacgtc gttttacaag gttattaaaa 3180tcaaattgat cttattaaaa ctgaaaattt gtaataaaat gctattgaaa aattaaaata 3240tagcaaacac ctaaattgga ctgattttta gattcaaatt taataattaa tctaaattaa 3300acttaaattt tataatatat gtcttgtaat atatcaagtt ttttttttta ttattgagtt 3360tggaaacata taataaggaa cattagttaa tattgataat ccactaagat cgacttagta 3420ttacagtatt tggatgattt gtatgagata ttcaaacttc actcttatca taatagagac 3480aaaagttaat actgatggtg gagaaaaaaa aatgttattg ggagcatatg gtaagataag 3540
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<223>FAD2-1A 3′UTR<400>5tggagcaacc aatgggccat agtgggagtt atggaagttt tgtcatgtat tagtacataa 60
ttagtagaat gttataaata agtggatttg ccgcgtaatg actttgtgtg tattgtgaaa120cagcttgttg cgatcatggt tataatgtaa aaataattct ggtattaatt acatgtggaa180agtgttctgc ttatagcttt ctgcct 206<210>6<211>125<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FAD2-1A 5′UTR<400>6ccatatacta atatttgctt gtattgatag cccctccgtt cccaagagta taaaactgca 60tcgaataata caagccacta ggcatgggtc tagcaaagga aacaacaatg ggaggtagag120gtcgt125<210>7<211>191<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FAD3-1A內(nèi)含子1<400>7gtaataattt ttgtgtttct tactcttttt tttttttttt tgtttatgat atgaatctca 60cacattgttc tgttatgtca tttcttcttc atttggcttt agacaactta aatttgagat120ctttattatg tttttgctta tatggtaaag tgattcttca ttatttcatt cttcattgat180tgaattgaac a 191<210>8
<211>346<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FAD3-1A內(nèi)含子2<400>8ttagttcata ctggcttttt tgtttgttca tttgtcattg aaaaaaaatc ttttgttgat60tcaattattt ttatagtgtg tttggaagcc cgtttgagaa aataagaaat cgcatctgga 120atgtgaaagt tataactatt tagcttcatc tgtcgttgca agttctttta ttggttaaat 180ttttatagcg tgctaggaaa cccattcgag aaaataagaa atcacatctg gaatgtgaaa 240gttataactg ttagcttctg agtaaacgtg gaaaaaccac attttggatt tggaaccaaa 300ttttatttga taaatgacaa ccaaattgat tttgatggat tttgca 346<210>9<211>142<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FAD3-1A內(nèi)含子3A<400>9gtatgtgatt aattgcttct cctatagttg ttcttgattc aattacattt tatttatttg60gtaggtccaa gaaaaaaggg aatctttatg cttcctgagg ctgttcttga acatggctct 120tttttatgtg tcattatctt ag142<210>10<211>1228<212>DNA<213>大豆
<220>
<223>FAD3-1A內(nèi)含子4<400>10taacaaaaat aaatagaaaa tagtgggtga acacttaaat gcgagatagt aatacctaaa 60aaaagaaaaa aatataggta taataaataa tataactttc aaaataaaaa gaaatcatag120agtctagcgt agtgtttgga gtgaaatgat gttcacctac cattactcaa agattttgtt180gtgtccctta gttcattctt attattttac atatcttact tgaaaagact ttttaattat240tcattgagat cttaaagtga ctgttaaatt aaaataaaaa acaagtttgt taaaacttca300aataaataag agtgaaggga gtgtcatttg tcttctttct tttattgcgt tattaatcac360gtttctcttc tctttttttt ttttcttctc tgctttccac ccattatcaa gttcatgtga420agcagtggcg gatctatgta aatgagtggg gggcaattgc acccacaaga ttttattttt480tatttgtaca ggaataataa aataaaactt tgcccccata aaaaataaat attttttctt540aaaataatgc aaaataaata taagaaataa aaagagaata aattattatt aattttatta600ttttgtactt tttatttagt ttttttagcg gttagatttt tttttcatga cattatgtaa660tcttttaaaa gcatgtaata tttttatttt gtgaaaataa atataaatga tcatattagt720ctcagaatgt ataaactaat aataatttta tcactaaaag aaattctaat ttagtccata780aataagtaaa acaagtgaca attatatttt atatttactt aatgtgaaat aatacttgaa840cattataata aaacttaatg acaggagata ttacatagtg ccataaagat attttaaaaa900ataaaatcat taatacactg tactactata taatattcga tatatatttt taacatgatt960ctcaatagaa aaattgtatt gattatattt tattagacat gaatttacaa gccccgtttt 1020tcatttatag ctcttacctg tgatctattg ttttgcttcg ctgtttttgt tggtcaaggg 1080acttagatgt cacaatatta atactagaag taaatattta tgaaaacatg taccttacct 1140caacaaagaa agtgtggtaa gtggcaacac acgtgttgca tttttggccc agcaataaca 1200
cgtgtttttg tggtgtacta aaatggac 1228<210>11<211>625<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FAD3-1A內(nèi)含子5<400>11gtacatttta ttgcttattc acctaaaaac aatacaatta gtacatttgt tttatctctt 60ggaagttagt cattttcagt tgcatgattc taatgctctc tccattctta aatcatgttt120tcacacccac ttcatttaaa ataagaacgt gggtgttatt ttaatttcta ttcactaaca180tgagaaatta acttatttca agtaataatt ttaaaatatt tttatgctat tattttatta240caaataatta tgtatattaa gtttattgat tttataataa ttatattaaa attatatcga300tattaatttt tgattcactg atagtgtttt atattgttag tactgtgcat ttattttaaa360attggcataa ataatatatg taaccagctc actatactat actgggagct tggtggtgaa420aggggttccc aaccctcctt tctaggtgta catgctttga tacttctggt accttcttat480atcaatataa attatatttt gctgataaaa aaacatggtt aaccattaaa ttcttttttt540aaaaaaaaaa ctgtatctaa actttgtatt attaaaaaga agtctgagat taacaataaa600ctaacactca tttggattca ctgca 625<210>12<211>98<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FAD3-1A內(nèi)含子3B
<400>12ggtgagtgat tttttgactt ggaagacaac aacacattat tattataata tggttcaaaa 60caatgacttt ttctttatga tgtgaactcc atttttta 98<210>13<211>115<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FAD3-1A內(nèi)含子3C<400>13ggtaactaaa ttactcctac attgttactt tttcctcctt ttttttatta tttcaattct 60ccaattggaa atttgaaata gttaccataa ttatgtaatt gtttgatcat gtgca 115<210>14<211>1037<212>DNA<213>大豆<220>
<223>Fad3-1C內(nèi)含子4<400>14gtaacaaaaa taaatagaaa atagtgagtg aacacttaaa tgttagatac taccttcttc 60ttcttttttt tttttttttt gaggttaatg ctagataata gctagaaaga gaaagaaaga120caaatatagg taaaaataaa taatataacc tgggaagaag aaaacataaa aaaagaaata180atagagtcta cgtaatgttt ggatttttga gtgaaatggt gttcacctac cattactcaa240agattctgtt gtctacgtag tgtttggact ttggagtgaa atggtgttca cctaccatta300ctcagattct gttgtgtccc ttagttactg tcttatattc ttagggtata ttctttattt360
tacatccttt tcacatctta cttgaaaaga ttttaattat tcattgaaat attaacgtga420cagttaaatt aaaataataa aaaattcgtt aaaacttcaa ataaataaga gtgaaaggat480catcattttt cttctttctt ttattgcgtt attaatcatg cttctcttct tttttttctt540cgctttccac ccatatcaaa ttcatgtgaa gtatgagaaa atcacgattc aatggaaagc600tacaggaacy ttttttgttt tgtttttata atcggaatta atttatactc cattttttca660caataaatgt tacttagtgc cttaaagata atatttgaaa aattaaaaaa attattaata720cactgtacta ctatataata tttgacatat atttaacatg attttctatt gaaaatttgt780atttattatt ttttaatcaa aacccataag gcattaattt acaagaccca tttttcattt840atagctttac ctgtgatcat ttatagcttt aagggactta gatgttacaa tcttaattac900aagtaaatat ttatgaaaaa catgtgtctt accccttaac cttacctcaa caaagaaagt960gtgataagtg gcaacacacg tgttgctttt ttggcccagc aataacacgt gtttttgtgg 1020tgtacaaaaa tggacag 1037<210>15<211>4010<212>DNA<213>大豆<220>
<223>部分FAD3-1A基因組克隆<400>15acaaagcctt tagcctatgc tgccaataat ggataccaac aaaagggttc ttcttttgat 60tttgatccta gcgctcctcc accgtttaag attgcagaaa tcagagcttc aataccaaaa120cattgctggg tcaagaatcc atggagatcc ctcagttatg ttctcaggga tgtgcttgta180attgctgcat tggtggctgc agcaattcac ttcgacaact ggcttctctg gctaatctat240
tgccccattc aaggcacaat gttctgggct ctctttgttc ttggacatga ttggtaataa300tttttgtgtt tcttactctt tttttttttt ttttgtttat gatatgaatc tcacacattg360ttctgttatg tcatttcttc ttcatttggc tttagacaac ttaaatttga gatctttatt420atgtttttgc ttatatggta aagtgattct tcattatttc attcttcatt gattgaattg480aacagtggcc atggaagctt ttcagatagc cctttgctga atagcctggt gggacacatc540ttgcattcct caattcttgt gccataccat ggatggttag ttcatactgg cttttttgtt600tgttcatttg tcattgaaaa aaaatctttt gttgattcaa ttatttttat agtgtgtttg660gaagcccgtt tgagaaaata agaaatcgca tctggaatgt gaaagttata actatttagc720ttcatctgtc gttgcaagtt cttttattgg ttaaattttt atagcgtgct aggaaaccca780ttcgagaaaa taagaaatca catctggaat gtgaaagtta taactgttag cttctgagta840aacgtggaaa aaccacattt tggatttgga accaaatttt atttgataaa tgacaaccaa900attgattttg atggattttg caggagaatt agccacagaa ctcaccatga aaaccatgga960cacattgaga aggatgagtc atgggttcca gtatgtgatt aattgcttct cctatagttg 1020ttcttgattc aattacattt tatttatttg gtaggtccaa gaaaaaaggg aatctttatg 1080cttcctgagg ctgttcttga acatggctct tttttatgtg tcattatctt agttaacaga 1140gaagatttac aagaatctag acagcatgac aagactcatt agattcactg tgccatttcc 1200atgtttgtgt atccaattta tttggtgagt gattttttga cttggaagac aacaacacat 1260tattattata atatggttca aaacaatgac tttttcttta tgatgtgaac tccatttttt 1320agttttcaag aagccccgga aaggaaggct ctcacttcaa tccctacagc aatctgtttc 1380cacccagtga gagaaaagga atagcaatat caacactgtg ttgggctacc atgttttctc 1440tgcttatcta tctctcattc attaactagt ccacttctag tgctcaagct ctatggaatt 1500ccatattggg taactaaatt actcctacat tgttactttt tcctcctttt ttttattatt 1560
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<220>
<223>FAD3-1A 3′UTR<400>16gtttcaaact ttttgggtta ttatttattg gattctagct actcaaatta cttttttttt 60aatgttatgt tttttggagt ttaacgtttt ctgaacaact tgcaaattac ttgcatagag120agacatggaa tatttatttg aaattagtaa ggtagtaata ataaattttg aattgtcagt180ttca 184<210>17<211>143<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FAD3-1A 5′UTR<400>17tgcggttata taaatgcact atcccataag agtatttttc gaagatttcc ttcttcctat 60tctaggtttt tacgcaccac gtatccctga gaaaagagag gaaccacact ctctaagcca120aagcaaaagc agcagcagca gca143<210>18<211>2683<212>DNA<213>大豆<220>
<223>部分FAD3-1B基因組克隆<400>18gttcaagcac agcctctaca acatgttggt aatggtgcag ggaaagaaga tcaagcttat 60tttgatccaa gtgctccacc acccttcaag attgcaaata tcagagcagc aattccaaaa120cattgctggg agaagaacac attgagatct ctgagttatg ttctgaggga tgtgttggta180
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gatttcgtca cgtacttgca tcatcatggt tacaagcaga aactgccttg gtaccgtggc 1560caggtatccc atttaacaca atttgtttca ttaacatttt aagagaattt ttttttcaaa 1620atagttttcg aaattaagca aataccaagc aaattgttag atctacgctt gtacttgttt 1680taaagtcaaa ttcatgacca aattgtcctc acaagtccaa accgtccact attttatttt 1740cacctacttt atagcccaat ttgccatttg gttacttcag aaaagagaac cccatttgta 1800gtaaatatat tatttatgaa ttatggtagt ttcaacataa aacatactta tgtgcagttt 1860tgccatcctt caaaagaagg tagaaactta ctccatgtta ctctgtctat atgtaatttc 1920acaggaatgg agttatctaa ggggtggtct tacaacagta gatcgcgact atggttggat 1980caacaacatt caccatgaca ttggcaccca tgttatccat caccttttcc ctcaaattcc 2040acattatcat ttaatcgaag cggtattaat tctctatttc acaagaaatt attgtatgtc 2100tgcctatgtg atctaagtca attttcacat aacacatgat caaactttct taattctttc 2160ttctaaattg aaaaagtgga ttatatgtca attgaaaatt ggtcaagacc acaaacatgt 2220gatgatctcc caccttacat ataataattt ctcctattct acaatcaata atccttctat 2280ggtcctgaat tgttcctttc ttttttcatt ttcttattct ttttgttgtc ccacaataga 2340ctaaagcagc aaaggcagtg ctaggaaagt attatcgtga gcctcagaaa tctgggccat 2400tgccacttca tctaataaag tacttgctcc acagcataag tcaggatcac ttcgttagcg 2460actctggcga cattgtgtac taccagactg attcccagct ccacaaagat tcttggaccc 2520agtccaacta aagtttttga tgctacattt acctatttca ctcttaaata ctatttccta 2580tgtaatatgt aatttagaat atgttaccta ctcaaatcaa ttaggtgaca tgtataagct 2640ttcataaatt atgctagaaa tgcacttact tttcaaagca tgc 2683<210>19<211>160
<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FAD3-1B內(nèi)含子1<400>19gtaactaatt attattacaa attgttatgt tatgttatgt tatgttgttg tgcctttttc 60tcagtgatgc tttagtcatt tcatttcact tggttatgca tgattgttcg ttcatatgtt120ctgtcatggt gagttctaat ttgattgatg catggaacag 160<210>20<211>119<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FAD3-1B內(nèi)含子2<400>20gttcctttta gcaacttttc atgttcactt tgtccttaaa ttttttttta tgtttgttaa 60aaaatctttg gtctgattta acaacctaac catttttaca actcatggat tttttgcag 119<210>21<211>166<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FAD3-1B內(nèi)含子3a<400>21gtattactat gagtttgctt gattaatttc cacatttttt ctttcttctt aattttaatc 60agtggttaga tttggttgtg ttccgataga agaaaagggg gtatctagag agatgtgaat 120ttcatgaagt ggttcatgat tatgtgtctt tatgccttta tgtcag166
<210>22<211>156<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FAD3-1B內(nèi)含子3b<400>22gtgagaccct ctttttccag aatgacagca ttattttact atatagtacc tcaattttta 60tatttctaaa attttgaatt cttgaaattg aaaggaaagg actttattgg gtctagcatc120tcactctctc tttgtgatat gaaccatata tttcag 156<210>23<211>148<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FAD3-1B內(nèi)含子3c<400>23gtaatctcac tctcacactt tctttataca tcgcacgcca gtgtgggtta tttgcaacct 60acaccgaagt aatgccctat aattaatgag gttaacacat gtccaagtcc aatattttgt120tcacttattt gaacttgaac atgtgtag 148<210>24<211>351<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FAD3-1B內(nèi)含子4<400>24taacacaatt tgtttcatta acattttaag agaatttttt tttcaaaata gttttcgaaa 60ttaagcaaat accaagcaaa ttgttagatc tacgcttgta cttgttttaa agtcaaattc120
atgaccaaat tgtcctcaca agtccaaacc gtccactatt ttattttcac ctactttata180gcccaatttg ccatttggtt acttcagaaa agagaacccc atttgtagta aatatattat240ttatgaatta tggtagtttc aacataaaac atacttatgt gcagttttgc catccttcaa300aagaaggtag aaacttactc catgttactc tgtctatatg taatttcaca g 351<210>25<211>277<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FAD3-1B內(nèi)含子5<400>25gtattaattc tctatttcac aagaaattat tgtatgtctg cctatgtgat ctaagtcaat 60tttcacataa cacatgatca aactttctta attctttctt ctaaattgaa aaagtggatt120atatgtcaat tgaaaattgg tcaagaccac aaacatgtga tgatctccca ccttacatat180aataatttct cctattctac aatcaataat ccttctatgg tcctgaattg ttcctttctt240ttttcatttt cttattcttt ttgttgtccc acaatag 277<210>26<211>158<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FAD3-1B 3′UTR<400>26agtttttgat gctacattta cctatttcac tcttaaatac tatttcctat gtaatatgta 60atttagaata tgttacctac tcaaatcaat taggtgacat gtataagctt tcataaatta120tgctagaaat gcacttactt ttcaaagcat gctatgtc158
<210>27<211>83<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FAD3-1B 5′UTR<400>27tctaatacga ctcactatag ggcaagcagt ggtatcaacg cagagtacgc gggggtaaca 60gagaaagaaa catttgagca aaa 83<210>28<211>4083<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FATB基因組克隆<400>28gggaaacaac aaggacgcaa aatgacacaa tagcccttct tccctgtttc cagcttttct 60ccttctctct ctccatcttc ttcttcttct tcactcagtc aggtacgcaa acaaatctgc120tattcattca ttcattcctc tttctctctg atcgcaaact gcacctctac gctccactct180tctcattttc tcttcctttc tcgcttctca gatccaactc ctcagataac acaagaccaa240acccgctttt tctgcatttc tagactagac gttctaccgg agaaggttct cgattctttt300ctcttttaac tttattttta aaataataat aatgagagct ggatgcgtct gttcgttgtg360aatttcgagg caatggggtt ctcattttcg ttacagttac agattgcatt gtctgctttc420ctcttctccc ttgtttcttt gccttgtctg atttttcgtt tttatttctt acttttaatt480tttggggatg gatatttttt ctgcattttt tcggtttgcg atgttttcag gattccgatt540ccgagtcaga tctgcgccgg cttatacgac gaatttgttc ttattcgcaa cttttcgctt600
gattggcttg ttttacctct ggaatctcac acgtgatcaa ataagcctgc tattttagtt660gaagtagaat ttgttcttta tcggaaagaa ttctatggat ctgttctgaa attggagcta720ctgtttcgag ttgctatttt ttttagtagt attaagaaca agtttgcctt ttattttaca780tttttttcct ttgcttttgc caaaagtttt tatgatcact ctcttctgtt tgtgatataa840ctgatgtgct gtgctgttat tatttgttat ttggggtgaa gtataatttt ttgggtgaac900ttggagcatt tttagtccga ttgatttctc gatatcattt aaggctaagg ttgacctcta960ccacgcgttt gcgtttgatg ttttttccat ttttttttta tctcatatct tttacagtgt 1020ttgcctattt gcatttctct tctttatccc ctttctgtgg aaaggtggga gggaaaatgt 1080attttttttt tctcttctaa cttgcgtata ttttgcatgc agcgacctta gaaattcatt 1140atggtggcaa cagctgctac ttcatcattt ttccctgtta cttcaccctc gccggactct 1200ggtggagcag gcagcaaact tggtggtggg cctgcaaacc ttggaggact aaaatccaaa 1260tctgcgtctt ctggtggctt gaaggcaaag gcgcaagccc cttcgaaaat taatggaacc 1320acagttgtta catctaaaga aggcttcaag catgatgatg atctaccttc gcctcccccc 1380agaactttta tcaaccagtt gcctgattgg agcatgcttc ttgctgctat cacaacaatt 1440ttcttggccg ctgaaaagca gtggatgatg cttgattgga agccacggcg acctgacatg 1500cttattgacc cctttgggat aggaaaaatt gttcaggatg gtcttgtgtt ccgtgaaaac 1560ttttctatta gatcatatga gattggtgct gatcgtaccg catctataga aacagtaatg 1620aaccatttgc aagtaagtcc gtcctcatac aagtgaatct ttatgatctt cagagatgag 1680tatgctttga ctaagatagg gctgtttatt tagacactgt aattcaattt catatataga 1740taatatcatt ctgttgttac ttttcatact atatttatat caactatttg cttaacaaca 1800ggaaactgca cttaatcatg ttaaaagtgc tgggcttctt ggtgatggct ttggttccac 1860gccagaaatg tgcaaaaaga acttgatatg ggtggttact cggatgcagg ttgtggtgga 1920
acgctatcct acatggttag tcatctagat tcaaccatta catgtgattt gcaatgtatc 1980catgttaagc tgctatttct ctgtctattt tagtaatctt tatgaggaat gatcactcct 2040aaatatattc atggtaatta ttgagactta attatgagaa ccaaaatgct ttggaaattt 2100gtctgggatg aaaattgatt agatacacaa gctttataca tgatgaacta tgggaaacct 2160tgtgcaacag agctattgat ctgtacaaga gatgtagtat agcattaatt acatgttatt 2220agataaggtg acttatcctt gtttaattat tgtaaaaata gaagctgata ctatgtattc 2280tttgcatttg ttttcttacc agttatatat accctctgtt ctgtttgagt actactagat 2340gtataaagaa tgcaattatt ctgacttctt ggtgttgggt tgaagttaga taagctatta 2400gtattattat ggttattcta aatctaatta tctgaaattg tgtgtctata tttgcttcag 2460gggtgacata gttcaagtgg acacttgggt ttctggatca gggaagaatg gtatgcgtcg 2520tgattggctt ttacgtgact gcaaaactgg tgaaatcttg acaagagctt ccaggtagaa 2580atcattctct gtaattttcc ttcccctttc cttctgcttc aagcaaattt taagatgtgt 2640atcttaatgt gcacgatgct gattggacac aattttaaat ctttcaaaca tttacaaaag 2700ttatggaacc ctttcttttc tctcttgaag atgcaaattt gtcacgactg aagtttgagg 2760aaatcatttg aattttgcaa tgttaaaaaa gataatgaac tacatatttt gcaggcaaaa 2820acctctaatt gaacaaactg aacattgtat cttagtttat ttatcagact ttatcatgtg 2880tactgatgca tcaccttgga gcttgtaatg aattacatat tagcattttc tgaactgtat 2940gttatggttt tggtgatcta cagtgtttgg gtcatgatga ataagctgac acggaggctg 3000tctaaaattc cagaagaagt cagacaggag ataggatctt attttgtgga ttctgatcca 3060attctagaag aggataacag aaaactgact aaacttgacg acaacacagc ggattatatt 3120cgtaccggtt taagtgtatg tcaactagtt tttttgtaat tgttgtcatt aatttctttt 3180cttaaattat ttcagatgtt gctttctaat tagtttacat tatgtatctt cattcttcca 3240
gtctaggtgg agtgatctag atatcaatca gcatgtcaac aatgtgaagt acattgactg 3300gattctggag gtatttttct gttcttgtat tctaatccac tgcagtcctt gttttgttgt 3360taaccaaagg actgtccttt gattgtttgc agagtgctcc acagccaatc ttggagagtc 3420atgagctttc ttccgtgact ttagagtata ggagggagtg tggtagggac agtgtgctgg 3480attccctgac tgctgtatct ggggccgaca tgggcaatct agctcacagt ggacatgttg 3540agtgcaagca tttgcttcga ctcgaaaatg gtgctgagat tgtgaggggc aggactgagt 3600ggaggcccaa acctatgaac aacattggtg ttgtgaacca ggttccagca gaaagcacct 3660aagattttga aatggttaac ggttggagtt gcatcagtct ccttgctatg tttagactta 3720ttctggcctc tggggagagt tttgcttgtg tctgtccaat caatctacat atctttatat 3780ccttctaatt tgtgttactt tggtgggtaa gggggaaaag ctgcagtaaa cctcattctc 3840tctttctgct gctccatatt tcatttcatc tctgattgcg ctactgctag gctgtcttca 3900atatttaatt gcttgatcaa aatagctagg catgtatatt attattcttt tctcttggct 3960caattaaaga tgcaattttc attgtgaaca cagcataact attattctta ttatttttgt 4020atagcctgta tgcacgaatg acttgtccat ccaatacaac cgtgattgta tgctccagct 4080cag 4083<210>29<211>109<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FATB內(nèi)含子I<400>29gtacgcaaac aaatctgcta ttcattcatt cattcctctt tctctctgat cgcaaactgc 60acctctacgc tccactcttc tcattttctc ttcctttctc gcttctcag 109
<210>30<211>836<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FATB內(nèi)含子II<400>30gttctcgatt cttttctctt ttaactttat ttttaaaata ataataatga gagctggatg 60cgtctgttcg ttgtgaattt cgaggcaatg gggttctcat tttcgttaca gttacagatt 120gcattgtctg ctttcctctt ctcccttgtt tctttgcctt gtctgatttt tcgtttttat 180ttcttacttt taatttttgg ggatggatat tttttctgca ttttttcggt ttgcgatgtt 240ttcaggattc cgattccgag tcagatctgc gccggcttat acgacgaatt tgttcttatt 300cgcaactttt cgcttgattg gcttgtttta cctctggaat ctcacacgtg atcaaataag 360cctgctattt tagttgaagt agaatttgtt ctttatcgga aagaattcta tggatctgtt 420ctgaaattgg agctactgtt tcgagttgct atttttttta gtagtattaa gaacaagttt 480gccttttatt ttacattttt ttcctttgct tttgccaaaa gtttttatga tcactctctt 540ctgtttgtga tataactgat gtgctgtgct gttattattt gttatttggg gtgaagtata 600attttttggg tgaacttgga gcatttttag tccgattgat ttctcgatat catttaaggc 660taaggttgac ctctaccacg cgtttgcgtt tgatgttttt tccatttttt ttttatctca 720tatcttttac agtgtttgcc tatttgcatt tctcttcttt atcccctttc tgtggaaggt 780gggagggaaa atgtattttt tttttctctt ctaacttgcg tatattttgc atgcag 836<210>31<211>169<212>DNA<213>大豆
<220>
<223>FATB內(nèi)含子III<400>31gtaagtccgt cctcatacaa gtgaatcttt atgatcttca gagatgagta tgctttgact 60aagatagggc tgtttattta gacactgtaa ttcaatttca tatatagata atatcattct120gttgttactt ttcatactat atttatatca actatttgct taacaacag169<210>32<211>525<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FATB內(nèi)含子IV<400>32gttagtcatc tagattcaac cattacatgt gatttgcaat gtatccatgt taagctgcta 60tttctctgtc tattttagta atctttatga ggaatgatca ctcctaaata tattcatggt120aattattgag acttaattat gagaaccaaa atgctttgga aatttgtctg ggatgaaaat180tgattagata cacaagcttt atacatgatg aactatggga aaccttgtgc aacagagcta240ttgatctgta caagagatgt agtatagcat taattacatg ttattagata aggtgactta300tccttgttta attattgtaa aaatagaagc tgatactatg tattctttgc atttgttttc360ttaccagtta tatataccct ctgttctgtt tgagtactac tagatgtata aagaatgcaa420ttattctgac ttcttggtgt tgggttgaag ttagataagc tattagtatt attatggtta480ttctaaatct aattatctga aattgtgtgt ctatatttgc ttcag525<210>33<211>389<212>DNA<213>大豆
<220>
<223>FATB內(nèi)含子V<400>33gtagaaatca ttctctgtaa ttttccttcc cctttccttc tgcttcaagc aaattttaag 60atgtgtatct taatgtgcac gatgctgatt ggacacaatt ttaaatcttt caaacattta120caaaagttat ggaacccttt cttttctctc ttgaagatgc aaatttgtca cgactgaagt180ttgaggaaat catttgaatt ttgcaatgtt aaaaaagata atgaactaca tattttgcag240gcaaaaacct ctaattgaac aaactgaaca ttgtatctta gtttatttat cagactttat300catgtgtact gatgcatcac cttggagctt gtaatgaatt acatattagc attttctgaa360ctgtatgtta tggttttggt gatctacag 389<210>34<211>106<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FATB內(nèi)含子VI<400>34tatgtcaact agtttttttg taattgttgt cattaatttc ttttcttaaa ttatttcaga 60tgttgctttc taattagttt acattatgta tcttcattct tccagt 106<210>35<211>82<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FATB內(nèi)含子VII<400>35gtatttttct gttcttgtat tctaatccac tgcagtcctt gttttgttgt taaccaaagg 60
actgtccttt gattgtttgc ag 82<210>36<211>208<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FATB 3′UTR<400>36gatttgaaat ggttaacgat tggagttgca tcagtctcct tgctatgttt agacttattc 60tggttccctg gggagagttt tgcttgtgtc tatccaatca atctacatgt ctttaaatat120atacaccttc taatttgtga tactttggtg ggtaaggggg aaaagcagca gtaaatctca180ttctcattgt aattaaaaaa aaaaaaaa 208<210>37<211>229<212>DNA<213>大豆<220>
<223>FATB 5′UTR<400>37acaattacac tgtctctctc ttttccaaaa ttagggaaac aacaaggacg caaaatgaca 60caatagccct tcttccctgt ttccagcttt tctccttctc tctctctcca tcttcttctt120cttcttcact cagtcagatc caactcctca gataacacaa gaccaaaccc gctttttctg180catttctaga ctagacgttc taccggagaa gcgaccttag aaattcatt229<210>38<211>1398<212>DNA<213>Cuphea pulcherrima
<220>
<223>KAS I基因<400>38atgcattccc tccagtcacc ctcccttcgg gcctccccgc tcgacccctt ccgccccaaa 60tcatccaccg tccgccccct ccaccgagca tcaattccca acgtccgggc cgcttccccc120accgtctccg ctcccaagcg cgagaccgac cccaagaagc gcgtcgtgat caccggaatg180ggccttgtct ccgttttcgg ctccgacgtc gatgcgtact acgacaagct cctgtcaggc240gagagcggga tcggcccaat cgaccgcttc gacgcctcca agttccccac caggttcggc300ggccagattc gtggcttcaa ctccatggga tacattgacg gcaaaaacga caggcggctt360gatgattgcc ttcgctactg cattgtcgcc gggaagaagt ctcttgagga cgccgatctc420ggtgccgacc gcctctccaa gatcgacaag gagagagccg gagtgctggt tgggacagga480atgggtggtc tgactgtctt ctctgacggg gttcaatctc ttatcgagaa gggtcaccgg540aaaatcaccc ctttcttcat cccctatgcc attacaaaca tggggtctgc cctgctcgct600attgaactcg gtctgatggg cccaaactat tcaatttcca ctgcatgtgc cacttccaac660tactgcttcc atgctgctgc taatcatatc cgccgtggtg aggctgatct tatgattgct720ggaggcactg aggccgcaat cattccaatt gggttgggag gctttgtggc ttgcagggct780ctgtctcaaa ggaacgatga ccctcagact gcctctaggc cctgggataa agaccgtgat840ggttttgtga tgggtgaagg tgctggagtg ttggtgctgg agagcttgga acatgcaatg900aaacgaggag cacctattat tgcagagtat ttgggaggtg caatcaactg tgatgcttat960cacatgactg acccaagggc tgatggtctc ggtgtctcct cttgcattga gagtagcctt 1020gaagatgctg gcgtctcacc tgaagaggtc aattacataa atgctcatgc gacttctact 1080ctagctgggg atctcgccga gataaatgcc atcaagaagg ttttcaagaa cacaaaggat 1140atcaaaatta atgcaactaa gtcaatgatc ggacactgtc ttggagcctc tggaggtctt 1200
gaagctatag cgactattaa gggaataaac accggctggc ttcatcccag cattaatcaa 1260ttcaatcctg agccatccgt ggagttcgac actgttgcca acaagaagca gcaacacgaa 1320gttaatgttg cgatctcgaa ttcatttgga ttcggaggcc acaactcagt cgtggctttc 1380tcggctttca agccatga 1398<210>39<211>1218<212>DNA<213>Cuphea pulcherrima<400>39atgggtgtgg tgactcctct aggccatgac cctgatgttt tctacaataa tctgcttgat 60ggaacgagtg gcataagcga gatagagacc tttgattgtg ctcaatttcc tacgagaatt120gctggagaga tcaagtcttt ctccacagat ggttgggtgg ccccgaagct ctctaagagg180atggacaagt tcatgctata catgctgacc gctggcaaga aagcattaac agatggtgga240atcaccgaag atgtgatgaa agagctagat aaaagaaaat gcggagttct cattggctca300gcaatgggtg gaatgaaggt attcaatgat gccattgaag ccctaaggat ttcatataag360aagatgaatc ccttttgtgt acctttcgct accacaaata tgggatcagc tatgcttgca420atggacttgg gatggatggg gcccaactac tcgatatcta ctgcttgtgc aacgagtaac480ttttgtataa tgaatgctgc gaaccatata atcagaggcg aagcagatgt gatgctttgc540gggggctcag atgcggtaat catacctatt ggtatgggag gttttgttgc atgccgagct600ttgtcccaga gaaattccga ccctactaaa gcttcaagac catgggacag taatcgtgat660ggatttgtta tgggggaagg agctggagtg ctactactag aggagttgga gcatgcaaag720aaaagaggtg cgactattta cgcagaattt ctaggtggga gtttcacttg cgatgcctac780cacatgaccg agcctcaccc tgatggagct ggagtgattc tctgcataga gaaggctttg840
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<223>δ-9去飽和酶<400>40atggctctca agctcaatcc tttcctttct caaacccaaa agttaccttc tttcgctctt 60ccaccaatgg ccagtaccag atctcctaag ttctacatgg cctctaccct caagtctggt120tctaaggaag ttgagaatct caagaagcct ttcatgcctc ctcgggaggt acatgttcag180gttacccatt ctatgccacc ccaaaagatt gagatcttta aatccctaga caattgggct240gaggagaaca ttctggttca tctgaagcca gttgagaaat gttggcaacc gcaggatttt300ttgccagatc ccgcctctga tggatttgat gagcaagtca gggaactcag ggagagagca360aaggagattc ctgatgatta ttttgttgtt ttggttggag acatgataac ggaagaagcc420cttcccactt atcaaacaat gctgaatacc ttggatggag ttcgggatga aacaggtgca480agtcctactt cttgggcaat ttggacaagg gcatggactg cggaagagaa tagacatggt540gacctcctca ataagtatct ctacctatct ggacgagtgg acatgaggca aattgagaag600
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<223>δ-9去飽和酶<400>41atggcgttga agcttcacca cacggccttc aatccttcca tggcggttac ctcttcggga 60cttcctcgat cgtatcacct cagatctcac cgcgttttca tggcttcttc tacaattgga120attacttcta aggagatacc caatgccaaa aagcctcaca tgcctcctag agaagctcat180gtgcaaaaga cccattcaat gccgcctcaa aagattgaga ttttcaaatc cttggagggt240tgggctgagg agaatgtctt ggtgcatctt aaacctgtgg agaagtgttg gcaaccacaa300gattttctac ccgacccggc ctccgaggga tttatggatc aagtcaagga gttgagggaa360agaaccaaag aaatcccgga tgagtacctt gtggtgttgg ttggcgatat gatcactgaa420
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1.一種大豆種子，其所含油組合物包括55-80％重量的油酸，10-40％重量的亞油酸，6％或低于6％重量的亞麻酸和2-8％重量的飽和脂肪酸。
2.如權(quán)利要求1所述的大豆種子，其中所述的種子包含重組的核酸分子，所述核酸分子包含第一組DNA序列，該序列在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)能夠抑制選自由FAD2、FAD3和FATB基因組成的組中至少兩種基因的內(nèi)源性表達(dá)，和第二組DNA序列，其在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)能夠提高選自由β-酮脂?；?ACP合酶I基因、β-酮脂?；?ACP合酶IV基因、δ-9去飽和酶基因所組成的組中的至少一種基因的內(nèi)源性表達(dá)。
3.如權(quán)利要求2所述的大豆種子，其中所述種子相對(duì)于來自具有相似遺傳背景但缺乏重組核酸分子的植物的種子來說，呈現(xiàn)提高的油酸含量，降低的飽和脂肪酸含量和降低的多不飽和脂肪酸含量。
4.如權(quán)利要求2所述的大豆種子，其中油組合物進(jìn)一步包括10-39％重量的亞油酸，4.5％或低于4.5％重量的亞麻酸和3-6％重量的飽和脂肪酸。
5.如權(quán)利要求2所述的大豆種子，其中油組合物進(jìn)一步包括10-39％重量的亞油酸，3.0％或低于3.0％重量的亞麻酸和2-3.6％重量的飽和脂肪酸。
6.如權(quán)利要求2所述的大豆種子，其中油組合物進(jìn)一步包括11-30％重量的亞油酸，4.5％或低于4.5％重量的亞麻酸和低于6％重量的飽和脂肪酸。
7.來自于權(quán)利要求2所述大豆種子的油，其中所述油相對(duì)于來自具有相似遺傳背景但缺乏重組核酸分子的植物種子的油來說，呈現(xiàn)提高的油酸含量，降低的飽和脂肪酸含量和降低的多不飽和脂肪酸含量。
8.來自于權(quán)利要求2所述大豆種子的食物。
9.一種大豆種子的容器，其中至少25％的種子呈現(xiàn)其油組合物包括55-80％重量的油酸、10-40％重量的亞油酸、6％或低于6％重量的亞麻酸和2-8％重量的飽和脂肪酸。
10.一種大豆種子，其具有的油組合物包括65-80％重量的油酸，10-30％重量的亞油酸，6％或低于6％重量的亞麻酸和2-8％重量的飽和脂肪酸。
11.如權(quán)利要求10所述的大豆種子，其中油組合物進(jìn)一步包括10-29％重量的亞油酸，4.5％或低于4.5％重量的亞麻酸和3-6％重量的飽和脂肪酸。
12.如權(quán)利要求10所述的大豆種子，其中油組合物進(jìn)一步包括10-29％重量的亞油酸，3.0％或低于3.0％重量的亞麻酸和2-3.6％重量的飽和脂肪酸。
13.一種粗制大豆油，其具有的油組合物包括55-80％重量的油酸，10-40％重量的亞油酸，6％或低于6％重量的亞麻酸和2-8％重量的飽和脂肪酸。
14.如權(quán)利要求13所述的粗制大豆油，其中所述的油選自由烹調(diào)油、色拉油和煎炸油所組成的組。
15.如權(quán)利要求13所述的粗制大豆油，其中所述的油是制備物質(zhì)的原材料，該物質(zhì)選自由起酥油、人造黃油、潤(rùn)滑油、生物柴油、燃油和柴油添加劑所組成的組。
16.如權(quán)利要求13所述的粗制大豆油，其中所述的油在大于1升的容積中生成。
17.如權(quán)利要求16所述的粗制大豆油，其中所述的油在大于10升的容積中生成。
18.一種粗制大豆油，其具有的油組合物包括65-80％重量的油酸，10-40％重量的亞油酸，6％或低于6％重量的亞麻酸和2-8％重量的飽和脂肪酸。
19.一種粗制大豆油，其具有的油組合物包括69-73％重量的油酸，21-24％重量的亞油酸，0.5-3％重量的亞麻酸和2-3％重量的飽和脂肪酸。
20.如權(quán)利要求19所述的粗制大豆油，其中所述的油選自由烹調(diào)油、色拉油和煎炸油所組成的組。
21.如權(quán)利要求19所述的粗制大豆油，其中所述的油是制備大豆食品的原材料。
22.一種結(jié)種子的轉(zhuǎn)化的大豆植物，其中所述種子呈現(xiàn)其油組合物包括55-80％重量的油酸，10-40％重量的亞油酸，6％或低于6％重量的亞麻酸和2-8％重量的飽和脂肪酸。
23.如權(quán)利要求22所述的轉(zhuǎn)化的大豆植物，其中所述的轉(zhuǎn)化的大豆植物包含重組的核酸分子，所述核酸分子包含第一組DNA序列，該序列在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)能夠抑制FAD2基因和FAD3基因的內(nèi)源性表達(dá)；和第二組DNA序列，其在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)能夠提高選自由β-酮脂酰基-ACP合酶I基因、β-酮脂酰基-ACP合酶IV基因、δ-9去飽和酶基因所組成的組中的至少一種基因的內(nèi)源性表達(dá)。
24.來自于如權(quán)利要求23所述轉(zhuǎn)化植物的給料。
25.來自于如權(quán)利要求23所述轉(zhuǎn)化植物的植物部分。
26.來自于如權(quán)利要求23所述轉(zhuǎn)化植物的種子。
27.一種轉(zhuǎn)化植物，其包含重組的核酸分子，所述核酸分子包含第一組DNA序列，該序列在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)能夠抑制選自由FAD2、FAD3和FATB基因組成的組中至少兩種基因的內(nèi)源性表達(dá)；和第二組DNA序列，該序列在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)能夠提高選自由β-酮脂?；?ACP合酶I基因、β-酮脂?；?ACP合酶IV基因、δ-9去飽和酶基因所組成的組中的至少一種基因的內(nèi)源性表達(dá)。
28.如權(quán)利要求27所述的轉(zhuǎn)化植物，其中所述的轉(zhuǎn)化植物是溫帶的含油種子植物。
29.如權(quán)利要求27所述的轉(zhuǎn)化植物，其中所述的轉(zhuǎn)化植物是大豆植物。
30.如權(quán)利要求27所述的轉(zhuǎn)化植物，其中所述的轉(zhuǎn)化植物與具有相似遺傳背景但缺乏重組核酸分子的植物相比，其產(chǎn)生的種子呈現(xiàn)提高的油酸含量，降低的飽和脂肪酸含量和降低的多不飽和脂肪酸含量。
31.一種改變植物細(xì)胞中油組合物的方法，其包括(A)用重組核酸分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述重組核酸分子包含第一組DNA序列，該序列在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)能夠抑制選自由FAD2、FAD3和FATB基因組成的組中至少兩種基因的內(nèi)源性表達(dá)；和第二組DNA序列，該序列在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)能夠提高選自由β-酮脂酰基-ACP合酶I基因、β-酮脂?；?ACP合酶IV基因和δ-9去飽和酶基因所組成的組中的至少一種基因的內(nèi)源性表達(dá)；和(B)培育所述植物細(xì)胞，其條件是其中所述第一組DNA序列和所述第二組DNA序列的轉(zhuǎn)錄被起始，由此相對(duì)于具有相似遺傳背景但缺乏重組核酸分子的植物細(xì)胞，所述的油組合物被改變。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述的培育步驟產(chǎn)生一種植物細(xì)胞，該植物細(xì)胞具有至少部分降低的FAD2酶和FAD3酶水平和至少部分提高的至少一種基因水平，所述基因選自由β-酮脂酰基-ACP合酶I基因、β-酮脂?；?ACP合酶IV基因和δ-9去飽和酶基因所組成的組。
33.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述細(xì)胞出現(xiàn)在多細(xì)胞環(huán)境中。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述細(xì)胞出現(xiàn)在轉(zhuǎn)化植物。
35.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述的改變相對(duì)于具有相似遺傳背景但缺乏重組核酸分子的植物細(xì)胞來說包括提高的油酸含量，降低的飽和脂肪酸含量和降低的多不飽和脂肪酸含量。
36.一種生產(chǎn)轉(zhuǎn)化植物的方法，該植物的種子具有降低的飽和脂肪酸含量，所述方法包括(A)用重組核酸分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述重組核酸分子包含第一組DNA序列，該序列在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)能夠抑制選自由FAD2、FAD3和FATB基因組成的組中至少兩種基因的內(nèi)源性表達(dá)；和第二組DNA序列，該序列在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)能夠提高選自由β-酮脂酰基-ACP合酶I基因、β-酮脂酰基-ACP合酶IV基因和δ-9去飽和酶基因所組成的組中至少一種基因的內(nèi)源性表達(dá)；和(B)培育該轉(zhuǎn)化的植物，其中轉(zhuǎn)化的植物產(chǎn)生的種子相對(duì)于具有相似遺傳背景但缺乏重組核酸分子的植物種子來說具有降低的飽和脂肪酸含量。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的培育步驟進(jìn)一步包括在植物的組織或器官中表達(dá)第一組DNA序列和所述的第二組DNA序列，其中所述的組織或器官選自由根、塊莖、干、葉子、莖、果實(shí)、漿果、堅(jiān)果、植物皮、莢、種子和花組成的組。
38.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的培育步驟進(jìn)一步包括在種子中表達(dá)第一組DNA序列和所述的第二組DNA序列。
39.一種重組核酸分子，其包含第一組DNA序列，該序列在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)能夠抑制選自由FAD2、FAD3和FATB基因組成的組中至少兩種基因的內(nèi)源性表達(dá)；和第二組DNA序列，該序列在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)能夠提高選自由β-酮脂?；?ACP合酶I基因、β-酮脂?；?ACP合酶IV基因和δ-9去飽和酶基因所組成的組中的至少一種基因的內(nèi)源性表達(dá)。
40.如權(quán)利要求39所述的重組核酸分子，其中所述的第一組DNA序列包含第一非編碼序列，其在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)能夠抑制FAD2基因的內(nèi)源性表達(dá)；和第二非編碼序列，其在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)能夠抑制FAD3-1A基因的內(nèi)源性表達(dá)。
41.如權(quán)利要求40所述的重組核酸分子，其中第一組DNA序列表達(dá)為正義共抑制RNA轉(zhuǎn)錄體。
42.如權(quán)利要求40所述的重組核酸分子，其中第一非編碼序列表達(dá)為第一正義共抑制RNA轉(zhuǎn)錄體，以及第二非編碼序列表達(dá)為第二正義共抑制RNA轉(zhuǎn)錄體，以及第一和第二正義共抑制轉(zhuǎn)錄體彼此不互相連接。
43.如權(quán)利要求40所述的重組核酸分子，其中第一組DNA序列表達(dá)為反義RNA轉(zhuǎn)錄體。
44.如權(quán)利要求40所述的重組核酸分子，其中第一非編碼序列表達(dá)為第一反義RNA轉(zhuǎn)錄體，以及第二非編碼序列表達(dá)為第二反義RNA轉(zhuǎn)錄體，以及第一和第二反義轉(zhuǎn)錄體彼此不互相連接。
45.如權(quán)利要求40所述的重組核酸分子，其中第一組DNA序列表達(dá)為能夠形成單一的雙鏈RNA分子的RNA轉(zhuǎn)錄體。
46.如權(quán)利要求40所述的重組核酸分子，其中所述第一組DNA序列進(jìn)一步包含第三非編碼序列，其在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)能夠抑制FAD3-1B基因的內(nèi)源性表達(dá)。
47.如權(quán)利要求46所述的重組核酸分子，其中所述第一非編碼序列是FAD2-1A序列，所述第二非編碼序列是FAD3-1A序列以及所述第三非編碼序列是FAD3-1B序列。
48.如權(quán)利要求47所述的重組核酸分子，其中所述FAD2-1A序列選自由FAD2-1A內(nèi)含子序列，F(xiàn)AD2-1A 3′UTR序列和FAD2-1A 5′UTR序列組成的組。
49.如權(quán)利要求47所述的重組核酸分子，其中所述FAD3-1A序列選自由FAD3-1A內(nèi)含子序列，F(xiàn)AD3-1A 3′UTR序列和FAD3-1A 5′UTR序列組成的組。
50.如權(quán)利要求47所述的重組核酸分子，其中所述FAD3-1B序列選自由FAD3-1B內(nèi)含子序列，F(xiàn)AD3-1B 3′UTR序列和FAD3-1B 5′UTR序列組成的組。
51.如權(quán)利要求40所述的重組核酸分子，其中所述的第一組DNA序列進(jìn)一步包含第三非編碼序列，該非編碼序列在宿主細(xì)胞表達(dá)時(shí)能夠抑制FATB基因的內(nèi)源性表達(dá)。
52.如權(quán)利要求51所述的重組核酸分子，其中所述FATB序列選自由FATB內(nèi)含子序列、FATB 3′UTR序列和FATB 5′UTR序列組成的組。
53.如權(quán)利要求39所述的重組核酸分子，其進(jìn)一步包含植物啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可操作地與所述第一組DNA序列連接。
54.如權(quán)利要求53所述的重組核酸分子，其中所述的植物啟動(dòng)子是FAD2-1A啟動(dòng)子，7Sα啟動(dòng)子或7Sα′啟動(dòng)子。
55.如權(quán)利要求39所述的重組核酸分子，其中所述的第二組DNA序列在表達(dá)時(shí)能夠提高至少兩種下述基因的內(nèi)源性表達(dá)，所述基因選自由β-酮脂酰基-ACP合酶I基因、β-酮脂?；?ACP合酶IV基因和δ-9去飽和酶基因所組成的組。
56.如權(quán)利要求39所述的重組核酸分子，其中所述的第二組DNA序列在表達(dá)時(shí)能夠提高β-酮脂酰基-ACP合酶I基因、β-酮脂?；?ACP合酶IV基因和δ-9去飽和酶基因的內(nèi)源性表達(dá)。
57.如權(quán)利要求39所述的重組核酸分子，其中所述的第一組DNA序列和所述的第二組DNA序列排列成單順反子構(gòu)型。
58.如權(quán)利要求39所述的重組核酸分子，其中所述的第二組DNA序列和第二組DNA序列排列成多順反子構(gòu)型。
59.一種重組的核酸分子，其包括第一組DNA序列，該序列在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)能夠抑制FAD2基因和FAD3基因的內(nèi)源性表達(dá)，其中所述的第一組DNA序列包含第一非編碼序列，該非編碼序列表達(dá)與FAD2基因的非編碼區(qū)有至少90％同一性的第一RNA序列；第一反義序列，該反義序列表達(dá)能夠與第一RNA序列形成雙鏈RNA分子的第一反義RNA序列；第二非編碼序列，該第二非編碼序列表達(dá)與FAD3基因的非編碼區(qū)有至少90％同一性的第二RNA序列；和第二反義序列，該第二反義序列表達(dá)能夠與第二RNA序列形成雙鏈RNA分子的第二反義RNA序列；和第二組DNA序列，該第二組DNA序列在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)能夠提高至少一種下述基因的內(nèi)源性表達(dá)，所述基因選自由β-酮脂?；?ACP合酶I基因、β-酮脂酰基-ACP合酶IV基因和δ-9去飽和酶基因組成的組。
60.如權(quán)利要求59所述的重組核酸分子，其中所述FAD2基因的非編碼區(qū)選自由FAD2-1A內(nèi)含子序列、FAD2-1A 3′UTR序列和FAD2-1A 5′UTR序列組成的組。
61.如權(quán)利要求59所述的重組核酸分子，其中所述FAD3基因的非編碼區(qū)選自由FAD3-1A內(nèi)含子序列、FAD3-1A 3′UTR序列和FAD3-1A 5′UTR序列組成的組。
62.如權(quán)利要求59所述的重組核酸分子，其中所述FAD3基因的非編碼區(qū)選自由FAD3-1B內(nèi)含子序列、FAD3-1B 3′UTR序列和FAD3-1B 5′UTR序列組成的組。
63.如權(quán)利要求59所述的重組核酸分子，其中第一組DNA序列表達(dá)為RNA轉(zhuǎn)錄體，該轉(zhuǎn)錄體能夠形成單一的雙鏈RNA分子。
64.如權(quán)利要求59所述的重組核酸分子，其進(jìn)一步包含間隔區(qū)序列，該間隔區(qū)序列將第一和第二反義序列與第一和第二非編碼序列分離，以便第一組DNA序列在表達(dá)時(shí)能夠形成單一的雙鏈RNA分子。
65.如權(quán)利要求64所述的重組核酸分子，其中所述的間隔區(qū)序列是可剪切的內(nèi)含子序列。
66.如權(quán)利要求65所述的重組核酸分子，其中所述的可剪切內(nèi)含子序列是可剪切的FAD3內(nèi)含子#5序列或可剪切的PDK內(nèi)含子序列。
67.如權(quán)利要求59所述的重組核酸分子，其中所述的FAD3基因的非編碼區(qū)是FAD3-1A序列，和其中所述的第一組DNA序列進(jìn)一步包含第三非編碼序列，該第三非編碼序列表達(dá)與FAD3-1B基因的非編碼區(qū)有至少90％的同一性的第三RNA序列，和第三反義序列，其表達(dá)能夠與第三RNA序列形成雙鏈RNA分子的第三反義RNA序列。
68.如權(quán)利要求59所述的重組核酸分子，其進(jìn)一步包含第三非編碼序列，該第三非編碼序列能夠表達(dá)與FATB基因的非編碼區(qū)有至少90％的同一性的第三RNA序列；和第三反義序列，該第三反義序列能夠表達(dá)與第三RNA序列形成雙鏈RNA分子的第三反義RNA序列。
69.如權(quán)利要求68所述的重組核酸分子，其中所述的FATB序列選自由FATB內(nèi)含子序列、FATB 3′UTR序列和FATB 5′UTR序列組成的組。
70.一種重組核酸分子，其包括第一組DNA序列，該序列在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)能夠抑制FAD2基因和FAD3基因的內(nèi)源性表達(dá)；和第二組DNA序列，該序列包含第一編碼序列，其能夠表達(dá)CP4EPSPS基因，和第二編碼序列，其在表達(dá)時(shí)能夠提高下述基因的內(nèi)源性表達(dá)，所述基因選自由β-酮脂?；?ACP合酶I基因、β-酮脂?；?ACP合酶IV基因和δ-9去飽和酶基因組成的組。
71.如權(quán)利要求70所述的重組核酸分子，其中所述的第一組DNA序列和所述的第二組DNA序列位于單一的T-DNA區(qū)域。
72.如權(quán)利要求70所述的重組核酸分子，其中所述的第一組DNA序列和所述的第二編碼序列位于第一T-DNA區(qū)域，并且所述的第一編碼序列位于第二T-DNA區(qū)域。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物遺傳學(xué)領(lǐng)域，其中提供了與脂肪酸合成途徑中多個(gè)基因的協(xié)同調(diào)節(jié)相關(guān)的重組核酸分子、構(gòu)建體和其它物質(zhì)。特別是，本發(fā)明的物質(zhì)與在脂肪酸合成途徑中能夠同時(shí)提高特定基因的表達(dá)以及同時(shí)抑制特定的其它基因的表達(dá)相關(guān)，本發(fā)明也提供整合了這些物質(zhì)的植物，特別是整合了這些構(gòu)建體的植物，其中該植物顯示出改變的種子油組合物。
文檔編號(hào)A01H5/00GK1655669SQ03811493
公開日2005年8月17日 申請(qǐng)日期2003年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月21日
發(fā)明者J·J·費(fèi)拉蒂, N·A·布林格, K·德赫斯 申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)有限公司