專利名稱：體外受精的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及卵母細(xì)胞與精子的體外共培養(yǎng)、體外受精(IVF)和受精配子的體外培養(yǎng)，其中培養(yǎng)條件包括整個培養(yǎng)周期的低氧壓或培養(yǎng)周期的各個階段的低氧壓，或者培養(yǎng)條件包括整個培養(yǎng)周期中的氧壓變化或培養(yǎng)周期的各個階段的氧壓變化。本發(fā)明還涉及未成熟卵母細(xì)胞或精子的體外成熟(IVM)、成熟卵母細(xì)胞與精細(xì)胞共培養(yǎng)以使卵子受精。
背景技術(shù)：
在自然界中，受精過程是精子細(xì)胞沉積到雌性溫血動物(包括人類在內(nèi))體內(nèi)，然后與卵母細(xì)胞結(jié)合并融合。然后該受精卵母細(xì)胞分裂形成胚胎。近幾十年來，輔助生殖技術(shù)的應(yīng)用使得科學(xué)家和臨床醫(yī)師能夠干預(yù)這些事件，從而治療一些個體的不孕癥或者能夠?qū)⒕?、卵母?xì)胞或胚胎貯存起來以備在其它地點和時間使用。體外受精(IVF)包括卵子的采集，例如通過腹腔鏡檢查進(jìn)行采集，然后將卵子與精子混合，培養(yǎng)胚胎后將這些胚胎轉(zhuǎn)移到雌性動物的子宮腔內(nèi)而使其繼續(xù)發(fā)育。最近的創(chuàng)新是引入了胞質(zhì)內(nèi)精子注射技術(shù)(ICSI)，該技術(shù)是將精子顯微注射到卵子的胞質(zhì)內(nèi)。
在所述方法的每一個步驟中，體外干預(yù)降低了正常的存活率和精子、卵母細(xì)胞以及胚胎的功能。眾多的研究已經(jīng)致力于對這些方法的改進(jìn)；然而，仍然不能獲得徹底的成功。例如，不到20％的IVF嘗試能夠使孩子出生。卵母細(xì)胞和胚胎在培養(yǎng)后明顯地喪失了功能。因此，盡管已經(jīng)開展了幾十年的工作，但是在輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域中，尤其是在配子和胚胎的處理、培養(yǎng)和貯存方面還留有很大的改革空間。
尤其需要改進(jìn)支持哺乳動物卵母細(xì)胞和胚胎的培養(yǎng)條件。經(jīng)體外受精或轉(zhuǎn)移的胚胎有很多在成熟前都停止了發(fā)育。結(jié)果對經(jīng)濟(jì)和人類水平都造成了影響。多次人類生育治療計劃涉及卵母細(xì)胞或胚胎的體外受精或轉(zhuǎn)移。人類生育治療的成功率并不高。由于成功率低，給經(jīng)濟(jì)和感情的投入帶來了很大的損失。因此提高成功率是非常有益的。造成低成功率的眾多原因之一是胚胎通常不能在體外正常生長和發(fā)育。改進(jìn)培養(yǎng)條件以便更好地支持胚胎生長不僅提高了生育治療的成功率而且還降低了由治療導(dǎo)致的多胞胎率。由于目前方法的成功率一般較低，所以醫(yī)生通常植入多個胚胎以便增加妊娠的可能性。然而多個胚胎的植入也同樣增加了多胞胎的可能性。如果每個胚胎存活的可能性較高，那么可想而知同時植入多個胚胎的需要程度也就降低了，而且多胞胎的幾率也就降低了。
現(xiàn)有技術(shù)記載了多種培養(yǎng)條件。US6140121中記載了一氧化氮對體外細(xì)胞如卵母細(xì)胞和胚胎的存活和發(fā)育具有不利的影響，尤其是在共培養(yǎng)系統(tǒng)中。向這種系統(tǒng)中添加一氧化氮抑制劑如血紅蛋白可以消除該有害作用，這對體外哺乳動物卵母細(xì)胞、胚胎或其它細(xì)胞是有利的。
美國專利申請US20010028878記載了一種通過將未成熟人類卵母細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-30小時而使人類卵母細(xì)胞在體外成熟的方法。該成熟終點是分裂中期II。
US6140121記載了促進(jìn)生殖細(xì)胞和胚胎的存活和功能的方法以及組合物。精子、卵母細(xì)胞和胚胎的體內(nèi)或體外存活和功能通過利用含阿拉伯糖、半乳糖和/或己糖醛酸的多糖而得到改進(jìn)。尤其是，含這種多糖的非殺精潤滑油(例如阿拉伯膠、果膠或半乳糖醛酸)提高了性交、人工授精或精液采集過程中精子的授精率。
類似地，一種含有多糖的冷凍培養(yǎng)基提高了精子、卵母細(xì)胞或胚胎的存活力，所述多糖包括阿拉伯糖、半乳糖和/或己糖醛酸US6110741記載了用于胚胎培養(yǎng)的含促性腺激素釋放素的組合物和體外受精方法。在添加了外源性促性腺激素釋放素(GnRH)的條件下培育靈長目動物胚胎導(dǎo)致絨毛膜促性腺激素產(chǎn)生量的增加，并伴有胚胎的存活力和著床力的提高。采用GnRH對體外受精的胚胎進(jìn)行的治療可被用來促進(jìn)植入。GnRH的激動劑降低了胚胎的著床力，因而被用作受精后的避孕。
US6050935記載了一種陰道受精方法和包含主腔室(main chamber)和微腔(micro chamber)的培養(yǎng)器。
US5882928記載了哺乳動物卵母細(xì)胞體外成熟和受精的方法。一種體外受精方法包括在含卵母細(xì)胞成熟抑制劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動物未成熟卵母細(xì)胞，該卵母細(xì)胞是在哺乳動物月經(jīng)周期的極早期從哺乳動物的卵巢中取出的，除去所述抑制劑并使所述卵母細(xì)胞成熟和受精以便生成用于后來植入子宮的胚胎。優(yōu)選，所述抑制劑是dbcAMP。
US 5837543記載了一個人類胚胎共培養(yǎng)系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中，源自女性體內(nèi)的卵母細(xì)胞與人輸卵管上皮細(xì)胞的單層培養(yǎng)物接觸；對所述卵母細(xì)胞授精；以及將胚胎移回到所述的女性體內(nèi)。
US 5730777記載了一種用于在密封腔室內(nèi)的氣態(tài)環(huán)境下進(jìn)行操作的裝置，該裝置包括i)形成第一腔室的第一腔壁，所述第一腔室內(nèi)是氣態(tài)環(huán)境和ii)形成第二個腔室的第二腔壁，該第二腔壁基本上將第一腔室密封起來，該第二腔室在第一與第二腔壁之間包含氣態(tài)環(huán)境。
US 4892830記載了一種可進(jìn)行環(huán)境調(diào)節(jié)的溫育箱，在該溫育箱內(nèi)孵育腔室的外殼大大地減弱了波長小于約500nm的光線的傳遞，從而使得腔室內(nèi)生物學(xué)物質(zhì)免受短波長光線的有害作用。該溫育箱還包括用于檢測腔室內(nèi)的氧氣和二氧化碳濃度的傳感器和用于將二氧化碳、氮氣或氧氣加入到溫育箱內(nèi)的氣體環(huán)境中從而將二氧化碳和氧氣維持在所需水平的裝置(mean)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空氣中的標(biāo)準(zhǔn)氧濃度(21％)對小鼠的受精卵和前期胚胎有害。然而如果將氧氣濃度降到5-10％，則沒有觀察到該抑制作用而且胚胎繼續(xù)發(fā)育。
WO9830676記載一種用于細(xì)胞和組織，尤其是敏感細(xì)胞和組織如卵母細(xì)胞、受精卵母細(xì)胞和植前(pre-implantation)-胚胎的方法和溫育箱，所述敏感細(xì)胞和組織需要高度穩(wěn)定的適于體外發(fā)育的物理和化學(xué)環(huán)境，其被培養(yǎng)在浸沒在恒溫調(diào)控的液體浴中的密封容器中，該容器具有適宜的內(nèi)部氣體環(huán)境，該氣體環(huán)境含有合適濃度的二氧化碳、氧氣和濕度。
WO9967364記載了一種用于早期胚胎向胚泡期增殖的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基含有效量的人GM-CSF從而提高了發(fā)育后能轉(zhuǎn)移有效胚泡的胚泡前胚胎的比率。它還記載了一種生成人早期胚胎以便轉(zhuǎn)移胚泡的培養(yǎng)方法。該方法包括在含有效量的人GM-CSF的培養(yǎng)基中和在提高有效胚泡轉(zhuǎn)移率的條件下將胚胎體外培育一段時間的步驟。還記載了包括使人早期胚胎生長以便轉(zhuǎn)移有效胚泡的培養(yǎng)方法在內(nèi)的IVF方案。
WO0032140記載了以下內(nèi)容與各種IVF中采用的將人生殖細(xì)胞浸沒在單一培養(yǎng)基中的方法不同，該專利文獻(xiàn)提供了一種方法，通過該方法生殖細(xì)胞可以象各種IVF方法一樣移動(move)通過一系列不同的培養(yǎng)基。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于制備質(zhì)量優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的哺乳動物前期胚胎(pre-embryo)的方法和系統(tǒng)，由此提高了利用該方法獲得的前期胚胎通過體外受精妊娠的成功率。利用經(jīng)本發(fā)明方法獲得的前期胚胎還可以得到高質(zhì)量的干細(xì)胞。
用于體外制備哺乳動物前期胚胎的所述系統(tǒng)包含·用于獲得哺乳動物卵母細(xì)胞的裝置(means)，和·用于獲得哺乳動物精子的裝置，和·一個具有至少兩個獨立的氣密腔室(air-tight chamber)的設(shè)備，其中一個腔室中的氧壓(oxygen tension)可以獨立于另一個腔室的氧壓而進(jìn)行變化，所述至少兩個獨立的氣密腔室構(gòu)成了主腔室(main chamber)和至少一個駐留室(residence chamber)，·所述設(shè)備包含至少一個入口，該入口能夠與用于獲得哺乳動物卵母細(xì)胞和/或哺乳動物精子的裝置互通(communication)，·一個用于取出前期胚胎的出口，以及·所述至少兩個腔室之間的一個接口(communication port)，該接口使得卵母細(xì)胞、精子和/或前期胚胎能夠在兩個腔室之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移。
一方面，所述系統(tǒng)被用于培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物。原則上所有細(xì)胞培養(yǎng)物都可以在所述系統(tǒng)中進(jìn)行培養(yǎng)，但是優(yōu)選是利用該系統(tǒng)培養(yǎng)配子、胚胎、胚泡、干細(xì)胞和干細(xì)胞系。
所述系統(tǒng)能以不同的方式被用來培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物。一方面，所述用于體外制備哺乳動物前期胚胎的方法包括下列步驟a1)提供哺乳動物卵母細(xì)胞，a2)提供哺乳動物精子，b)培養(yǎng)卵母細(xì)胞和精子，c)用精子使卵母細(xì)胞受精從而獲得受精卵母細(xì)胞，和d)使受精卵母細(xì)胞分裂從而獲得多細(xì)胞前期胚胎，其中a1)或a2)中的至少一個步驟是在氧壓低于15％.的條件中進(jìn)行的。
另一方面，所述用于體外制備哺乳動物前期胚胎的方法包括下列步驟a)提供選自哺乳動物卵母細(xì)胞和哺乳動物精子的配子，b)培養(yǎng)所述卵母細(xì)胞和精子，c)用精子使卵母細(xì)胞受精從而獲得受精卵母細(xì)胞，和
d)使受精卵母細(xì)胞分裂從而獲得多細(xì)胞前期胚胎，其中培養(yǎng)是在能夠進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的氧壓下進(jìn)行，且其中至少一個步驟包括氧壓的變化。
一方面本發(fā)明包括一種用于植入前期胚胎的方法，包括按照本文進(jìn)一步描述的方法培養(yǎng)卵母細(xì)胞和精子，并將得到的前期胚胎移入雌性哺乳動物的子宮內(nèi)。
而且高質(zhì)量的前期胚胎還可用于胚胎干細(xì)胞的生產(chǎn)。高質(zhì)量的胚胎含有內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass)數(shù)量增加的細(xì)胞，結(jié)果導(dǎo)致更多干細(xì)胞發(fā)育。
所述生產(chǎn)干細(xì)胞的方法包括a)提供本文記載的多細(xì)胞前期胚胎，b)分離出a)中的多細(xì)胞前期胚胎，c)從b)中的前期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出細(xì)胞，d)在基質(zhì)膠中培養(yǎng)從所述內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出的細(xì)胞，e)獲得干細(xì)胞。
另一方面是獲得的干細(xì)胞，該干細(xì)胞是由本文記載的方法從多細(xì)胞前期胚胎中獲得的。
一方面是干細(xì)胞，其中所述干細(xì)胞是穩(wěn)定的，也就是說染色體內(nèi)或細(xì)胞表面抗原性不發(fā)生突變或其它遺傳改變。
干細(xì)胞可以發(fā)育成一個或多個干細(xì)胞系。一方面涉及從由本文記載的方法產(chǎn)生的干細(xì)胞得到的干細(xì)胞系。
可以誘導(dǎo)干細(xì)胞產(chǎn)生多種分化細(xì)胞。因此重要的是了解干細(xì)胞系的起源和用于培養(yǎng)所述干細(xì)胞系的培養(yǎng)條件。
一方面所涉及的干細(xì)胞包裝產(chǎn)品包括°由本文其它部分記載的多細(xì)胞前期胚胎發(fā)育而成的干細(xì)胞°記載干細(xì)胞和獲得所述干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)條件的說明書。
定義本文中的術(shù)語“凋亡(apoptosiss)”應(yīng)當(dāng)被理解為受控制的細(xì)胞死亡，其中細(xì)胞本身破壞了其細(xì)胞核DNA，也就是DNA鏈發(fā)生斷裂。
本文中的術(shù)語“裂球(blastomer)”是指卵裂后的胚胎中出現(xiàn)的小細(xì)胞。
本文中的術(shù)語“胚泡”和“多細(xì)胞-前期胚胎”可以互換使用，用來描述由受精卵早期分裂后的細(xì)胞簇組成的胚胎，所述細(xì)胞簇由能夠形成胎盤的外層細(xì)胞和能夠形成胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)組成。
本文中的術(shù)語“氧壓變化”是指氧壓降低或增加的情況。所述變化在細(xì)胞發(fā)育階段進(jìn)行，該變化基于視覺或圖像上的判斷或基于對細(xì)胞培養(yǎng)物的發(fā)育時間框架的了解或基于前期胚胎代謝的變化。
本文中的術(shù)語“胚胎”是指構(gòu)成具有兩個原核(pro-nucleus)的細(xì)胞的受精卵，或已經(jīng)進(jìn)行了細(xì)胞分裂和由兩個細(xì)胞形成一個細(xì)胞簇的受精卵。
本文中的術(shù)語“配子”是指雌性動物的未受精卵或雄性動物的精子。
本文中的術(shù)語“植入”是指將胚胎轉(zhuǎn)移到雌性動物的子宮內(nèi)。
本文中的術(shù)語“IVM”是指“體外成熟”。
本文中的術(shù)語“IVF”是指“體外受精”。
本文中的術(shù)語“低氧壓”是指低于15％的氧壓。
本文中的術(shù)語“MF-II”是指處于第二次細(xì)胞減數(shù)分裂中期的卵母細(xì)胞。MF-II卵母細(xì)胞具有一個極體、膨脹的(expanded)卵丘(cumulus)復(fù)合體并且最終經(jīng)歷生發(fā)泡的裂解。
本文中的術(shù)語“卵母細(xì)胞”是指雌性動物的配子。該配子可以是未成熟的也可以是成熟的。
本文中的術(shù)語“氧壓”是指組織的氣相中的氧濃度或細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)周圍的氧濃度。
本文中的術(shù)語“氧壓單位”被用來描述氧壓的變化，例如從3％到5％的變化是2個單位的變化。
本文中的術(shù)語“初級卵母細(xì)胞”是指未成熟卵母細(xì)胞。該卵母細(xì)胞直到第一次減數(shù)分裂結(jié)束后才成熟。
本文中的術(shù)語“前期II(prophase II)”是指第二次減數(shù)分裂的前期(prophase)。
本文中的術(shù)語“精子”是指雄性動物的配子。所述精子可以是成熟的或不成熟的，在成熟期，它能夠穿透卵母細(xì)胞并使其受精。
本文中的術(shù)語“干細(xì)胞”是指得自胚泡的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的未分化多潛能細(xì)胞或全潛能細(xì)胞。
本文中的術(shù)語“干細(xì)胞系”是指得自干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，該干細(xì)胞系是穩(wěn)定的，也就是說它經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)而不發(fā)生變化。干細(xì)胞系可以是部分分化的或未分化的，即多潛能的或全潛能的，多潛能是指它能在動物體內(nèi)發(fā)育成一些而不是所有的細(xì)胞類型，或者全潛能是指能夠分化成所有的細(xì)胞類型。
本文中的術(shù)語“合子”是指受精卵或1-細(xì)胞胚胎。
本文中的術(shù)語“透明帶”是指胚胎殼。


圖1表示基于VanAbbel等的胚胎評價體系。
圖2表示累積胚胎評價(CES)系統(tǒng)。
圖3表示溫育箱。
發(fā)明詳述以下說明書公開了一種體外制備哺乳動物前期胚胎的方法，該方法包括以下步驟a)提供選自哺乳動物卵母細(xì)胞和哺乳動物精子的配子，b)培養(yǎng)所述卵母細(xì)胞和精子，c)用精子使卵母細(xì)胞受精從而獲得受精卵母細(xì)胞，以及或者d)使受精卵母細(xì)胞分裂從而獲得多細(xì)胞前期胚胎，其中至少步驟a)或b)是在氧壓低于15％的條件中進(jìn)行的，或者e)使受精卵母細(xì)胞分裂從而獲得多細(xì)胞前期胚胎，其中所述培養(yǎng)是在能夠進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的氧壓下進(jìn)行且其中至少一個步驟包括氧壓的變化。所述氧壓變化包括在單個步驟中至少是在兩種不同的氧壓下培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物。所述氧壓變化隨著其它部分記載的細(xì)胞培養(yǎng)物的發(fā)育階段而進(jìn)行。具體地講，在環(huán)境氧壓下處理(handling)或觀察細(xì)胞培養(yǎng)物并不是所述氧壓變化，這是本發(fā)明的目的。
通過改變或降低IVF過程中一些步驟的氧壓或者改變或降低所有IVF步驟的氧壓，可以提高配子和胚胎的質(zhì)量。
在包括氧濃度為20-21％在內(nèi)的環(huán)境條件下培養(yǎng)哺乳動物配子、體外受精的卵母細(xì)胞或胚胎被認(rèn)為抑制了配子和卵子。將氧濃度降到1％至15％，或?qū)⒀鯘舛冉档?％至19％并且在a)、b)、c)和e)中的一個步驟或所有步驟中改變氧壓以便使更多的胚胎可以達(dá)到胚泡期。人類體外成熟和體外授精技術(shù)中存在的問題之一是游離活性氧(reactive oxygen species)的活化和濃度，所述游離活性氧最初由高氧壓產(chǎn)生并且在制備精子和體外受精過程中進(jìn)行補(bǔ)給。通過在低氧壓或變化的氧壓下處理和培養(yǎng)配子和胚胎，并且將卵母細(xì)胞和精子共培養(yǎng)，使IVF方法獲得了改進(jìn)，令人驚奇的是，IVF方法的改進(jìn)是在與滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)的情況下獲得的。
在如上所述的發(fā)明中，a)，b)，c)和d)中的一個或更多步驟可以在低氧壓下進(jìn)行，而在如上所述的發(fā)明中，a)，b)，c)和d)中的一個或更多步驟也可以在低氧壓或高氧壓下進(jìn)行。
本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是其中至少a)步驟的一部分步驟和至少一個其它步驟是在氧壓低于15％的條件中進(jìn)行的體外培養(yǎng)方法。在一個實施方案中，步驟a)和b)是在低氧壓時進(jìn)行的。更優(yōu)選的實施方案是其中a)，b)，c)和d)中的至少3個步驟是在氧壓低于15％的條件中進(jìn)行的方法。在另一個實施方案中，步驟a)，b)和c)是在低氧壓時進(jìn)行的。在另一個實施方案中，步驟b)、c)和d)是在低氧壓時進(jìn)行的。在另一個實施方案中，步驟a)，c)和d)是在低氧壓時進(jìn)行的。在另一個實施方案中，步驟a)，b)，c)和d)都是在低氧壓時進(jìn)行的。
所述方法的另一個優(yōu)選實施方案是其中步驟d)的氧壓比b)和c)中的任一個步驟的氧壓高。
所述方法的另一個優(yōu)選實施方案是其中a)，b)，c)和d)中的所有步驟以及將胚胎轉(zhuǎn)移到子宮內(nèi)的步驟是在氧壓低于20％，諸如低于15％、諸如低于13％、諸如低于11％、諸如低于10％、諸如低于9％、諸如低于8％、諸如低于7％、諸如低于6％、諸如低于5％、諸如低于4％、諸如低于3％、諸如低于2％、諸如低于1％時進(jìn)行的。
本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是本文記載的其中氧壓的變化發(fā)生在步驟a)的體外培養(yǎng)方法。本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案是本文記載的其中氧壓的變化發(fā)生在步驟b)的體外培養(yǎng)方法。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是本文記載的其中氧壓的變化發(fā)生在步驟c)的體外培養(yǎng)方法。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是本文記載的其中氧壓的變化發(fā)生在步驟e)的體外培養(yǎng)方法。
本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是本文記載的其中氧壓的變化發(fā)生在步驟a)和步驟b)的體外培養(yǎng)方法。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是本文記載的其中氧壓的變化發(fā)生在步驟a)和步驟c)的體外培養(yǎng)方法。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是本文記載的其中氧壓的變化發(fā)生在步驟a)和步驟e)的體外培養(yǎng)方法。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是本文記載的其中氧壓的變化發(fā)生在步驟b)和步驟c)的體外培養(yǎng)方法。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是本文記載的其中氧壓的變化發(fā)生在步驟b)和步驟e)的體外培養(yǎng)方法。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是本文記載的其中氧壓的變化發(fā)生在步驟c)和步驟e)的體外培養(yǎng)方法。
特別是在卵母細(xì)胞的成熟過程中氧壓的升高是優(yōu)選的。
本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是本文記載的其中氧壓的變化發(fā)生在步驟a)、b)和c)的體外培養(yǎng)方法。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是本文記載的其中氧壓的變化發(fā)生在步驟a)、b)和e)的體外培養(yǎng)方法。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是本文記載的其中氧壓的變化發(fā)生在步驟a)、c)和e)的體外培養(yǎng)方法。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是本文記載的其中氧壓的變化發(fā)生在步驟b)、c)和e)的體外培養(yǎng)方法。
本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是本文記載的其中氧壓的變化發(fā)生在步驟a)、b)、c)和e)的體外培養(yǎng)方法。
在一個實施方案中，所述培養(yǎng)條件包括最初被選定濃度在1％至21％之間的氧壓。
在一個實施方案中，氧壓的變化是將氧壓變?yōu)榈陀?0％，例如低于19％，諸如低于18％，例如低于17％，諸如低于16％，例如低于15％，諸如低于14％，例如低于13％，諸如低于12％，例如低于11％，諸如低于10％，例如低于9％，諸如低于8％，例如低于7％，諸如低于6％，例如低于5％，諸如低于4％，例如低于3％，諸如低于2％，例如低于1％。
在另一個實施方案中，氧壓的變化是將氧壓降低至少1個單位，諸如至少2個單位，例如至少3個單位，諸如至少4個單位，例如至少5個單位，例如至少6個單位，諸如至少7個單位，例如至少8個單位，諸如至少9個單位，例如至少10個單位，諸如至少11個單位，例如至少12個單位，諸如至少13個單位，例如至少14個單位，諸如至少15個單位，例如至少16個單位，諸如至少17個單位，例如至少18個單位，諸如至少19個單位。
在另一個實施方案中，氧壓的變化是將氧壓降低1-19個單位，諸如1-18個單位，例如1-17個單位，諸如1-16個單位，例如1-15個單位，諸如1-14個單位，例如1-13個單位，諸如1-12個單位，例如1-11個單位，諸如1-10個單位，例如1-9個單位，諸如1-8個單位，例如1-7個單位，諸如1-6個單位，例如1-5個單位，諸如1-4個單位，例如1-3個單位，諸如1-2個單位。
在一個實施方案中，氧壓的變化是將氧壓變?yōu)楦哂?％，例如高于3％，諸如高于4％，例如高于5％，諸如高于6％，例如高于7％，諸如高于8％，例如高于9％，諸如高于10％，例如高于11％，諸如高于12％，例如高于13％，諸如高于14％，例如高于15％，諸如高于16％，例如高于17％，諸如高于18％，例如高于19％，諸如高于20％，例如高于21％。
在另一個實施方案中，氧壓的變化是氧壓被升高了至少1個單位，諸如至少2個單位，例如至少3個單位，諸如至少4個單位，例如至少5個單位，例如至少6個單位，諸如至少7個單位，例如至少8個單位，諸如至少9個單位，例如至少10個單位，諸如至少11個單位，例如至少12個單位，諸如至少13個單位，例如至少14個單位，諸如至少15個單位，例如至少16個單位，諸如至少17個單位，例如至少18個單位，諸如至少19個單位。
在另一個實施方案中，氧壓的變化是將氧壓升高至少1-3個單位，諸如至少2-5個單位，諸如至少3-7個單位，諸如至少4-9個單位，諸如至少5-11個單位，例如至少6-13個單位，諸如至少8-15個單位，例如至少10-18個單位，諸如至少12-20個單位。
在一個優(yōu)選的實施方案，發(fā)生上述變化的氧壓被調(diào)節(jié)到高于或低于上述的最初氧壓。因此發(fā)生變化的氧壓被調(diào)節(jié)到1％至21％的濃度。
氧壓的監(jiān)控和調(diào)節(jié)可以通過本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何方法來進(jìn)行。
所述方法的另一個優(yōu)選實施方案是其中所述條件包括氧壓的升高以及后來氧壓的降低。所述氧壓的升高是至少2個單位，且所述氧壓的升高維持至少30分鐘。在一個實施方案中，氧壓至少是0.5％，最大是20％。特別是使卵母細(xì)胞成熟時，氧壓的升高是優(yōu)選的。
在另一個實施方案中，氧壓的變化進(jìn)行至少1分鐘，例如至少2分鐘，諸如至少3分鐘，例如至少4分鐘，諸如至少5分鐘，例如至少6分鐘，諸如至少7分鐘，例如至少8分鐘，諸如至少9分鐘，例如至少10分鐘，諸如至少11分鐘，例如至少12分鐘，諸如至少13分鐘，例如至少14分鐘，諸如至少15分鐘，例如至少16分鐘，諸如至少20分鐘，例如至少30分鐘，諸如至少45分鐘，例如至少1小時，諸如至少1.5小時，例如至少2小時，諸如至少2.5小時，例如至少3小時，諸如至少4小時，例如至少5小時，諸如至少6小時，例如至少7小時，諸如至少8小時，例如至少9小時，諸如至少10小時。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所提到的組合方式中的a)，b)，c)和e)中的每個步驟中氧壓的變化按照上述記載的持續(xù)時間進(jìn)行一次或多次。
在一個實施方案中，上述的變化持續(xù)時間被應(yīng)用于所提到的a)，b)，c)和e)步驟的每種組合方式中，其中在一個或多個步驟中氧濃度發(fā)生變化。
所述方法的另一個優(yōu)選實施方案是其中氧壓根據(jù)細(xì)胞所處周期或階段或細(xì)胞結(jié)構(gòu)和卵母細(xì)胞或胚胎的條件或質(zhì)量進(jìn)行調(diào)節(jié)。
在一個實施方案中，如本文所記載的細(xì)胞培養(yǎng)包括在本發(fā)明b)步驟中雌性和雄性配子的共-培養(yǎng)。所述共培養(yǎng)可以進(jìn)行至少1分鐘，諸如至少2分鐘，諸如至少5分鐘，諸如至少10分鐘，諸如至少30分鐘，諸如至少1小時，諸如至少2小時，諸如至少3小時，諸如至少4小時，諸如至少5小時，諸如至少10小時，諸如至少15小時，諸如至少20小時，諸如至少25小時，諸如至少30小時，諸如至少35小時，諸如至少40小時，諸如至少45小時，諸如至少50小時。
在另一個實施方案中，所述氧壓變化進(jìn)行至少1分鐘，例如至少2分鐘，諸如至少3分鐘，例如至少4分鐘，諸如至少5分鐘，例如至少6分鐘，諸如至少7分鐘，例如至少8分鐘，諸如至少9分鐘，例如至少10分鐘，諸如至少11分鐘，例如至少12分鐘，諸如至少13分鐘，例如至少14分鐘，諸如至少15分鐘，例如至少16分鐘，諸如至少20分鐘，例如至少30分鐘，諸如至少45分鐘，例如至少1小時，諸如至少1.5小時，例如至少2小時，諸如至少2.5小時，例如至少3小時，諸如至少4小時，例如至少5小時，諸如至少6小時，例如至少7小時，諸如至少8小時，例如至少9小時，諸如至少10小時。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所提到的組合方式中a)，b)，c)和e)每個步驟中氧壓的變化按照上述記載的持續(xù)時間可進(jìn)行一次或多次。
在一個實施方案中，上述的變化持續(xù)時間被應(yīng)用于所提到的a)，b)，c)和e)步驟的每種組合方式中，其中在一個或多個步驟中氧濃度發(fā)生變化。
卵母細(xì)胞和精子共培養(yǎng)的目的是提高卵母細(xì)胞的受精率。而且，所述培養(yǎng)條件與卵母細(xì)胞和精子的培養(yǎng)條件相同，也能夠提高受精率。
配子以上記載的發(fā)明可以利用任何種類的能夠參與胚胎形成的細(xì)胞來進(jìn)行，這種細(xì)胞的實例包括哺乳動物的卵母細(xì)胞和精子細(xì)胞。哺乳動物卵母細(xì)胞和哺乳動物精子是分別從雌性哺乳動物或雄性哺乳動物獲得的配子。這些哺乳動物可以是，但不限于，人、耕畜如牛(cow)、豬、馬、山羊、綿羊、鹿，其它種類的家畜如狗，貓，實驗動物如兔、大鼠、小鼠、猴子或瀕于滅絕的動物種類或受到威脅的動物種類(包括但不限于老虎、獅子、熊貓、大猩猩(gorilla)、鯨)，或由人控制配對的的其它哺乳動物，包括但不限于，耕畜育種、家畜育種或使得在限制動物找到配偶的條件下生存的動物(動物園動物)配對，尤其是要避免任何近交的危險。
在一個優(yōu)選的實施方案中，哺乳動物卵母細(xì)胞和哺乳動物精子是從牛獲得的配子。在另一個優(yōu)選的實施方案中，哺乳動物卵母細(xì)胞和哺乳動物精子是從豬獲得的配子。在另一個優(yōu)選的實施方案中，哺乳動物卵母細(xì)胞和哺乳動物精子是從馬獲得的配子。在一個更優(yōu)選的實施方案中，哺乳動物卵母細(xì)胞和哺乳動物精子是從人獲得的配子。
卵母細(xì)胞在多數(shù)情況下，上述卵母細(xì)胞是從希望懷孕的雌性母本獲得的。而精子細(xì)胞是從可能是雄性配偶的雄性動物獲得的，或者配子是從成為配偶的雌性和雄性動物獲得。然而在一些情況下，優(yōu)選使用得自雌性或雄性供體的細(xì)胞。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述卵母細(xì)胞是從雌性動物卵巢中獲得的未成熟卵母細(xì)胞。該卵母細(xì)胞是未成熟的，但一離開卵巢它就成為成熟卵母細(xì)胞。在雌性胚胎的卵巢中，初級卵母細(xì)胞啟動第一次減數(shù)分裂的前期，在該階段中，周圍的上皮細(xì)胞進(jìn)行發(fā)育且原始卵泡形成。含有處于第一次減數(shù)分裂前期與中期之間的核網(wǎng)期的卵母細(xì)胞的原始卵泡構(gòu)成靜止期，它從出生前開始直到至少青春期或一直到原始卵泡重新進(jìn)入第一次減數(shù)分裂。進(jìn)入原始卵泡期時，仍處于核網(wǎng)期的初級卵母細(xì)胞開始體積增大，周圍的卵泡細(xì)胞從扁平變成立方形，然后卵母細(xì)胞與卵泡細(xì)胞之間的透明帶發(fā)育。在卵母細(xì)胞和透明帶周圍開始長出厚細(xì)胞層，在該細(xì)胞層內(nèi)側(cè)出現(xiàn)了充滿液體的空間，當(dāng)這些空間融合在一起時就形成了囊(antrum)。當(dāng)所述囊達(dá)到其最大尺寸時，卵泡成熟，被稱作三級卵泡、Graafian卵泡或囊狀卵泡，其直徑達(dá)到6-12mm。一旦卵泡成熟，初級卵母細(xì)胞就恢復(fù)了其第一次減數(shù)分裂，并且該第一次減數(shù)分裂后馬上排卵。第二次減數(shù)分裂緊接在第一次減數(shù)分裂之后開始，而且當(dāng)次級卵母細(xì)胞顯示形成紡錘體時，排卵，并且該卵母細(xì)胞從卵巢排出。在即將排卵前，成熟卵泡的直徑約為15mm。如果卵母細(xì)胞受精，則可以完成第二次減數(shù)分裂。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，卵母細(xì)胞得自初級卵泡、次級卵泡、原囊狀(preantral)卵泡、早期囊狀卵泡或囊狀卵泡。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，獲得了源自處于后原始階段或初級階段的卵泡核網(wǎng)期的卵母細(xì)胞。
正常排卵的婦女在每個月經(jīng)周期將募集(recruit)約300個如上所述的未成熟卵母細(xì)胞。這種蓄積在實際周期前進(jìn)行。在行經(jīng)那一天，仍存在約20-30個未成熟卵母細(xì)胞。正常情況下，在凋亡過程中，除一個卵母細(xì)胞外，其于所有的卵母細(xì)胞都將在排卵前死亡。在第5-10天，約10-15個未成熟卵母細(xì)胞將存在于其直徑為10-12mm的小卵泡中。一些仍在生長而另一些則開始進(jìn)行凋亡過程。任選地本發(fā)明中使用的配子來源于直徑約為8-12mm的卵泡。這種小卵泡的優(yōu)點在于它們以相當(dāng)大的數(shù)目存在而不需重度激素處理，它們可以用超聲檢測并且可以通過超聲引導(dǎo)的陰道卵泡穿刺法來取出卵母細(xì)胞。
卵母細(xì)胞可以通過吸入針而從卵巢中取出。卵母細(xì)胞的獲得通常由兩種常規(guī)方法中的一種方法來實現(xiàn)。第一種，超聲輔助吸引術(shù)是一種較小的手術(shù)操作，可以利用靜脈內(nèi)無痛法(analgesia)來完成。通常，將超聲探頭從陰道插入。所述探頭發(fā)出高頻聲波，這些聲波被轉(zhuǎn)化為骨盆的圖像而顯示于監(jiān)視屏上。當(dāng)識別到一個成熟卵泡時，專業(yè)人員通過陰道將針導(dǎo)入卵泡。利用抽吸裝置將卵子由針內(nèi)取出。這被稱作吸引法。所述針還可以通過腹腔壁或膀胱導(dǎo)入卵泡。這些方法在利用針通過陰道很難接近卵巢和其卵泡時是必需的。腹腔鏡檢是一種通常需要全身麻醉的外科手術(shù)。在手術(shù)室內(nèi)，外科醫(yī)生通過婦女肚臍下或內(nèi)部的切口插入腹腔鏡，所述腹腔鏡是酷似望遠(yuǎn)鏡的長而細(xì)的管子。通過腹腔鏡觀察，外科醫(yī)生將針通過腹腔壁導(dǎo)入卵泡。然后吸出卵子和卵泡液。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，通過取出含有初級、次級或囊狀卵泡的部分或全部卵巢組織并從所述卵巢組織中獲得初級、次級或囊狀卵泡來得到源自卵巢的卵母細(xì)胞。卵母細(xì)胞可以從剛由雌性動物體內(nèi)取出的卵巢組織中獲得，并且進(jìn)一步成熟直到受精階段。卵母細(xì)胞被從卵巢組織中分離出來后還可以被冷藏(cool)或冷凍(freeze)而且進(jìn)一步成熟直到受精階段。從雌性動物體內(nèi)中取出的卵巢組織可以在分離卵母細(xì)胞之前進(jìn)行冷藏或冷凍。
在一個優(yōu)選的實施方案中，被用來收集卵母細(xì)胞的針是注射器的一部分且所述針和所述注射器內(nèi)的氧壓受到控制。針和注射器可以構(gòu)成一個獨立的單元，易于操作而且其中氧壓通過與控制單元連接而被維持在一定的壓值。載有卵母細(xì)胞的注射器被轉(zhuǎn)移到無菌條件下，在該無菌條件下所述卵母細(xì)胞被轉(zhuǎn)到培養(yǎng)基中。所述無菌條件可以構(gòu)成空氣層流臺(laminar airflow bench)或溫育箱的工作區(qū)域。在一種方法中所述卵母細(xì)胞還可被轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)器中，在該容器內(nèi)注射器的針刺穿溫育箱的隔膜，然后無需打開溫育箱就能將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)器內(nèi)。針和注射器還可以與溫育箱直接相連。卵母細(xì)胞被以這種方式通過針和管從卵巢直接轉(zhuǎn)移到溫育箱的培養(yǎng)器中。因此，無論哪種方法，優(yōu)選是在低氧壓下轉(zhuǎn)移卵母細(xì)胞。
在一個實施方案中，用能夠使卵母細(xì)胞成熟的激素治療哺乳動物，然后從該哺乳動物獲得卵母細(xì)胞。總之，有兩次時機(jī)可以收集卵母細(xì)胞。通過對婦女施用激素來收集多個成熟卵母細(xì)胞，或者不對雌性動物進(jìn)行激素治療就收集未成熟卵母細(xì)胞，然后卵母細(xì)胞再進(jìn)行體外成熟?；诩に刂委煹姆椒ㄈ缦滤鲈谔岣吲怕涯芰Φ倪^程中，采用藥物進(jìn)行誘導(dǎo)以使患者的卵巢排出數(shù)個成熟卵子而不象通常每月只發(fā)育出單個卵子。上述過程通常稱為提高卵泡的募集或控制卵巢的過度刺激。根據(jù)方案和患者的具體情況，可以調(diào)整藥物類型和劑量。經(jīng)常是，在7至10天內(nèi)給藥。目前使用的藥物，包括但不限于克羅米芬(clomiphene)檸檬酸鹽、人絕經(jīng)促性腺激素(hCG)和被稱作亮丙瑞林(leuprolide)的促性腺激素釋放激素(GnRH)類似物。多數(shù)這些藥物可以單獨使用或與其它藥物聯(lián)合用藥。
當(dāng)臨近收集卵母細(xì)胞的時間時，用超聲頻繁掃描卵巢來監(jiān)控卵泡的發(fā)育，所述卵泡是供卵子生長的充滿了液體的囊。取血樣測定雌激素的血清濃度，有時也測定促黃體激素(LH)。
雌激素的產(chǎn)生隨著卵泡的發(fā)育增加。LH引發(fā)(trigger)排卵。通過分析超聲和血液檢測結(jié)果，確定出收集或取出卵子的最好時機(jī)。當(dāng)卵泡差不多成熟時(通常是在排卵的1天半前)，注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)。由于大約36小時后進(jìn)行排卵，所以使用hCG能夠控制發(fā)生排卵的時間。HCG刺激婦女的LH的自然釋放，LH的自然釋放通常引發(fā)排卵。該釋放還引起卵子發(fā)生改變以便后來精子進(jìn)入時而受精。
還可以收集未成熟卵母細(xì)胞并將其用于IVF中。用未成熟配子起始的優(yōu)點有若干個。處于不孕癥治療的婦女通常進(jìn)行多天的激素復(fù)雜處理以便得到足夠數(shù)目的成熟前期II卵母細(xì)胞來用于體外受精。該激素治療伴隨疼痛、不適、緊張和卵巢過度刺激綜合癥(一種患者和醫(yī)生感到畏懼的病癥)的危險。這種激素療法被制定用來挽救未成熟卵母細(xì)胞，否則這些未成熟卵母細(xì)胞將發(fā)生凋亡。因此，這些激素是卵巢中進(jìn)行IVF所需的大量卵母細(xì)胞從未成熟到成熟所必需的。如果不施用激素，那么就象正常排卵婦女一樣只有一個卵母細(xì)胞成熟。在凋亡過程開始前，通過從卵巢中釋放這些未成熟卵母細(xì)胞并且在臨床規(guī)定的培養(yǎng)基中使所述卵母細(xì)胞成熟，婦女可以避免激素治療所帶來的風(fēng)險與不適而且仍然具有充足數(shù)目的成熟中期(MF-II)卵母細(xì)胞被用于后來的IVF治療。
在一個優(yōu)選的實施方案中，如上所述的激素治療是利用促性腺激素來進(jìn)行。因此，所述治療可以涉及外源或內(nèi)源激素以及其它作用于FSH或LH受體的藥物。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述激素是促卵泡激素(FSH)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述激素是促黃體激素(LH)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，所述激素是FSH或LH的衍生物或內(nèi)源性相關(guān)激素。
冷凍保存在本發(fā)明的一個實施方案中，上述獲得的卵母細(xì)胞被保存起來以備后用，所述保存就是冷凍保存。當(dāng)按照所述方法收集卵母細(xì)胞時，獲得了多個卵母細(xì)胞，并不是所有這些卵母細(xì)胞立刻進(jìn)行受精過程。在一個實施方案中，保存過程中，卵母細(xì)胞被冷藏到20℃以下，諸如10℃以下，諸如5℃以下。另一實施方案中，在保存過程中，卵母細(xì)胞被冷凍到0℃以下，諸如約-40℃，諸如約-80℃。
在IVF循環(huán)結(jié)束時，通常得到多個可用于移植的胚胎，剩余的胚胎可以按照上述方法保存起來。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，移植四個以上的胚胎具有多胎妊娠的顯著風(fēng)險，然而它并不增加單胎妊娠比率。冷凍保存的優(yōu)點是增加了妊娠的機(jī)會而不需要多次循環(huán)刺激和多次索取卵母細(xì)胞。
被選用于冷凍的胚胎可以在新鮮胚胎轉(zhuǎn)移的當(dāng)天冷凍或者在后來的最多四天內(nèi)冷凍?？梢詫⑴咛シ胖迷诶鋬雠囵B(yǎng)基中并逐步進(jìn)行冷凍。在冷凍過程結(jié)束時，可以將胚胎保存在液氮中。
精子在上述的IVF過程中，需用精子使卵母細(xì)胞受精。所獲得的用于本發(fā)明的精子可以是未成熟的精子，諸如精細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞或成熟精子。由一個初級精母細(xì)胞通過減數(shù)分裂可以得到四個精子，所述減數(shù)分裂包括第一次和第二次減數(shù)分裂。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述精子是在根據(jù)所采用的培養(yǎng)條件確定的氧壓下從雄性動物獲得的。雄性的精子細(xì)胞或精子通常是通過手淫獲得的。另一種收集精細(xì)胞的方法是手術(shù)方法，其中將針導(dǎo)入男子的睪丸，然后將精細(xì)胞吸入針管。另一種方法是通過機(jī)械刺激射精并收集精液而獲得。采用一種已知的洗精液的方法從精液中分離出精子。在該方法中，于試管中將精子與水溶液混合起來。然后將該試管置于離心機(jī)中并以高速旋轉(zhuǎn)。離心力使得重量較大的精細(xì)胞沉淀于液層下。小心移去該液層后再注入新鮮溶液。過1小時左右，一些運動的精子飄浮到液層當(dāng)中。這些精子能被用來使卵子受精。
從患有嚴(yán)重雄性不孕癥的雄性體內(nèi)收集精子，通過針穿刺活組織檢查或顯微外科技術(shù)可以回收到未成熟的精細(xì)胞。未成熟精子細(xì)胞及其周圍的足細(xì)胞由于在培養(yǎng)基中具有抗凋亡活性而使精子受益和成熟。已知睪丸中的凋亡是精子功能喪失的主要因素，尤其是在不孕的雄性中。在雄性動物體內(nèi)，所有有尾精子前體直到全部胞質(zhì)脫離且最終看到正常精子之前都被看成是未成熟的。還可以從死亡的男性或雄性動物獲得未成熟的精子細(xì)胞。而且，如果患者被診斷患有癌癥，可以切下睪丸或卵巢組織并在開始可能導(dǎo)致不孕的處理前冷凍起來以備后來從冷凍組織中提取未成熟配子，其中所述處理如細(xì)胞抑制處理或放射處理。這些不成熟配子可以最終在合成培養(yǎng)基中成熟起來。
在一個實施方案中，所述精子細(xì)胞在被用于授精過程之前被冷藏。在另一個實施方案中，所述精子細(xì)胞在被用于授精過程之前被冷凍。所述冷藏和冷凍過程是為以后利用精子提供機(jī)會的貯存條件。
IVM本發(fā)明的一個實施方案涉及IVF以及IVM，參見上述定義。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及IVM。人類配子的體外成熟是將未成熟人類配子培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)基中。如此源自男性的配子成為未成熟精子細(xì)胞，如此源自女性的配子成為未成熟卵母細(xì)胞。通過從卵巢或睪丸組織中抽吸和提取可以從不孕癥治療的女性或男性獲得未成熟配子。
收集處于體外成熟(IVM)后的不同階段之一的卵母細(xì)胞。在一個實施方案中，從卵泡中分離出未成熟配子。在一個實施方案中，所述卵泡的直徑為1-25mm，諸如2-18mm，諸如3-13mm，諸如5-12mm，諸如7-11mm，諸如8-10mm。
在另一個實施方案中，未成熟配子是初級卵母細(xì)胞。在另一個實施方案中，未成熟配子處于第一次減數(shù)分裂前期。在另一個實施方案中，未成熟配子處于第一次減數(shù)分裂核網(wǎng)期。在另一個實施方案中，未成熟配子處于第一次減數(shù)分裂中期的后期。在另一個實施方案中，卵母細(xì)胞得自初級卵泡。在另一個實施方案中，卵母細(xì)胞得自成熟卵泡。
一個實施方案中，未成熟配子選自初級卵原細(xì)胞或后期卵母細(xì)胞。
在本發(fā)明的一個實施方案中，得自婦女卵巢的未成熟卵母細(xì)胞被確認(rèn)為是具有緊密卵丘質(zhì)(tight cumulus mass)、見不到極體或生發(fā)泡的卵母細(xì)胞。
在一個優(yōu)選的實施方案中，被收集的未成熟配子被培養(yǎng)并發(fā)育成熟直到中期II，該中期II伴有卵丘、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的同步成熟。卵母細(xì)胞的成熟是卵母細(xì)胞發(fā)育的最后階段，它為受精和胚胎發(fā)育作好準(zhǔn)備。其可被分為兩個常規(guī)過程細(xì)胞核的成熟和細(xì)胞質(zhì)的成熟。細(xì)胞核的成熟被定義為減數(shù)分裂的恢復(fù)(resumption)和向MF-II的進(jìn)展，而細(xì)胞質(zhì)成熟被定義為基因組外的變化(該變化是為卵子活化作準(zhǔn)備)、原核形成和早期胚胎發(fā)生。因此未成熟雌性配子應(yīng)當(dāng)被理解為是，通過與成熟精細(xì)胞接觸中止了減數(shù)分裂從而沒能接受來自精細(xì)胞的遺傳物質(zhì)并形成受精細(xì)胞的卵細(xì)胞。MF-II應(yīng)當(dāng)被理解為是具有極體、膨脹的卵丘復(fù)合體并最終經(jīng)歷了生發(fā)泡破裂的卵母細(xì)胞。這些卵母細(xì)胞很容易通過一般用來處理用于IVF的卵母細(xì)胞的常規(guī)技術(shù)來識別。對于人類來說，有可能產(chǎn)生其細(xì)胞核成熟期已經(jīng)進(jìn)行到MF-II的卵母細(xì)胞，但是這些卵母細(xì)胞不能完成植入前的發(fā)育。將未成熟配子從前期培育到中期II的體外成熟過程可以在20至30個小時內(nèi)完成。
在本發(fā)明中，確定細(xì)胞階段的標(biāo)準(zhǔn)不僅是細(xì)胞核的成熟期而且是細(xì)胞質(zhì)和卵丘的膨脹。本發(fā)明的另一個特征在于所述成熟過程完成得更快。因此，未成熟配子在10至30小時內(nèi)(諸如24至30小時，即24至26小時)完成從前期到MF-II的發(fā)育。該快速成熟可以使卵丘膨脹失敗和胞質(zhì)失調(diào)的危險性最小化。而且，它能使卵母細(xì)胞的暴露最小化從而使體外培育的時間比所需的時間更長。
合成的細(xì)胞培養(yǎng)基可以用于上述成熟過程。術(shù)語“合成培養(yǎng)基”是指不含生物學(xué)方法提取的血清物質(zhì)并且其中所有組分及其濃度是已知的和被記載過的培養(yǎng)基。術(shù)語“生物學(xué)方法提取的血清物質(zhì)”包括諸如免疫球蛋白等物質(zhì)。激素如生長激素和促性腺激素不認(rèn)為是從血清中提取出來的。如果向培養(yǎng)基中添加激素或得自血清的物質(zhì)，優(yōu)選重組的激素或得自血清的物質(zhì)。
利用不含生物學(xué)提取的血清物質(zhì)的培養(yǎng)基的優(yōu)勢在于不存在病毒或其它病原體或有害顆粒被帶入培養(yǎng)基并隨后帶入胚胎的危險被大大減小或根本不存在。而且，血清有可能含有一種目前未知的抑制細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)同步成熟和卵丘膨脹的因子。
因此，本發(fā)明的一個方面涉及一種避免非授精配子在體外成熟過程中感染或污染含有已知和/或未知感染因子(諸如朊病毒、類病毒、病毒、支原體、細(xì)菌、真菌)的方法，該方法通過在不含源自至少可能含有感染因子的原料的組分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述配子。在一個優(yōu)選的實施方案中，該方法涉及避免污染毒性、致畸、致癌或誘變組分。
適于本發(fā)明使用的培養(yǎng)基的實例是含有至少一種能夠同時使細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和卵丘細(xì)胞成熟的因子的培養(yǎng)基。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述培養(yǎng)基含有合成的脂質(zhì)或脂質(zhì)前體，諸如甾醇或其可代謝的衍生物。這可以是可的松(cortisone)。利用這些化合物的優(yōu)點在于能夠穩(wěn)定細(xì)胞膜、提供用于膜構(gòu)建的前體和作為在卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體中參與局部旁分泌類固醇產(chǎn)生的物質(zhì)?？傻乃苫蚱溲苌镞€可直接參與刺激這些未成熟卵母細(xì)胞而且最終使這些卵母細(xì)胞同步成熟。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)是一種既能供養(yǎng)卵母細(xì)胞也能供養(yǎng)其卵丘細(xì)胞的培養(yǎng)基。在本技術(shù)領(lǐng)域中已知向成熟培養(yǎng)基中添加促性腺激素和/或類固醇諸如E2能夠增強(qiáng)例如牛、猴和人卵母細(xì)胞的授精能力和/或發(fā)育能力。向人IVM培養(yǎng)基中添加促性腺素(FSH和hCG)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用但其最適濃度(或絕對必要性)還未得到充分的確定。卵丘細(xì)胞可被確定為是一種與其它類型的體細(xì)胞的共培養(yǎng)物(c-culture)，它們通常需要培養(yǎng)基中的中高度蛋白濃度。已經(jīng)提出卵母細(xì)胞需要用雌激素來啟動以便產(chǎn)生Ca++振動(oscillation)。因此本發(fā)明的培養(yǎng)基優(yōu)選含有雌激素，其濃度為0.1-10.mu.g/mL雌二醇17-.β，例如0.3-3.mu.g/mL雌二醇17-.β，優(yōu)選1.mu.g/mL雌二醇17-.β。
在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案中，所述合成培養(yǎng)基含有作為抗凋亡物質(zhì)的ATA(金精三羧酸(Aurin Tricarboxylic Acid))。ATA的優(yōu)勢在于其可能提供抑制凋亡過程而不損害卵母細(xì)胞成熟的最佳條件。ATA存在的另一優(yōu)勢在于其使血清衍生產(chǎn)物如HSA或BSA的濃度降低，以至于血清衍生產(chǎn)物的濃度是零。
由于取回的(retrieved)卵母細(xì)胞的卵丘體已經(jīng)處于凋亡過程所以使用抗凋亡的物質(zhì)是優(yōu)選的。當(dāng)在卵母細(xì)胞-卵丘復(fù)合體中開始凋亡時，就預(yù)示著成熟的開始。
然而，當(dāng)該過程在正常卵巢中進(jìn)行時，將誘導(dǎo)卵母細(xì)胞中的凋亡。當(dāng)誘導(dǎo)成熟期開始的凋亡信號發(fā)出后就將卵母細(xì)胞從卵巢中取出，在含有例如終止進(jìn)一步凋亡的ATA的簡扼長江培養(yǎng)基中將進(jìn)行全面的發(fā)育。
所述培養(yǎng)基可以是一種如PCT/EP97/06721中所記載的一種培養(yǎng)基，其被引入本文作為參考。作為所述培養(yǎng)基的添加劑，使用EP1090300或WO9967365中所使用的添加劑，這些添加劑被表示為Medi-Cult SSR 4x、Medi-Cult SSR 4xa，、Medi-Cult SSR 4xb、Medi-Cult SSR1或Medi-Cult SSR2。作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，優(yōu)選的培養(yǎng)基是EP1090300中記載的Medi-Cult BBEM。
除了培養(yǎng)基中的內(nèi)含物外，當(dāng)為了獲得可以受精的卵母細(xì)胞而進(jìn)行體外培養(yǎng)時其它因素也是重要的。這些因素包括吸出卵母細(xì)胞的時機(jī)和吸出時的卵泡的大小。卵泡生長過程中的凋亡早期或人工平臺期可模擬具有發(fā)育能力的最終排卵前卵泡成熟期。
哺乳動物卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)不但涉及卵泡的生長，而且還涉及卵泡和卵母細(xì)胞的大小。人卵母細(xì)胞看起來具有依賴于恢復(fù)減數(shù)分裂和結(jié)束成熟期的能力的大小?？梢杂^察到，從小于8mm的卵泡獲得的卵母細(xì)胞的成熟率和裂解率降低。這些結(jié)果表示人卵母細(xì)胞成熟的能力與卵泡的成熟密切相關(guān)。如上所述，取回的正在成熟中的卵母細(xì)胞處于凋亡的早期。因此，隨著卵母細(xì)胞體積的增大，獲得凋亡晚期的卵母細(xì)胞的風(fēng)險則增大，也就是說卵母細(xì)胞接近于死亡細(xì)胞的風(fēng)險增大?；谶@些實驗，取回的卵母細(xì)胞的優(yōu)選尺寸小于12mm。
在本發(fā)明的一個實施方案中，體外成熟是在氧壓低于20％，諸如低于15％、諸如低于13％、諸如低于11％、諸如低于10％、諸如低于9％、諸如低于8％、諸如低于7％、諸如低于6％、諸如低于5％、諸如低于4％、諸如低于3％、諸如低于2％、諸如低于1％或在本文其它部分記載的條件中進(jìn)行的。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，體外成熟是在上述低氧壓時進(jìn)行的。一種培養(yǎng)條件是氧壓的暫時升高，其中所述升高是氧壓升高至少1個單位，諸如至少2個單位，例如至少3個單位，諸如至少4個單位，例如至少5個單位，例如至少6個單位，諸如至少7個單位，例如至少8個單位，諸如至少9個單位，例如至少10個單位，諸如至少11個單位，例如至少12個單位，諸如至少13個單位，例如至少14個單位，例如至少15個單位。
在另一個實施方案中，氧壓的升高是最大15個單位，例如最大14個單位，諸如最大12個單位，例如最大11個單位，諸如最大10個單位，例如最大9個單位，諸如最大8個單位，例如最大7個單位，諸如最大6個單位，例如最大5個單位，諸如最大4個單位，例如最大3個單位，諸如最大2個單位，例如最大1個單位。
在另一個實施方案中，氧壓升高1-15個單位，諸如1-12個單位，例如1-10個單位，諸如1-8個單位，例如1-7個單位，諸如1-6個單位，例如1-5個單位，諸如1-4個單位，例如1-3個，諸如1-2個單位。
總體上，氧壓的升高進(jìn)行至少5分鐘，諸如至少10分鐘，例如至少20分鐘，諸如至少30分鐘，諸如至少45分鐘，例如至少1小時，諸如至少1.5小時，例如至少2小時，諸如至少2.5小時，例如至少3小時，諸如至少4小時，例如至少5小時，諸如至少6小時，例如至少7小時，諸如至少8小時，例如至少9小時，諸如至少10小時。
上述培養(yǎng)基還可被用于培養(yǎng)得自睪丸的未成熟精子前體細(xì)胞。
IVM被進(jìn)一步記載在WO 9967365和美國專利申請US 20010028878中。
在本發(fā)明的一個實施方案中，未成熟精子被培養(yǎng)到成熟。精子的這種體外成熟是在氧壓低于20％，諸如低于15％、例如低于13％、諸如低于11％、例如低于10％、諸如低于9％、例如低于8％、諸如低于7％、例如低于6％、諸如低于5％、例如低于4％、諸如低于3％、例如低于2％、諸如低于1％時進(jìn)行的。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，精子的這種體外成熟是在上述低氧壓時進(jìn)行的。一種培養(yǎng)條件是氧壓的暫時升高，其中所述氧壓升高是至少1個單位，諸如至少2個單位，例如至少3個單位，諸如至少4個單位，例如至少5個單位，諸如至少6個單位，例如至少7個單位，且所述氧壓的升高持續(xù)至少5分鐘，諸如至少10分鐘，例如至少20分鐘，諸如至少30分鐘，諸如至少45分鐘，例如至少1小時，諸如至少1.5小時，例如至少2小時，諸如至少2.5小時，例如至少3小時。
授精當(dāng)收集卵母細(xì)胞后，它們可以如上所述進(jìn)行體外成熟、培養(yǎng)一段時間或立即受精。在本發(fā)明的一個實施方案中，這些培養(yǎng)物是在氧壓低于20％，諸如低于15％、例如低于13％、諸如低于11％、例如低于10％、諸如低于9％、例如低于8％、諸如低于7％、例如低于6％、諸如低于5％、例如低于4％、諸如低于3％、例如低于2％、諸如低于1％時進(jìn)行的。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述培養(yǎng)物是在如上所述的低氧壓時進(jìn)行的。
上述氧壓的變化的一個實例是在氧壓為5％，氧壓被升高到15％時持續(xù)一段時間，然后氧壓被降低到12％的條件下培養(yǎng)的卵母細(xì)胞。
被回收的卵子在實驗室接受檢測而且每個卵子按照以下方法來確定成熟度等級。卵子的成熟度決定何時加入精子(授精)。未成熟卵母細(xì)胞被收集后立即可以授精，也可以在幾小時后，在第二天或當(dāng)未成熟卵母細(xì)胞成熟后進(jìn)行授精。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，在一個培養(yǎng)皿中將所述卵母細(xì)胞和精子一起進(jìn)行共培養(yǎng)。在另一個實施方案中，所述共培養(yǎng)可以與滋養(yǎng)細(xì)胞一起進(jìn)行共培養(yǎng)。這些用或不用滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行的共培養(yǎng)是在氧壓低于20％，諸如低于15％、例如低于13％、諸如低于11％、例如低于10％、諸如低于9％、例如低于8％、諸如低于7％、例如低于6％、諸如低于5％、例如低于4％、諸如低于3％、例如低于2％、諸如低于1％時進(jìn)行的。
在本發(fā)明的一個實施方案中，在低氧壓下以及有或無滋養(yǎng)細(xì)胞存在的條件中進(jìn)行的共培養(yǎng)還包括氧壓的暫時升高，其中所述氧壓的升高是至少1個單位，諸如至少2個單位，例如至少3個單位，諸如至少4個單位，例如至少5個單位，諸如至少6個單位，例如至少7個單位，且所述氧壓的升高持續(xù)至少30分鐘，諸如至少45分鐘，例如至少1小時，諸如至少1.5小時，例如至少2小時，諸如至少2.5小時，例如至少3小時。
每1個卵子與5000至500000個精子進(jìn)行共培養(yǎng)。授精需要大約18個小時才能完成，并且約12個小時后受精細(xì)胞或前期胚胎分裂成兩個細(xì)胞。48小時后，當(dāng)每個前期胚胎通常由兩至四個細(xì)胞組成時，它們即可被植入到婦女的子宮當(dāng)中。該過程被稱作胚胎轉(zhuǎn)移。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述授精是在氧壓低于20％，諸如低于15％、例如低于13％、諸如低于11％、例如低于10％、諸如低于9％、例如低于8％、諸如低于7％、例如低于6％、諸如低于5％、例如低于4％、諸如低于3％、例如低于2％、諸如低于1％時進(jìn)行的。
在本發(fā)明的一個實施方案中，在低氧壓時進(jìn)行的授精還包括氧壓的暫時升高，其中所述氧壓的升高是至少1個單位，諸如至少2個單位，例如至少3個單位，諸如至少4個單位，例如至少5個單位，諸如至少6個單位，例如至少7個單位，且所述氧壓的升高持續(xù)至少30分鐘，諸如至少45分鐘，例如至少1小時，諸如至少1.5小時，例如至少2小時，諸如至少2.5小時，例如至少3小時。
在一個優(yōu)選的實施方案中，卵母細(xì)胞和精細(xì)胞的培養(yǎng)包括在使卵母細(xì)胞成熟的條件下培養(yǎng)所述未成熟卵母細(xì)胞的步驟。所述條件包括低于15％、例如低于13％、諸如低于11％、例如低于10％、諸如低于9％、例如低于8％、諸如低于7％、例如低于6％、諸如低于5％、例如低于4％、諸如低于3％、例如低于2％、諸如低于1％的氧壓。可以選定所述氧壓并在培養(yǎng)過程中隨著體外最適條件發(fā)生變化，而且還與卵母細(xì)胞的所處階段和質(zhì)量一致。
所述IVF方法與卵母細(xì)胞至胚胎的胚胎發(fā)生階段有關(guān)。
卵母細(xì)胞是未受精的卵子。所述卵母細(xì)胞位于卵泡細(xì)胞群的中央。當(dāng)卵子沿著輸卵管向下移動時所述卵泡細(xì)胞群起著保護(hù)卵子本身的作用。為了到達(dá)卵子，精子必須首先穿透該卵泡細(xì)胞群(被稱作卵丘(cumulus))，然后所述精子必須在直接包裹在卵子周圍的彈性外膜上穿孔。
受精卵子也被稱作合子或1細(xì)胞胚胎。卵子被密封在透明帶(zonapellucida)中。在卵子內(nèi)是兩個較小的凹面球體一每個球體是由一個親本或另一個親本貢獻(xiàn)的含有親本DNA的‘原核’。在透明帶內(nèi)能觀察到被稱作‘極體’的球體。在采用第二部分母系遺傳物質(zhì)授精后該極體從卵子中適當(dāng)?shù)赝簧斐鰜怼?br> 授精的一天后發(fā)生第一次細(xì)胞分裂，結(jié)果產(chǎn)生2個細(xì)胞的胚胎。從胚胎發(fā)生的單細(xì)胞階段到胚泡階段的整個過程，胚胎在沒有營養(yǎng)源的條件下自由漂浮而且被完全束縛在透明帶中。因此在這整個過程中胚胎維持同樣大小。
胚胎中的每個細(xì)胞再次分裂，結(jié)果產(chǎn)生4個細(xì)胞的胚胎。在該階段，每個單體細(xì)胞仍然可能發(fā)育成完整的人。如果胚胎在該階段分裂成四個細(xì)胞，將出生四個相同的四胞胎。盡管罕見，但仍有許多已知實例。
在8細(xì)胞胚胎中，分化尚未發(fā)生。每個細(xì)胞可以發(fā)育成一個完整的人(理論上)。因此，在該階段取走任何一個細(xì)胞用以遺傳診斷都不會影響余下胚胎的發(fā)育。
在胚泡中，胚胎約有64個細(xì)胞。這些細(xì)胞此時不再相等。此時的胚胎有一個充滿液體的腔，且胚胎中被稱作內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的部分位于所述腔的一側(cè)。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中的半打細(xì)胞正是用以發(fā)育成胎兒和嬰兒的細(xì)胞。其余的細(xì)胞，外層細(xì)胞或表面細(xì)胞被稱作滋養(yǎng)外胚層，他們幫助形成胎盤。
ICSI在本發(fā)明的一個實施方案中，通過胞質(zhì)內(nèi)精子注射(intracytoplsmicsperm injection，ICSI)用精子使所述卵母細(xì)胞受精。胞質(zhì)內(nèi)精子注射還被稱作精子向卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的直接注射(DISCO)，該方法可被用于在人類患者中輔助受精。該技術(shù)將體外授精與顯微注射技術(shù)結(jié)合在一起。收集并適當(dāng)?shù)刂苽浯菩月涯讣?xì)胞(卵子)，將單個精子從所制的樣品分離到顯微注射針中，然后將該精子注射到卵母細(xì)胞的卵質(zhì)中。在胞質(zhì)內(nèi)精子注射法(ICSI)中，用專用的維持吸管(specialized holding pipette)維持(holding)成熟卵子。然后采用非常微細(xì)、尖利的空心針固定并吸取單個精子。然后將該針小心地穿透卵子的帶區(qū)并進(jìn)入卵子的胞質(zhì)內(nèi)。將該精子注射到胞質(zhì)中并小心取出針。第二天早晨檢測卵子正常受精的跡象。
未成熟的猴卵母細(xì)胞中胞質(zhì)控制對發(fā)育能力的重要性已有記載。采用顯微操作法，從MF-II卵母細(xì)胞中取出卵質(zhì)并將其注射到前期I卵母細(xì)胞中。與未采用卵質(zhì)注射的卵母細(xì)胞相比通過胞質(zhì)轉(zhuǎn)移而接受了卵母細(xì)胞的猴的受孕率增加了7倍。
在本發(fā)明的一個實施方案中，通過ICSI受精的卵母細(xì)胞是在氧壓低于20％，諸如低于15％、例如低于13％、諸如低于11％、例如低于10％、諸如低于9％、例如低于8％、諸如低于7％、例如低于6％、諸如低于5％、例如低于4％、諸如低于3％、例如低于2％、諸如低于1％下進(jìn)行培養(yǎng)。
胚胎階段本發(fā)明的一個實施方案是將受精卵母細(xì)胞培養(yǎng)到胚胎階段(該階段是可以轉(zhuǎn)移到雌性動物的子宮內(nèi)的階段)。這可以通過在卵母細(xì)胞受精后培養(yǎng)至少0.5天，諸如至少1天。例如至少2天，諸如至少3天，例如至少4天，諸如至少5天，諸如至少6天，例如至少7天，諸如至少8天，例如至少9天而實現(xiàn)。
可以轉(zhuǎn)移到子宮中的胚胎處于兩細(xì)胞階段、四細(xì)胞階段、六細(xì)胞階段、八細(xì)胞階段、桑椹胚階段，或胚泡階段，透明帶消失的胚泡階段，或所述胚胎的透明帶(胚殼體)打開以幫助在植入子宮前孵化胚胎的階段。在這每一階段中，由所述胚胎中取出細(xì)胞碎片，由此提高胚胎的質(zhì)量。
存在三種類型胚胎細(xì)胞，這三種類型細(xì)胞最終產(chǎn)生完整的胚胎及其相關(guān)組織，存在于植入前或植入時的極早期胚胎中的這三種細(xì)胞是·外胚層細(xì)胞，能夠自我更新或分化成胚胎的所有細(xì)胞類型，·內(nèi)胚層細(xì)胞，在胚胎周圍產(chǎn)生保護(hù)膜(卵黃囊)，和·滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞，其首先發(fā)育成一群細(xì)胞，這些細(xì)胞能進(jìn)行自我復(fù)制并產(chǎn)生一系列特化細(xì)胞，它們形成胎盤的主要部分。
在一個優(yōu)選的實施方案中，按照上述方法將所述受精卵母細(xì)胞培養(yǎng)到胚胎階段以備轉(zhuǎn)移到雌性動物的子宮中，所述培養(yǎng)是在氧壓低于20％，諸如低于15％、例如低于13％、諸如低于11％、例如低于10％、諸如低于9％、例如低于8％、諸如低于7％、例如低于6％、諸如低于5％、例如低于4％、諸如低于3％、例如低于2％、諸如低于1％時進(jìn)行的。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述受精卵母細(xì)胞在氧壓低于13％或氧壓在1％至21％之間的條件下培養(yǎng)2-3天從而達(dá)到4細(xì)胞階段，然后被轉(zhuǎn)移到雌性動物的子宮中。
在本發(fā)明的一個實施方案中，用激光、機(jī)械力或酸性蒂羅德溶液(tyrode)輔助孵化使透明帶打開。
胚胎的“質(zhì)量”可以根據(jù)不同的評價體系進(jìn)行評估。評價等級通過內(nèi)細(xì)胞群的大小確定。所述等級也可以由諸如細(xì)胞數(shù)目、細(xì)胞勻整性(尺寸的勻整性)和裂殖(fragmentation)程度等因素決定的。還存在其它影響胚胎外觀的因素，諸如多核化、液泡的出現(xiàn)、顆粒度、胚胎周圍的殼厚度等。尤其，胚泡中的細(xì)胞總數(shù)也是質(zhì)量等級。
在一種評價體系中，卵子受精后約48小時(或以后)才確定“質(zhì)量”。經(jīng)過48小時(“2天”)，優(yōu)選至少一些胚胎是至少3個細(xì)胞，優(yōu)選是4個細(xì)胞或更多。到那時它們必須至少是兩細(xì)胞-否則它們基本上是“停滯的”。經(jīng)過72小時(“3天”)，優(yōu)選一些胚胎是至少6個細(xì)胞，且優(yōu)選至少少數(shù)胚胎具有至少7個或更多個細(xì)胞?？焖侔l(fā)育對于成功而言并不是必需的，已經(jīng)觀察到由慢至第3天才4個細(xì)胞的胚胎發(fā)育成的嬰兒，但是妊娠的機(jī)會隨著細(xì)胞數(shù)目的增加而增加。
細(xì)胞數(shù)多以及細(xì)胞外觀均勻(裂球)并且?guī)缀醪换蛲耆话l(fā)生裂殖的胚胎與其細(xì)胞數(shù)目少、細(xì)胞均勻性較差以及更容易發(fā)生裂殖的對應(yīng)物相比植入的總幾率較高。
在IVF實驗室中于顯微鏡下觀察到的胚胎質(zhì)量能夠比較合理地預(yù)測通過移入胚胎而導(dǎo)致妊娠的機(jī)會。然而，由于存在著許多其它無法測量的影響因素，所以這些概括并不是總能適用。一些循環(huán)在轉(zhuǎn)移3個外觀完好的胚胎后中斷，但在轉(zhuǎn)移低級胚胎后卻也生出了漂亮的嬰兒。胚胎繼續(xù)發(fā)育的真正遺傳性能和子宮內(nèi)壁(lining)的質(zhì)量與接受力實際上是不可能測量的。
可被檢測的另一個重要變量是胚胎轉(zhuǎn)移技術(shù)本身。向子宮內(nèi)膜內(nèi)壁的無創(chuàng)順利轉(zhuǎn)移對于為胚胎提供繼續(xù)正常發(fā)育的最好機(jī)會是必要的。
最后，胚胎質(zhì)量的唯一真實檢驗為胚胎是否正常植入和發(fā)育并最終能夠隨媽媽離開醫(yī)院回家。換句話說，胚胎評價體系非常不完善，而且對于質(zhì)量來說，懷孕測試一般需要更多的“質(zhì)量”信息，而顯微鏡能夠顯示的“質(zhì)量”信息要少些。
大多數(shù)IVF臨床單位利用眾多評價體系中的一種對每個胚胎進(jìn)行“分級”，其中只有少數(shù)評價體系可用于本發(fā)明。
由于不同發(fā)育階段可用于不同過程等事實，所以重要的是在高級(advanced)生育治療過程中要對人卵母細(xì)胞、受精卵和卵裂胚胎進(jìn)行評價和分類。一種可被用于本發(fā)明的胚胎評價體系與Van Abbel等(1992)和Ziebe等(1997)的評價體系一致在該評價體系中，根據(jù)卵裂期(＝裂球數(shù))對胚胎進(jìn)行評價，并且無核裂片的數(shù)量用形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價。兩細(xì)胞階段至桑椹胚階段的胚胎可以按照下列形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)獲得評價等級1.0級大小相同的對稱裂球，沒有無核裂片。
2.0級大小不均等的裂球，沒有無核裂片。
2.1級裂殖度小于10％的胚胎。
2.2級裂球裂殖度為10-20％的胚胎。
3.0級裂球裂殖度為20-50％的胚胎。
3.2級裂球裂殖度大于50％的胚胎。
4.0級完全裂殖。
5.0級授精的，未分離的。
6.0級未授精的，未分離的。
M桑椹胚B1早期胚泡。
B2正在膨脹的胚泡。
B3經(jīng)過膨脹的胚泡。
Bn1正常腔，正常細(xì)胞。
Bn2正常腔，粒狀細(xì)胞或暗細(xì)胞。
Bn3異常腔。
HB1正在孵化的胚泡。
HB2經(jīng)過孵化的胚泡。
在本發(fā)明的一個實施方案中，將胚胎經(jīng)過培養(yǎng)使得胚胎的裂球數(shù)為3-5個，且評價等級定為1.0；2.0；2.1和2.2。
在本發(fā)明的一個實施方案中，將胚胎經(jīng)過培養(yǎng)使得胚胎的裂球數(shù)為4個，且評價等級為1.0；2.0和2.1。
已經(jīng)表明，不僅是胚胎階段而且裂殖度對于選擇胚胎也是重要的。還要考慮以下因素1)透明帶的厚度和可變性。不僅因為透明帶在體外條件中變硬對胚胎造成問題。透明帶的稀薄度或可變稀薄度可能與更好的受孕機(jī)會有關(guān)。這大概是由于在孵化過程中滋養(yǎng)層細(xì)胞能更好地穿透稀薄帶而不是厚硬帶。2)裂片的類型和分布。裂片在胚胎中的均勻分布可能會干擾所有裂球之間的多處連接，因此危及胚胎的功能。如果裂片分布在一個區(qū)域，胚胎所受到的這種干擾就不那么嚴(yán)重了。3)胚胎卵裂的時間。胚胎的最快正常分裂也可能具有繁衍后代的最好機(jī)會。由此可知，用于移植的最好胚胎將是Van Abbel等級最低的胚胎，胚胎隨著移植的時間(即受精后2天時用于轉(zhuǎn)移的4-細(xì)胞)、透明帶的可變厚度而正常分裂，并且如果有裂片存在，則選擇具有局部裂片的胚胎。
在另一個評價體系中，被移植到雌性動物子宮中的胚胎獲得了累積胚胎級分(cumulative embryo score，CES)(Joesbury等，1998)。在該評價體系中，在授精后的第二天并且就在移植前對胚胎進(jìn)行等級評價。評級是基于裂球的顆粒度(granularity)和對稱性、裂殖以及發(fā)育速率。一個理想完美的胚胎被定的級分為最大值4.0分，根據(jù)偏離每個形態(tài)參數(shù)的最適值的程度扣除0.5或0.1分。
受精卵的級分被定為1分。
大小均勻并具有對稱裂球的胚胎的級分被定為4分。
具有大小不等裂球且裂殖度小于10％的胚胎的級分被定為3分。
裂殖度為10-50％的胚胎的級分被定為2分。
裂殖度大于50％的胚胎的級分被定為1分。
每個胚胎的級分是通過將選用于移植的每個胚胎的等級乘以該胚胎的裂球數(shù)而獲得的。發(fā)育速率比‘理想’生長速率快的胚胎比具有‘正?！L模式的胚胎更不容易導(dǎo)致懷孕。為了說明快速發(fā)育胚胎的潛在缺點，給5-細(xì)胞階段的胚胎計3分，并給6-，7-或8-細(xì)胞胚胎計2分，然后計算CES。選出最高得分的胚胎用于子宮移植。選用于移植的胚胎的總體質(zhì)量基于累積胚胎級分(CES)，該累積級分是每個選用胚胎的級分的乘積。
在本發(fā)明的一個實施方案中，將胚胎培養(yǎng)到裂殖度為10-50％的3-5個細(xì)胞的階段，由此該胚胎的級分為6-7。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，將胚胎培養(yǎng)到裂殖度小于10％的3-5個細(xì)胞的階段，由此該胚胎的級分為7-8。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，將胚胎培養(yǎng)到裂殖度小于10％的4個細(xì)胞的階段，由此該胚胎的級分為8。
在第三個評價體系中，得到每個胚胎的定級胚胎級分(GraduatedEmbryos Score，GES)(Fisch等，2001)。GES體系可能的總分是100分，它基于受精后16-18，25-27和64-67小時時進(jìn)行的三次評價。
第一次評價，16-18h核仁沿著原核軸排成一行，級分計為20。
第二次評價，25-27h有序和對稱卵裂，級分計為30。
不發(fā)生裂殖，級分為30。
裂殖率小于20％，級分計為25。
裂殖率大于20％，級分計為0。
第三次評價，64-67h7個I級細(xì)胞或8個I級細(xì)胞或8個II級細(xì)胞或9個I級細(xì)胞，級分計為20。
7個II級細(xì)胞或9個II級細(xì)胞或10個I級細(xì)胞或11個I級細(xì)胞或致密的I級細(xì)胞，級分計為10。
其中I級是對稱的裂球并且未發(fā)生裂殖，II級則是不太均勻的裂球而且裂殖率小于20％。將胚胎每次評價的級分相乘從而得到所述胚胎的總級分。胚胎的最大級分是100。
在本發(fā)明的一個實施方案中，胚胎經(jīng)過培養(yǎng)，在授精的64-67個小時后產(chǎn)生7-9個細(xì)胞的胚胎并根據(jù)GES評分系統(tǒng)獲得60-100的級分。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，胚胎經(jīng)過培養(yǎng)，在授精的64-67個小時后產(chǎn)生7個I級細(xì)胞或8個I級細(xì)胞或8個II級細(xì)胞或9個I級細(xì)胞并根據(jù)GES評分系統(tǒng)獲得70-100的級分。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，胚胎經(jīng)過培養(yǎng)，在授精的64-67個小時后產(chǎn)生7個I級細(xì)胞或8個I級細(xì)胞或8個II級細(xì)胞或9個I級細(xì)胞并根據(jù)GES評分系統(tǒng)獲得80-100的級分。
任何將胚胎質(zhì)量與受孕關(guān)聯(lián)的評分系統(tǒng)都可用來確定胚胎質(zhì)量。
在胚胎的發(fā)育過程中，到達(dá)胚泡期。胚泡是一種受精后發(fā)育5-7天的胚胎。該階段的胚胎具有兩種不同類型的細(xì)胞和中央腔。其剛開始分化。被稱作滋養(yǎng)外胚層(trophectoderm)的表面細(xì)胞將變成胎盤，被稱作內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的內(nèi)細(xì)胞將變成胎兒。一個健康的胚泡應(yīng)當(dāng)在第6天結(jié)束時從被稱為透明帶的外殼開始孵化。孵化后的約24小時內(nèi)，應(yīng)當(dāng)將其植入母親子宮的內(nèi)壁上。
通過顯微鏡鏡檢卵母細(xì)胞可以檢測到異常情況如空泡的形成、胞質(zhì)包涵體和細(xì)胞器的聚簇。這些卵母細(xì)胞產(chǎn)生正常胚胎的可能性很小。已知卵母細(xì)胞可能出現(xiàn)細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)異常，這種異常在臨床條件下難以通過光學(xué)顯微鏡觀測到。最常見的卵母細(xì)胞遺傳變異導(dǎo)致在第一次減數(shù)分裂中染色單體分離的錯誤。棄去質(zhì)量差的卵母細(xì)胞，培養(yǎng)質(zhì)量好的卵母細(xì)胞。
胚胎移植(embryo transferr)在大多數(shù)體外授精過程中，授精后第2天(4-8個細(xì)胞)將胚胎移植到子宮。一種觀點是早期胚胎的利用可以明顯降低IVF方法的受孕結(jié)果，而且更理想地是利用培養(yǎng)了5-7天胚泡期的胚胎。潛在的優(yōu)點包括胚胎和子宮之間更加一致性和在較長的培養(yǎng)周期中選擇質(zhì)量更好的胚胎的能力。由于每次移植選擇更少數(shù)目的高效胚胎，胚泡移植還有助于減少由IVF導(dǎo)致的多胞胎的數(shù)目。
受精后第2-10天將胚胎植入子宮壁。在植入過程中，所述胚胎與母體供血系統(tǒng)相連從而能夠生長。在植入時，婦女的身體第一次懷孕。植入前，身體不能辨別未受精卵(即將消亡)與正在發(fā)育的胚胎之間的差別。
將懸浮在培養(yǎng)基液滴中的一個或多個前期胚胎吸入到移液管中，所述前期胚胎被引入子宮頸中并將液體沉著到子宮腔中。在該過程中植入了一個或多個胚胎。
體外授精的胚泡培養(yǎng)和移植方法是另一種將胚胎轉(zhuǎn)移到母體子宮的方法。通過胚泡胚胎轉(zhuǎn)移，被轉(zhuǎn)移的胚胎數(shù)目更少從而減少了多次受孕的風(fēng)險，使得總的受孕幾率很高。
體外授精(IVF)和胚胎培養(yǎng)的最終目的是提供能夠繼續(xù)正常發(fā)育并正常出生的高質(zhì)量胚胎。然而，在標(biāo)準(zhǔn)的IVF培養(yǎng)條件下，僅有約20-40％的人體胚胎能在培養(yǎng)的第5天發(fā)展到胚泡期。這種低速率的胚胎發(fā)育是由次佳胚胎培養(yǎng)環(huán)境導(dǎo)致的結(jié)果。正由于這個原因，通常在培養(yǎng)的第2-3天才將胚胎轉(zhuǎn)移到子宮中。
這種方法所存在的一個問題是通常在輸卵管而不是子宮中發(fā)現(xiàn)2-3天齡的胚胎。排卵后約80天該胚胎被首次移入子宮中。植入過程在胚泡形成后約3天開始并開始孵化。因此，如果改進(jìn)體外培養(yǎng)條件，胚泡形成的速率則非常高，那么就可以在胚泡期和更“自然”的時間將胚胎放置到子宮當(dāng)中，并且是剛一到胚泡期就開始植入。
IVF后轉(zhuǎn)移胚泡還能提供另一種降低多次受孕幾率的有益方法。一些2或3天齡的胚胎不具備稱為高質(zhì)量胚泡和活胎的能力。然而，在培養(yǎng)的第2或第3天，我們沒有可靠的方法來檢測哪些胚胎能長期成活。通過將胚胎培養(yǎng)到胚泡期我們有更多的機(jī)會來選擇最適于移植的胚胎。然后我們移植更少的胚胎并能獲得很高的受孕率而多次懷孕(三胞胎或更多胞胎)的風(fēng)險卻很低。
在一個實施方案中，步驟a)是在氧壓低于15％的條件中進(jìn)行的，其它條件如上文所述。
在一個實施方案中，步驟b)是在氧壓低于15％的條件中進(jìn)行的，其它條件如上文所述。
在一個實施方案中，步驟a)和b)是在氧壓低于15％的條件中進(jìn)行的，其它條件如上文所述。
在一個實施方案中，步驟a)和c)是在氧壓低于15％的條件中進(jìn)行的，其它條件如上文所述。
在一個實施方案中，步驟a)和d)是在氧壓低于15％的條件中進(jìn)行的，其它條件如上文所述。
在一個實施方案中，步驟b)和c)是在氧壓低于15％的條件中進(jìn)行的，其它條件如上文所述。
在一個實施方案中，步驟b)和d)是在氧壓低于15％的條件中進(jìn)行的，其它條件如上文所述。
在一個實施方案中，步驟a)、b)和c)是在氧壓低于15％的條件中進(jìn)行的，其它條件如上文所述。
在一個實施方案中，步驟a)、b)和d)是在氧壓低于15％的條件中進(jìn)行的，其它條件如上文所述。
在一個實施方案中，步驟a)、c)和d)是在氧壓低于15％的條件中進(jìn)行的，其它條件如上文所述。
在一個實施方案中，步驟b)，c)和d)是在氧壓低于15％的條件中進(jìn)行的，其它條件如上文所述。
在一個實施方案中，步驟a)，b)，c)和d)是在氧壓低于15％的條件中進(jìn)行的，其它條件如上文所述。
在一個實施方案中，步驟b)，c)和d)是在氧壓低于15％的條件中進(jìn)行的，其它條件如上文所述。
培養(yǎng)條件上述包括步驟a)，b)，c)和d)或e)的體外培養(yǎng)方法和胚胎向子宮內(nèi)的植入是在無菌條件中進(jìn)行的。在使用前對培養(yǎng)基和儀器消毒。
按照上述方式降低氧壓，其中所述培養(yǎng)可以在氧壓低于20％，諸如低于15％、諸如低于13％、諸如低于11％、諸如低于10％、諸如低于9％、諸如低于8％、諸如低于7％、諸如低于6％、諸如低于5％、諸如低于4％、諸如低于3％、諸如低于2％、諸如低于1％下進(jìn)行。氧壓是通過向體外培養(yǎng)環(huán)境中充入氧氣、氮氣、二氧化碳、氦氣或其它惰性氣體或這些氣體中的兩種或多種氣體的混合物來調(diào)節(jié)的。
本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是卵母細(xì)胞、精細(xì)胞和胚胎的培養(yǎng)條件包括30-45℃，諸如32-42℃，諸如34-40℃，諸如36-38℃，諸如36,5-37,5℃，諸如約37℃的溫度。在一個優(yōu)選實施方案中，卵母細(xì)胞、精細(xì)胞和胚胎的培養(yǎng)條件包括約37℃的溫度。
不幸地是標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中的大多數(shù)胚胎(約75％)到了4-8細(xì)胞階段不能繼續(xù)發(fā)育。然而一些臨床征兆表明盡管發(fā)育成胚泡的胚胎比例很低但還是應(yīng)在胚泡期植入人胚胎。一些研究已經(jīng)使用了共培養(yǎng)技術(shù)，該技術(shù)是將胚胎與滋養(yǎng)細(xì)胞如非洲綠猴腎細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，該技術(shù)能使胚泡形成的數(shù)量翻倍。已有一些利用這些培養(yǎng)技術(shù)的研究結(jié)果表明胚泡轉(zhuǎn)移后的植入速率提高了，尤其是對于以前的植入反復(fù)遭受失敗的婦女來說植入速率提高了。
通過將精細(xì)胞、卵母細(xì)胞和胚胎與滋養(yǎng)細(xì)胞層進(jìn)行共培養(yǎng)來克服輔助繁殖技術(shù)中的一些困難。然而，共培養(yǎng)具有質(zhì)量不穩(wěn)定以及可靠性差的特性而且增加了病原體由滋養(yǎng)細(xì)胞向合子或胚胎轉(zhuǎn)移的危險性，所述合子或胚胎將被植回到有動物或人的活體內(nèi)。在一個優(yōu)選的實施方案中，卵母細(xì)胞和精子在沒有滋養(yǎng)細(xì)胞層的條件下進(jìn)行共培養(yǎng)。
小規(guī)模的敏感細(xì)胞和組織的體外生產(chǎn)，即成熟、授精、生長、繁殖等通常是在裝有培養(yǎng)基和必要的初始細(xì)胞或組織的象小培養(yǎng)燒瓶、培養(yǎng)皿或平皿這樣的容器中進(jìn)行。然后將所述容器放置在溫育箱，該溫育箱能夠提供可選的恒定溫度并且環(huán)境大氣中含有特定細(xì)胞或組織發(fā)育和/或維持所必需的氣體。具體地是所述氣體包括一定比例和濃度的濕氣(即水蒸氣)、游離氧氣(O2)和二氧化碳(CO2)。
通過控制環(huán)境溫度以及CO2含量，可以使培養(yǎng)基的Ph穩(wěn)定一段時間。穩(wěn)定的溫度與穩(wěn)定的CO2含量導(dǎo)致穩(wěn)定的pH。
在本發(fā)明的一個實施方案中，在本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的培養(yǎng)基中培養(yǎng)卵母細(xì)胞和精子。根據(jù)卵母細(xì)胞或精子所處階段培養(yǎng)基可以單一的或不同的。卵母細(xì)胞和精子還可以在經(jīng)改良適于低氧壓條件的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。所述改良可以是物理的或化學(xué)的方法，后者例如是通過利用氧分子載體或過氧化氫酶的方法。
本發(fā)明的一個實施方案是將培養(yǎng)條件用于卵母細(xì)胞和胚胎從而使胚胎的內(nèi)細(xì)胞的數(shù)目增加。增加的內(nèi)細(xì)胞數(shù)目構(gòu)成質(zhì)量較好的胚胎。
本發(fā)明的另一個實施方案是培養(yǎng)卵母細(xì)胞核精子并將所產(chǎn)生的胚胎轉(zhuǎn)移到雌性哺乳動物的子宮，更精確地說是雌性動物的輸卵管。所述轉(zhuǎn)移可以在雌激素處理后進(jìn)行。所述轉(zhuǎn)移所述轉(zhuǎn)移非常有希望導(dǎo)致雌性動物懷孕。
所記載的方法提高了胚胎向雌性動物子宮轉(zhuǎn)移的成功率從而提高了受孕率。以這種方式，優(yōu)化了不孕癥的治療。
當(dāng)在氧壓低于15％的條件下對卵母細(xì)胞和精子進(jìn)行共培養(yǎng)能夠產(chǎn)生質(zhì)量較好的配子和前期胚胎。當(dāng)?shù)陀?5％的可變氧壓下對卵母細(xì)胞和精子進(jìn)行共培養(yǎng)也能產(chǎn)生質(zhì)量較好的配子和前期胚胎。質(zhì)量較好的配子和前期胚胎提高了不孕癥的治療效率。
當(dāng)在可變的氧壓下對卵母細(xì)胞和精子進(jìn)行共培養(yǎng)能夠產(chǎn)生質(zhì)量較好的配子和前期胚胎。
利用該方法的可能性是在任選低于15％的可變氧壓下對卵母細(xì)胞和精子進(jìn)行共培養(yǎng)從而產(chǎn)生質(zhì)量較好的配子和前期胚胎并且增加了內(nèi)細(xì)胞的數(shù)目和優(yōu)化了干細(xì)胞的培養(yǎng)。
在一個實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物是在氧壓增大的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的，開始以最低的氧壓培養(yǎng)配子以及在培養(yǎng)胚胎和胚泡的過程中逐漸增加氧壓。組成單一結(jié)構(gòu)諸如胚泡的細(xì)胞數(shù)目愈多，所需要的氧壓愈高。
在一個實施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)物是在氧壓升高的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的，開始以最低的氧壓培養(yǎng)配子以及在培養(yǎng)胚胎和胚泡的過程中逐漸增加氧壓以及針對卵母細(xì)胞迅速將氧壓升到10-12％以便加快成熟過程。
按照上述方法而提高胚胎的質(zhì)量可以將胚胎轉(zhuǎn)移的成功率由約20％提高到至少25％，諸如至少30％，例如至少35％，諸如至少40％。
溫育箱如上文所述的卵母細(xì)胞、精子和胚胎或其它生物材料諸如細(xì)胞培養(yǎng)物或組織的培養(yǎng)可以在溫育箱中進(jìn)行。
本發(fā)明的溫育箱在體外培養(yǎng)、檢測和操作過程中為維持細(xì)胞培養(yǎng)物諸如卵母細(xì)胞、精子和胚胎提供了可控的環(huán)境。更具體地說，所述溫育箱可以消除對細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可能有害或起阻礙作用的條件。
本發(fā)明的一個實施例包括能夠體外生產(chǎn)哺乳動物前期胚胎的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括用于獲得哺乳動物卵母細(xì)胞的裝置和用于獲得哺乳動物精子的裝置和具有至少兩個分離氣密室的設(shè)備，其中一個氣密室的氧壓變化不影響另一個氣密室的氧壓，其中一個氣密室構(gòu)成一個主腔室以及另一個所述的氣密室構(gòu)成至少一個駐留室，所述設(shè)備包括至少一個能夠與獲得哺乳動物卵母細(xì)胞和/或哺乳動物精子的裝置相通的進(jìn)口，和一個取出前期胚胎的出口以及一個所述至少室之間的通口以便使卵母細(xì)胞，精子和/或前期胚胎于室之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移。
主腔室包括一個用于處理細(xì)胞培養(yǎng)物的工作區(qū)域。主腔室包括用于處理細(xì)胞培養(yǎng)物的設(shè)備，例如含有培養(yǎng)基的容器。主腔室還可包括另一個用于處理細(xì)胞培養(yǎng)物的設(shè)備，例如顯微鏡，ICSI設(shè)備。從主腔室到進(jìn)口或出口有一個連接件。具體地是所述主腔室不是一個進(jìn)口。具體地是所述主腔室不是一個駐留室。
駐留室是一個用于容納一個或多個培養(yǎng)器的室，培養(yǎng)器本身可以是一個駐留室。所述駐留室與主腔室相連或被置于主腔室內(nèi)。具體地說所述駐留室不是進(jìn)口或出口。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述溫育箱提供了用于控制溫度、濕度和O2濃度的裝置。如果需要就利用層流空氣將微生物從環(huán)境中清除從而使溫育箱內(nèi)達(dá)到無菌條件。
室內(nèi)的氧壓或氧濃度可以得到控制。氧壓可通過測定裝置來確定。而且室內(nèi)的氧壓可以通過充入氣體如氧氣、氮氣、二氧化碳、氦氣或另一種惰性氣體或這些氣體中的兩種或多種氣體的混合物來維持或改變。因此所述溫育箱提供了用于充入所述氣體的裝置。在調(diào)控、維持和改變氧壓的過程中，每個室的室內(nèi)氧壓可以獨立地是0.1到至少21％的水平。一個優(yōu)選的氧壓可以是0.5到15％的水平。室內(nèi)的溫度和濕度可以通過測量裝置和供給裝置按照預(yù)定的每種氣體、溫度和濕度的最小和最大值來測定和調(diào)控。所述供給裝置可構(gòu)成流入氣體或含水氣體(濕度)的裝置而且所述供給裝置還可構(gòu)成加熱器或冷藏器。
在所述系統(tǒng)的一個實施方案中，直接進(jìn)入溫育箱任意一個室的氣體在進(jìn)入溫育箱的室之前通過循環(huán)流經(jīng)增濕器而被加濕。所述氣體在進(jìn)入溫育箱的室內(nèi)之前還可被加熱或冷藏。
一個實施方案是這樣一個系統(tǒng)，該系統(tǒng)中用于獲取卵母細(xì)胞的裝置是一個帶有針管的系統(tǒng)，所述針管在氣密的條件下與用于從針管向所述設(shè)備轉(zhuǎn)移的裝置相通，該裝置包括任選地連接于針管的注射器。
本發(fā)明的另一個實施方案是這樣一個系統(tǒng)，該系統(tǒng)中用于獲取哺乳動物精子的裝置是一個其中氧壓為可控的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)可以是一個任選地氣密性的而且任選地與針管連接的注射器。
利用上述針管并結(jié)合氧壓的控制來實施本發(fā)明，可以在包括上文所述的低氧壓條件下收集卵母細(xì)胞。
在所述系統(tǒng)的實施方案中，每個室中的溫度都是可獨立調(diào)節(jié)的。
在所述系統(tǒng)的另一個實施方案中，每個室的氧壓獨立地通過充入氧氣、氮氣、二氧化碳、氦氣或其它惰性氣體，或這些氣體中的兩種或多種氣體的混合物并且同時從室中抽出所述氣體來調(diào)節(jié)，以這種方式使得室內(nèi)的氣壓與溫育箱外面的大氣壓一致。
在所述系統(tǒng)的另一個實施方案中，室內(nèi)的氣壓略高于主腔室周圍的大氣壓。
在室內(nèi)保持高濕度是避免其中培養(yǎng)和供養(yǎng)著細(xì)胞培養(yǎng)物如卵母細(xì)胞、精子、胚胎的培養(yǎng)基過量蒸發(fā)所必需的。所述系統(tǒng)的一個優(yōu)選實施方案是一種溫育箱，該溫育箱的每個室中的濕度被獨立地調(diào)節(jié)到50％至100％，諸如60％至99％，例如70％至98％，更優(yōu)選80％至97％，諸如70％至96％，例如80％至95.5％，更優(yōu)選90％至95％水平。
大多數(shù)生物材料培養(yǎng)物是在10-50℃的溫度下保存的。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，溫育箱中的溫度被調(diào)到適于培養(yǎng)卵母細(xì)胞，精子，胚胎和包括干細(xì)胞系在內(nèi)的干細(xì)胞的溫度，包括將溫度預(yù)選到30-45℃，諸如32-42℃，諸如34-40℃，諸如36-38℃，諸如36,5-37,5℃，諸如約37℃。在一個優(yōu)選的實施方案中，卵母細(xì)胞，精子，胚胎和包括干細(xì)胞系在內(nèi)的干細(xì)胞的培養(yǎng)條件包括約37℃的溫度。
在另一個實施方案中，溫育箱的每個室的溫度是可控的并且按照上述溫度可獨立地進(jìn)行調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)的方式是如果溫度比預(yù)選溫度低例如0.2度，就打開加熱器。如果溫度比預(yù)選溫度高例如0.2度，就打開冷藏器。當(dāng)室內(nèi)實際溫度達(dá)到預(yù)選溫度則關(guān)閉加熱器或冷藏器。
在所述系統(tǒng)的一個優(yōu)選實施方案中，進(jìn)口和出口與一個單獨開口裝置，諸如門相通。
在所述系統(tǒng)的一個更優(yōu)選的實施方案中，出口和進(jìn)口是以將用于細(xì)胞培養(yǎng)物的裝置和設(shè)備轉(zhuǎn)移到室內(nèi)和室外的方式進(jìn)行組合的。優(yōu)選是其中所述進(jìn)口和出口的組合是一種氣密艙的系統(tǒng)。更優(yōu)選是其中所述進(jìn)口構(gòu)成氣閘(air-lock)的內(nèi)門而出口構(gòu)成氣閘的外門的系統(tǒng)。另外優(yōu)選是這樣一個系統(tǒng)，該系統(tǒng)中所述氣閘包括構(gòu)成氣密室的內(nèi)門和外門之間從而構(gòu)成一個氣密小室。
在所述系統(tǒng)的一個實施方案中，所述氣閘的內(nèi)門和外門每次只能打開一個以便每次只有一個門被打開，并且當(dāng)一個門被完全關(guān)閉時另一個門才能被打開。當(dāng)外門打開時氣閘中沒有氣體進(jìn)入。
在所述系統(tǒng)的一個實施方案中，氣閘的氣壓是可控的并且氧氣、氮氣、二氧化碳、氦氣或其它氣體的量、溫度和濕度都是可調(diào)的。通過調(diào)節(jié)氧氣、氮氣、二氧化碳、氦氣或其它氣體或這些氣體中的兩種或多種氣體的混合氣體的充入量可以調(diào)節(jié)氣閘的氣壓。氣閘的所述溫度和濕度還可通過打開加熱器或冷藏器或通過補(bǔ)充濕氣的調(diào)節(jié)方式來進(jìn)行調(diào)節(jié)?？梢园凑罩糜跉忾l中的測量裝置所提供的測量值來調(diào)節(jié)氣體濃度、溫度和濕度。所述氣體的補(bǔ)充可以按照預(yù)定水平來進(jìn)行，溫度和濕度還可按照預(yù)定水平來進(jìn)行調(diào)節(jié)。在一個優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)氣體濃度、溫度和濕度，將氣閘中的氣壓調(diào)到與主腔室的氣壓相似的水平。
在所述系統(tǒng)的一個實施方案中，氣閘的內(nèi)門只有當(dāng)包括溫度、濕度和氣量在內(nèi)的條件與其中安置著氣閘的室內(nèi)條件相同時才打開。
在所述系統(tǒng)的一個實施方案中，將一個盤子置于氣閘內(nèi)。該盤易于容器、處理物和其它設(shè)備的進(jìn)出。
在溫育箱的工作區(qū)和溫育箱外側(cè)之間放置著一個氣閘，從而降低了造成工作區(qū)和貯藏區(qū)條件(溫度、濕度、氧氣濃度)發(fā)生改變的風(fēng)險。在氣密艙與溫育箱外側(cè)之間是氣閘的外門。從外面轉(zhuǎn)入工作區(qū)的所有物體和培養(yǎng)基可以通過氣密艙，此時氣閘的內(nèi)門是關(guān)閉的，氣閘的外門是打開的，所述物體被放置在氣閘中，氣閘關(guān)閉。氣密艙內(nèi)的環(huán)境被調(diào)節(jié)成與工作區(qū)的環(huán)境類似，當(dāng)達(dá)到所述條件時，可以打開氣閘的內(nèi)門，所述物體可以被轉(zhuǎn)移到工作區(qū)。將物體從工作區(qū)轉(zhuǎn)移到溫育箱的外面是按照以下方式進(jìn)行的關(guān)閉氣閘的外門，將氣閘的條件調(diào)節(jié)到與工作區(qū)的條件相似，當(dāng)達(dá)到所述條件時打開氣閘的內(nèi)門，可以將所述物體從工作區(qū)轉(zhuǎn)移到氣閘，關(guān)閉氣閘的內(nèi)門，打開氣閘的外門并將所述物體轉(zhuǎn)移到溫育箱的外面。一種控制方式只允許每次打開氣閘的一個門。包括燈忽開忽關(guān)或發(fā)聲響的報警表明氣閘的內(nèi)部大概需要打開以及氣閘內(nèi)的條件與工作區(qū)的條件有區(qū)別了。
在本系統(tǒng)的另一個實施方案中，當(dāng)處理卵母細(xì)胞、精子、胚胎和包括干細(xì)胞系在內(nèi)的干細(xì)胞時，可以放置和使用一臺顯微鏡。所述顯微鏡可以是雙目顯微鏡。其中放置著需要監(jiān)測培養(yǎng)皿的顯微鏡的工作區(qū)位于主腔室內(nèi)部。顯微鏡通過主腔室頂部的孔延伸，其延伸的方式能夠更好地使操作者舒適地處理溫育箱內(nèi)部的細(xì)胞培養(yǎng)物并且任選地連接到一個監(jiān)控屏幕。所述孔包括密封主腔室邊緣與顯微鏡之間的環(huán)形縫隙的密封裝置以便降低或避免主腔室與溫育箱外部之間發(fā)生泄漏。所述密封裝置可以是易變形的塑料管頭。
所述顯微鏡可以連接一個照相機(jī)，可以對所述照相機(jī)進(jìn)行調(diào)節(jié)從而獲取細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物的圖像，在預(yù)定的時間間隔內(nèi)通過手控或自控來取得圖像。將該圖像保存起來，優(yōu)選是電子保存在計算機(jī)里?？梢园凑找韵路绞絹砝盟鰣D像。
在所述系統(tǒng)的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，在主腔室內(nèi)獲得工作區(qū)，所述工作區(qū)包括一塊用于放置裝有細(xì)胞培養(yǎng)組織的培養(yǎng)裝置的空間，所述細(xì)胞培養(yǎng)組織通過顯微鏡可以觀察到，并且所述工作區(qū)包括用于放置處理裝置的空間。
在所述系統(tǒng)的另一個優(yōu)選技術(shù)方案中，主腔室包括開口裝置或孔或允許操作者的手進(jìn)入以便操作室內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)物或設(shè)備的手口。
在所述系統(tǒng)的一個優(yōu)選技術(shù)方案中，所述開口裝置或孔或手口連著手套或無手指的手套。這些手套或無指手套以適于操作者的手進(jìn)入手套或無指手套的方式和操作室內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)物或設(shè)備的方式來進(jìn)行安裝。手套或溫育箱與手套或無指手套之間的固緊區(qū)域不允許任何微生物如病毒、真菌和細(xì)菌從溫育的外面進(jìn)入到溫育箱內(nèi)部或者反之亦然，或者至少通過在手套與主腔室壁之間安放密封裝置而將透過這些開口或孔的氣體量最小化。通過將手伸到手套或無指手套中來操作培養(yǎng)皿。如果需要，在使用前對放置在溫育箱內(nèi)部的所述手套表面進(jìn)行消毒。
在另一個實施方案中，所述開口裝置包括若干個孔，從該孔可以獲得直接流出溫育箱的氣流或平行指向具有開口的裝置的壁的氣流。所述氣體可以是空氣、氮氣等。所述氣體可以在不使用孔的時候關(guān)閉以及所述孔可以用鎖關(guān)閉。氣流防止空氣進(jìn)入溫育箱。
可以將棍、棒或儀器連接到所述開口裝置上，所述棍、棒或儀器可以通過光纖來操縱，而且需要進(jìn)行處理的細(xì)胞培養(yǎng)物或設(shè)備可以通過所述的棍、棒或儀器來操作。
在所述系統(tǒng)的一個實施方案中，所述溫育箱在主腔室后面有個允許插入大體積物體的門，所述大體積物體是諸如插入主腔室中的顯微鏡。至少一個駐留室是單獨控制的從而使得主腔室的開口不影響至少一個駐留室內(nèi)的培養(yǎng)條件。
在本系統(tǒng)的一個實施方案中，所述主腔室表面的至少一小部分被膜取代，該膜具有這樣一種膜結(jié)構(gòu)，就是針可以穿透該膜結(jié)構(gòu)，當(dāng)取出針時，膜上針孔部分又恢復(fù)到原來的形狀，并且無論膜是否經(jīng)過針穿透，氣體或顆粒都不會透過膜進(jìn)行擴(kuò)散。
在所述系統(tǒng)的一個實施方案中，至少兩個分離的室被安排成一個主腔室和一個或多個小氣密駐留室。優(yōu)選是一個較小的駐留室位于主腔室內(nèi)或與主腔室相連的系統(tǒng)。另外優(yōu)選是一個其中駐留室是氣密性的并在溫度、濕度和氧氣、氮氣和二氧化碳的含量方面是可控的而且彼此獨立以及獨立于主腔室的系統(tǒng)。更優(yōu)選是一個其中由駐留室構(gòu)成適用于培養(yǎng)器的箱體的系統(tǒng)，所述箱體裝有卵母細(xì)胞，精子，胚胎，和包括干細(xì)胞系在內(nèi)的干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。所述箱體構(gòu)成用于細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)室或貯存室。另外優(yōu)選是一個其中所述每個箱體適于容納一個含有細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)器的系統(tǒng)。另一個優(yōu)選的系統(tǒng)是其中箱體的數(shù)目對應(yīng)于細(xì)胞培養(yǎng)物發(fā)育期的數(shù)目。
在所述系統(tǒng)的一個實施方案中，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)包括至少未成熟卵母細(xì)胞、成熟卵母細(xì)胞、未成熟精細(xì)胞、成熟精細(xì)胞、受精卵母細(xì)胞、2細(xì)胞胚胎、4細(xì)胞胚胎、8細(xì)胞胚胎、干細(xì)胞和干細(xì)胞系的發(fā)育階段。
在所述系統(tǒng)的一個實施方案中，每個駐留室的氧壓和壓力可以通過計算機(jī)掃描所述室或所述氣密箱體中的胚胎圖像來進(jìn)行控制。所述圖像是通過照相機(jī)攝取的。通過人工可以將所述照相機(jī)連結(jié)到每個氣密箱體，或者照相機(jī)可以自動地從一個箱體移向另一個箱體或著照相機(jī)永久性地與每個箱體連接，或者氣密箱體以這樣一種方式移向照相機(jī)，該方式是將箱體安裝在carousel中或?qū)⑾潴w安裝在其中沿著例如軌道系統(tǒng)移動箱體的系統(tǒng)上。與每個細(xì)胞培養(yǎng)器永久性連接的照相機(jī)可以是例如芯片、CCD照相機(jī)或箔中小相機(jī)。
在另一個實施方案中，所述培養(yǎng)物的圖像以至少1分鐘、諸如至少5分鐘、諸如至少10分鐘，諸如至少20分鐘、諸如至少40分鐘、諸如至少1小時、諸如至少2小時、諸如至少4小時、諸如至少6小時、諸如至少8小時、諸如至少12小時、諸如至少18小時、諸如至少24小時的間隔被傳送到計算機(jī)。
可以將所述圖像與預(yù)先貯存的一系列圖像進(jìn)行比較，所述預(yù)先貯存的圖像幾乎共同構(gòu)成了一部由不同發(fā)育途徑組成的電影，所述途徑包括產(chǎn)生質(zhì)量好的、質(zhì)量適中的、質(zhì)量差的胚泡和/或干細(xì)胞和/或干細(xì)胞和/或干細(xì)胞系的途徑和導(dǎo)致細(xì)胞死亡的途徑。預(yù)先貯存的圖像通過計算機(jī)程序連接成包括培養(yǎng)條件的信息。通過將培養(yǎng)物中的配子或細(xì)胞的圖像與預(yù)先貯存起來的圖像進(jìn)行比較可以由計算機(jī)程序確定是否需要調(diào)整培養(yǎng)條件以便獲得最好質(zhì)量或預(yù)定質(zhì)量的胚泡、干細(xì)胞或干細(xì)胞系。
可以手工或自動調(diào)整包括例如溫度和氧壓在內(nèi)的培養(yǎng)條件。為了手工調(diào)整培養(yǎng)條件，監(jiān)控屏上的諸如閃爍或高亮度劃線的指示器可以顯示何時計算機(jī)程序發(fā)現(xiàn)了其中培養(yǎng)條件應(yīng)當(dāng)進(jìn)行調(diào)整的駐留室。例如氧壓的變化可以是短期的氧壓降低或增加從而引起細(xì)胞的發(fā)育或氧壓的持續(xù)改變從而達(dá)到特定的培養(yǎng)條件。
在本發(fā)明的一個實施方案中，當(dāng)如上所述將培養(yǎng)中的細(xì)胞的圖像與預(yù)先貯存的圖像結(jié)合后，為了作出響應(yīng)可以對進(jìn)一步包括培養(yǎng)基組分在內(nèi)的培養(yǎng)條件進(jìn)行手工或自動調(diào)節(jié)。
優(yōu)選是在由配子到胚泡的發(fā)育過程中培養(yǎng)基改變1-4次。更優(yōu)選是改變1-3次培養(yǎng)基。最優(yōu)選是改變1-2次培養(yǎng)基。
在本發(fā)明的一個實施方案中，如上所述預(yù)先貯存的圖像和不同的發(fā)育途徑包括計算機(jī)的環(huán)境控制程序。該程序通過結(jié)合培養(yǎng)中的細(xì)胞的圖像和預(yù)先貯存的圖像來控制包括本文其它部分所記載的溫度、氣體和/或培養(yǎng)基在內(nèi)的環(huán)境條件。
在一個實施方案中，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)開始后啟動所述環(huán)境控制程序。所述環(huán)境控制程序既可以通過手功鍵入細(xì)胞的發(fā)育階段來啟動，也可以通過細(xì)胞圖像來啟動所述環(huán)境控制程序。
在一個實施方案中，培養(yǎng)器的培養(yǎng)室是碗形的，底比口小，這樣在所述較小的底部要進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞處于一個有限的區(qū)域內(nèi)從而使相機(jī)的聚焦最佳化，得到圖像后按照本文其它部分所描述的方法對該圖像加以利用。
在一個實施方案中，所述培養(yǎng)器包括至少一個安裝到碗形培養(yǎng)室的管子。通過所述至少一個管子，氣體和培養(yǎng)基可以得到改變，可以連接儀器如溫度計或用于獲得其它測量值如培養(yǎng)基的化合物濃度或摩爾滲透壓濃度的儀器。用于每個培養(yǎng)室的罩可以是相機(jī)或所述相機(jī)可以被插入或直接安裝到罩上。所述罩還可以包括用于使相機(jī)準(zhǔn)確定位的操縱工具。所述操縱工具可以是但不局限于至少一個任選地帶有刻度的垂直桿或任選地帶有刻度的水平桿，該水平桿用以固定相機(jī)或相機(jī)的附件。
在一個實施方案中，所述培養(yǎng)器和/或培養(yǎng)室由使細(xì)胞避光的材料組成。如果所述材料驅(qū)光，那么所述罩子則可以由光-感材料制成從而確保能夠利用顯微鏡或相機(jī)觀察細(xì)胞。如果材料不驅(qū)光，所述培養(yǎng)器則可以通過驅(qū)光的駐留室來避光，或者所述培養(yǎng)器可以任何隱匿方法來避開溫育箱的光或避開來自溫育箱外面的光。
在一個實施方案中，所述培養(yǎng)器包括駐留室并且包括駐留室的特征和本文其它部分所記載的氣密箱。
在一個實施方案中，所述溫育箱包括一個按照本文其它部分所記載進(jìn)行ICSI的ICSI系統(tǒng)。
在本系統(tǒng)的一個實施方案中，所述駐留室是可移動的氣密箱。優(yōu)選是一個具有氣密箱的系統(tǒng)，所述氣密箱被從設(shè)備移開后可以被連接到用于控制溫度、濕度和氧氣、氮氣和二氧化碳濃度的裝置上。更優(yōu)選是一個其中用于控制溫度、濕度和氧氣、氮氣和二氧化碳濃度的裝置是可移動的系統(tǒng)。更優(yōu)選是一個其中氣密箱的壁含有膜的系統(tǒng)。更優(yōu)選是一個氣密箱包括一個用于緊固一個或多個細(xì)胞培養(yǎng)器的緊固件的系統(tǒng)。更優(yōu)選是一個其中細(xì)胞培養(yǎng)器的壁含有無菌膜的系統(tǒng)。在所述系統(tǒng)的一個實施方案中，氣密箱可以進(jìn)行至少6天的運輸。
在所述系統(tǒng)的一個實施方案中，主腔室的直徑尺寸介于1cm和2m之間，諸如介于20和50cm之間，諸如在50和70cm之間，諸如在70和90cm之間，諸如在90和110cm之間，諸如在110和130cm之間，諸如在130和150cm之間，諸如在150和170cm之間，諸如在170和200cm之間。優(yōu)選是縱向腔室具有的深度在50和110cm之間，諸如在50和70cm之間，諸如在70和90cm之間，諸如在90和110cm之間，長度在50和200cm之間，諸如在50和70cm之間，諸如在70和90cm之間，諸如在90和110cm之間，諸如在110和130cm之間，諸如在130和150cm之間，諸如在150和170cm之間，諸如在170和200cm之間，高度50和110cm之間，諸如在50和70cm之間，諸如在70和90cm之間，諸如在90和110cm之間。
干細(xì)胞本發(fā)明的另一個方面涉及一種胚胎干細(xì)胞組合物。所述方法增加了胚泡內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的數(shù)目和質(zhì)量，從而進(jìn)一步提高了從內(nèi)細(xì)胞團(tuán)衍生的干細(xì)胞的數(shù)目和質(zhì)量。
在一個實施方案中，所述干細(xì)胞比常規(guī)干細(xì)胞更穩(wěn)定。在未分化階段可以在一段時間內(nèi)持續(xù)得到干細(xì)胞。在一個實施方案中，干細(xì)胞的所述未分化階段是通過包括氧壓低于15％在內(nèi)的培養(yǎng)條件來維持的。
一個實施方案涉及產(chǎn)生干細(xì)胞的方法，所述方法包括a)按照本文其它部分所記載的內(nèi)容提供多細(xì)胞前期胚胎，b)分離a)中的多細(xì)胞前期胚胎，c)從b)中的前期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離細(xì)胞，d)在基質(zhì)膠(matrix gel)中培養(yǎng)從內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分離的所述細(xì)胞，e)獲得干細(xì)胞。
在一個實施方案中，b)，c)，d)和e)中的至少一個步驟是在氧壓低于15％的條件中進(jìn)行的。在另一個實施方案中，b)，c)，d)和e)中的至少兩個步驟是在氧壓低于15％的條件中進(jìn)行的。在另一個實施方案中，b)，c)，d)和e)中的至少三個步驟是在氧壓低于15％的條件中進(jìn)行的。在另一個實施方案中，b)，c)，d)和e)中的所有步驟是在氧壓低于15％的條件中進(jìn)行的。
另一方面是按照上文所定義的得自細(xì)胞培養(yǎng)物的干細(xì)胞。從所述干細(xì)胞可以得到干細(xì)胞系。
在一個實施方案中，干細(xì)胞被維持在未分化階段的時間是至少4小時，諸如至少8小時，例如至少12小時，諸如至少24小時，例如至少2天，諸如至少3天，例如至少4天，諸如至少5天，例如至少7天，諸如至少9天，例如至少11天，諸如至少13天，例如至少15天，諸如至少20天，例如至少25天，諸如至少30。
在一個實施方案中，干細(xì)胞被維持在未分化階段的時間是至少1個月，諸如至少1.5個月，例如至少2個月，諸如至少3個月，例如至少4個月，諸如至少5個月，例如至少6個月，諸如至少7個月，例如至少8個月，諸如至少9個月，例如至少10個月，諸如至少11個月，例如至少12個月。
在一個實施方案中，干細(xì)胞被維持在未分化階段的時間是至少1年，諸如至少1.5年，例如至少2年，諸如至少2.5年，例如至少3年，諸如至少3.5年，例如至少4年，諸如至少4.5年，例如至少5年，諸如至少6年，例如至少7年，諸如至少8年，例如至少9年，諸如至少10年，例如至少11年，諸如至少12年，例如至少13年，諸如至少14年，例如至少15年，諸如至少20年。
在被維持在未分化階段的時間內(nèi)所述干細(xì)胞是穩(wěn)定的，也就是說在染色體內(nèi)或細(xì)胞表面抗原性方面沒有發(fā)生突變或其它遺傳變化。所述干細(xì)胞系不含病原體，它們很好鑒定，因為人類來源是已知的，并且配子和/或胚胎和/或胚泡的培養(yǎng)條件是已知的。
在一個實施方案中，干細(xì)胞和/或干細(xì)胞系在基質(zhì)凝膠上和/或具有滋養(yǎng)細(xì)胞的條件下繁殖。胞外基質(zhì)可以是合成的或得自動物/人材料，目的是根據(jù)基質(zhì)內(nèi)的添加物或成分來支持干細(xì)胞錨著、卵裂和確保去分化、分化或使它們處于未分化狀態(tài)。
由干細(xì)胞產(chǎn)生的干細(xì)胞系是穩(wěn)定的，也就是說在染色體內(nèi)或細(xì)胞表面抗原性方面沒有發(fā)生突變或其它遺傳變化。所述干細(xì)胞系不含病原體，它們很好鑒定，因為人類來源是已知的，并且配子和/或胚胎和/或胚泡的培養(yǎng)條件是已知的。
每個干細(xì)胞系都被提供了說明書(certificate)，該說明書表明該細(xì)胞系的來源、包括細(xì)胞表面抗原類型在內(nèi)的該細(xì)胞系特征和控制該細(xì)胞系進(jìn)一步發(fā)育成分化細(xì)胞的處方(recipe)。
另一方面是干細(xì)胞包裝(package)，該包裝含有°上文所定義的干細(xì)胞，°說明書，記載干細(xì)胞和從中獲得干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)條件。
具體地，所述說明書記載了所述細(xì)胞是在氧壓低于15％的條件下和上述用于生產(chǎn)多細(xì)胞前期胚胎的a)至e)中的至少一部分步驟中培養(yǎng)的。優(yōu)選是在上述低氧壓中培養(yǎng)的。所述說明書中可以包括用于控制細(xì)胞系進(jìn)一步發(fā)育成分化細(xì)胞的處方。

圖1表示一種胚胎評價系統(tǒng)。胚胎的發(fā)育過程從頂部開始。分級或發(fā)育如下所示1.0級大小相同的對稱裂球，沒有無核裂片。
2.0級大小不均等的裂球，沒有無核裂片。
2.1級裂殖度小于10％的胚胎。
2.2級裂球裂殖度為10-20％的胚胎。
3.0級裂球裂殖度為20-50％的胚胎。
3.2級裂球裂殖度大于50％的胚胎。
4.0級完全分裂。
5.0級授精的，未分離的。
6.0級未授精的，未分離的。
M桑椹胚B1早期胚泡。
B2正在膨脹中的胚泡。
B3經(jīng)過膨脹后的胚泡。
Bn1正常腔，正常細(xì)胞。
Bn2正常腔，粒狀細(xì)胞或暗細(xì)胞。
Bn3異常腔。
HB1正在孵化中的胚泡。
HB2經(jīng)過孵化后的胚泡。
圖2表示累積胚胎分級(CES)系統(tǒng)。這是一個給不同發(fā)育階段的胚胎打分的實例。圖2a是一種形成了相同數(shù)目的裂球且沒有裂片的胚胎，級分計為4分。圖2b是一種裂球數(shù)目不等且裂片少于10％的胚胎，級分計為3分。圖2c是一種不同裂球的數(shù)目不等且裂殖度為10-50％的胚胎。圖2d是一種具有幾乎不可識別的裂球且裂殖度＞50％的胚胎，級分計為1分。
圖3表示一種溫育箱。該溫育箱配備了氣閘，調(diào)節(jié)氧氣、氮氣、二氧化碳和其它氣體以及溫度的調(diào)節(jié)器。在該溫育箱中放置了顯微鏡和氣密箱。
實施例低氧壓對卵母細(xì)胞質(zhì)量、人卵的體外成熟、體外授精和胚胎發(fā)育過程中胚胎發(fā)育的影響以下實施例是在Section for reproductive biology，Herlev UniversityHospital進(jìn)行的，在這里目前每年實施多于500個IVF循環(huán)和200個IVM循環(huán)。所進(jìn)行的研究涉及人的體外授精治療的兩個方面。
1)低氧壓是否有利于常規(guī)IVF2)低氧壓是否有利于IVM治療。
從收集卵母細(xì)胞到胚胎轉(zhuǎn)移期間，所有配子和胚胎的培養(yǎng)和處理在普通實驗室和溫育箱中進(jìn)行或者在處于培養(yǎng)箱內(nèi)的階段中進(jìn)行(見以下說明)。
培養(yǎng)箱該培養(yǎng)箱包括一個密封的培養(yǎng)箱，它配有用于操作體外培養(yǎng)物的多功能窺視孔系統(tǒng)。氣體環(huán)境應(yīng)當(dāng)是，5％CO2和5％O2，潮濕環(huán)境。溫度為37.2℃，所述環(huán)境和箱應(yīng)當(dāng)是無菌的。應(yīng)當(dāng)連接一個氣閘。
通過利用這種系統(tǒng)可以避免氧壓和二氧化碳的變化，而且根據(jù)已經(jīng)公開的數(shù)據(jù)可以期望得到一個較好的培養(yǎng)結(jié)果。
研究方案研究1將200個常規(guī)IVF循環(huán)隨機(jī)分配給在5％CO2中具有5％氧壓的培養(yǎng)箱中的每一培養(yǎng)物或具有20％O2和5％CO2的普通溫育箱中的每一培養(yǎng)物。
給每組約600個胚胎提供上述條件并收集以下數(shù)據(jù)受精卵的數(shù)目，卵裂卵的數(shù)目，胚胎質(zhì)量，可轉(zhuǎn)移的胚胎的數(shù)目，
經(jīng)過冷凍后的胚胎的數(shù)目，妊娠的數(shù)目，移植率。
研究2將100個IVM循環(huán)隨機(jī)分配給在5％CO2中具有5％氧壓的培養(yǎng)箱中的每一培養(yǎng)物或具有20％O2和5％CO2的普通溫育箱中的每一培養(yǎng)物。
給每組約100個胚胎提供上述條件并收集以下數(shù)據(jù)具有GVBD的卵的數(shù)目，MFII卵母細(xì)胞的數(shù)目，受精卵的數(shù)目，卵裂卵的數(shù)目，胚胎質(zhì)量，可轉(zhuǎn)移的胚胎的數(shù)目，經(jīng)過冷凍后的胚胎的數(shù)目，妊娠的數(shù)目，移植率。
結(jié)果在對所有滿足試驗條件的患者進(jìn)行不孕癥臨床治療的過程中征得了他們的同意。
征得同意后，將患者隨機(jī)分組在傳統(tǒng)方案中，將胚胎在20％O2水平培養(yǎng)；在測試方案中，將胚胎在5％O2水平培養(yǎng)。卵母細(xì)胞用注射器從卵巢中取出，以便獲得卵巢的正常氧壓。
胚胎的5％培養(yǎng)在選取胚胎的前一天，通過在低氧壓環(huán)境中保溫來制備培養(yǎng)基。
在選取胚胎的當(dāng)天，制備精子并立即保溫以便與后續(xù)的授精平衡。
選取胚胎后，確認(rèn)胚胎并立即放入經(jīng)過保溫的培養(yǎng)基中，并在5％O2環(huán)境中保溫。
下午，使胚胎授精，然后移到另一個培養(yǎng)皿中。
受精的胚胎繼續(xù)維持在低氧環(huán)境中直到打算轉(zhuǎn)移回來。在轉(zhuǎn)移前，對所有胚胎進(jìn)行分級打分以便選出適于轉(zhuǎn)移的最好胚胎。
結(jié)果

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權(quán)利要求
1.一種用于體外制備哺乳動物前期胚胎的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括用于獲得哺乳動物卵母細(xì)胞的裝置，和用于獲得哺乳動物精子的裝置，和具有至少兩個獨立的氣密腔室的設(shè)備，其中一個腔室中的氧壓可以獨立于另一個腔室的氧壓而發(fā)生變化，所述至少兩個獨立的氣密腔室構(gòu)成了主腔室和至少一個駐留室，所述設(shè)備包含至少一個入口，該入口能夠與用于獲得哺乳動物卵母細(xì)胞和/或哺乳動物精子的裝置互通，用于取出前期胚胎的出口，以及所述至少兩個腔室之間的接口，該接口可以使卵母細(xì)胞、精子和/或前期胚胎在兩個腔室之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移。
2.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中用于獲得哺乳動物卵母細(xì)胞的裝置是帶有針的系統(tǒng)，它在氣密條件下與從針向所述設(shè)備轉(zhuǎn)移的裝置互通，這種轉(zhuǎn)移裝置包括注射器和管。
3.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中所述用于獲得哺乳動物精子的裝置是可以調(diào)控內(nèi)部氧壓的系統(tǒng)。
4.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中所述腔室內(nèi)的環(huán)境被維持在無菌狀態(tài)。
5.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中每個腔室的溫度可以獨立調(diào)節(jié)。
6.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中每個腔室的氧壓獨立地通過充入氧氣、氮氣、二氧化碳、氦氣或另一種惰性氣體，或這些氣體中的兩種或多種氣體的混合物并且同時從室中抽出氣體來調(diào)節(jié)，以這種方式使得空氣與大氣壓一致。
7.權(quán)利要求6的系統(tǒng)，其中室內(nèi)的氣壓略高于主腔室周圍的大氣壓。
8.權(quán)利要求1-7之一的系統(tǒng)，其中每個腔室的濕度可以被調(diào)控到50至100％的水平。
9.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中所述入口和出口與單個開口裝置，諸如門組合。
10.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中所述入口和出口在裝置中組合，以便將細(xì)胞培養(yǎng)裝置和設(shè)備轉(zhuǎn)移到外腔室中以及從外腔室中移出。
11.權(quán)利要求10的系統(tǒng)，其中所述入口和所述出口的組合是氣閘。
12.權(quán)利要求11的系統(tǒng)，其中所述入口構(gòu)成氣閘的內(nèi)門而出口構(gòu)成氣閘的外門。
13.權(quán)利要求12的系統(tǒng)，其中所述氣閘包括位于所述內(nèi)門與所述外門間的壁從而構(gòu)成一個氣密小室。
14.權(quán)利要求13的系統(tǒng)，其中所述內(nèi)門和外門以每次只可以打開一個門的方式一次打開一個，并且當(dāng)一個門被完全關(guān)閉時另一個門才能被打開。
15.權(quán)利要求14的系統(tǒng)，其中所述氣閘的環(huán)境是可調(diào)控的，所述環(huán)境包括氣體含量、溫度和濕度，所述氣體是氧氣、氮氣、二氧化碳、氦氣或另一種惰性氣體。
16.權(quán)利要求15的系統(tǒng)，其中所述氣閘的內(nèi)門只可以在包括溫度、濕度和含氧量在內(nèi)的條件與內(nèi)部設(shè)置了氣閘的室的內(nèi)部條件相同時打開。
17.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中當(dāng)處理卵母細(xì)胞、精子和胚胎時可以放置并使用一臺顯微鏡。
18.權(quán)利要求1-17之一的系統(tǒng)，其中在主腔室內(nèi)獲得工作區(qū)，所述工作區(qū)包括放置含有經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的培養(yǎng)裝置的空間，其中所述經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)通過顯微鏡觀察，且所述工作區(qū)包括用于放置處理裝置的空間。
19.權(quán)利要求1-17之一的系統(tǒng)，其中主腔室內(nèi)放置了一臺顯微授精設(shè)備。
20.權(quán)利要求1-19之一的系統(tǒng)，其中主腔室包括允許人操作室內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)物或設(shè)備的開口裝置。
21.權(quán)利要求20的系統(tǒng)，其中所述開口裝置是連接的手套，這些手套以適合人手戴入并在室內(nèi)操作細(xì)胞培養(yǎng)物或設(shè)備的方式安裝。
22.權(quán)利要求20所述的系統(tǒng)，其中所述開口裝置與由光纖操縱的棍、棒或儀器連接，用所述棍、棒或儀器對細(xì)胞培養(yǎng)物或設(shè)備進(jìn)行操作。
23.權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中所述主腔室表面的至少一小部分被膜取代，該膜是無菌的且具有可以被針刺穿的結(jié)構(gòu)，當(dāng)取出針時，膜上針刺部位被填補(bǔ)，并且無論膜是否被針穿刺，氣體或顆粒都不會透過膜進(jìn)行擴(kuò)散。
24.權(quán)利要求1-23之一的系統(tǒng)，其中所述至少兩個獨立的室被布置成一個主腔室和一個或多個較小的氣密駐留室。
25.權(quán)利要求24的系統(tǒng)，其中所述較小的駐留室位于主腔室內(nèi)或與主腔室相連。
26.權(quán)利要求25的系統(tǒng)，其中所述駐留室是氣密的且彼此獨立的，它可以獨立于主腔室來調(diào)控溫度、濕度以及氧氣含量、氮氣含量和二氧化碳含量。
27.權(quán)利要求26的系統(tǒng)，其中所述駐留室構(gòu)成適于培養(yǎng)容器的箱體，所述培養(yǎng)容器含有下列的細(xì)胞培養(yǎng)物卵母細(xì)胞，精子，胚胎和包括干細(xì)胞系在內(nèi)的干細(xì)胞。
28.權(quán)利要求27所述的系統(tǒng)，每個箱體適于放置含有下列的細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)容器卵母細(xì)胞，精子，胚胎和包括干細(xì)胞系在內(nèi)的干細(xì)胞。
29.權(quán)利要求28所述的系統(tǒng)，其中箱體的數(shù)目對應(yīng)于卵母細(xì)胞，精子，胚胎和包括干細(xì)胞系在內(nèi)的干細(xì)胞的發(fā)育階段數(shù)目。
30.權(quán)利要求29所述的系統(tǒng)，其中所述發(fā)育階段至少包括未成熟卵母細(xì)胞、成熟卵母細(xì)胞、精子、受精卵母細(xì)胞、4細(xì)胞胚胎、8細(xì)胞胚胎、桑椹胚、胚泡和包括干細(xì)胞系在內(nèi)的干細(xì)胞。
31.權(quán)利要求1-30之一的系統(tǒng)，其中每個室或氣密箱體的氧壓和壓力可以通過用計算機(jī)獲取所述室或所述氣密箱體中胚胎的圖像來控制。
32.權(quán)利要求24所述的系統(tǒng)，其中所述氣密箱體是可移動的。
33.權(quán)利要求32所述的系統(tǒng)，其中所述氣密箱體從所述設(shè)備移開后，可以被連接到用于控制溫度、濕度以及氧氣、氮氣和二氧化碳的含量的裝置上。
34.權(quán)利要求33所述的系統(tǒng)，其中所述用于控制溫度、濕度以及氧氣、氮氣和二氧化碳的含量的裝置是可移動的。
35.權(quán)利要求32-34之一的系統(tǒng)，其中所述箱體的壁含有膜。
36.權(quán)利要求32-35之一的系統(tǒng)，其中所述小箱體包括用于固緊一個或多個細(xì)胞培養(yǎng)容器的固緊裝置。
37.權(quán)利要求36所述的系統(tǒng)，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)容器的壁包含無菌膜。
38.權(quán)利要求32-37之一的系統(tǒng)，其中所述小箱體可以運輸至少6天。
39.權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述主腔室的大小構(gòu)成每個壁的1cm至2m的空間。
40.權(quán)利要求1-39所述系統(tǒng)用于培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物的用途。
41.權(quán)利要求1-39所述系統(tǒng)用于培養(yǎng)配子、胚胎、胚泡、干細(xì)胞、干細(xì)胞系的用途。
42.一種用于體外制備哺乳動物前期胚胎的方法，包括下列步驟a1)提供哺乳動物卵母細(xì)胞，a2)提供哺乳動物精子，b)培養(yǎng)卵母細(xì)胞和精子，c)用精子使卵母細(xì)胞受精從而獲得受精卵母細(xì)胞，和d)使受精卵母細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞分裂從而獲得多細(xì)胞前期胚胎，其中a1)或a2)中的至少一個步驟是在氧壓低于15％的條件中進(jìn)行的。
43.權(quán)利要求42的方法，其中哺乳動物卵母細(xì)胞和哺乳動物精子是分別從雌性哺乳動物或雄性哺乳動物獲得的配子，諸如選自由牛、豬、馬、山羊、綿羊、狗、貓、兔、大鼠、小鼠、老虎、獅子、熊貓、大猩猩、鯨和人組成的組中的哺乳動物。
44.權(quán)利要求1的方法，其中哺乳動物卵母細(xì)胞和哺乳動物精子是從牛獲得的配子。
45.權(quán)利要求1的方法，其中哺乳動物卵母細(xì)胞和哺乳動物精子是從豬獲得的配子。
46.權(quán)利要求1的方法，其中哺乳動物卵母細(xì)胞和哺乳動物精子是從馬獲得的配子。
47.權(quán)利要求1的方法，其中哺乳動物卵母細(xì)胞和哺乳動物精子是從人體獲得的配子。
48.權(quán)利要求1-47之一的方法，其中所述卵母細(xì)胞從卵巢獲得。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述卵母細(xì)胞從初級卵泡，次級卵泡、原囊狀卵泡、早期囊狀卵泡或囊狀卵泡獲得。
50.權(quán)利要求48至49的方法，其中所述卵母細(xì)胞通過用針吸從卵巢獲得。
51.權(quán)利要求48至50的方法，其中通過取出含有初級卵泡，次級卵泡或囊狀卵泡的部分或全部卵巢組織并從所述卵巢組織中獲取初級卵泡，次級卵泡或囊狀卵泡來獲得所述卵母細(xì)胞。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所取出的部分或全部卵巢組織已經(jīng)被冷凍。
53.權(quán)利要求50的方法，其中所述針是注射器的一部分并且所述針和注射器中的氧壓低于15％。
54.權(quán)利要求1-53之一的方法，其中在用能使卵母細(xì)胞成熟的激素處理所述哺乳動物后，從哺乳動物獲得卵母細(xì)胞。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述激素是促卵泡激素(FSH)。
56.權(quán)利要求54的方法，其中所述激素是促黃體激素(LH)。
57.權(quán)利要求1-56的方法，其中卵母細(xì)胞已經(jīng)被冷藏。
58.權(quán)利要求1-56的方法，其中卵母細(xì)胞已經(jīng)被冷凍。
59.權(quán)利要求1-47的方法，其中精子是未成熟精子或成熟精子，包括精子細(xì)胞或精母細(xì)胞。
60.權(quán)利要求59的方法，其中所述未成熟或成熟精子是在氧壓低于15％的條件下從雄性動物獲得的。
61.權(quán)利要求59-60的方法，其中所述精子是從取自雄性動物的睪丸組織中獲得的。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述睪丸組織已被冷凍。
63.權(quán)利要求59-62的方法，其中精子從精液或睪丸組織獲得。
64.權(quán)利要求59-63的方法，其中所述精子已被冷藏。
65.權(quán)利要求59-63的方法，其中所述精子已被冷凍。
66.權(quán)利要求1-58的方法，其中所述卵母細(xì)胞是未成熟卵母細(xì)胞。
67.權(quán)利要求66的方法，其中所述未成熟卵母細(xì)胞從卵泡獲得。
68.權(quán)利要求67的方法，其中所述卵泡的直徑為1-25mm，諸如2-18，諸如3-13mm，諸如5-12mm，諸如7-11mm，諸如8-10mm。
69.權(quán)利要求66的方法，其中所述未成熟卵母細(xì)胞是初級卵母細(xì)胞。
70.權(quán)利要求66的方法，其中所述未成熟配子處于第一次減數(shù)分裂前期。
71.權(quán)利要求66的方法，其中所述未成熟配子處于第一次減數(shù)分裂核網(wǎng)期。
72.權(quán)利要求66的方法，其中所述未成熟配子處于第一次減數(shù)分裂中期的后期。
73.權(quán)利要求66-72的方法，其中將所述未成熟配子培養(yǎng)到中期II，伴有卵丘、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的同步成熟。
74.權(quán)利要求66-73的方法，其中在20至30小時期間內(nèi)完成所述未成熟配子到中期II的培養(yǎng)過程。
75.權(quán)利要求66-74的方法，其中步驟b)包括在能使所述未成熟卵母細(xì)胞成熟的條件下培養(yǎng)該卵母細(xì)胞的步驟。
76.權(quán)利要求75的方法，其中所述條件包括氧壓低于15％。
77.權(quán)利要求1-76之一的方法，其中氧壓低于13％、諸如低于11％、諸如低于10％、諸如低于9％、諸如低于8％、諸如低于7％、諸如低于6％、諸如低于5％、諸如低于4％、諸如低于3％、諸如低于2％、諸如低于1％。
78.權(quán)利要求1的方法，其中步驟b)包括將卵母細(xì)胞和精子共培養(yǎng)。
79.權(quán)利要求78的方法，其中將所述卵母細(xì)胞和精子共培養(yǎng)至少1分鐘，諸如至少2分鐘，諸如至少5分鐘，諸如至少10分鐘，諸如至少30分鐘，諸如至少1小時，諸如至少2小時，諸如至少3小時，諸如至少4小時，諸如至少5小時，諸如至少10小時，諸如至少1 5小時，諸如至少20小時，諸如至少25小時，諸如至少30小時，諸如至少35小時，諸如至少40小時，諸如至少45小時，諸如至少50小時。
80.權(quán)利要求78-79的方法，其中所述卵母細(xì)胞和精子與滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。
81.權(quán)利要求78-80的方法，其中卵母細(xì)胞與精子共培養(yǎng)導(dǎo)致卵母細(xì)胞被精子受精。
82.權(quán)利要求1-77的方法，其中卵母細(xì)胞通過胞質(zhì)內(nèi)精子注射(ICSI)而被精子受精。
83.權(quán)利要求1-82之一的方法，其中將受精的卵母細(xì)胞培養(yǎng)到胚胎階段，該階段是可以轉(zhuǎn)移到雌性動物子宮的階段。
84.權(quán)利要求83的方法，其中適于胚胎轉(zhuǎn)移的階段通過在卵母細(xì)胞受精后培養(yǎng)至少0.5天，諸如至少1天，例如至少2天，諸如至少3天，例如至少4天，諸如至少5天，諸如至少6天，例如至少7天，諸如至少8天，例如至少9天來獲得。
85.權(quán)利要求83-84的方法，其中胚胎階段是兩細(xì)胞階段。
86.權(quán)利要求83-84的方法，其中胚胎階段是四細(xì)胞階段。
87.權(quán)利要求83-84的方法，其中胚胎階段是六細(xì)胞階段。
88.權(quán)利要求83-84的方法，其中胚胎階段是八細(xì)胞階段。
89.權(quán)利要求83-84的方法，其中胚胎階段是桑椹胚階段。
90.權(quán)利要求83-84的方法，其中胚胎階段是胚泡階段。
91.權(quán)利要求83-84的方法，其中胚胎階段是胚泡階段，該階段中透明帶消失。
92.權(quán)利要求85-91的方法，其中所述胚胎的透明帶打開以便幫助在植入子宮前孵化胚胎。
93.權(quán)利要求92的方法，其中通過用激光、機(jī)械力或酸性蒂羅德溶液輔助孵化來使透明帶打開。
94.權(quán)利要求83-93的方法，其中從所述胚胎中去除細(xì)胞碎片。
95.權(quán)利要求1-94之一的方法，其中步驟a)的至少一部分以及至少一個其它步驟是在氧壓低于15％時進(jìn)行的。
96.權(quán)利要求1-95之一的方法，其中步驟a)，b)，c)和d)中的至少三個步驟是在氧壓低于15％時進(jìn)行的。
97.權(quán)利要求1-96之一的方法，其中步驟a)，b)，c)和d)中的所有步驟是在氧壓低于15％時進(jìn)行的。
98.權(quán)利要求1-97之一的方法，其中步驟d)的氧壓比步驟b)和c)中任一個的氧壓高。
99.權(quán)利要求66-76的方法，其中使卵母細(xì)胞成熟的條件包括將氧壓升高后再降低氧壓。
100.權(quán)利要求99的方法，其中氧壓升高了至少1個單位，諸如至少2個單位，例如至少3個單位，諸如至少4個單位，例如至少5個單位，例如至少6個單位，諸如至少7個單位，例如至少8個單位，諸如至少9個單位，例如至少10個單位。
101.權(quán)利要求1-100之一的方法，其中氧壓至少是0.5％，最大為21％。
102.權(quán)利要求99-100的方法，其中氧壓的升高被維持至少5分鐘，例如至少10分鐘，諸如至少20分鐘，例如至少30分鐘，諸如至少45分鐘，例如至少1小時，諸如至少1.5小時，例如至少2小時，諸如至少2.5小時，例如至少3小時，諸如至少4小時，例如至少5小時，諸如至少6小時，例如至少7小時，諸如至少8小時，例如至少9小時，諸如至少10小時。
103.權(quán)利要求1-102之一的方法，其中氧壓根據(jù)卵母細(xì)胞或胚胎所處的階段和條件來進(jìn)行調(diào)控。
104.權(quán)利要求1-103之一的方法，其中卵母細(xì)胞，精子和胚胎的培養(yǎng)條件包括30-45℃，諸如32-42℃，諸如34-40℃，諸如36-38℃，諸如36.5-37.5℃，諸如約37℃的溫度。
105.權(quán)利要求1-104之一的方法，其中卵母細(xì)胞，精子和胚胎的培養(yǎng)條件包括約37℃的溫度。
106.權(quán)利要求1-105之一的方法，其中培養(yǎng)物的氧壓是通過向體外培養(yǎng)物的環(huán)境中充入氧氣、氮氣、二氧化碳、氦氣或其它惰性氣體或這些氣體中的兩種或多種氣體的混合物來調(diào)節(jié)的。
107.權(quán)利要求1-107之一的方法，其中步驟a)，b)，c)和d)中的所有步驟和胚胎向子宮的轉(zhuǎn)移都是在氧壓低于20％，諸如低于15％、諸如低于13％、諸如低于11％、諸如低于10％、諸如低于9％、諸如低于8％、諸如低于7％、諸如低于6％、諸如低于5％、諸如低于4％、諸如低于3％、諸如低于2％、諸如低于1％時進(jìn)行的。
108.權(quán)利要求1-108之一的方法，其中步驟a)，b)，c)和d)中的所有步驟和胚胎向子宮的轉(zhuǎn)移都是在無菌條件中進(jìn)行的。
109.權(quán)利要求1-108之一的方法，其中所述培養(yǎng)基含有脂質(zhì)或脂質(zhì)前體，諸如甾醇或其功能等價的衍生物。
110.權(quán)利要求1-109之一的方法，其中所述培養(yǎng)基含有ATA(金精三羧酸)。
111.權(quán)利要求1-110之一的方法，其中所述添加劑是Medi-Cult SSR 4x、Medi-Cult SSR 4xa、Medi-Cult SSR 4xb、Medi-Cult SSR2或Medi-Cult SSR3。
112.權(quán)利要求1-111之一的方法，其中用于卵母細(xì)胞或精子發(fā)育的每個階段的培養(yǎng)基包括本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的培養(yǎng)基。
113.權(quán)利要求1-112之一的方法，其中所述培養(yǎng)基被調(diào)整到低氧壓的條件，所述調(diào)整可以是物理的或化學(xué)的方法，后者例如是通過利用氧分子載體或過氧化氫酶的方法。
114.權(quán)利要求1-113之一的方法，其中所述培養(yǎng)條件使得形成的胚胎內(nèi)細(xì)胞的數(shù)目增多了。
115.權(quán)利要求1-114之一的方法，其中胚胎經(jīng)過培養(yǎng)使得胚胎的裂球數(shù)為3-5個并且評價等級為1.0；2.0；2.1和2.2。
116.權(quán)利要求1-114之一的方法，其中胚胎經(jīng)過培養(yǎng)使得胚胎的裂球數(shù)為4個并且評價等級為1.0；2.0和2.1。
117.權(quán)利要求1-114之一的方法，其中胚胎經(jīng)過培養(yǎng)使3-5個細(xì)胞階段的胚胎具有10-50％的裂殖度，因此依據(jù)CES分級系統(tǒng)該胚胎的級分為6-7。
118.權(quán)利要求1-114之一的方法，其中胚胎經(jīng)過培養(yǎng)導(dǎo)致3-5個細(xì)胞階段的胚胎具有小于10％的裂殖度，因此依據(jù)CES分級系統(tǒng)該胚胎的級分為7-8。
119.權(quán)利要求1-114之一的方法，其中胚胎經(jīng)過培養(yǎng)導(dǎo)致4個細(xì)胞階段的胚胎具有小于10％的裂殖度，因此依據(jù)CES分級系統(tǒng)該胚胎的級分為8。
120.權(quán)利要求1-114之一的方法，其中胚胎經(jīng)過培養(yǎng)，在受精后64-67小時產(chǎn)生7-9個細(xì)胞的胚胎，并依據(jù)GES分級系統(tǒng)獲得了60-100的級分。
121.權(quán)利要求1-114之一的方法，其中胚胎經(jīng)過培養(yǎng)，導(dǎo)致在受精后64-67小時，產(chǎn)生具有7個等級I的細(xì)胞或8個等級I的細(xì)胞或8個等級II的細(xì)胞或9個等級I的細(xì)胞的胚胎，且依據(jù)GES分級系統(tǒng)獲得了70-100的級分。
122.權(quán)利要求1-114之一的方法，其中胚胎經(jīng)過培養(yǎng)，導(dǎo)致在受精后64-67小時，產(chǎn)生具有7個等級I的細(xì)胞或8個等級I的細(xì)胞或8個等級II的細(xì)胞或9個等級I的細(xì)胞的胚胎，且依據(jù)GES分級系統(tǒng)獲得了80-100的級分。
123.植入前期胚胎的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求1至122之一的卵母細(xì)胞和精子并且將得到的前期胚胎移入雌性哺乳動物的子宮內(nèi)。
124.權(quán)利要求123的方法，其中所述胚胎被移入雌性動物子宮的輸卵管內(nèi)。
125.權(quán)利要求123-124的方法，其中在雌性動物經(jīng)過激素處理后將所述胚胎移入該雌性動物的子宮內(nèi)。
126.一種用于體外制備哺乳動物前期胚胎的方法，包括下列步驟a)提供選自哺乳動物卵母細(xì)胞和哺乳動物精子的配子，b)培養(yǎng)所述卵母細(xì)胞和精子，c)用精子使卵母細(xì)胞受精從而獲得受精卵母細(xì)胞，和e)使受精卵母細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞分裂從而獲得多細(xì)胞前期胚胎，其中所述培養(yǎng)是在能夠進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的氧壓中進(jìn)行且其中至少一個步驟包括氧壓的變化。
127.權(quán)利要求126的方法，其中哺乳動物卵母細(xì)胞和哺乳動物精子是分別從雌性哺乳動物或雄性哺乳動物獲得的配子，所述哺乳動物是諸如選自由牛、豬、馬、山羊、綿羊、狗、貓、兔、大鼠、小鼠、老虎、獅子、熊貓、大猩猩、鯨和人組成的組中的哺乳動物。
128.權(quán)利要求126的方法，其中哺乳動物卵母細(xì)胞和哺乳動物精子是得自牛的配子。
129.權(quán)利要求126的方法，其中哺乳動物卵母細(xì)胞和哺乳動物精子是得自豬的配子。
130.權(quán)利要求126的方法，其中哺乳動物卵母細(xì)胞和哺乳動物精子是得自馬的配子。
131.權(quán)利要求126的方法，其中哺乳動物卵母細(xì)胞和哺乳動物精子是得自人的配子。
132.權(quán)利要求126-131之一的方法，其中卵母細(xì)胞獲自于卵巢。
133.權(quán)利要求132的方法，其中卵母細(xì)胞獲自于初級卵泡，次級卵泡、原囊狀卵泡、早期囊狀卵泡或囊狀卵泡。
134.權(quán)利要求132-133之一的方法，其中所述卵母細(xì)胞通過用針吸從卵巢獲得。
135.權(quán)利要求132-134之一的方法，其中通過取出含有初級卵泡，次級卵泡或囊狀卵泡的部分或全部卵巢組織并從所述卵巢組織中獲取初級卵泡，次級卵泡或囊狀卵泡來獲得所述卵母細(xì)胞。
136.權(quán)利要求135的方法，其中所取出的部分或全部卵巢組織已經(jīng)被冷凍。
137.權(quán)利要求134的方法，其中所述針是注射器的一部分并且所述針和注射器中的氧壓低于15％。
138.權(quán)利要求126-137之一的方法，其中在用能使卵母細(xì)胞成熟的激素處理哺乳動物后，從該哺乳動物獲得卵母細(xì)胞。
139.權(quán)利要求138的方法，其中所述激素是促卵泡激素(FSH)。
140.權(quán)利要求138的方法，其中所述激素是促黃體激素(LH)。
141.權(quán)利要求126-140的方法，其中卵母細(xì)胞已經(jīng)被冷藏。
142.權(quán)利要求126-140的方法，其中卵母細(xì)胞已經(jīng)被冷凍。
143.權(quán)利要求126-131的方法，其中精子是未成熟精子或成熟精子，包括精子細(xì)胞或精母細(xì)胞。
144.權(quán)利要求143的方法，其中所述未成熟或成熟精子是在氧壓低于15％的條件下從雄性動物獲得的。
145.權(quán)利要求143-144的方法，其中所述精子是從取自雄性動物的睪丸組織中獲得的。
146.權(quán)利要求145的方法，其中所述睪丸組織已被冷凍。
147.權(quán)利要求143-146的方法，其中精子從精液或睪丸組織獲得。
148.權(quán)利要求143-147的方法，其中所述精子已被冷
149.權(quán)利要求143-147的方法，其中所述精子已被冷藏。
150.權(quán)利要求126-142的方法，其中所述卵母細(xì)胞是未成熟卵母細(xì)胞。
151.如權(quán)利要150的方法，其中所述未成熟卵母細(xì)胞從卵泡獲得。
152.權(quán)利要求151的方法，其中所述卵泡的直徑為1-25mm，諸如2-18，諸如3-13mm，諸如5-12mm，諸如7-11mm，諸如8-10mm。
153.權(quán)利要求150的方法，其中所述未成熟卵母細(xì)胞是初級卵母細(xì)胞。
154.權(quán)利要求150的方法，其中所述未成熟配子處于第一次減數(shù)分裂前期。
155.權(quán)利要求150的方法，其中所述未成熟配子處于第一次減數(shù)分裂核網(wǎng)期。
156.權(quán)利要求150的方法，其中所述未成熟配子處于第一次減數(shù)分裂中期的后期。
157.權(quán)利要求150-156的方法，其中將所述未成熟配子培養(yǎng)到中期II，并伴有卵丘、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的同步成熟。
158.權(quán)利要求150-157的方法，其中在20至30小時期間內(nèi)完成所述未成熟配子到中期II的培養(yǎng)過程。
159.權(quán)利要求126-158的方法，其中所述氧壓的降低是在步驟a)，b)，c)或e)中的一個步驟中于使卵母細(xì)胞或精子成熟的條件中進(jìn)行的。
160.權(quán)利要求126-158的方法，其中所述氧壓的降低是在步驟a)，b)，c)或e)中的兩個步驟中于使卵母細(xì)胞或精子成熟的條件中進(jìn)行的。
161.權(quán)利要求126-158的方法，其中所述氧壓的降低是在步驟a)，b)，c)或e)中的三個步驟中于使卵母細(xì)胞或精子成熟的條件中進(jìn)行的。
162.權(quán)利要求126-158的方法，其中所述氧壓的降低是在步驟a)，b)，c)或e)中的所有步驟中于使卵母細(xì)胞或精子成熟的條件中進(jìn)行的。
163.權(quán)利要求126-158的方法，其中所述氧壓的升高是在步驟a)，b)，c)或e)中的一個步驟中于使卵母細(xì)胞或精子成熟的條件中進(jìn)行的。
164.權(quán)利要求126-158的方法，其中所述氧壓的升高是在步驟a)，b)，c)或e)中的兩個步驟中于使卵母細(xì)胞或精子成熟的條件中進(jìn)行的。
165.權(quán)利要求126-158的方法，其中所述氧壓的升高是在步驟a)，b)，c)或e)中的三個步驟中于使卵母細(xì)胞或精子成熟的條件中進(jìn)行的。
166.權(quán)利要求126-158的方法，其中所述氧壓的升高是在步驟a)，b)，c)或e)中的所有步驟中于使卵母細(xì)胞或精子成熟的條件中進(jìn)行的。
167.權(quán)利要求126-166之一的方法，其中將培養(yǎng)的初始氧壓選定在1％至21％之間。
168.權(quán)利要求126-167之一的方法，其中氧壓的變化是將氧壓改變到低于20％，例如低于19％，諸如低于18％，例如低于17％，諸如低于16％，例如低于15％，諸如低于14％，例如低于13％，諸如低于12％，例如低于11％，諸如低于10％，例如低于9％，諸如低于8％，例如低于7％，諸如低于6％，例如低于5％，諸如低于4％，例如低于3％，諸如低于2％，例如低于1％。
169.權(quán)利要求126-168之一的方法，其中氧壓的變化是將氧壓降低至少1個單位，諸如至少2個單位，例如至少3個單位，諸如至少4個單位，例如至少5個單位，例如至少6個單位，諸如至少7個單位，例如至少8個單位，諸如至少9個單位，例如至少10個單位，諸如至少11個單位，例如至少12個單位，諸如至少13個單位，例如至少14個單位，諸如至少15個單位，例如至少16個單位，諸如至少17個單位，例如至少18個單位，諸如至少19個單位。
170.權(quán)利要求126-169之一的方法，其中氧壓的變化是將氧壓降低1-19個單位，諸如1-18個單位，例如1-17個單位，諸如1-16個單位，例如1-15個單位，諸如1-14個單位，例如1-13個單位，諸如1-12個單位，例如1-11個單位，諸如1-10個單位，例如1-9個單位，諸如1-8個單位，例如1-7個單位，諸如1-6個單位，例如1-5個單位，諸如1-4個單位，例如1-3個單位，諸如1-2個單位。
171.權(quán)利要求126-170之一的方法，其中氧壓的變化是將氧壓改變到高于2％，例如高于3％，諸如高于4％，例如高于5％，諸如高于6％，例如高于7％，諸如高于8％，例如高于9％，諸如高于10％，例如高于11％，諸如高于12％，例如高于13％，諸如高于14％，例如高于15％，諸如高于16％，例如高于17％，諸如高于18％，例如高于19％，諸如高于20％，例如高于21％。
172.權(quán)利要求126-171之一的方法，其中氧壓的變化是將氧壓升高至少1個單位，諸如至少2個單位，例如至少3個單位，諸如至少4個單位，例如至少5個單位，例如至少6個單位，諸如至少7個單位，例如至少8個單位，諸如至少9個單位，例如至少10個單位，諸如至少11個單位，例如至少12個單位，諸如至少13個單位，例如至少14個單位，諸如至少15個單位，例如至少16個單位，諸如至少17個單位，例如至少18個單位，諸如至少19個單位。
173.權(quán)利要求126-172之一的方法，氧壓的變化是氧壓升高了1-3個單位，諸如2-5個單位，例如3-7個單位，諸如4-9個單位，例如5-11個單位，諸如6-13個單位，例如8-15個單位，諸如10-18個單位，例如12-20個單位。
174.權(quán)利要求126-173之一的方法，其中變化后的氧壓被調(diào)節(jié)到高于或低于初始氧壓的水平。
175.權(quán)利要求174的方法，其中變化后的氧壓被調(diào)節(jié)到1％至21％的水平。
176.權(quán)利要求126-175之一的方法，其中氧壓的變化進(jìn)行至少1分鐘，例如至少2分鐘，諸如至少3分鐘，例如至少4分鐘，諸如至少5分鐘，例如至少6分鐘，諸如至少7分鐘，例如至少8分鐘，諸如至少9分鐘，例如至少10分鐘，諸如至少11分鐘，例如至少12分鐘，諸如至少13分鐘，例如至少14分鐘，諸如至少15分鐘，例如至少16分鐘，諸如至少20分鐘，例如至少30分鐘，諸如至少45分鐘，例如至少1小時，諸如至少1.5小時，例如至少2小時，諸如至少2.5小時，例如至少3小時，諸如至少4小時，例如至少5小時，諸如至少6小時，例如至少7小時，諸如至少8小時，例如至少9小時，諸如至少10小時。
177.權(quán)利要求126-176之一的方法，其中步驟b)包括卵母細(xì)胞與精子的共培養(yǎng)。
178.權(quán)利要求177的方法，其中卵母細(xì)胞與精子被共培養(yǎng)至少1分鐘，諸如至少2分鐘，諸如至少5分鐘，諸如至少10分鐘，諸如至少30分鐘，諸如至少1小時，諸如至少2小時，諸如至少3小時，諸如至少4小時，諸如至少5小時，諸如至少10小時，諸如至少15小時，諸如至少20小時，諸如至少25小時，諸如至少30小時，諸如至少35小時，諸如至少40小時，諸如至少45小時，諸如至少50小時。
179.權(quán)利要求177-178之一的方法，其中卵母細(xì)胞和精子與滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)。
180.權(quán)利要求177-179的方法，其中卵母細(xì)胞與精子的共培養(yǎng)導(dǎo)致卵母細(xì)胞被精子受精。
181.權(quán)利要求126-176的方法，其中卵母細(xì)胞通過胞質(zhì)內(nèi)注射精子(ICSI)而被精子受精。
182.權(quán)利要求126-181之一的方法，其中受精的卵母細(xì)胞被培養(yǎng)到胚胎階段以備轉(zhuǎn)移到雌性動物的子宮內(nèi)。
183.權(quán)利要求182的方法，其中適于胚胎轉(zhuǎn)移的階段通過將卵母細(xì)胞在受精后培養(yǎng)至少0.5天，諸如至少1天。例如至少2天，諸如至少3天，例如至少4天，諸如至少5天，諸如至少6天，例如至少7天，諸如至少8天，例如至少9天而獲得。
184.權(quán)利要求182-183的方法，其中所述胚胎階段是兩細(xì)胞階段。
185.權(quán)利要求182-183的方法，其中所述胚胎階段是四細(xì)胞階段。
186.權(quán)利要求182-183的方法，其中所述胚胎階段是六細(xì)胞階段。
187.權(quán)利要求182-183的方法，其中所述胚胎階段是八細(xì)胞階段。
188.權(quán)利要求182-183的方法，其中所述胚胎階段是桑椹胚階段。
189.權(quán)利要求182-183的方法，其中所述胚胎階段是胚泡階段。
190.權(quán)利要求182-183的方法，其中胚胎階段是胚泡階段，該階段中透明帶消失。
191.權(quán)利要求184-190的方法，其中所述胚胎的透明帶打開以幫助在植入子宮前孵化胚胎。
192.權(quán)利要求191的方法，其中通過用激光、機(jī)械力或酸性蒂羅德溶液輔助孵化使透明帶打開。
193.權(quán)利要求182-192的方法，其中從所述胚胎中去除細(xì)胞碎片。
194.權(quán)利要求126-193之一的方法，其中氧壓至少是0.5％，最大為21％。
195.權(quán)利要求126-194之一的方法，其中氧壓根據(jù)卵母細(xì)胞或胚胎所處的階段和條件來進(jìn)行調(diào)控。
196.權(quán)利要求126-195之一的方法，其中卵母細(xì)胞、精子和胚胎的培養(yǎng)條件包括30-45℃，諸如32-42℃，諸如34-40℃，諸如36-38℃，諸如36.5-37.5℃，諸如約37℃的溫度。
197.權(quán)利要求126-196之一的方法，其中卵母細(xì)胞，精子和胚胎的培養(yǎng)條件包括約37℃的溫度。
198.權(quán)利要求126-197之一的方法，其中培養(yǎng)物的氧壓是通過向體外培養(yǎng)物的環(huán)境中充入氧氣、氮氣、二氧化碳、氦氣或其它惰性氣體或這些氣體中的兩種或多種氣體的混合物來調(diào)節(jié)的。
199.權(quán)利要求126-198之一的方法，其中步驟a)，b)，c)和e)中的所有步驟以及胚胎向子宮的轉(zhuǎn)移都是在無菌條件中進(jìn)行的。
200.權(quán)利要求126-199之一的方法，其中所述培養(yǎng)基含有脂質(zhì)或脂質(zhì)前體，諸如甾醇或其功能等價的衍生物。
201.權(quán)利要求126-200之一的方法，其中所述培養(yǎng)基含有ATA(金精三羧酸)。
202.權(quán)利要求126-201之一的方法，其中所述添加劑是Medi-Cult SSR4x、Medi-Cult SSR 4xa、Medi-Cult SSR 4xb、Medi-Cult SSR2或Medi-CultSSR3。
203.權(quán)利要求126-202之一的方法，其中用于卵母細(xì)胞或精子發(fā)育的每個階段的培養(yǎng)基包括本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的培養(yǎng)基。
204.權(quán)利要求203的方法，其中所述培養(yǎng)基被調(diào)整到低氧壓的條件，所述調(diào)整可以是物理的或化學(xué)的方法，后者例如是通過利用氧分子載體或過氧化氫酶的方法。
205.權(quán)利要求126-204之一的方法，其中所述培養(yǎng)條件使得形成的胚胎內(nèi)細(xì)胞的數(shù)目增多了。
206.權(quán)利要求126-205之一的方法，其中胚胎經(jīng)過培養(yǎng)使得胚胎的裂球數(shù)為3-5個并且評價等級為1.0；2.0；2.1和2.2。
207.權(quán)利要求126-205之一的方法，其中胚胎經(jīng)過培養(yǎng)使得胚胎的裂球數(shù)為4個并且評價等級為1.0；2.0和2.1。
208.權(quán)利要求126-205之一的方法，其中胚胎經(jīng)過培養(yǎng)導(dǎo)致3-5個細(xì)胞階段的胚胎具有10-50％的裂殖度，因此依據(jù)CES分級系統(tǒng)該胚胎的級分為6-7。
209.權(quán)利要求126-205之一的方法，其中胚胎經(jīng)過培養(yǎng)導(dǎo)致3-5個細(xì)胞階段的胚胎具有小于10％的裂殖度，因此依據(jù)CES分級系統(tǒng)該胚胎的級分為7-8。
210.權(quán)利要求126-205之一的方法，其中胚胎經(jīng)過培養(yǎng)導(dǎo)致4個細(xì)胞階段的胚胎具有小于10％的裂殖度，因此依據(jù)CES分級系統(tǒng)該胚胎的級分為8。
211.權(quán)利要求126-205之一的方法，其中胚胎經(jīng)過培養(yǎng)，在受精后64-67小時產(chǎn)生7-9個細(xì)胞的胚胎，并依據(jù)GES分級系統(tǒng)獲得了60-100的級分。
212.權(quán)利要求126-205之一的方法，其中胚胎經(jīng)過培養(yǎng)在受精后64-67小時產(chǎn)生7個等級I的細(xì)胞或8個等級I的細(xì)胞或8個等級II的細(xì)胞或9個等級I的細(xì)胞并且依據(jù)GES分級系統(tǒng)獲得了70-100的級分。
213.權(quán)利要求126-205之一的方法，其中胚胎經(jīng)過培養(yǎng)在受精后64-67小時產(chǎn)生7個等級I的細(xì)胞或8個等級I的細(xì)胞或8個等級II的細(xì)胞或9個等級I的細(xì)胞并且依據(jù)GES分級系統(tǒng)獲得了80-100的級分。
214.植入前期胚胎的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求126至213之一的卵母細(xì)胞和精子并且將得到的前期胚胎移入雌性哺乳動物的子宮內(nèi)。
215.權(quán)利要求215的方法，其中所述胚胎被移入雌性動物子宮的輸卵管內(nèi)。
216.權(quán)利要求215-216的方法，其中在雌性動物經(jīng)過激素處理后將所述胚胎移入該雌性動物的子宮內(nèi)。
217.一種制備干細(xì)胞的方法，該方法包括a)提供權(quán)利要求42-213之一的多細(xì)胞前期胚胎，b)分離出a)中的多細(xì)胞前期胚胎，c)從b)的前期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出細(xì)胞，d)在基質(zhì)膠中培養(yǎng)從所述內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出的細(xì)胞，e)獲得干細(xì)胞。
218.權(quán)利要求217的方法，其中其中步驟b)，c)，d)和e)中的至少一個步驟是在氧壓低于15％時進(jìn)行的。
219.權(quán)利要求217的方法，其中其中步驟b)，c)，d)和e)中的至少兩個步驟是在氧壓低于15％時進(jìn)行的
220.權(quán)利要求217的方法，其中其中步驟b)，c)，d)和e)中的至少三個步驟是在氧壓低于15％時進(jìn)行的
221.權(quán)利要求217的方法，其中其中步驟b)，c)，d)和e)中的所有步驟是在氧壓低于15％時進(jìn)行的
222.由權(quán)利要求217-221之一方法得到的干細(xì)胞。
223.權(quán)利要求222所述的干細(xì)胞，其中所述干細(xì)胞是穩(wěn)定的，也就是說染色體內(nèi)或細(xì)胞表面抗原性不發(fā)生突變或其它遺傳改變。
224.由權(quán)利要求217-221的干細(xì)胞得到的干細(xì)胞系。
225.使用由權(quán)利要求217-221的方法獲得的干細(xì)胞制備干細(xì)胞系的用途。
226.一種干細(xì)胞包裝產(chǎn)品，該包裝產(chǎn)品含有權(quán)利要求217-221之一的干細(xì)胞說明書，其中記載了適于干細(xì)胞和由該干細(xì)胞獲得的細(xì)胞培養(yǎng)物的培養(yǎng)條件。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于制備哺乳動物前期胚胎和質(zhì)量高于現(xiàn)有技術(shù)的干細(xì)胞的方法和系統(tǒng)。所述系統(tǒng)包括包括用于獲得哺乳動物卵母細(xì)胞的裝置和用于獲得哺乳動物精子的裝置和一個具有至少兩個獨立的氣密腔室的設(shè)備，其中一個腔室中的氧壓可以不依賴于另一個腔室的氧壓而發(fā)生變化，所述至少兩個獨立的氣密腔室構(gòu)成了一個主腔室和至少一個駐留室。用于體外制備哺乳動物前期胚胎的所述方法包括步驟a1)提供哺乳動物卵母細(xì)胞，a2)提供哺乳動物精子，b)培養(yǎng)卵母細(xì)胞和精子，c)用精子使卵母細(xì)胞受精從而獲得受精卵母細(xì)胞，和d)使受精卵母細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞分裂從而獲得多細(xì)胞前期胚胎，其中a1)或a2)中的至少一個步驟是在氧壓低于15％的條件中進(jìn)行的，或者e)使受精卵母細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞分裂從而獲得多細(xì)胞前期胚胎，其中所述培養(yǎng)是在適于細(xì)胞培養(yǎng)的氧壓時進(jìn)行的并且其中至少一個步驟包括氧壓力的變化。干細(xì)胞是由多細(xì)胞前期胚胎產(chǎn)生的。
文檔編號A01N1/02GK1675354SQ03819537
公開日2005年9月28日 申請日期2003年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月17日
發(fā)明者斯文德·林登堡 申請人:哥本哈根政府醫(yī)院,位于海萊烏