專利名稱：抗－雞球蟲病組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可有效預防和治療雞球蟲病的組合物。更具體的，本發(fā)明涉及對雞和其它禽類的球蟲病具有優(yōu)秀的預防和治療效果的組合物，該藥物可有效的預防雞球蟲病感染，有效的改善一些臨床病況諸如與雞球蟲病相關(guān)的體重減輕，或者，該組合物能非常有效的治療雞球蟲病。
背景技術(shù)：
雞球蟲病(雞中發(fā)生的球蟲病)是由感染艾美球蟲屬(genusEimeria)原蟲而引起的。在雞中，艾美球蟲屬物種不同，則癥狀和寄生蟲棲息地也不相同。重要的致病艾美球蟲屬物種主要是以下5種即禽艾美球蟲(Eimeria tenella)、奈氏艾美球蟲(E.necatrix)、百型艾美球蟲(E.maxima)、波氏艾美球蟲(E.brunetti)和堆形艾美球蟲(E.acervulina)，而其它公知的艾美球蟲屬物種包括和緩艾美球蟲(E.mitis)、塞前艾美球蟲(E.praecox)、哈氏艾美球蟲(E.hagani)和變位艾美球蟲(E.mivati)。在鵪鶉中，已知球蟲病是由E.uzura、E.tsunodai等等引起的；在火雞中，已知是由珠雞和緩艾美球蟲(E.meleagrimitis)、腺樣艾美球蟲(E.adenoides)和E.gallopovonis引起的；而在珍珠雞中，已知是由E.grenieri和E.numidae引起的。球蟲病是造成最具破壞性損失的雞疾病中的一種，而球蟲病的感染是通過經(jīng)過口腔攝入卵囊而引起的。疾病癥狀包括各種腹瀉、食欲缺乏、厭食和體重減輕，并且感染禽類通常都會死亡。是否能被感染與禽類的年齡(以日計)、性別或種類無關(guān)。盡管球蟲病更多的被發(fā)現(xiàn)在自由散養(yǎng)的雞籠中，然而，最近報道在多層籠檻中的下蛋母雞中也暴發(fā)了球蟲病。還需注意的是，當禽類同時感染了產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringens)時，球蟲病的癥狀要更嚴重。球蟲病的預防通常通過預防籠檻被卵囊污染、和通過抗球蟲藥的使用來實現(xiàn)。禽類使用的各種合成的抗球蟲藥物和離子運載(ionophorous)抗菌素可用作預防性的抗球蟲藥物，并且，磺胺藥或者磺胺藥物和嘧啶藥物的混合物可用于治療。在商業(yè)化基礎上，也可使用疫苗。
在雞中，抗球蟲藥物只能在孵化后10周內(nèi)使用，在雛雞(broilerchickens)中，需要強制性的在運輸之前至少7天內(nèi)停止用藥，因為蛋類和肉類只有在抗球蟲藥物最后一次給藥后經(jīng)過一段時間后才能被允許進行運輸。在這段時間內(nèi)，禁止給予抗球蟲藥物，因此有可能暴發(fā)雞球蟲病。另一個問題是耐藥雞雙孢子球蟲的增加，因此，每個農(nóng)場需要選擇對于各自農(nóng)場有效的抗球蟲藥物。而開發(fā)針對雞球蟲病的大量的抗球蟲藥物需要時間。然而，最近由于殘留抗球蟲藥物的作用、對人和其它動物的副作用、耐藥雞雙孢子球蟲的出現(xiàn)等等，抗球蟲藥物的使用受到了嚴格的限制。在歐洲，將在2007年之前禁止使用抗球蟲藥物。在日本，抗球蟲藥物的使用也因為飼料添加劑方面的管理條例的執(zhí)行而被嚴格的禁止。
對于口服活疫苗而言，人們做了諸多努力用弱毒性的菌株以系統(tǒng)性的免疫雞類，由此預防雞類被高毒性的菌株感染。活體疫苗的一個例子是一種含有來自幾個物種卵囊的混合物，將其給予雞類，雞將被溫和的非-致命級菌感染而獲得了免疫力。然而，此類鳥類雙孢子球蟲活體疫苗具有不可忽視的缺陷，即雞的農(nóng)場也遭受了污染。另一方面，滅活疫苗僅能產(chǎn)生不足量的抗體以預防感染，因此不十分有效。還需要注意的是，即使雞已經(jīng)被免疫，產(chǎn)生保護性的抗體還需要數(shù)周時間，該時間對于雛雞來說是太長了。
當雞被感染了雞球蟲病時，雞的腸道菌群受到干擾，從而導致了諸如腹瀉等癥狀。該腹瀉會持續(xù)特別長的時間從而導致體力耗盡以及免疫退化。禽類然后會染上壞死性小腸結(jié)腸炎。
日本專利2548115、2698778和2698779公開了使用鳥類抗體對哺乳動物進行被動免疫。該被動免疫用在當給予異種抗體(從雞蛋)用以被動免疫(特別的，通過注射或其它的胃腸外給藥)的過程中，在此操作中，最初給予動物含有抗體的食物以在預防性或治療性給予抗體之前建立口服免疫耐受，從而預防過敏性休克和血清病。因此，該方法與本發(fā)明的思路是完全不同的，該方法中動物的保護是通過口服被動免疫來實現(xiàn)的。本發(fā)明發(fā)明人還提交了一項專利申請(日本專利號2034005)，涉及用于斷奶前豬或母牛的大腸桿菌病的口服預防性或治療性試劑，該試劑通過用至少一種選自造成豬大腸桿菌病的腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(E.coli)的987P、K88和K99抗原以及造成牛大腸桿菌病的腸產(chǎn)毒性大腸桿菌的K99抗原來免疫雞類，并從免疫過的雞下的雞蛋中獲得抗體而制備；該試劑含有該抗原特異性的多克隆抗體。本發(fā)明發(fā)明人也提交了一項專利申請(日本專利號2615673)，涉及到用于抑制食用禽類的食物中毒性細菌的材料，包括由通過預先接種了食物中毒性細菌而已經(jīng)產(chǎn)生免疫力的雞下的整蛋、蛋黃、或蛋的含抗體部分，其含有食物中毒性細菌特異性的抗體。這些專利或許公開了雞蛋抗體的用途，但是它們只是公開了通過口服被動免疫來保護動物對抗細菌的侵害，并不是保護動物對抗原蟲的侵害。直至今天，使用被動免疫來用于原蟲的思路仍然是未知的，而對于本領(lǐng)域而言，使用雞蛋抗體用于口服導入對抗細菌或病毒的被動免疫則是已知的。
需要注意的是，只有少數(shù)文獻報道對抗雞雙孢子球蟲的被動免疫，而許多文獻公開了使用各種抗原來對抗雞雙孢子球蟲的疫苗。有一篇文獻中報道生產(chǎn)了一種對抗百型艾美球蟲配子母細胞的鼠單克隆抗體以確定對抗雞球蟲病的被動免疫(Infection and Immunity，56972-976，1988，Infection and Immunity，58557-562，1990)。然而，在該文獻中，試驗是通過靜脈注射鼠單克隆抗體而不是口服給予的，因此，該文章離實際應用還很遙遠。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)上文所描述的情況來看，本發(fā)明的發(fā)明人作了充分的研究，他們發(fā)現(xiàn)，雞、鵪鶉或其它禽類使用抗原性外膜蛋白或其免疫原性片段(它們具有與雞球蟲病相關(guān)的堆形艾美球蟲、禽艾美球蟲和百型艾美球蟲的子孢子和裂殖子所共有的免疫原性)作為抗原進行免疫，以生產(chǎn)抗-雞球蟲病抗體，然后由所述禽類所產(chǎn)生的蛋中的抗體向雞或其它禽類給藥，抗體附著到艾美球蟲屬物種原蟲的子孢子或裂殖子上，以抑制子孢子或裂殖子在上皮細胞上的附著和侵入，由此，破壞了子孢子和裂殖子的病原性。本發(fā)明發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，當本發(fā)明的抗-雞球蟲病抗體與乳酸菌聯(lián)合給藥時，通過改善腸道菌群以及促進免疫力以及通過本發(fā)明抗體更為有效的作用，可以獲得對雞球蟲病的優(yōu)秀的預防性和治療性效果。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，當本發(fā)明抗-雞球蟲病抗體與從用產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌免疫的雞所下的蛋中得到的抗體聯(lián)合給藥時，通過預防由產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌混合感染導致的癥狀的惡化，以及通過本發(fā)明抗體更為有效的作用，可以獲得對雞球蟲病的優(yōu)秀的預防性和治療性效果。本發(fā)明還完成了如下發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明包括以下所述的發(fā)明內(nèi)容。
(1)用于口服給藥的抗-雞球蟲病組合物，含有從用抗原性外膜蛋白或其免疫原性片段(具有與雞球蟲病相關(guān)的堆形艾美球蟲、禽艾美球蟲和百型艾美球蟲的子孢子和裂殖子所共有的免疫原性)進行免疫的雞所下的蛋中得到的抗體。
(2)上述(1)的組合物，進一步含有乳酸菌。
(3)上述(1)或(2)的組合物，進一步含有從用產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌進行免疫的雞所下的蛋中得到的抗體。
(4)上述(1)至(3)中任一項的組合物，用于預防或治療雞球蟲病。
(5)含有上述(1)至(4)中任一項的組合物的鳥飼料。
(6)一種預防或治療雞球蟲病的方法，其中，上述(1)的抗體口服給予禽類，任選地，與乳酸菌或從用產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌進行免疫的雞所下的蛋中得到的抗體聯(lián)合給藥。
本發(fā)明更為詳細的描述如下。
本發(fā)明中所使用的抗原是抗原性外膜蛋白或其免疫原性片段，其含有與雞球蟲病相關(guān)的堆形艾美球蟲、禽艾美球蟲和百型艾美球蟲的子孢子和裂殖子所共有的免疫原性。
由于此抗原含有與雞球蟲病相關(guān)的堆形艾美球蟲、禽艾美球蟲和百型艾美球蟲的子孢子和裂殖子所共有的免疫原性，因此，無論病原體是堆形艾美球蟲、禽艾美球蟲或百型艾美球蟲，通過使用此抗原所得到的產(chǎn)品都是有效的。
可使用的所述抗原的例子包括記載在Avian Diseases，44379-389，2000中的大小為18至27千道爾頓的的可溶蛋白(F3)或3-1E蛋白；記載于J.Parasitol.，84654-656，1998中的大小為21千道爾頓的裂殖子蛋白；以及記載于Infection and Immunity，591271-1277，1991中的保護級分蛋白(protective fractionprotein)(FV)。
“免疫原性片段”并沒有特定的限制，只要其含有至少一個表位，且能用作免疫原即可。
由于已經(jīng)報道，抗體可以識別含有三個氨基酸殘基的氨基酸序列(F.Hudecz等人，J.Immunol.Methods，147201-210，1992)，含有三個或更多氨基酸殘基的肽可以假設為免疫原性片段的最小單元。然而，免疫原性片段是優(yōu)選含有五個或更多氨基酸殘基的肽或多肽，更優(yōu)選的含有十個或更多的氨基酸殘基。
抗原性外膜蛋白或其免疫原性片段也可以通過溶液相肽合成、固相肽合成、或其它肽合成中使用的方法來合成，如有需要，合成操作可以通過使用自動化肽合成儀來完成。合成操作可以根據(jù)1975年Tokyo Kagaku Dojin出版的日本生物化學學會(The JapaneseBiochemical Society)編輯的″Lectures on BiochemicalExperiments，1，Chemistry of Proteins IV″；Izumiya等人″Fundamentals and Experiments of Peptide Synthesis″Maruzen，1985；l987年Tokyo Kagaku Dojin出版的日本生物化學學會編輯的″Lectures on Biochemical Experiments，Second Series，2，Chemistry of Proteins，Second Volume″；等等文獻中所描述的程序進行操作。
抗原性外膜蛋白或其免疫原性片段還可以通過使用基因工程技術(shù)從具有相應核苷酸序列的DNA或RNA中制備得到。(例如，參見1986年Tokyo Kagaku Dojin出版的日本生物化學學會編輯的″Lectures onBiochemical Experiments，Second Series，1，Methods in GeneStudy I″；1986年Tokyo Kagaku Dojin出版的日本生物化學學會編輯的″Lectures on Biochemical Experiments，Second Series，1，Methods in Gene Study II″；以及1987年Tokyo Kagaku Dojin出版的日本生物化學學會編輯的″Lectures on BiochemicalExperiments，Second Series，1，Methods in Gene Study III″)。
當免疫原性片段是低分子量的物質(zhì)時，免疫原性片段可以與載體相結(jié)合的形式使用。可以使用的示例性的載體包括匙孔血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、禽血清白蛋白、聚-L-賴氨酸、聚丙氨酰賴氨酸、二棕櫚酰賴氨酸、破傷風類毒素和多糖。免疫原性片段可以通過本領(lǐng)域公知的方法諸如戊二醛方法、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺方法、馬來酰亞胺苯甲?；?N-羥基琥珀酰亞胺酯方法、雙重氮化聯(lián)苯胺方法、和N-琥珀酰亞胺-3-(2-二硫代吡啶)丙酸酯方法與載體相結(jié)合。吸附在諸如硝化纖維素(nitrocellurose)顆粒、聚乙烯吡咯烷酮、或脂質(zhì)體等載體上的免疫原性片段也可作為免疫原使用。
免疫也可通過經(jīng)由皮下注射、肌內(nèi)注射、口服給藥等途徑給予免疫原(如上文所述的抗原性外膜蛋白或其免疫原性片段)而實現(xiàn)。接種的免疫原的量基于蛋白或肽優(yōu)選在0.01至10mg之間。在最初免疫之后2至10周的間隔給予加強的免疫來實現(xiàn)更高的抗體效價。在加強劑量之后2周，特異性地與禽雙孢子球蟲抗原發(fā)生作用的抗體不僅產(chǎn)生在雞的血清中還產(chǎn)生在雞蛋中。由此免疫了的抗體通常能在四個月內(nèi)都能保持很高的抗體效價。如果抗體效價發(fā)生下降，以上文所述的相似的方法給予強化免疫以使效價保持在其高水平之中。蛋的抗體活性可以通過熒光抗體工藝技術(shù)和或酶抗體技術(shù)進行評估。
免疫原優(yōu)選的以佐劑混合物的形式注射。可以使用的輔劑可以是本領(lǐng)域中公知的，諸如弗氏完全佐劑，弗氏不完全佐劑、氫氧化鋁佐劑、和百日咳鮑特氏菌(Bordetella pertussis)佐劑。
如上所制備的蛋中的抗體可以以整蛋或蛋黃溶液的形式使用，或者以通過噴霧干燥器等制得的粉末形式使用。整蛋或蛋黃也可脫脂以便可以以水-溶性蛋白的形式使用。抗體也可在使用前純化或初步純化。
本發(fā)明組合物是給予禽類的，特別是給予雞類的。以每個體每天的抗體效價而言，組合物的劑量通常是它的1至106倍，盡管給藥的量優(yōu)選根據(jù)鳥的按星期計算的年齡、性別、品種等來進行調(diào)節(jié)。
當如上所述的抗體與乳酸菌一起給藥時，與雞球蟲病相關(guān)的體重減輕的癥狀將更好的緩解。乳酸菌通常以10-109乳酸菌比1g抗體的比例使用。乳酸菌可以同時與抗體給藥，或者，在給予抗體后適宜的間隔內(nèi)給藥。
為了所述目的而使用的乳酸菌并不限于特定的種類，屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)或乳球菌屬(Lactococcus)的任何乳酸菌可以單獨或以兩種或多種物種或菌株的組合物的形式使用。屬于乳桿菌屬的乳酸菌的例子包括嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)、干酪乳桿菌(L.casei)、L.fernentum、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)、類干酪乳桿菌(L.paracasei)、乳酸乳桿菌(L.lactis)、植物乳桿菌(L.plantarum)、路氏乳桿菌(L.reuteri)、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)以及唾液乳桿菌(L.salivarius)；屬于雙歧桿菌類的乳酸菌包括青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)、雙歧雙歧桿菌(B.bifidum)、短雙歧桿菌(B.breve)、嬰兒雙歧桿菌(B.infantis)、長雙歧桿菌(B.longum)、假長雙歧桿菌(B.pseudolongum)和嗜熱雙歧桿菌(B.thermophilum)；屬于鏈球菌的乳酸菌包括無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、唾液鏈球菌(S.salivarius)和嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)；屬于腸球菌的乳酸菌包括糞腸球菌(Enterococcus faecalis)和屎腸球菌(E.faecium)；屬于乳球菌的乳酸菌包括乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
當上文所述的抗體與從用產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌進行免疫的雞的蛋中獲得的抗體(此后稱為“抗-產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌抗體”)一同給藥時，與雞球蟲病相關(guān)的體重減輕的癥狀將更好的緩解?？?產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌抗體通常以0.01-100g比1g抗-雞球蟲病抗體的比例使用。抗-產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌抗體可以與抗-雞球蟲病抗體同時給藥，也可以在給予抗-雞球蟲病抗體之后的適當間隔內(nèi)給藥。
抗-產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌抗體可以通過與上述制備抗-雞球蟲病抗體相似的方法制備，除了所使用的免疫原是產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌?？?產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌抗體和抗-雞球蟲病抗體也可在同時用上文所述的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌和抗原性外膜蛋白或其免疫原性片段免疫的同時制備。
用于生產(chǎn)抗-產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌抗體的抗原的例子包括記載于J.Anim.Sci.，7519-25，1997中的蛋白；記載于Avian Diseases，21241-255，1977中的毒素；記載于Vet.Rec.，120435-439，1987中的蛋白；記載于Vaccine，111253-1258，1993中的蛋白；以及記載于FEMS Immunol.Med.Microbiol.，7321-336，1993的蛋白。
本發(fā)明抗-雞球蟲病組合物可以以含有濃度為0.001％-10％的每一有效組分的溶液的形式喂飼，或者以與飼料混合而使飼料中含有0.001％-10％濃度的每一有效組分的粉末、顆粒、片劑或糊劑的形式喂飼。同時，抗-雞球蟲病抗體可以以腸包衣劑型的形式給藥以防止組合物在胃中被消化和降解。
此說明書包括公開于日本專利申請2002-189137的說明書中的內(nèi)容，它是本申請的優(yōu)先權(quán)文本。
本發(fā)明最佳實施模式[實施例1]四周大的雞口服給予與雞球蟲病相關(guān)的堆形艾美球蟲NA株(PE0101)、禽艾美球蟲MM株(PE0102)和百型艾美球蟲NT株(PE0103)中各自2×106的卵囊以實施感染，在感染后4周對雞進行尸檢以獲得腸道及其內(nèi)容物。根據(jù)Avian Diseases，39538-547，1995的內(nèi)容純化子孢子和裂殖子。從堆形艾美球蟲(NA株)的裂殖子中得到的可溶性外膜蛋白進行SDS-PAGE以獲得18-27kD的外膜蛋白(Avian Diseases，44379-389，2000)。含0.5mg/ml該外膜蛋白的溶液用弗氏不完全佐劑乳化，所得乳劑以每一肌肉1ml的劑量注射到12周大的母雞的左右胸肌中作為最初的免疫。在最初免疫6周之后，母雞以相同的方式進行第二次免疫。在第二次免疫之后2周，母雞血液中的抗-雞球蟲病抗體的抗體效價通過酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法測定(AvianDiseases，44379-389，2000)，抗體效價為30,000至120,000倍。母雞的蛋的抗體效價為30,000至120,000倍，該抗體效價水平可以再維持四個月。收集蛋，通過噴霧干燥制備含有蛋抗體的整蛋粉末。生產(chǎn)的粉末的抗體效價為60,000倍。當通過間接免疫熒光染色法評價該抗體與子孢子和裂殖子的交叉反應性時(Avian Diseases，44379-389，2000)，該抗體特異性地在艾美球蟲物種(堆形艾美球蟲、禽艾美球蟲和百型艾美球蟲)的子孢子和裂殖子的表面染色，證明該抗體對于這些物種是共同普遍抗體。
實施例1中所制備的抗-雞球蟲病抗體加入到雛雞飼料中以評估抗體對試驗性用雞球蟲病(禽艾美球蟲)感染的雞的效果(AvianDisease，31112-119，1987)。此次評估所使用的動物是″Chunky″它是一種為了雛雞生產(chǎn)而特定培育的品系，通過將抗體加入到早期長肥階段用標準雛雞飼料中來給予0.1％、1％和10％的濃度的抗體(SDBNo.1Research Institute For Animal Science In Biochemistry& Toxicology)。雞用禽艾美球蟲(ET株)的卵囊以1000卵囊/動物的濃度感染(J.Protozool，9154-161，1962)，每組中含有10只雞。感染后雞的觀察時段為2周。主要觀察的是雞的體重增加和飼料轉(zhuǎn)化比例。同時觀察O.P.G.(每克糞便的卵囊數(shù)量)和盲腸損傷(″Coccidiosis in Chicken″，由K.Tsunoda主編，ChikusanShuppan出版，1983)。在給予含0.1％抗原的飼料的組中證實了體重增加的顯著效果，同時在給予含有1.0％的抗原的飼料中的組中證實了對飼料轉(zhuǎn)化比例的顯著效果。
如結(jié)果所證實的，通過向患有球蟲病的雞類給予含有0.1％或更多抗體的飼料，雞類的狀況包括體重增加和飼料轉(zhuǎn)化比例都有顯著的改善。通過給每一觀察項打分來確定測試物質(zhì)的總效果，并且該抗體被證實是十分有效的。
表1

a)相對重量增加(％)＝[感染組的體重增加]÷[未感染組的體重增加]×100b)飼料轉(zhuǎn)化比例＝[平均飼料攝取量]÷[平均體重增加]c)每組的卵囊得分通過以下的計算和指標確定與對照組相比較的醫(yī)療組的O.P.G.＝[醫(yī)療組的O.P.G.]÷[感染的未治療對照組的O.P.G.]×100標準0:0至1％；+51.1至25％；+1026至50％；+2051至75％；+4076至100％。
d)盲腸損傷得分根據(jù)以下指標計算0未觀察到損傷；+1盲腸壁上分散著非常少量的淤斑，而整個內(nèi)容物都是正常的；+2在內(nèi)容物中發(fā)現(xiàn)少量的血，并且觀察到大量的出血損傷；+3在盲腸中發(fā)現(xiàn)大量出血或盲腸核(香蕉-樣形狀的干酪狀物質(zhì)，可能帶有血凝塊或呈灰白色)并且清楚的觀察到盲腸壁增厚以及盲腸變形和萎縮；+4盲腸萎縮顯著，損傷擴散到直腸。腸壁極端增厚，在盲腸中發(fā)現(xiàn)血凝塊和盲腸核。確定1只雞的平均得分，然后將得分轉(zhuǎn)換為10只雞的得分，如表1所示。
e)ACI(抗-球蟲指數(shù))＝[相對體重增加百分比+存活率]-[卵囊得分+損傷得分]ACI180或更高非常有效；160至179相當有效；120至161略微有效；低于120無效。
通過使用包括實施例1中所制備的抗-雞球蟲病抗體和乳酸菌(嗜酸乳桿菌)的飼料來評估抗體對被試驗性的感染了雞球蟲病(禽艾美球蟲)的雞的效果。乳酸菌(嗜酸乳桿菌，ATCC 4356株)在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過冷凍干燥制備含有1×1011細菌/g的粉末。此次評估所使用的動物是″Chunky″，它是一種雛雞品系，此種雞用早期長肥階段用標準雛雞飼料喂飼(SDB No.1)，飼料中加入了0.1％的抗體和106/g的乳酸菌。雞以1000卵囊/動物的濃度感染了禽艾美球蟲(ET株)的卵囊，每一組中含有10只雞。感染后的雞的觀察時間為2周。主要觀察雞的體重增加和飼料轉(zhuǎn)化比例。同時觀察O.P.G.和盲腸損傷。在用抗體和乳酸菌給藥的組中，對其體重的增加被證實具有顯著的作用。在同組中同樣證實了對飼料轉(zhuǎn)化比例的顯著作用。
如結(jié)果所證實的，通過向被球蟲感染的雞給予含有抗-雞球蟲病抗體和乳酸菌(嗜酸乳桿菌)的飼料，雞的狀況包括體重的增加和飼料轉(zhuǎn)化比例都有顯著的改善。測試物質(zhì)的總效果通過每一觀察項的得分來確定，抗體被證實是非常有效的。
表2
評估含有實施例1中所制備的抗-雞球蟲病抗體和從用產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌免疫了的雞的蛋中得到的抗-產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌抗體的飼料對被試驗性的感染了雞球蟲病(禽艾美球蟲)和產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的雞的治療效果(Avian Disease，24324-333，1980)。
按照如下操作制備抗-產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌抗體。產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(ATCC 3624株)在巰基乙醇酸鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)。含有1×1010/ml的產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌的溶液用弗氏不完全佐劑乳化，所得乳劑以每塊肌肉1ml的劑量注射到12周大的母雞的左右胸肌中作為最初免疫。最初免疫之后6周，以相似的方法給藥母雞第二次免疫。第二次免疫2周后，抗-產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌抗體在母雞血液中的抗體效價通過細胞凝集試驗測定，測得抗體的效價為300至1200倍。母雞的蛋的抗體效價為300至1200倍，此抗體效價水平可以再維持四個月。將蛋收集起來，通過噴霧干燥制備含有蛋抗體的整蛋粉末。制備粉末的抗體效價為600倍。
此次評估所使用的動物是″Chunky″，它是一種雛雞品系，此種雞用早期長肥階段用標準雛雞飼料喂飼(SDB No.1)，飼料中加入了0.1％的抗-雞球蟲病抗體和0.1％的抗-產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌抗體。雞以1000卵囊/動物的濃度感染了禽艾美球蟲(ET株)的卵囊，以107產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌/動物的濃度感染產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌(ATCC3624株)，每一組中含有10只雞。注射后的雞的觀察時間為2周。主要觀察雞的體重增加和飼料轉(zhuǎn)化比例。同時觀察O.P.G.和盲腸損傷。在用抗-雞球蟲病抗體和抗-產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌抗體給藥的組中，對其體重的增加被證實具有顯著的作用。在同組中同樣證實了對飼料轉(zhuǎn)化比例的顯著作用。
如結(jié)果所證實的，通過向被球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌感染的雞同時給予含有0.1％的抗-雞球蟲病抗體和0.1％的抗-產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌抗體的飼料，雞的狀況包括體重的增加和飼料轉(zhuǎn)化比例都有顯著的改善。測試物質(zhì)的總效果通過每一觀察項的得分來確定，抗體被證實是非常有效的。
表3
實施例1中所制備的抗-雞球蟲病抗體加入到飼料中以評估抗體對實驗性感染了雞球蟲病(堆形艾美球蟲)的雞的效果(Avian Disease，31112-119，1987)。此次評估所使用的動物是″Chunky″，它是一種雛雞品系，抗體的給藥通過向用于早期長肥階段(SDB No.1)的標準雛雞飼料中加入0.1％，1％和10％的抗體而實現(xiàn)。雞以1000卵囊/動物的濃度感染了堆形艾美球蟲(EA株)的卵囊，每一組中含有10只雞。注射后的雞的觀察時間為2周。主要觀察雞的體重增加和飼料轉(zhuǎn)化比例。同時觀察O.P.G.和盲腸損傷。即使是在給予含有0.1％抗體的飼料的組中也同樣證實了抗體施用在體重增加中的顯著作用。
如結(jié)果所證實的，通過向遭受雞球蟲病的雞給予含有0.1％或更高的抗-雞球蟲病抗體的飼料，雞的體重的增加有顯著的改善。
表4

a)通過以下指標確定小腸損傷得分0沒有觀察到損傷；+1分散在十二指腸的含卵囊的白色壞死斑；+2觀察到更多的白色壞死斑，損傷擴展到小腸上部；+3觀察到更多的損傷，損傷都彼此融合在一起。觀察到小腸壁增厚，內(nèi)容物呈水狀；+4十二指腸和小腸上部變?yōu)闇\灰色，因為發(fā)生大量的互融的損傷。腸壁極端增厚，在腸壁內(nèi)含有膏狀粘液。確定1只雞的平均得分，然后轉(zhuǎn)化成如表4所示的10只雞的得分。
如實施例2、3和5中所示，當抗-雞球蟲病抗體或與乳酸菌相聯(lián)合的抗體通過在飼料中混合而連續(xù)給予雞時，被試驗性地感染了雞球蟲病的雞的癥狀有所緩解，且雞顯示體重發(fā)生增加。當感染了雞球蟲病的雞通過混合在飼料中而給予抗-雞球蟲病抗體和乳酸菌的混合物時，雞的狀況包括體重增加和飼料轉(zhuǎn)化比例得到顯著的改善。當與抗-雞球蟲病抗體同時給予抗-產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌抗體時，雞球蟲病的發(fā)展被抑制，并且發(fā)現(xiàn)了包括體重增加和飼料轉(zhuǎn)化比例上的改善。
此處所引用的所有的出版物、專利和專利申請都以其全文引入作為參考。
工業(yè)實用性本發(fā)明抗-雞球蟲病組合物含有抗-雞球蟲病抗體，任選地同時含有能在雞體內(nèi)與雙孢子球蟲特異性發(fā)生作用的乳酸菌或抗-產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌抗體。因此，本發(fā)明的抗-雞球蟲病組合物可非常有效的預防雞的球蟲病，并且可以作為抗球蟲藥物和疫苗的替代物。組合物還能非常有效的緩解雞球蟲病和在體重增加方面的癥狀。
權(quán)利要求
1.一種用于口服給藥的抗-雞球蟲病組合物，其含有從用抗原性外膜蛋白或其免疫原性片段進行免疫的雞所下的蛋中得到的抗體，所述抗原性外膜蛋白或其免疫原性片段具有與雞球蟲病相關(guān)的堆形艾美球蟲、禽艾美球蟲和百型艾美球蟲的子孢子和裂殖子共有的免疫原性。
2.權(quán)利要求1的組合物，其進一步含有乳酸菌。
3.權(quán)利要求1的組合物，其進一步含有從用產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌進行免疫的雞所下的蛋中得到的抗體。
4.權(quán)利要求1的組合物，其用于雞球蟲病的預防或治療。
5.一種禽類飼料，其含有權(quán)利要求1的組合物。
6.一種預防或治療雞球蟲病的方法，其中，將權(quán)利要求1的抗體口服給予禽類，任選地，與乳酸菌和/或從用產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌進行免疫的雞所下的蛋中得到的抗體相結(jié)合使用。
全文摘要
本發(fā)明涉及預防或治療雞球蟲病的方法，其包括口服給予禽類用抗原性外膜蛋白或其免疫原性片段進行免疫的雞所下的蛋中得到的抗體，所述的抗原性外膜蛋白或其免疫原性片段具有與雞球蟲病相關(guān)的堆形艾美球蟲、禽艾美球蟲和百型艾美球蟲的子孢子和裂殖子共有的免疫原性。該抗體可任選地和乳酸菌和/或從用產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌進行免疫的雞所下的蛋中得到的其它抗體一起使用。
文檔編號A23K1/18GK1678349SQ0382056
公開日2005年10月5日 申請日期2003年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月28日
發(fā)明者兒玉義勝, 橫山英明, S·V·恩古延 申請人:株式會社源