專利名稱:植物種的轉(zhuǎn)化和外源基因的表達(dá)的制作方法
本發(fā)明涉及一種改良植物的基因型和表型的方法，該方法對(duì)植物子葉組織，特別是對(duì)用一種由植物飼養(yǎng)細(xì)胞制備的培養(yǎng)基預(yù)處理的子葉引入一種農(nóng)業(yè)土壤桿菌(Agrobacterium)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。該方法能高效地用于轉(zhuǎn)化植物以達(dá)到增強(qiáng)性能和/或提供新的表型。
植物育種方法的應(yīng)用一直受到限制是由于很難在植物種間進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移，因此開發(fā)一種方法用于植物種的遺傳工程可能是具有吸引力的，但是植物細(xì)胞與其他類型的細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的要求實(shí)質(zhì)上是很不相同的。首先，植物細(xì)胞不同于單細(xì)胞微生物，它們的增殖率低;其次，對(duì)于生存、增殖和再生來說，植物細(xì)胞對(duì)它們所處的環(huán)境極為敏感;第三，為了確定外源基團(tuán)是否已起作用地被整合在植物細(xì)胞內(nèi)，需要證實(shí)再生植株是否已表達(dá)了基因產(chǎn)物;最后，使植物細(xì)胞具有硬質(zhì)的細(xì)胞壁進(jìn)行遺傳工程將更加困難。
由于在植物細(xì)胞操作和基因有效表達(dá)的證實(shí)之間有著相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間間隔，因此，在轉(zhuǎn)化、細(xì)胞生長(zhǎng)及再生植株的每個(gè)階段要求實(shí)現(xiàn)高效率是必不可少的。另外還應(yīng)考慮到使特定技術(shù)和該技術(shù)中所利用的材料與特定植物種之間的相匹配問題。此外，為了從轉(zhuǎn)化細(xì)胞的愈傷組織獲得再生植株，還需進(jìn)一步機(jī)慮轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物的連續(xù)手工操作。
A.L.Gunay et al.Plant Science Letters(1978)11365-372，介紹了從紅胡椒子葉離體再生胡椒;J.R.Liu et al.，Plant Cellorgan Culture(1983)2293-304，介紹了從包括子葉在內(nèi)的蘋果幼苗外植體的再生;B.R.Thomas et al.，Theor.Appl.Genet.(1981)59215-219，介紹了蕃茄再生培養(yǎng)基;The 1985 Calgene U.S.Patent Application Serial No.798，050 by Fillatti et al.介紹了本發(fā)明的農(nóng)業(yè)土壤桿菌;in Horsch et al.Science(1985)2281229-1231介紹了用葉圓片法根癌農(nóng)業(yè)土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciene)轉(zhuǎn)化植物;也可參考Herrera-Estrella et al.，Nature(1983)303209-213;Fraley et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)804803-4807;and Bevan et al.，Nature(1983)304184-187，in Stalker et al.，J.Biol.Chem.(1985)2604724-4728，介紹了草甘膦抗性aro A基因;而由deGreve，J.Mol.Appl.Genet.(1983)1499-511;Salomon et al.，EMBO J.(1984)3141-146;Velten et al.，ibid.(1984)32723-2730;Garfinkel et al.，Cell(1983)27143-153;and Barker et al.，Plant Mol.Bio(1983)2335-350.介紹了轉(zhuǎn)錄起始區(qū)和終止區(qū);Comai et al.，Nature(1985)317741-744，介紹了對(duì)草甘膦提供耐性的鼠傷寒沙門氏菌突變基因aro A在植物體中的表達(dá);其它討論蕃茄子葉再生的報(bào)導(dǎo)包括Orsay，F(xiàn)rench Theor.Appl.Genet.68(4)，1984，317-322;Seeni，S.et al.，Canadian J.Botany 59(10)，1981，1941-1943;and Vnuchkova，V.A.，F(xiàn)iziol Rast(Moscow，USSR)，24(5)，1977，1094-1100。
本發(fā)明提供的方法是產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物種，所得到的植物種含有能穩(wěn)定表達(dá)的新核苷酸構(gòu)建物。這些方法是采用改裝的(disarmed)農(nóng)業(yè)土壤桿菌和植物子葉組織的高效率轉(zhuǎn)化技術(shù)。植物子葉組織正常情況是與由植物飼養(yǎng)細(xì)胞所限定的培養(yǎng)基預(yù)培育。這種方法可得到高比例的正常轉(zhuǎn)化細(xì)胞，而后這些正常轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能再生成植株，這些植株能生長(zhǎng)成植物并結(jié)實(shí)。該技術(shù)能為穩(wěn)定表達(dá)的引入的基因提供保證，尤其是引入的外源基因使植物具備新的表型。
本發(fā)明提供了包括用植物子葉組織將新的核苷酸構(gòu)建物引入植物種的細(xì)胞的新方法和新產(chǎn)品。這些被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的再生形成表達(dá)存在于該核苷酸構(gòu)建物中的一種或多種基因的植物體，從而至少提供一種不同于原來栽培品種的植物的性狀，尤其是表型性狀。
所用的方法是利用受傷的子葉組織與限定的培養(yǎng)基一起預(yù)培育，所預(yù)培育的植物子葉組織與經(jīng)過改裝并被轉(zhuǎn)化的農(nóng)業(yè)土壤桿菌在適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，這種農(nóng)業(yè)土壤桿菌具有轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的能力，并且有一種DNA的構(gòu)建物連結(jié)在T-DNA的一個(gè)邊界上。這種構(gòu)建物的制備是通過連結(jié)異源的DNA片段，其中包括至少能在寄主體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的一個(gè)基因。當(dāng)構(gòu)建物中有一種選擇標(biāo)記物時(shí)，共培養(yǎng)的細(xì)胞可轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基中，該再生培養(yǎng)基通常含有為轉(zhuǎn)化細(xì)胞而選用的殺菌劑。帶葉分枝形成后，將分枝轉(zhuǎn)移到選擇的生根培養(yǎng)基中形成完整的小植株，而后小植株可能會(huì)長(zhǎng)大以提供種子，插條等等，以便繁殖新的植物。所以，該方法能保證高效率轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞及由這些轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生出植物體。
可被轉(zhuǎn)化的植物種都是那些大批生產(chǎn)有待于培養(yǎng)和經(jīng)營(yíng)的植物，這些植物包括蔬菜、水果、觀賞花、木本植物種等等，如下述的雙子葉植物和多子葉植物蕃茄、松屬、胡椒、萵苣、黃瓜、大豆、蕓苔屬(油菜子)、楊樹、觀嘗花等等。
用滅菌的種子作植物子葉的來源，這些子葉可以是成熟的或不成熟的、可以是已經(jīng)從種子內(nèi)伸出的或還存在于種子內(nèi)的、也可切開種子并從種皮內(nèi)解剖出子葉。許多植物的子葉會(huì)是已經(jīng)伸出來的，但有少數(shù)幾種，如松樹，其子葉可能是未成熟的，而要從種子內(nèi)獲得。
為了得到伸出的子葉，通常要在合適的萌發(fā)培養(yǎng)基中，萌發(fā)至少4天，但要少于約15天，最好為6到8天。所得到的子葉組織用作轉(zhuǎn)化織織的來源，子葉受到損傷作為再生部位，再生發(fā)生在靠近基部的受傷細(xì)胞部位是較好的。最方便的是將子葉切成幾片，通常切成三片，而利用中間的那片。
將受傷的子葉組織轉(zhuǎn)移到飼養(yǎng)平板上，飼養(yǎng)平板上的細(xì)胞對(duì)受傷的子葉組織作為一種滋養(yǎng)培養(yǎng)物并提高轉(zhuǎn)化效率。
任何適合的植物細(xì)胞懸浮液均可作飼養(yǎng)培養(yǎng)物，如煙草(Nieotiana)或玉米，尤其是前者。然而煙草飼養(yǎng)細(xì)胞對(duì)于某些作物，例如蕃茄是最佳的，玉米即其他的植物飼養(yǎng)細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞也有用。與飼養(yǎng)細(xì)胞所限定的培養(yǎng)基的預(yù)培育的時(shí)間通常至少6小時(shí)，但不得超過約48小時(shí)，通常是用12到24小時(shí)。
制備飼養(yǎng)平板是通過用植物懸浮液培養(yǎng)物，如煙草細(xì)胞約104-1010細(xì)胞/毫升，通常107-108細(xì)胞/毫升，置于軟的瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)，一般為含有約0.5%至1%瓊脂和適宜的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，如Murashige和Skoog基本有機(jī)培養(yǎng)基、適量的激素，即植物生長(zhǎng)素，如2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、激動(dòng)素和維生素，如硫胺素，再與培養(yǎng)基一起適當(dāng)調(diào)pH至5-6，最好為pH5.5。激動(dòng)素和硫胺一般約為0.75-1.5毫克/升，而2，4-D一般約為0.05-0.2毫克/升。最理想是臨用前配制飼養(yǎng)平板，通常在使用前至少一天或兩天配制。
用多孔蓋覆蓋飼養(yǎng)平板(軟瓊脂層)以防止飼養(yǎng)細(xì)胞與子葉外植體進(jìn)行接觸，該多孔蓋使外植體浸于所限定的培養(yǎng)基中。用無菌濾紙圓片很容易制成上述多孔蓋。接著讓子葉預(yù)保溫，隨后將子葉轉(zhuǎn)移到含有轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的DNA構(gòu)建物的農(nóng)業(yè)土壤桿菌的肉湯液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)物內(nèi)，使該DNA構(gòu)建物的遺傳能力轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi)。一般農(nóng)業(yè)土壤桿菌的數(shù)量約為106-1010細(xì)胞/毫升，通常約為108-1010細(xì)胞/毫升，隨特定菌株的不同不各有差異。
子葉在細(xì)菌液體培養(yǎng)物中接觸農(nóng)業(yè)土壤桿菌的時(shí)間通常至少約1分鐘，不超過1小時(shí)，平均約30分鐘。該細(xì)菌液體培養(yǎng)物如MG/L(同LBMG;見Garfinkel et al.，J.Bacteriol.(1980)144732-743)。接著從細(xì)菌肉湯液體培養(yǎng)基中將子葉切片轉(zhuǎn)移，除去過量的表面液體并將子葉切片放回到飼養(yǎng)平板上。在飼養(yǎng)平板上的細(xì)菌共培養(yǎng)時(shí)間通常至少為6小時(shí)、12小時(shí)、不超過約4天，平均約1-3天。隨后將與細(xì)菌共培養(yǎng)后的子葉片轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基中。
再生培養(yǎng)基通常含有一種殺菌劑，如羧芐青霉素(500毫克/升)，并可含有選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇試劑，例如帶有卡那霉素抗性基因(APH3′Ⅱ)，加入的卡那霉素至少約30毫克/升，通常不超過約500毫克/升，最好約為50-100毫克/升。再生培養(yǎng)基還常有一種適當(dāng)?shù)柠}源，如Murashige Skoog鹽培養(yǎng)基;一種適當(dāng)?shù)奶荚?，如蔗?及其它適合的附加物，如激素、玉米素等約0.75-2.25毫克/升，肌醇約50-200毫克/升等等。還可補(bǔ)充加入維生素，如Nitsch維生素，約加入1000X母液的0.5-1.5毫升/升，1.0毫升/升在再生培養(yǎng)基中是常見的。在100毫升最終體積中，1000X母液的Nitsch維生素含有50毫克鹽酸硫胺素、200毫克甘氨酸、50毫克煙酸、50毫克鹽酸吡哆素、50毫克葉酸、50毫升生物素并用水定容;碳源為10-30克/升。再生培養(yǎng)基通常含有約0.5-1.0%瓊脂，將再生培養(yǎng)基調(diào)pH至pH6±0.5。
在2-3周內(nèi)通常出現(xiàn)帶葉的分枝，當(dāng)長(zhǎng)至1-2厘米長(zhǎng)時(shí)，立即將它們?cè)诨壳袛嗖⑥D(zhuǎn)移到一種生根培養(yǎng)基中，這種培養(yǎng)基也可能是幼苗生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，同時(shí)加入羧芐青霉和卡那霉素硫酸鹽。
可用各種改裝的菌株以保證高效率轉(zhuǎn)化植物。這些改裝的菌株會(huì)全部或部分缺失T-DNA區(qū)，尤其是缺失激素基因區(qū)，也可能缺失一或二個(gè)邊界，該區(qū)與冠癭堿的表達(dá)有關(guān)，Ti或Ri質(zhì)粒缺失一個(gè)與構(gòu)建物順序顯著同源的區(qū)域是最理想的。
所用的農(nóng)業(yè)土壤桿菌系統(tǒng)包括使用一種改裝的株系例如根癌農(nóng)業(yè)土壤桿菌PC2760(G.Coms et al.，Plasmid(1982)715-29;G.Coms et al.，Gene(1981)1433;A.Hoekema et al.，Nature(1983)303179-181;European Patent Application 84-200239.6，2424183)。
在植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中所用的農(nóng)業(yè)土壤桿菌本身用一種寄主范圍廣泛的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，這種廣譜質(zhì)?？梢詮腅.Coli穿梭至農(nóng)桿菌。要實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)可用含有一個(gè)P-1不親和群質(zhì)粒復(fù)制子，例如RK2和能在E.Coli中提供多個(gè)拷貝，通常至少是5個(gè)，最好至少是10個(gè)直至200個(gè)拷貝的質(zhì)粒的復(fù)制子。廣譜質(zhì)粒的特征是有至少一個(gè)T-DNA邊界順序，尤其是右邊界順序，或者由企圖整合進(jìn)入植物種的基因組內(nèi)的各種構(gòu)建物在一個(gè)方向?qū)蓚€(gè)邊界順序分開。
被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可以是培養(yǎng)的細(xì)胞、亦可以是愈傷組織中的無結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)、或者是結(jié)構(gòu)的葉片外植體、帶葉分枝培養(yǎng)物、種子、果實(shí)、葉片、根等、或者是有結(jié)構(gòu)的完整的植物體。外源構(gòu)建物通常存在于全部或基本上全部的植物組織的細(xì)胞中，然而外源構(gòu)建物的表達(dá)可能僅限于特定的細(xì)胞或植物發(fā)育的特定階段。這種外源構(gòu)建物將包括轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯起始信號(hào)和終止信號(hào)，以有意義的基因的5′端為起始信號(hào)，而以其3′端為終止信號(hào)。
RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)(啟動(dòng)子)的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)對(duì)植物寄主可以是天然存在的或可能為其他來源，該區(qū)在蕃茄寄主體內(nèi)是起作用的。其他來源包括農(nóng)業(yè)土壤桿菌T-DNA基因，如胭脂堿、章魚堿、mannopine或其他冠癭堿生物合成的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)、植物或不同于寄主的其它植物的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)、各種病毒，尤其是各種寄主特異著毒的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，或部分或全部人工合成的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。
轉(zhuǎn)錄起始區(qū)不僅包括RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)，而且還可包含能保證轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)。該區(qū)的調(diào)節(jié)包括化學(xué)或物理阻遏或誘導(dǎo)，如代謝物或光或與葉、根、種子等等有關(guān)的以細(xì)胞分化為基礎(chǔ)的調(diào)節(jié)。因此，可從適當(dāng)?shù)幕虻玫睫D(zhuǎn)錄起始區(qū)或其調(diào)節(jié)部分，如光誘導(dǎo)的1，5-雙磷酸核酮糖羧基酶基因、逆境誘導(dǎo)基因、受溫度調(diào)節(jié)的熱休克基因、創(chuàng)傷誘導(dǎo)基因、分生組織特異基因等。
3′端終止區(qū)可來自與轉(zhuǎn)錄起始區(qū)相同或不相同的基因，如該區(qū)有意義的基因具有一個(gè)在蕃茄種中起作用的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)，該區(qū)可與這個(gè)基因一起保留下來。
構(gòu)建一個(gè)能表達(dá)的盒帶(Cassette)包含轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)控制下的有意義的基因、起始密碼子、基因的編碼順序、有或無基因內(nèi)區(qū)轉(zhuǎn)譯終止密碼子，隨后是轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。轉(zhuǎn)錄終止區(qū)包括終止區(qū)、通常還包括多腺苷酸化的信號(hào)順序以及與轉(zhuǎn)錄終止有關(guān)的其它順序。轉(zhuǎn)錄方向是從5′→3′的方向。表達(dá)的盒帶通常約少于10Kb基，經(jīng)常約少于6Kb，至少約為1Kb，更常見至少約為2Kb。
有意義的基因可來自于染色體基因、cDNA、人工合成基因、或由此形成的結(jié)合物。該基因的表達(dá)產(chǎn)物存在于除細(xì)胞質(zhì)之外的其它部位，其構(gòu)建通常要包括導(dǎo)致將該基因表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到特定部位的特定氨基酸順序。該特定部位可以是細(xì)胞器，如葉綠體、線粒體或細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)膜。該基因表達(dá)產(chǎn)物亦可分泌到細(xì)胞的外周胞質(zhì)區(qū)或外界環(huán)境中。各種分泌引導(dǎo)體(leaders)、膜整合順序以及為了將肽表達(dá)產(chǎn)物定向地引入特定部位的轉(zhuǎn)運(yùn)順序都在文獻(xiàn)中有描述，例如參閱Cashmore et al.，Biotechnology(1985 3803-808，Wickner and Lodish，Science(1985)203400-407。
用于植物種的有意義基因包括各種各樣的表型性狀或非表型性狀基因，表型性狀基因中有酶的，這些酶能提供抗逆境，如抗由熱和鹽分而引起的脫水、抗昆蟲、抗除草劑、抗有毒金屬或微量元素等。這些抗性可能是由于標(biāo)部位的改變、受體細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)蛋白量的提高，增加與某種產(chǎn)物的生物合成途徑有關(guān)的一種或多種酶，保護(hù)受體抵抗逆境等等。這些基因可從原核生物或真核生物、細(xì)菌、真菌如酵母、病毒、植物、哺乳動(dòng)物得到、或全部或部分由人工合成。所述基因包括抗草甘膦3-烯醇丙酮基二氧膦基莽草酸鹽合成酶基因、腈水解酶、脯氨酸和谷氨酰胺生物合成途徑中有關(guān)的基因、金屬巰基蛋白基因、組氨酸三甲基內(nèi)鹽基因、硫酯酶Ⅱ基因、酰基載體蛋白質(zhì)基因、乙酰基?；D(zhuǎn)移酶基因等。其它有意義的基因是涉及調(diào)節(jié)生長(zhǎng)的基因，如源/匯點(diǎn)(碳素分配)關(guān)系的控制，如固體含量的變化、或激素調(diào)節(jié)、光合效率、如改變RuBP羧基酶的效率、或改變植物品味的質(zhì)量或營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、改變固體液體比例、粘性或植物果實(shí)的數(shù)量、大小、色澤、磨損抗性或硬度等基因。
也可用一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒帶，在這里可以首尾相接的方式利用表達(dá)盒帶以便各個(gè)基因表達(dá)，這些基因可以彼此獨(dú)立地表達(dá)產(chǎn)物，也可能是同時(shí)受到調(diào)節(jié)。這些表達(dá)產(chǎn)物可以獨(dú)立地起作用、亦可結(jié)合起來起作用。
用農(nóng)業(yè)土壤桿菌的方法被轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞中的表達(dá)盒帶通?？拷黅-DNA右邊界或T-DNA的兩個(gè)邊界至少約1Kb之內(nèi)。這些邊界可由任何Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒獲得，并可用常規(guī)方法與表達(dá)盒帶連結(jié)。為了從除了Ti或Ri質(zhì)粒之外的質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)移以構(gòu)建表達(dá)盒帶，并通過同源重組方法將其整合進(jìn)入Ti或Ri質(zhì)粒的T-DNA區(qū)。因此，該表達(dá)盒帶可在其一個(gè)或兩個(gè)邊緣處具有的DNA順序與存在于Ti質(zhì)?；騌i質(zhì)粒中的T-DNA區(qū)的順序同源，要改裝Ti質(zhì)粒使之缺失表達(dá)對(duì)瘤形成所必需的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因。
通常在至少具有一個(gè)復(fù)制系統(tǒng)的載體上攜帶表達(dá)盒帶，為便種起見常用的是具有一個(gè)在大腸腸桿菌中起作用的復(fù)制系統(tǒng)，如ColEl、pSC101、pACYC184等。在該方法每次操作后的每個(gè)階段，使得得到的構(gòu)建物克隆化、作順序測(cè)定，并作測(cè)定后的矯正處理。除用大腸桿菌復(fù)制系統(tǒng)的部位外，還可用廣譜的復(fù)制系統(tǒng)，如P-1不親和質(zhì)粒，如pRK290的復(fù)制系統(tǒng)，這些質(zhì)粒與被改裝的Ti質(zhì)粒一起對(duì)于T-DNA轉(zhuǎn)移到植物種寄主體內(nèi)是特別有效的。
除了這種復(fù)制系統(tǒng)外，通常還至少存在一種標(biāo)記物，該標(biāo)記物可用于一種或多種寄主中，還可為個(gè)別的寄主提供各種不同的標(biāo)記物，即為了在原核寄主體內(nèi)的選擇可用一種標(biāo)記物，而對(duì)真核寄主，尤其是植物種寄主中的選擇要用另一種標(biāo)記物。這些標(biāo)記物可保護(hù)宿主抗殺生物劑，如抗菌素、毒素、重金屬等;或起互補(bǔ)作用，對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主提供原養(yǎng)型。所用的各種基因包括新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTⅡ)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT)、氯霉素氨基轉(zhuǎn)移酶(CAT)、腈水解酶、艮他霉素抗性基因等。對(duì)植物寄主的選擇而言，特定有意義的標(biāo)記物包括提供卡那霉素抗性或G418抗性的NPTⅡ、通過潮霉素抗性的HPT、提供氯霉素抗性的CAT、提供草甘膦抗性的aro A突變基因等。
用限制性核酸內(nèi)切酶切割一種相當(dāng)重復(fù)的體系，依次引入包括各種構(gòu)建物、表達(dá)盒帶、標(biāo)記物等的各種片仔，并將特定構(gòu)建體或片段插入有效的部位。在連接和克隆后，為了進(jìn)一步的操作，可再分離出載體。所有這些技術(shù)在文獻(xiàn)中都有詳細(xì)地說明。在Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1982.中，還可找到特例。
現(xiàn)在可用適宜選擇的方法分離出含有所期望結(jié)構(gòu)建物的被轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，這些轉(zhuǎn)化細(xì)胞在一種選擇的培養(yǎng)基中長(zhǎng)成愈傷組織。該選擇的培養(yǎng)基可能含有一種殺生物劑，即抗生素如G418、潮霉素、博萊霉素等，決定于構(gòu)建物中所含有的特定標(biāo)記物來保證抗性，根據(jù)植物細(xì)胞的敏感性，殺生物劑的濃度可以不同。無選用標(biāo)記的，或該標(biāo)記基因的表達(dá)已證明不宜用于選擇，則可用南方(Sourhern)、北方(Northern)、或西方(Western)印跡法來檢測(cè)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的核苷酸順序和蛋白質(zhì)。
一旦愈傷組織形成帶葉的分枝后，可將這些帶葉分枝轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中，以產(chǎn)生能表達(dá)有意義基因的小植株。
所得到的小植物將具有各種不同的所期望的表型，如對(duì)熱、鹽度、除草劑等逆境的抗性、被改進(jìn)的加工特性，被改進(jìn)的能接受感覺的特性，植物特殊產(chǎn)物，如植物油的優(yōu)先形成、細(xì)菌或哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)的產(chǎn)生等等。
以下提供的實(shí)施例，僅用以說明本發(fā)明但不限于本發(fā)明。
大腸桿菌MM294菌株(Hanahan，J.Mol.Biol.(1983)116557-580)被用作含有pRK290型復(fù)制子的雙元載體的受體，上面已介紹了土壤桿菌C58菌株，PC2760是土壤桿菌LBA4404菌株(Hoekema et al.，Nature(1983)303179-180)的另一個(gè)名稱。通過將pTIA6轉(zhuǎn)化到A114.菌株(NT1)(Nester and Kosuge et al.，Nature(1983)303179)來產(chǎn)生K12菌株。用于大腸桿菌的抗菌素水平為毫克/升，卡那霉素為30、氯霉素為50、青霉素300、四環(huán)素為10、及艮他霉素為20。除非另有說明，用于土壤桿菌的其它抗菌素水平也是以毫克/升計(jì)，各為100毫克/升卡那霉素或艮他霉素和50毫升/升羧芐青霉素或氯霉素。
限制性核酸內(nèi)切酶和T4連接酶由市場(chǎng)購(gòu)得，并按照生產(chǎn)者的建議來使用，可用上述Maniatis等人所介紹的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行克隆和分子分析。
實(shí)施例1質(zhì)粒的構(gòu)建將含有APHⅡ(Jorgensen et al.，Mol.Gen，(1979)17765)的完整結(jié)構(gòu)基因的Tn5的BglⅡ-SmaⅠ片段克隆到pUC8(Vieira and Messing，Gene(1982)19259)中，由于有一個(gè)很貼近SmaⅠ位點(diǎn)的EcoRⅠ位點(diǎn)，可將上述片段轉(zhuǎn)化成HindⅢ-EcoRⅠ片段。然后將含有APHⅡ基因的3′部分的PstⅠ-EcoRⅠ片段與EcoRⅠ-BamHⅠ-SalⅠ-PstⅠ銜接物一起組入pUC7(pCGN546W)的EcoRⅠ位點(diǎn)中。由于該構(gòu)建體不提供卡那霉素抗性，因此卡那霉素抗性是通過將APHⅡ基因的BglⅡ-PstⅠ片段插入BamHⅠ-PstⅠ位點(diǎn)(pCGN546X)來獲得。這個(gè)步驟是使APHⅡ基因重新組裝，以使EcoRⅠ位點(diǎn)位于該基因的側(cè)面。有一個(gè)ATG密碼子是在從帶有APHⅡ起始密碼子ATG的解讀密碼以外的上游。通過將APHⅡ的5′端的Sau 3A-PstⅠ片段插入pCGN546W的BamHⅠ-PstⅠ位點(diǎn)可獲得質(zhì)粒pCGN550，由于APHⅡ5′端的Sau 3A-PstⅠ片段缺失不需要的ATG，因此可避免產(chǎn)生不期望的ATG。
然后將含有APHⅡ基因(1ATG)的EcoRⅠ片段克隆到pCGN451的EcoRⅠ單一位點(diǎn)中，該位點(diǎn)含有能表達(dá)的章魚堿合成酶盒帶，得到pCGN552(1ATG)。
將含有章魚堿盒帶5′一非編碼區(qū)的1556bp的質(zhì)粒與PTiA6的章魚堿合成酶的3′非編碼區(qū)融合，此種融合是通過一種EcoRⅠ的銜接物。如由Barker et al.，Plant Mol.Biol.(1983)2325所確定的，對(duì)于3′區(qū)來說pTi的相同區(qū)為11，207到12，823堿基對(duì)，5′區(qū)的相同區(qū)為13，643到15，208堿基對(duì)。
得到的5′片段如下含有編碼區(qū)的5′端的一個(gè)小的再克隆片段，如BamHⅠ-EcoRⅠ片段克隆在pBR322中，即為質(zhì)粒pCGN407。BamHⅠ-EcoRⅠ片段具有編碼區(qū)XmnⅠ位點(diǎn)，而pBR322則具有2個(gè)XmnⅠ位點(diǎn)。pCGN407用XmnⅠ消化，用Bal 31核酸切割，并將EcoRⅠ銜接物加入到這些片段中。在EcoRⅠ和BamHⅠ消化后，按大小分離這些片段，隨后將各分離部分克隆化和順序化。有一種情況是，整個(gè)編碼區(qū)和5′非翻譯序列的10bp已經(jīng)被除去，留下5′非轉(zhuǎn)錄區(qū)、mRNA帽子位點(diǎn)和5′完整非翻譯區(qū)至一個(gè)BamHⅠ位點(diǎn)的16個(gè)堿基對(duì)。通過在7%丙烯酰胺凝膠上按大小分離可得到此小片段，同時(shí)洗脫出長(zhǎng)約130堿基對(duì)的幾個(gè)片段。將此分離的DNA連結(jié)進(jìn)入M13mp9，并對(duì)上述幾個(gè)克隆進(jìn)行順序測(cè)定，再將此順序與已知的章魚堿合成酶基因的順序進(jìn)行分析比較。M13構(gòu)建體稱為pI4，用BamHⅠ和EcoRⅠ消化pI4質(zhì)粒得小片段，將該小片段與含有pTIA6(Garfinkel and Nester，J.Bacteriol.(1980)144732)上游5′順序的XhoⅠ至BamHⅠ的片段連接，并同時(shí)與含有3′順序的EcoRⅠ至XhoⅠ片段連結(jié)。將所得到的XhoⅠ片段克隆到pUC8衍生質(zhì)粒，即為pCGN426的XhoⅠ位點(diǎn)。該質(zhì)粒與pUC8不同之處在于只含有用DNA多聚酶Ⅰ插入唯一EcoRⅠ位點(diǎn)。當(dāng)XhoⅠ銜接物插入pUC8的HincⅡ單一位點(diǎn)時(shí)，由于HincⅡ限制性核酸內(nèi)切酶污染核酸酶而失去PstⅠ和HindⅢ位點(diǎn)。得到的pCGN451質(zhì)粒含有單一的EcoRⅠ位點(diǎn)，以便在5′非編碼區(qū)(該5′非編碼區(qū)含有包括T-DNA的右邊緣的1550堿基對(duì)的5′非轉(zhuǎn)錄順序、mRNA帽子位點(diǎn)和16堿基對(duì)的5′非轉(zhuǎn)譯順序);和3′區(qū)(該3′區(qū)含有267堿基對(duì)的編碼區(qū)、終止密碼子、196堿基對(duì)的3′非轉(zhuǎn)譯DNA、多腺苷酸A位點(diǎn)和1，153堿基對(duì)的3′非轉(zhuǎn)錄順序之間插入蛋白質(zhì)的編碼順序。
所得到質(zhì)粒PCGN451有恰當(dāng)排列方向的OCS5′和OCS3′，此質(zhì)粒用EcoRⅠ消化，從pCGN551消化得來的EcoRⅠ片段含有完整的卡那霉素抗性基因，此基因被插入EcoRⅠ位點(diǎn)，使得pCGN552具有的卡那霉素抗性基因處于恰當(dāng)?shù)呐帕蟹较颉?br>用此OCS/KAN(章魚堿合成酶基因/卡那霉素抗性基因)為反式二元載體pCGN587提供一種可選擇的標(biāo)記。
所設(shè)計(jì)的章魚堿合成酶啟動(dòng)子盒帶的5′部分是由TiA6DNA的XhoⅠ片段的15208-13644堿基對(duì)(Barker′的編號(hào)組成的，該5′部分還含有與T-DNA轉(zhuǎn)移有連帶關(guān)系的T-DNA界面順序(邊緣)。在質(zhì)粒pCGN587中，從pCGN552中的OCS/KAN基因能提供一種可選擇的標(biāo)記和右邊緣，由HindⅢ-EcoⅠ片段再克隆的左界面區(qū)為pCGN565中的KpnⅠ-EcoRⅠ片段得到pCGN580。pCGN565是一種以pUC8-Cm為基礎(chǔ)的克隆載體，但含有pUC18銜接物，pCGN580與BamHⅠ聯(lián)成線狀用以取代pVCK102的較小的BglⅡ片段(Knauf and Nester，Plasmid(1982)845)，產(chǎn)生pCGN585。
通過用含有OCS/KAN基因的pCGN552的XhoⅠ片段代替pCGN585的較小的SalⅠ片段，可得到pCGN587。
pPMG85的構(gòu)建由pTiA6(Salomom et al.，EMBO J.(1984)3141∶146)的mannopine合成酶基因(mas)5′區(qū)來構(gòu)建pPMG85。該基因從(Knauf and Nester，Plasmid(1982)845-54)的pTiA6的T-DNA的一個(gè)柯氏質(zhì)粒(cosmid)克隆而獲得，此質(zhì)粒稱為PVCK232。用EcoRⅠ消化pVCK232，所得到的稱為Eco13或EcoC的其中一個(gè)片段被克隆在pACYC184中，得到質(zhì)粒pCGN14。用CalⅠ和SphⅠ消化pCGN14，得到一種片段的混合物，其中有所需要的片段，該所需要的片段是從ClaⅠ位點(diǎn)20128處到SphⅠ位點(diǎn)21562切下來(Barker et al.，Plant Mol.Bio(1983)2335-350)而得到的。此片段含有mas 5′區(qū)并被克隆在pUC 19(Yanisch-Perron et al.，Gene(1985)33103-119)，pUC19，SphⅠ和AccⅠ變成線性分子的得到質(zhì)粒pCGN40。將pPMG34(Stalker et al.，J.Biol.Chem.(1985)2604724-4728)的aro A BamHⅠ片段，以適當(dāng)?shù)呐帕蟹较蚩寺∵M(jìn)入pCGN40中，在這里，aroA基因和mas啟動(dòng)子區(qū)融合，得到pPMG67。
要得到一個(gè)多腺苷酸化的信號(hào)，可用pTiA6(Garfinkel et al.，Cell(1983)27143-153)的tml3′區(qū)。含有該區(qū)的T-DNA BamHⅠ片段(9062-13774;Barker編號(hào))定向地從pVCK232被克隆在pACYC184中。在此處，13774核苷酸是靠近載體的HindⅢ位點(diǎn)。用SmaⅠ消化得到的質(zhì)粒，該質(zhì)粒在tml3′區(qū)的11210核苷酸(Barker的編號(hào))切斷至插入一個(gè)八聚體XhoⅠ銜接物(由新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室合成，用HindⅢ、XhoⅠ消化所得到的質(zhì)粒pBamⅩ，通過用HindⅢ和SalⅠ消化pPMG67得到含有大部分mas5′區(qū)和aro A基因的片段克隆進(jìn)入線狀的pBamⅩ，所得到的質(zhì)粒pPMG73含有5′-mas-aroA-tml-3′雜合基因。
考慮到在農(nóng)業(yè)土壤桿菌中進(jìn)行有效選擇，可將pUC4K(Vieira and Messing，Gene(1982)19259-268)的卡那霉素抗性基因從SalⅠ處切割并克隆在存在于已知的pPMG76的mas5′區(qū)的aro A末端的XhoⅠ位點(diǎn)。
將在pRiA4T-LT-DNA(White and Nester，J.Bacteriol(1980)1411134;Taylor et al.，Mol.Gen.Genet.(1985)201546)的Hind17區(qū)中的一個(gè)2.0Kb EcoRⅠ片段克隆在pPMG76的氯霉素抗性基因EcoRⅠ位點(diǎn)中，得到pPMG82。
為選擇抗卡那霉素的轉(zhuǎn)化植株，霉構(gòu)建msa-npt雜合基因(見Velten et al.，EMBO J.(1984)32723-2730用一種類似的構(gòu)建)。通過用EcoRⅤ(21552;Barker的編號(hào))和EcoRⅠ(在pUC19多聚銜接物)消化pCGN40以切割mas5′區(qū)并克隆在用SmaⅠ和EcoRⅠ消化的pCGN451中。限制性缺失pCGN451的全部ocs5′區(qū)并在該位插入mas5′區(qū)。此外，pUC19多聚銜接物從XbaⅠ到EcoRⅠ的部分被插入在mas啟動(dòng)區(qū)和ocs多腺苷酸化作用的位點(diǎn)之間，為待表達(dá)基因的插入可選擇不同的位點(diǎn)。將帶有Tn5 npt基因(Rothstein et al.，Cell(1980)19795-805)的pCGN552的EcoRⅠ片段插入質(zhì)粒pCGN46的EcoRⅠ位點(diǎn)中，此處除去了5′區(qū)未轉(zhuǎn)譯的ATG順序。
通過用XhoⅠ消化以切斷mas-npt-ocs雜合基因，并將其克隆在pPMG82的SalⅠ位點(diǎn)中，得到pPMG85。
所得到的質(zhì)粒pPMG85包含從EcoRⅠ位點(diǎn)起始、來自pACYC184的一個(gè)EcoRⅠ-HindⅢ 1.5Kb片段和順時(shí)針排列的來自pUC4K的細(xì)菌卡那霉素抗性基因、以順時(shí)針方向定位的mas5′區(qū)核苷酸21476到20128、包含來自pPMG34片段的BamHⅠ-SalⅠaro A、從核苷酸11207到9062的tml3′區(qū)、一個(gè)來自pACYC184的四環(huán)素抗性基因的BamHⅠ-SalⅠ片段、來自pCGN552的npt基因、一個(gè)來自pACYC184的2.5Kb SalⅠ-EcoRⅠ片段和來自在BglⅡ-HindⅢ-17片段(Huffman et al.，J.Bacteriol(1984)157269-276)上的pRIA4的2Kb EcoRⅠ片段。
實(shí)施例2蕃茄子葉組織的轉(zhuǎn)化從幼苗得到完全無菌的蕃茄子葉組織，幼苗是于24℃下在含有Murashige-Skoog鹽培養(yǎng)基和0.8%瓊脂(pH6.0)的100×25毫米培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)發(fā)育16小時(shí)/8小時(shí)日/夜周期時(shí)間。各蕃茄種均可使用，但本發(fā)明是用UC82B近交繁殖系，它可從戴維斯站(澳)加利福利亞大學(xué)蔬菜作物系CA 95616得到。將子葉切成三片并將中間一片子葉置于飼養(yǎng)平板上預(yù)培育24小時(shí)。用滴管將0.5毫升的煙草懸浮培養(yǎng)物(106細(xì)胞/毫升)移到含有Murashige基本有機(jī)培養(yǎng)基(K.C.生物制品)、2、4-d(0.1毫克/升)激動(dòng)素(1毫克/升)、硫胺素(0.9毫克/升)和磷酸氫鉀(200毫克/升、pH5.5)的0.8%瓊脂培養(yǎng)基上，以制備飼養(yǎng)平板，該飼養(yǎng)平板在使用前兩天制備。煙草懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)兩天后，將一張含有飼養(yǎng)培養(yǎng)基的3毫米無菌濾紙圓片放在煙草細(xì)胞的上部。
將子葉切片中三分之一的中間那些子葉切片預(yù)保溫后，置于根癌土壤桿菌2760/587/85菌株(1×107-1×108細(xì)菌/毫升)的液體MG/L肉湯液體培養(yǎng)物(1-5毫升)中。(將質(zhì)粒pCGN87和pPMG85轉(zhuǎn)化到大腸桿菌C2110(polA)利用卡那霉素和草甘膦抗性選出共合體，引自Fromard et al.，Bio Technology，May1983，PP.262-267)。用兩個(gè)菌株大腸桿菌和一個(gè)菌株的土壤桿菌進(jìn)行細(xì)菌接合，其中一株大腸桿菌(MM294)具有提供遷移功能的pRK2073，而另一株大腸桿菌(C2110)帶有卡那霉素抗性標(biāo)記的質(zhì)粒將被轉(zhuǎn)移到土壤桿菌中去。兩株大腸桿菌均于37℃在LB肉湯液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過夜，土壤桿菌株則于28℃在MG/L肉湯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。三種菌株各取50微升置于MG/L平板的硝化纖維濾紙上混合，該平板于28℃保溫3天，混合液在補(bǔ)加100微克/毫升卡那霉素和100微克/毫升鏈霉素的AB基本培養(yǎng)基上劃線后，于28℃保溫兩天，所加的鏈霉素使兩株大腸桿菌致死。通過在上述培養(yǎng)基上兩次以上的劃線培養(yǎng)以純化和挑取單個(gè)菌落。將子葉切片與細(xì)菌在飼養(yǎng)平板上共培養(yǎng)48小時(shí)，隨后將其轉(zhuǎn)移到含有500毫克/升羧芐青霉素和100毫克/升卡那霉素的再生培養(yǎng)基中。再生培養(yǎng)基是含有玉米素(2毫克/升)、肌醇(100毫克/升)、蔗糖(20克/升)、Nitsch維生素及0.8%瓊脂(pH6.0)的一種K.C.生物制品Murashige-Skoog鹽培養(yǎng)基。發(fā)育2-3周后即可觀察到帶葉枝條的生長(zhǎng)，當(dāng)帶葉枝條長(zhǎng)至約1.25厘米長(zhǎng)時(shí)，將其切下斷并轉(zhuǎn)移到含有羧芐青霉素(500毫克/升)和卡那霉素(500毫克/升)的Murashige和Skoog培養(yǎng)基中以便生根，10-12天內(nèi)發(fā)育出根。
將在含有卡那霉素培養(yǎng)基上發(fā)育并隨后生根的帶葉枝條進(jìn)行APH酶活性和是否存在aro A蛋白質(zhì)的檢測(cè)。西方印跡法蕃茄植株的提取液在西方印跡法中(Comai et al.，Nature(1985)37341-344)顯出aro A蛋白質(zhì)的一條正常。用誘變的草甘膦抗性aro A基因表達(dá)產(chǎn)物，按常規(guī)方法使兔子產(chǎn)生免疫即可獲得抗體用于西方印跡法。美國(guó)專利4，535，060的有關(guān)介紹已為本發(fā)明列入?yún)⒖肌Ｔ谟袠?biāo)準(zhǔn)條帶的凝膠中證實(shí)草苷膦抗性酶確實(shí)生成并且在寄主細(xì)胞中也是穩(wěn)定的。
在假定已轉(zhuǎn)化的蕃茄植株和枝條上也進(jìn)行了氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH 3′Ⅱ)的分析，發(fā)育成帶葉分枝條并隨后在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上生根的約90%的蕃茄植株已檢驗(yàn)出對(duì)APH3′Ⅱ酶活性為正帶，APH 3′Ⅱ提供對(duì)卡那霉素和新霉素的抗性。用電泳法將酶與其它干擾的蛋白質(zhì)分離，分析APH 3′Ⅱ的活性(Reiss et al.，Gene(1984)30211-218)。亦可通過在原位卡那霉素的磷酸化作用檢測(cè)出APH 3′Ⅱ的酶促活性?？敲顾睾汀拨?32P〕ATP都可作為底物用，并包埋在瓊脂糖凝膠里，該瓊脂糖凝膠被置于含有蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠的上面。酶促反應(yīng)后，磷酸化的卡那霉素被轉(zhuǎn)移到P-81二氧磷基纖維素離子交換紙上，用放射自顯影法最后可見使放射性標(biāo)記的卡那霉素顯影。用0.1毫克/毫升的蛋白質(zhì)酶K洗P-81離子交換紙，以改進(jìn)Reiss等人的方法。
在子葉細(xì)菌共培養(yǎng)后，放在“2Z”再生培養(yǎng)基平板上的約90-100%子葉都再生出帶葉枝條。放在含有羧芐青霉素和卡那霉素“2Z”培養(yǎng)基平板上約60-90%子葉也都形成了帶葉枝條。在選擇培養(yǎng)基上開始培養(yǎng)的約80%的帶葉枝條隨后都在含有卡那霉素(50毫克/毫升)的生根培養(yǎng)基上生出了根。通過蛋白質(zhì)的西方印跡法分析，有90%以上的這些帶葉枝條在產(chǎn)生了aro A蛋白質(zhì)的卡那霉素上生出了根，表1列出了蕃茄轉(zhuǎn)化的結(jié)果。
表1通過與農(nóng)業(yè)土壤桿菌共培養(yǎng)的蕃茄轉(zhuǎn)化處理 子葉數(shù) 總數(shù)不飼養(yǎng)物 13/19 68% 27/41 66%KCMS+培養(yǎng)基 14/22 64%玉米飼養(yǎng)物 10/14 71% 24/37 64.3%KCMS+培養(yǎng)基 6/11 55%8/12 67%煙草飼養(yǎng)物 12/12 100% 33/37 89.3%KCMS+培養(yǎng)基 10/12 83%11/13 85%無飼養(yǎng)物 4/18 22% 11/35 31/5%N6培養(yǎng)基 7/17 41%玉米飼養(yǎng)物 6/22 27% 11/32 29.0%N6培養(yǎng)基 5/10 31%對(duì)照數(shù)KCMS+培養(yǎng)基是煙草培養(yǎng)基，N6培養(yǎng)基是玉米培養(yǎng)基。
通過肉眼檢查子葉在含有100毫克/升卡那霉素的2Z培養(yǎng)基上開始生長(zhǎng)的綠色帶葉分枝可測(cè)定出轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
因此，以上介紹的蕃茄轉(zhuǎn)化/再生系統(tǒng)是快速而有效的，85%以上的共培養(yǎng)的外植體隨后都在選擇的卡那霉素培養(yǎng)基上發(fā)育成帶葉分枝并表達(dá)了aro A蛋白質(zhì)。每個(gè)外植體長(zhǎng)出了2-10個(gè)帶葉分枝，6周后，每個(gè)外植體長(zhǎng)出了10、20或甚至更多個(gè)的帶葉的分枝。草甘膦噴霉試驗(yàn)證實(shí)得到的蕃茄植株對(duì)0.75磅/英畝的草甘膦具有抗性。
上述結(jié)果證明能夠有效地轉(zhuǎn)化植物種，利用此種方法外源基因可以整合進(jìn)入植物基因組而且能夠表述。并提供新的表型性狀。根據(jù)高效的轉(zhuǎn)化，在適當(dāng)?shù)钠谙迌?nèi)，又沒有過多的重復(fù)步驟就可實(shí)現(xiàn)成功的轉(zhuǎn)化。如上述介紹所證實(shí)的，所提供的植物種能保護(hù)植物免受除草劑的傷害，從而可以實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物的快速生長(zhǎng)和高產(chǎn)。
為清楚理解起見，雖已通過說明和舉例的方法，詳細(xì)介紹了本發(fā)明，但顯然可在申請(qǐng)的專利范圍內(nèi)實(shí)行某些變動(dòng)和修改。
權(quán)利要求
1.一種高效轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法，將DNA引入上述的植物細(xì)胞，該DNA能在上述細(xì)胞中復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，該方法包括在植物細(xì)胞所限定的培養(yǎng)基中培育子葉細(xì)胞，并與含有一種構(gòu)建體、并被改裝和轉(zhuǎn)化的農(nóng)業(yè)土壤桿菌(Agrobacterium)細(xì)胞共培養(yǎng)。這種構(gòu)建體包括一個(gè)T-DNA的邊界和能夠在植物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的一個(gè)有價(jià)值的基因，此構(gòu)建體還能夠被轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞內(nèi)，以后整合進(jìn)入該植物細(xì)胞的基因組。利用上述構(gòu)建體能夠被整合進(jìn)入該植物細(xì)胞基因組，以便提供被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。除去上述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的細(xì)菌，在再生培養(yǎng)基中培育該轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，以產(chǎn)生帶葉的分枝，以及轉(zhuǎn)移帶葉分枝到生根培養(yǎng)基中以產(chǎn)生小植物。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中上述子葉細(xì)胞是通過完全無菌的條件下，得到萌發(fā)的無菌種子，形成伸出的子葉;以及將上述子葉至少切成兩片，除去該種子的其他部分并挑選更靠近種子的那片子葉切片。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1的一種方法，其中所說的限定培養(yǎng)基是指含有激素和維生素的軟的瓊脂培養(yǎng)基中，有每毫升104-1010細(xì)胞生長(zhǎng)，這種培養(yǎng)基在培育上述子葉細(xì)胞時(shí)，至少前一天制備出來。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1的一種方法，其中所說的植物細(xì)胞首先與細(xì)菌肉湯液體培養(yǎng)基中的上述土壤桿菌接觸，隨后將與土壤桿菌接觸過的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到條件培養(yǎng)基中。
5.一種有效地轉(zhuǎn)化蕃茄植物細(xì)胞的方法，將DNA引進(jìn)該蕃茄植物細(xì)胞，其中DNA能在該細(xì)胞中復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，上述方法包括將子葉細(xì)胞置于植物細(xì)胞所限定的培養(yǎng)基中培育，與含有一種構(gòu)建體、并經(jīng)過改裝和轉(zhuǎn)化的土壤桿菌細(xì)胞共培養(yǎng)，這種構(gòu)建體包括一個(gè)T-DNA邊界和在蕃茄植物細(xì)胞內(nèi)能夠轉(zhuǎn)錄的有價(jià)值的基因，這種構(gòu)建體能夠被轉(zhuǎn)移到蕃茄植物細(xì)胞內(nèi)并且能夠整合進(jìn)入該細(xì)胞的基因組，根據(jù)上述構(gòu)建體整合進(jìn)入該蕃茄植物細(xì)胞的基因組，以便提供轉(zhuǎn)化的蕃茄植株細(xì)胞;除去上述轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的細(xì)菌，與再生培養(yǎng)基中該轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞在再生培養(yǎng)基中培育，以產(chǎn)生帶葉分枝，以及將上述的帶葉分枝轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中，以產(chǎn)生小植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5的一種方法，其中所說的子葉細(xì)胞是通過實(shí)質(zhì)上在無菌條件下，使無菌種子萌發(fā)來獲得，形成伸出的子葉;以及將上述子葉至少切成兩片，除去該種子的剩余部分并挑選靠近種子一片子葉切片。
7.一種蕃茄細(xì)胞具有編碼外源的草甘膦抗性的3-烯醇丙酮基二氧膦基莽草酸鹽合成酶的構(gòu)建物。
8.一種具有外源的草甘膦抗性的3-烯醇丙酮基二氧膦基莽草酸鹽合成酶的蕃茄細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求
7的一種蕃茄細(xì)胞，其中所說的蕃茄細(xì)胞是蕃茄(Lycopersicon esculentum)。
10.根據(jù)權(quán)利要求
8，由蕃茄細(xì)胞組成的蕃茄苗。
專利摘要
本發(fā)明涉及通過將子葉的帶葉分枝培養(yǎng)物與外源基因共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化，隨后由轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生出植物體，從而產(chǎn)生能表達(dá)外源基因的植物體以產(chǎn)生植物種，特別是利用一種受到控制的農(nóng)業(yè)土壤桿菌(Agrobacte-rium)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)來轉(zhuǎn)化蕃茄帶葉分枝培養(yǎng)物，而后使轉(zhuǎn)化的蕃茄組織再生成植物體。
文檔編號(hào)C12N15/82GK87104202SQ87104202
公開日1988年3月9日 申請(qǐng)日期1987年6月10日
發(fā)明者喬安·菲拉蒂, 布魯斯·R·托馬斯 申請(qǐng)人:加利福尼亞基因公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan