專利名稱：一種受植物系統(tǒng)獲得性抗性誘導劑誘導的啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物分子生物學和基因工程技術領域，具體涉及一種受植物系統(tǒng)獲得性抗性誘導劑誘導的啟動子及其應用。該啟動子來源于擬南芥中對烯丙異噻唑(PBZ，Probenazole，3-烯丙氧基-2-苯丙異噻唑-1，1-二氧化物)及其相關活性產(chǎn)物誘導響應基因的上游非轉錄區(qū)域序列。這一啟動子片段在單子葉和雙子葉植物中能夠借助于誘導物起始和驅動下游附近基因的表達。用這種啟動子片段構建重組表達載體轉化植物，可獲得新型轉基因植物。在這些新型轉基因植物中，PBZ及其相關活性產(chǎn)物(BIT)可以隨意地誘導目標基因的表達和調(diào)控。
背景技術：
在過去十多年中，人們已經(jīng)獲得了上百個在作物遺傳改良中有重要應用價值的功能基因。隨著功能基因組研究的進展，人們還會批量地克隆出有廣泛應用價值的功能基因。這些多樣性的基因資源將會被用來大規(guī)模地改良作物和其它重要植物，以便滿足人口增長導致對糧食日益增長的需求，緩解環(huán)境治理和保護的巨大壓力，以及為城鎮(zhèn)居民提供豐富的生活必需品和高質(zhì)量的生活環(huán)境。這些多樣性的功能基因資源需要在不同類型啟動子的調(diào)控下才能恰到好處地發(fā)揮作用。
一般來說，啟動子是位于基因編碼區(qū)上游的一段DNA，包含轉錄起始區(qū)。啟動子區(qū)域同時包含多種調(diào)控基因表達的元件，如大約位于轉錄起始位點上游30bp(-30)位置的TATA box，以及位于上游75bp位置的CAAT box。植物啟動子中還包含可以感應其他外界因素的調(diào)控元件，諸如光、化學物質(zhì)、營養(yǎng)條件、熱、缺氧、重金屬等環(huán)境因子，進而對相關基因進行表達調(diào)控。啟動子內(nèi)的另外一些DNA序列與發(fā)育的時序或基因表達的組織特異性有關。真核體系中還存在增強子序列，可以大大提高附近基因的表達水平；這些增強效應與其所處的位置和方向沒有多大關系。
近年來，植物基因工程技術在作物品種的遺傳改良方面，特別是在抗病蟲特性和抗除草劑特性，以及谷物籽粒品質(zhì)改良上取得了令人矚目的成就和進展，而且在許多其它方面也愈來愈顯示出了其巨大的應用潛力，如植物生物反應器的構建等。然而，在取得這些突破性進展的同時，關于轉基因植物的生態(tài)安全和食品安全問題也引起了公眾越來越多的關注、爭論甚至抗議。這中間除了非理性和非科學因素外，現(xiàn)行的選擇性基因和目標功能基因的表達體系也的確存在其內(nèi)在的局限性。自然狀態(tài)下，生物體內(nèi)基因的表達都受到嚴格的調(diào)控。調(diào)控因子可能是發(fā)育進程相關的，表現(xiàn)為基因的程序化表達，包括時空表達；也可能是環(huán)境因子誘導的，表現(xiàn)為基因的應急式表達。然而，目前植物基因工程中所用的啟動子多為組成型的，這些組成型的啟動子驅使選擇性標記基因和目標功能基因持續(xù)高效表達，為轉基因技術和轉基因植物的安全性問題埋下了隱患。事實上，選擇性標記基因只需要在篩選轉化體時表達；抗病蟲、抗除草劑及生物反應器中的目標功能基因也只是在生長發(fā)育特定的階段需要表達，許多時候甚至僅僅是短暫的表達。對植物而言，外源基因的無效持續(xù)表達不僅是物質(zhì)和能量不必要的消耗，而且還干擾植物細胞的正常生理活動，影響收獲器官的產(chǎn)量和品質(zhì)，甚至還會引起性狀喪失等后果。最近在Bt(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白轉基因棉花上已發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)毒性蛋白基因長時間的表達，易導致棉鈴蟲對毒性蛋白產(chǎn)生抗性(Mcaughey et al.，Nature biotechnol.16144-146.1998)。以植物作為生物反應器也存在類似的問題。對于生態(tài)環(huán)境而言，持續(xù)表達的外源基因可能會通過花粉或其它途徑在近緣物種間轉移，導致有潛在危害的部分選擇性基因或功能基因及其控制的性狀逃逸，進而對整個食物鏈和生物多樣性造成難以預料的后果。
為了克服組成型啟動子在植物基因工程中的這些缺點，人們已經(jīng)考慮開發(fā)利用誘導型啟動子，組織特異性/發(fā)育階段特異性啟動子。誘導型啟動子應用于植物基因工程有許多突出的優(yōu)勢，主要體現(xiàn)在1、目標功能基因可以根據(jù)需要誘導表達；2、基因的表達水平可以通過調(diào)節(jié)誘導劑/因子的強度而得到調(diào)節(jié)；3、通過使用不同的誘導劑/因子組合可以調(diào)節(jié)相關功能基因的協(xié)同表達。
在植物上，創(chuàng)傷誘導表達系統(tǒng)是較早被研究的、試圖用于抗病蟲基因工程的一種誘導型表達系統(tǒng)(Lorberth et al.，Plant J. 2477-86.1992)。但是由于這類啟動子是借助于病蟲侵害引起的創(chuàng)傷來誘導目標功能基因表達，所誘導的抗病蟲基因表達的速度和強度不足以產(chǎn)生及時有效的抗性，因而不能產(chǎn)生理想的抗性效果。此外，其它機械損傷，如暴風雨等，也能引起抗病蟲基因不必要的表達。
其次，缺氧誘導的玉米乙醇脫氫酶Adh I基因的啟動子可能是研究得最為詳盡的誘導型啟動子之一。
通過電穿孔的方法，將缺氧誘導的玉米乙醇脫氫酶Adh I基因轉化源于懸浮培養(yǎng)的玉米原生質(zhì)體(Howard，et al.，Planta，170535-450.1987)。轉化后的原生質(zhì)體置于低氧含量處，并于20小時后分析Adh I的表達。為便于測量缺氧誘導的Adh I表達，將天然Adh I基因5’調(diào)控片段(1096 bp)與CAT相連。他們的結果顯示，在源于同源的培養(yǎng)細胞的原生質(zhì)體中，標準的缺氧條件可以調(diào)控單子葉植物玉米的Adh I啟動子/CAT基因。同時，他們又發(fā)現(xiàn)，在玉米原生質(zhì)體中，Adh I的啟動子片段本身就足以響應缺氧條件的誘導，進而調(diào)控外源基因的表達，無需編碼區(qū)和3’區(qū)的存在。
其他研究者(Lee et al.，Plant Physiology 85327-330 1987)進一步確定了玉米Adh I基因與缺氧誘導相關的DNA片段。這些研究者在玉米原生質(zhì)體中轉入包含CAT編碼順序和Adh I啟動子的重組基因，24小時后檢測CAT活性。通過改變啟動子片段的長度，Lee等人確定從轉錄起始位點上游146bp的啟動子順序足以在缺氧狀態(tài)下啟動CAT的表達。然而啟動子順序向5’端繼續(xù)延伸到266或955bp后，CAT表達量上升了5或8倍。
Walker等人繼續(xù)用瞬間表達方法研究玉米Adh I基因上游受缺氧誘導啟動基因表達的順序(Walker et al.，proc.Natl.Acad.Sci.USA 846624-6628 1987)。他們確定了啟動子中與缺氧誘導的基因表達相關的2段順序-133--124和-113--99(轉錄起始位點上游)。這2段順序對于誘導是必須的。在無親緣關系的病毒啟動子前添加這段40bp的元件后可以受缺氧誘導。
另外有人發(fā)現(xiàn)在穩(wěn)定轉化的煙草細胞內(nèi)，如果用玉米Adh I基因-1094-+106這一段調(diào)控CAT基因，在合適的缺氧條件下，有非常低的CAT基因表達(Ellis et al.，EMBOJournal 611-16 1987)。事實上，只檢測到CAT的mRNA。然而，將octopine合成酶基因或花椰菜鑲嵌病毒(CaMV)的啟動子元件接在Adh I啟動子的5’端，可刺激CAT的表達，并在缺氧誘導后檢測到CAT。包含與Adh I基因轉錄起始位點5’相鄰順序247bp的片段，足以將CAT基因的表達置于缺氧調(diào)控之下。因此，即使在有組成型的octopine合成酶或CaMV 35S啟動子片段存在的條件下，這段247 bp的順序的存在仍使基因的表達受缺氧調(diào)控。Howard、Lee以及Walker等人通過瞬間表達分析獲得的受缺氧誘導調(diào)控的Adh I啟動子區(qū)域與Ellis等人通過穩(wěn)定轉化植物所獲得的一致或類似。
由于Adh I基因的啟動子誘導響應因子為缺氧狀態(tài)，因而在轉基因作物上的應用沒有現(xiàn)實的可操作性。
在眾多誘導型啟動子中，化學誘導型啟動子在調(diào)控外源基因的表達上有許多突出的優(yōu)點，其中最主要的優(yōu)點是可控性強。高效、專一的化學誘導啟動子理論上可以用于各種類型功能基因的安全表達，最理想的可能是用于抗病蟲的植物基因工程和生物反應器植物的構建。
在細菌和動物系統(tǒng)中已有不少能調(diào)控外源基因表達的誘導物/啟動子組合。許多細菌內(nèi)的誘導體系是基于能夠響應代謝物或其類似物的啟動子。用包含相關啟動子的目的基因轉化細菌后，在其培養(yǎng)基中加入合適的誘導物，便可以引起目的產(chǎn)物的表達。成熟的誘導物/啟動子組合包括3-β-吲哚乙酸/色氨酸啟動子，IPTG/lac啟動子，磷酸鹽/磷酸鹽饑餓誘導啟動子，以及L-阿拉伯糖/ara B啟動子等。類似的，重金屬/metallothionine啟動子，熱/熱休克等啟動子已應用于動物細胞的培養(yǎng)系統(tǒng)中，調(diào)控外源基因的表達。
在植物上，除草劑安全劑誘導啟動子是一類研究得比較深入的實用型化學誘導啟動子，但由于其誘導特異性等方面尚存在一些問題，目前尚未得到廣泛的應用(Hershey et al.，Plant Mol Biol.17679-690，1991)。美國曾批準一個除草劑安全劑誘導的啟動子的專利(美國專利號5364780)，研究者以第一個“適用于大田生產(chǎn)的化學物質(zhì)誘導而在轉基因植物中調(diào)控目的基因表達的啟動子”得到了專利(1991年)。在進一步的應用中，他們將In2-2啟動子與報告基因GUS相連，轉化擬南芥植物，通過組織化學的方法分析發(fā)現(xiàn)對于不同類型的除草劑安全劑，GUS分別表達于根、苗等不同組織(De Veylder L et al.，Plant CellPhysiology，38(5)568-577，1997)。
其它報道的化學誘導型啟動子有水楊酸、葡聚糖受體、Cu2+、醇類、四環(huán)素、雌性激素、生長素，細胞激動素，赤霉酸，乙烯和脫落酸等誘導啟動子(Davies，P.(Ed.)PlantHormones and Their roles in Plant Growth and Development，Martinus Nijhoff Publ.1987；Ebel et al.，1984)。這些啟動子主要用于理論研究，不具備實際應用價值。
本發(fā)明所使用的化學誘導物質(zhì)——PBZ，是生產(chǎn)上使用多年的植物系統(tǒng)獲得性抗性的誘導劑，具有許多優(yōu)越性。首先，該藥劑對植物的正常生長發(fā)育無明顯影響，對病原菌也沒有直接毒性，不易引起抗藥性，其誘導抗病機理主要是在轉錄水平上調(diào)控體內(nèi)一系列相關基因的表達(Sakamoto et al.，Plant Mol Biol.40847-855.1999；Yoshioka et al.，Plant J.25(2)149-157.2001；丁德榮，復旦大學博士后出站報告，2001)。其次，它是一種防治稻瘟病的高效抗病性誘導劑，可以減輕由稻瘟病造成產(chǎn)量損失的80-90％，且效果穩(wěn)定，已經(jīng)成為東南亞稻區(qū)防治稻瘟病使用面積最大的抗病誘導劑(Zeigler，Leogler and Teng(Ed.)Strategies for the discovery of rice blast fungicides. inRice Blast Disease，CAB International Press.1994)。最后，烯丙異噻唑在植物體內(nèi)具有內(nèi)吸輸導性，克服了水楊酸等誘導劑在植物體內(nèi)不能輸導、易引起植物毒害的缺點(Kessmann，et al.，Annu Rev Phytopathol. 32439-459.1994)。
綜上所述，烯丙異噻唑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應用具有很大的可操作性，因而最有可能被應用于調(diào)控大田轉基因植物中目的基因的表達。據(jù)報道，烯丙異噻唑可以誘導水稻中一些抗病相關基因的增強表達，如RPR1基因。該基因的編碼產(chǎn)物含有亮氨酸富集重復區(qū)(LRR)和核甘酸結合位點(NBS)，這些是許多已知抗病基因所共有的特征。RPR1基因的表達還可以被常用的植物系統(tǒng)獲得性抗病性(SAR)誘導劑BTH和SA，以及病原菌的誘導(Sakamoto et al.，Plant Mol Biol. 40847-855.1999)。在擬南芥上的研究發(fā)現(xiàn)，PBZ或其活性代謝產(chǎn)物BIT也能誘導系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)。與常用的化學誘導劑BTH和INA不同，PBZ是通過激活SA上游成分來激活SA/NPR1介導的防御信號途徑，進而誘導SAR，而前者似乎是作為SA的類似物而發(fā)揮作用的(Yoshioka et al.，PlantJ. 25(2)149-157.2001)。
然而至今為止，對PBZ誘導增強表達相關基因的啟動子的研究尚未見報道，也無在轉基因植物體內(nèi)通過PBZ調(diào)控相應啟動子和結構基因組合的可誘導體系的報道。
本發(fā)明運用差減抑制雜交技術和啟動子捕捉技術，并借助于生物信息學的途徑，從水稻和擬南芥中分離受PBZ誘導上調(diào)的基因的啟動子，鑒定它們對PBZ誘導響應水平。這些啟動子片段可被用于建立一套基因誘導表達系統(tǒng)，在轉基因植物中調(diào)控外源基因的表達。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種受植物系統(tǒng)獲得性抗性誘導劑誘導的啟動子及其應用，以便應用化學物質(zhì)控制轉基因植物和植物組織中基因的選擇性表達。
本發(fā)明提供的受植物系統(tǒng)獲得性抗性誘導劑誘導的啟動子，是源于擬南芥的、對PBZ誘導響應的核酸啟動子片段。這些核酸啟動子片段已構建到含有非植物來源基因的重組載體中，轉化植物后發(fā)現(xiàn)結構基因的表達水平受PBZ的誘導調(diào)控。因此在用PBZ誘導后，轉基因植物中與該啟動子片段連接的目的基因的表達水平將會上升。
上述所說的核酸啟動子可從多數(shù)作物中獲得，單子葉植物如水稻、玉米、燕麥、小麥、草、大麥、高粱、洋蔥、和甘蔗；雙子葉植物如擬南芥、苜蓿、大豆、矮牽?；ā⒚藁?、甜菜、黃瓜、番茄、煙草、豌豆等。最主要的是從擬南芥和水稻中獲得的核酸啟動子。
上述所說的一組核酸啟動子片段，是與水稻OsPIG-1(Oryza sativa Probenazoleinducible gene-1)基因(SEQ ID No.1)部分同源的擬南芥AtPIG-1基因(SEQ ID No.2)5’上游啟動子區(qū)域的核苷酸序列。帶有所述啟動子片段的轉基因植物在用PBZ處理時會引起連接在所述啟動子3’末端的目的基因的表達升高。在擬南芥中，該基因5’上游啟動子區(qū)域的核苷酸序列可以為2132bp(SEQ ID No.3)或1183bp(SEQ ID No.4)。這些序列包含受PBZ誘導的調(diào)控元件和不同的組織特異性表達元件等。
所述核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與固定在固體支撐膜上的SEQ ID No.2的核苷酸雜交，經(jīng)0.1 X SSC，0.1％SDS于50℃～65℃洗脫后，在-80℃對X-光片曝光24小時后可獲得放射自顯影信號。
本發(fā)明的另一方面是與一重組DNA載體相關。該載體含有上述核苷酸序列作為啟動子。該載體可轉化植物，包含本發(fā)明中的一個核酸啟動子片段、與該啟動子相連的編碼特定目的基因的DNA序列及合適的3’下游序列，使轉化該重組載體后的植物在有化合物PBZ的作用下，特定目的基因轉錄產(chǎn)物水平上升。本發(fā)明中，目的基因有編碼GUS基因，編碼抗病基因如白葉枯病、稻瘟病等抗性基因，編碼抗昆蟲的基因，編碼蛋白酶抑制劑基因，編碼Bacillus thuringenesis昆蟲內(nèi)毒素的基醫(yī)，編碼植物乙烯生物合成酶的基因，編碼植物激素生物合成酶的基因，編碼雄性不育/育性表型的基因，編碼鈣調(diào)素基因，編碼各種疫苗基因，以及編碼各種藥用或食用成分基因等。
本發(fā)明的另一方面還包括用本發(fā)明的重組DNA序列轉化的植物，這種轉基因植物用化合物PBZ處理誘導目的基因表達量增高，該基因序列經(jīng)操作連接在所述啟動子片段的3’端。這樣的轉基因植物的種子同樣認定為該發(fā)明的體現(xiàn)。
本發(fā)明的最后一方面包括在植物中引起目的基因表達增高的方法，它有幾個步驟組成a)用上述的重組DNA結構轉化植物；b)用化合物PBZ處理轉基因植物；c)使轉基因植物在期望的時候增加目的基因產(chǎn)物的含量。
具體實施例方式
1、水稻培養(yǎng)、PBZ處理、材料收集與抗病性鑒定取適量稻種，用自來水浸泡片刻，去除癟谷。再用3％的過氧化氫溶液消毒30min，之后棄去雙氧水，用無菌自來水洗滌數(shù)次并在30℃下用無菌自來水浸種3天。待種子露白后，均勻地鋪在襯有4層無菌紗布的搪瓷盤上，27℃下，光照16h/黑暗8h周期下培養(yǎng)7天。之后用100ppm烯丙異噻唑分別在第1-9天處理水稻，處理方式是根部溶液浸泡。處理后全部進行接種稻瘟菌，接種方法為置接種箱內(nèi)，在26℃下、相對濕度為85％以上的條件下進行噴霧接種，接種液濃度為1×105孢子/毫升，接種后保濕24hr，取出置蔭棚中噴霧保濕，7d后調(diào)查病情。
按接種處理后第1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12天的時間梯度收集水稻的根、葉組織，液氮速凍，置于-70℃保存。
2、水稻總RNA的抽提抽RNA所用的一切器皿均用0.1％的DEPC水處理或200℃烘烤，以去除RNA酶。
(1)熱酚法抽提水稻總RNA取水稻材料2g，置于研缽中，加液氮充分研磨至細粉狀，立即轉移到10ml離心管中，加預熱至90℃的抽提緩沖液4ml，劇烈振蕩混勻，3min后加入2ml氯仿，搖動混勻15-20min，12,000g離心15min，吸上清，加入1/3V的8M LiCl，混勻，4℃下放置16hr，離心收集沉淀，分別用2M LiCl和80％乙醇洗滌2次，室溫晾干，沉淀溶于100ulDEPC水中。
(2)Trizol法抽提水稻總RNA分裝1ml trizol試劑，作標記。將適量水稻組織從冰箱中取出，迅速于液氮中研磨成細粉。把粉末放入加有1ml TRIzol試劑的1.5ml離心管中，用力搖勻后室溫靜置5min(然后可暫放4℃下)；加0.2ml氯仿并搖勻，室溫放置3min，4℃下13,000g離心15min，取上層水相轉移至一個新的離心管。水相中加0.5ml異丙醇，室溫沉淀10min，4℃下13，000g離心15min，去上清。加1ml 75％的乙醇洗滌沉淀，13,000g離心5min，去盡上清。沉淀于室溫干燥5min以徹底去除乙醇。加20μl無菌DEPC水溶解RNA，取1μl以1∶1000稀釋，測定O.D.260與O.D.280的紫外吸收值，另取1μl RNA進行電泳，確定RNA的濃度與純度。
3、mRNA分離純化mRNA分離純化按mRNA Purification Kit說明進行。
4、抑制消減雜交(SSH)具體操作按Clontech試劑盒說明書進行。
5、差減cDNA文庫的構建(T/A克隆法)從PCR擴增后的正向和反向差減cDNA群體(共25ul)中取出3ul，1μl pGEM-T EasyVector(50 ng)，1U T4 DNA連接酶加入到1×T4連接酶緩沖液中混勻，4℃下連接過夜。連接反應完成后，將反應液加入到100μl大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞中，冰浴30min，42℃下熱激90s，迅速轉移至冰上放置3-5min，加入37℃預熱的液體LB培養(yǎng)基300μl，再置于37℃搖床中，150rpm培養(yǎng)60min。將培養(yǎng)好的菌液200μl與40μl X-gal溶液(10mg/ml)、4μl IPTG溶液(10mg/ml)混合后涂布于含有100μg/ml氨芐青霉素的LB平板上。37℃下倒置培養(yǎng)15h。于X-gal/IPTG瓊脂平板上挑取白色克隆，點種于盛有液體LB的96孔板中，培養(yǎng)過夜，加15％甘油，液氮速凍，-80℃保種備用。
將保種質(zhì)粒分別接種于裝有2ml含100μg/ml氨芐青霉素的液體LB的試管中，置于搖床內(nèi)37℃下，240rpm培養(yǎng)過夜。次日堿法抽提質(zhì)粒。首先將菌液轉移到1.5ml離心管中，13,000g離心1min，去上清，加入100μl冰預冷的溶液I，振蕩將菌體細胞打勻；再加入200μl新配置的溶液II，室溫放置3min；加150μl冰預冷的溶液III，冰上放置5min；然后13,000g離心10min，收集上清，加2倍體積乙醇，室溫沉淀2min；13,000g離心10min，去上清并加入70％乙醇洗滌一次，再以13,000g離心2min，去盡上清并于室溫下開蓋晾干5min。最后加40μl無菌水溶解質(zhì)粒。
6差示篩選差減cDNA文庫第一輪差示篩選(1)質(zhì)粒樣品點膜挑取200個重組子編號，分別抽提質(zhì)粒，于每個小孔中加入1ul質(zhì)粒(200ng)/9ulH2O/10ul0.6N NaOH，混勻。(制備cDNA文庫的兩套重復拷貝膜)，做好記錄。室溫晾干30min，尼龍膜含DNA的一面朝上，漂浮置于0.5M Tris-HCl(pH7.5)中和液2-4min，于無菌水中漂洗，晾干，紫外照射固定。
(2)差示探針制備分別取正向差減雜交cDNA(以PBZ處理作Tester，非處理作Driver)和反向差減雜交cDNA(以非處理為Tester，以PBZ處理為Driver)的PCR擴增產(chǎn)物40ul(～400-1600ng)，PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收PCR產(chǎn)物。先后用RsaI(15units，37℃，1hr)，SmaI(10units，R.T，1hr)，EaeI(10units，37℃，1hr)酶切消化以充分去除cDNA分子兩端的接頭。酶切產(chǎn)物同樣用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收，即為差異篩選探針。探針標記采用隨機引物DNA標記系統(tǒng)。
(3)點雜交分別取約200ng正向差減cDNA和反向差減cDNA群體標記探針，兩種探針分別用來雜交同一cDNA文庫的兩套重復拷貝膜。點雜交采用-68℃條件(6xSSC/5xDenhardt’s/0.1％SDS/100ug/ml鮭精DNA)。洗膜條件為(2xSSC/0.5％SDS，68℃，4×20min；0.2xSSC/0.5％SDS，68℃，4×20min)。
第二輪差示篩選取初篩的cDNA重組子質(zhì)粒，以pGEM-T的一對通用引物T7/SP6擴增外源插入片斷。PCR體系為20ng質(zhì)粒模板/0.5uM SP6/1 unit Tag/200uM dNTPs/2ul 10xPCR反應緩沖液。PCR反應程序為94℃ 5min，60℃ 2min，72℃，2min，1個循環(huán)；95℃ 30s，60℃ 100s，72℃ 2min，30個循環(huán)；72℃延長7min。取3ulPCR產(chǎn)物，點樣于2％Agarose/EB/1xTAE，5V/cm電泳，轉膜(注制備兩套重復拷貝膜)。
分別取約100ng正向/反向差減cDNA群體制備放射性探針。兩種探針分別用來雜交PCR產(chǎn)物的兩套重復拷貝膜，雜交，洗膜條件同上。
7、Northern雜交分析(1)制備Northern雜交膜稱取一定量的瓊脂糖(在膠中的終濃度為1％)，加入適量水，加熱使瓊脂糖溶解，稍作冷卻后加入甲醛(終濃度2.2mol/L)和MOPS緩沖液(終濃度為1×)。在膠凝固期間處理RNA。每種RNA樣品取40μg，加入甲醛(終濃度2.2mol/L)、甲酰胺(終濃度為50％)，MOPS電泳緩沖液(終濃度0.5×)，混勻，置于65℃水浴15min，取出后迅速放在冰上靜置3min。樣品在加入上樣緩沖液后，上樣于甲醛變性膠，在4℃下1×MOPS緩沖液中按3-4V/cm的電壓走電泳。電泳留出一個泳道作EB染色，檢測電泳質(zhì)量并確定條帶位置。電泳進行約7h后結束。將膠取出，用DEPC水淋洗數(shù)次，放入20×SSC溶液中浸泡2次共45min去除甲醛。將凝膠中的RNA吸印轉移至Hybond-N尼龍膜，轉移約14h后結束。在膜上標記上樣孔位置后與凝膠剝離，放入6×SSC溶液中漂洗，晾干。然后在紫外交聯(lián)儀中使RNA交聯(lián)固定。
(2)Northern雜交探針取自隨機挑取復篩的cDNA重組子，T7/SP6擴增出插入子片段，玻璃粉法回收各片段，放射性同位素標記探針進行Northern雜交。選用的雜交與洗膜溫度為65℃。雜交后放射自顯影7天，洗片觀察。洗片后用煮沸的0.1％SDS溶液漂洗雜交膜1-3次，直至探針被完全洗下(通過測膜的放射性來驗證)。然后將膜與18S rRNA探針于68℃下雜交，最后洗膜時洗到0.1×SSC，放射自顯影2天。
(3)PCR擴增產(chǎn)物的電泳分離、膠回收與探針制備將PCR反應產(chǎn)物與1/6體積的6×上樣緩沖液混合，上樣于1％的瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液中90V電泳35分鐘。溴化乙錠(EB)染色后，于UV 312nm下將含有目的片段的凝膠割下置于1.5ml eppendorf，加3倍于凝膠體積的6mol/L NaI溶液，55℃水浴保溫3-5min使膠溶解。然后加入5μl玻璃粉懸濁液，振蕩混勻，于冰上放置5min。13,000g離心1min，去上清；加洗滌緩沖液200μl重懸玻璃粉，13,000g離心1min，去上清；如此重復洗滌2-3次后，去盡上清，55℃水浴保溫5min使殘留液體揮發(fā)。加15μl無菌水，振蕩混勻，靜置10min，13,000g離心1min，取上清即得所需DNA片段。
Northern雜交采用42℃條件下(5xSSC/5xDenhardt’s/1％SDS/100ug/ml鮭精DNA/50％(V/V)甲酰胺)，預雜交4hr，然后加入放射性標記探針，雜交16-24hr，洗膜條件2xSSC/0.5％SDS，室溫，2×5min；0.2xSSC/0.1％SDS，室溫，2×5min；0.2xSSC/0.1％SDS，42℃，2×15min；0.1xSSC/0.1％SDS，68℃，2×15min。
8、cDNA片段測序與BLAST分析PCR擴增產(chǎn)物的自動測序測序前先根據(jù)Plasmid Purification Kit的操作手冊抽提純化質(zhì)粒。細菌接種及培養(yǎng)方法同上。收集4ml菌液中所含的細胞于一個1.5ml離心管中。室溫下，每管加入250μl已包含RNA酶的溶液1，振蕩混勻菌體細胞，再加入250μl溶液2，快速混勻，室溫放置3min。之后加入350μl冰預冷的溶液3，顛倒離心管數(shù)次，冰上靜置5min。然后13，000g離心10min，將上清轉移至套有微型濾柱的另一離心管中。13,000g離心1min，此時質(zhì)粒附著于濾柱上。棄去套管中的液體；向濾柱內(nèi)加500μl溶液4，再以13,000g離心1min，棄去套管中的液體；向濾柱內(nèi)加700μl溶液5，13,000g離心1min，棄去套管中的液體；再離心一次使濾柱甩干。換一個干凈套管，往濾柱內(nèi)加100μl無菌水，13,000g離心1min，收集套管中的溶液，即得純化的質(zhì)粒。電泳鑒定質(zhì)粒的純度與濃度。
取300ng質(zhì)粒和測序引物(T7或SP6)加入到3μlBig Dye反應混合物中，補水至總體積為7.5μl，短暫離心后放入PCR儀，按以下程序進行測序反應96℃變性10s；再按96℃ 5s，50℃ 10s，60℃ 4min進行25個循環(huán)，反應結束后加入95％的乙醇30μl，振蕩混勻，置于冰上30min，4℃下以13,000g離心20min，去上清；加70％的乙醇100μl洗滌，4℃下以13,000g離心10min，去盡上清。4℃下開蓋晾干2h以上，加2μl上樣緩沖液溶解沉淀。上樣前先95℃變性2min，然后用ABI Prism 377 DNA自動測序儀進行核苷酸順序測定。
9、全長cDNA的分離鑒定(1)cDNA文庫雜交膜的制備接種大腸桿菌XL1-Blue MRF’于含有50μg/ml四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃下，240rpm培養(yǎng)過夜。次日將菌液以1∶100的比例接種于不含抗生素的50ml液體LB中，37℃下，300rpm培養(yǎng)至菌液O.D.600＝0.5，1000g離心，去上清，加入8ml 10mmol/L的硫酸鎂溶液重懸細胞。
取制備好的受體菌液5ml與包含至少一個根cDNA文庫量(2.7×105個噬菌體)的λZAP Express混合，37℃保溫15min使噬菌體充分吸附。取混合液0.7ml與48℃預熱的0.8％頂層瓊脂9ml混勻，迅速鋪在一塊37℃預熱的15cm LB平板上。一共鋪板7塊。待頂層瓊脂凝固后，將平板倒置于37℃培養(yǎng)過夜。
等噬菌斑長滿平板后把平板取出，4℃下放置2 h以上使平板表面變硬。取一張略小于平板的Hybond-N+尼龍膜覆蓋于平板表面，1min后揭下。將膜依次放入變性液(1.5MNaCl，0.5M NaOH)、中和液(1.5 MNaCl，0.5M pH7.4的Tris-Cl)和2×SSC溶液中處理3min，5min，1min后，置于干凈濾紙上晾干。再放入紫外交聯(lián)儀(Bio-Rad公司產(chǎn)品)以C3程序進行紫外交聯(lián)。
(2)cDNA克隆的篩選將制備好的雜交膜放入預雜交液(含有6×SSC，5×Denhart’s，0.5％SDS，100μg/ml變性小牛胸腺DNA)中，68℃預雜交1-2h，同時進行探針的放射性標記。
取實驗中制備的帶有PCR擴增片段的質(zhì)粒為模板，限制性酶切、膠電泳，并回收片段用于探針標記。取200ng回收片段，沸水浴中變性3min后迅速插在冰上冷卻。將變性過的DNA加入到含有下列成分的50μl體系中dCTP、dGTP、dTTP(終濃度各為20μmol/L)，[α-32P]dATP(終濃度333nmol/L，放射強度50μCi)，牛血清白蛋白(終濃度400mg/L)，Klenow酶(終濃度105U/L)。混勻后稍作離心，室溫下反應1-2h。標記反應完成后，加少許藍色葡聚糖，混勻。同時用滴管做一根簡易的Sephadex G-50層析柱。將反應液過柱，收集藍色組分。再將收集的液體沸水浴變性5min，迅速置于冰上冷卻，即得雜交探針。
預雜交結束后，將標好的探針加入到預雜交液中，68℃下雜交14h。完成后將雜交液倒出保存以便于下一輪篩庫使用。雜交膜依次用2×SSC，1×SSC，0.5×SSC(均含有0.1％的SDS)溶液于60℃漂洗。將膜取出，用紙巾吸去多余液體，再將膜用保鮮膜包好，測定放射強度。-70℃下放射自顯影，根據(jù)放射性的強弱，壓片時間在24小時至一星期不等。
洗片后，根據(jù)X光片上的黑色斑點，在平板上找出相應位置的噬菌斑，用無菌的滴管挖下，并放到含有1ml SM溶液和40μl氯仿的1.5ml的離心管中。振蕩打散后于4℃保存。取適量噬菌體懸液，按前文所述方法再進行兩輪篩選，直至得到純的噬菌體克隆。
(3)cDNA克隆pBK-CMV質(zhì)粒的切離接種大腸桿菌XLOLR于含有50μg/ml四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，240rpm培養(yǎng)過夜。次日將菌液以1∶100的比例接種于不含抗生素的50ml液體LB中，37℃，300rpm培養(yǎng)至菌液O.D.600＝1.0，備用。
將250-500μl篩選到的單噬斑懸液及1μl ExAssist輔助噬菌體加入到200μlXL1-Blue MRF’(O.D.600＝2.0)中，37℃保溫15min.加3ml LB液體培養(yǎng)基，搖床中37℃，240rpm培養(yǎng)2-2.5h，取出，置于70℃水浴15min，然后4000g離心5min，留上清。
將100μl上清液與新制備的XLOLR受體菌混合，37℃保溫15min。再加入300μl液體LB，搖床中37℃，240rpm培養(yǎng)45min。取出，涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。能夠在抗性平板上長出的菌落即含有pBK-CMV質(zhì)粒(帶有cDNA插入片段)。
(4)cDNA陽性克隆的鑒定與測序堿法抽提pBK-CMV質(zhì)粒，T3/T7引物作PCR鑒定插入片段大小。將插入片段插入到pBlueScript II SK+質(zhì)粒，利用位于pBlueScript II SK+質(zhì)粒多克隆位點兩側的T3/T7引物序列進行自動測序。
10、基因組文庫的篩選除噬菌體和受體菌分別換成了λEMBL 3和E.coli p2392外，從基因文庫中篩選到基因克隆的方法與篩選cDNA文庫的方法基本相同。
11、OsPIG-1基因的分離用上述方法篩選獲得11個PIG基因克隆。其中，噬菌體和受體菌分別為λEMBL 3和E.coli p2392，篩選到的陽性克隆不需作質(zhì)粒切離。
將分離獲得的陽性克隆進行擴增，以得到足夠的噬菌體。按上述的方法制備受體菌p2392的感受態(tài)。取105pfu的陽性λEMBL 3噬菌體與0.1ml受體菌混合，37℃吸附15min，加入3ml 0.7％頂層瓊脂并混勻后，倒入一塊新鮮的LB平板。37℃培養(yǎng)6-8h至噬菌斑長滿平板，加入5ml SM溶液，置于4℃數(shù)小時，間歇搖動，使噬菌體浸出。吸出SM，往平板上再加入1ml SM；平板斜放15min，將吸出的SM與第一次的合并。在收集的噬菌體液中加入0.1ml氯仿，輕微振蕩，4℃中以4000g離心10min，回收上清，加40μl氯仿，4℃保存。
以低復數(shù)感染法擴增噬菌體，經(jīng)甘油梯度離心純化后制備噬菌體DNA。先接種受體菌p2392的單菌落于50ml液體LB中，37℃、240 rpm培養(yǎng)過夜。次日根據(jù)菌液的OD600值，按1 OD＝8×108個細胞計算細菌濃度。取2份菌液，每份含有1010個細菌，4000g離心10min，去上清，加3ml SM重懸沉淀。兩份樣品中分別加入5×107和5×108pfu的重組噬菌體，37℃保溫20min，間或振蕩。再將每份樣品加入到250ml經(jīng)37℃預熱的液體LB中，37℃、300rpm培養(yǎng)8-12 h，直至細菌培養(yǎng)物接近完全裂解。再往菌液中加入5ml氯仿，繼續(xù)培養(yǎng)10min后將培養(yǎng)物取出。
培養(yǎng)物冷卻至室溫后，加入胰DNase I與胰RNase酶(終濃度均為1μg/ml)，室溫下消化30min。加入固體氯化鈉和固體聚乙二醇(PEG 6000)至終濃度分別為1mol/L和10％。待固體溶解后，冰浴1.5h使噬菌體沉淀。4℃下以11000g離心10min，棄上清，將噬菌體沉淀重懸于10ml TM溶液中(50mmol/L pH 7.8 Tris-Cl，10mmol/L MgSO4。)。向懸浮液中加入等體積氯仿，振蕩30s，4℃下以3000g離心15min，回收含噬菌體的水相。按下列步驟制備甘油分級梯度i)將3ml含40％甘油的TM溶液加入超離心管底部。
ii)在40％甘油-TM溶液上小心地鋪上4ml含有5％甘油的TM溶液。
iii)將噬菌體懸液小心地鋪在5％甘油-TM溶液的上面。
iv)將離心管的剩余空間用TM溶液加滿。4℃下，35000rpm超離心60min。棄上清，加入1ml TM溶液重懸沉淀。即得純化的重組噬菌體。
在噬菌體懸液中加入5μg胰DNA酶，1μg胰RNA酶，37℃消化30min。再加入0.5 mol/LpH 8.0的EDTA溶液40μl、蛋白酶K 50μg、10％SDS溶液50μl，混勻后于56℃保溫1h。消化液冷卻至室溫后，加入等體積的平衡酚(pH 8.0)，翻轉數(shù)次混勻。3000g離心5min，回收上層水相；再分別用等體積的1∶1的酚∶氯仿和24∶1的氯仿∶異戊醇抽提水相各一次。然后加入1/10體積的3mol/L pH 7.0的乙酸鈉溶液，2倍體積的無水乙醇，室溫放置30min。4℃下以13000g離心10min，棄上清并加入1ml 70％乙醇洗滌沉淀；再于4℃下以13000g離心2min，去盡上清。DNA沉淀室溫干燥后，加100μl pH 7.5的TE緩沖液溶解。
用Sal I等多種限制酶對重組λDNA作酶切分析，構建插入片段的物理圖譜。同時將電泳膠中的DNA酶切片段轉移至Hybond-N+膜，以文庫篩選所用的探針作Southern blot分析，確定OsPIG-1基因在插入片段中的位置。將各酶切片段插入到pBlueScript II SK+質(zhì)粒，構建亞克隆。以T3/T7引物進行測序，并將各亞克隆的核苷酸順序進行拼接，得到OsPIG-1全基因(SEQ ID No.1)。
12、OsPIG-1基因的BLAST分析，AtPIG-1啟動子的分離通過NCBI網(wǎng)站的BLAST分析，發(fā)現(xiàn)擬南芥中存在一個OsPIG-1基因的部分同源基因，同源區(qū)段的同源程度為84.75％(50/59，SEQ ID No.5)。文獻檢索還發(fā)現(xiàn)該基因位于擬南芥中SA/NPR1防御信號途徑上，該途徑上的部分基因可以被PBZ誘導增強表達。根據(jù)基因組數(shù)據(jù)庫的序列，設計出了兩對引物(SEQ ID No.6，SEQ ID No.7，SEQ ID No.8)，擴增出AtPIG-1基因的啟動子序列(SEQ ID No.3，SEQ ID No.4)。
ATG上游2132bp片段的擴增F5’GGACTCCAAGCAACGACG3’R5’GCTAATCAACGAAGAGACC3’PCR反應條件95℃，3min95℃ 40sec55.2℃ 30sec72℃ 80sec循環(huán)35次延伸 72℃ 5min將擴增出的片段回收，克隆(T-Vector)，轉化LB/Amp酶切鑒定，測序表明從兩頭測的結果與Genbank數(shù)據(jù)一致。
ATG上游1183bp片段的擴增FACTTAAAATCATACAAATCTTATCCR5’GCTAATCAACGAAGAGACC3’PCR反應條件95℃，3min95℃ 40sec52℃ 30sec72℃ 60sec
循環(huán)3次95℃ 40sec55℃ 30sec72℃ 60sec循環(huán)27次延伸 72℃ 5min回收、克隆、轉化、測序同上。
13、帶AtPIG-1啟動子的植物轉基因載體的構建與轉基因研究比較帶有AtPIG-1基因上游序列T載體和雙元轉基因載體pCAMBIA 1301(含GUS報告基因)上的酶切位點。分別挑選出合適的雙酶切組合，使載體上原有的CaMV 35S啟動子能被完全切除，且使酶切后的目的片段與載體片段有相同的粘性末端。分別使用Nco I、EcoR I雙酶切，可以獲得長度約2.1kb、1.1kb的AtPIG-1基因的上游調(diào)控順序(SEQ IDNo.1、2)。
酶切產(chǎn)物經(jīng)膠電泳回收后4℃b下連接過夜。次日將連接反應產(chǎn)物轉化大腸桿菌TOP 10感受態(tài)細胞，涂布于帶有合適抗生素(卡那霉素或氨芐青霉素)的LB平板上，37℃下培養(yǎng)14h。從平板上挑單菌落接種，37℃下培養(yǎng)過夜，堿法抽提質(zhì)粒，即得重組后的轉基因載體，分別包含兩種長度的AtPIG-1基因上游調(diào)控序列。
選用新鮮的洋蔥表皮為材料，取出靠近核心部分的瓣片，0.1％的HgCl消毒5min，再以無菌水洗滌。用鑷子撕下瓣片的內(nèi)表皮，平鋪于含0.7％瓊脂的GM培養(yǎng)基平板上(用于誘導組的平板內(nèi)含100mg/L的PBZ)。
稱取100mg金粉或鎢粉(顆粒直徑1.5-3.0μm)放入1.5ml離心管，加1ml無水乙醇，充分振蕩混勻；13000g離心1min，去上清。以1ml無菌水重懸沉淀，超聲處理1min，再以13000g離心1min，去上清。沉淀用無水乙醇洗滌數(shù)次后，重懸于1ml無水乙醇中。將金粉或鎢粉懸液振蕩混勻，吸取30μl，加入轉基因載體(濃度為1μg/μl)60μl和2.5mol/L氯化鈣溶液75μl，振蕩混勻。再加入0.1mol/L亞精胺30μl，振蕩混勻。冰浴20min，期間不時取出振蕩。13000g離心1min，棄上清；沉淀用乙醇洗滌兩次，重懸于30μl無水乙醇中。
在使用基因槍轉化前先用75％乙醇對基因槍(Bio-Rad公司產(chǎn)品)進行消毒。按Bio-Rad公司提供的操作規(guī)程，將帶有轉基因載體的金粉或鎢粉(每皿10μl金粉懸液)打入植物組織中。選用的氦氣壓力為1100kPa。
轉化后的洋蔥表皮在25℃下、白光中培養(yǎng)1天后切成1cm左右見方的小片，置于培養(yǎng)皿中，加入X-Gluc染色液，37℃下染色約5小時后觀察顯色結果，洋蔥表皮經(jīng)3％的甲醛溶液固定，在顯微鏡下拍照。
37℃下染色約5小時后，含上述AtPIG-1上游順序且經(jīng)PBZ誘導的實驗組均可以由肉眼觀察到藍色的斑點，為誘導表達的GUS蛋白與其底物作用的結果；而未誘導組沒有觀察到任何細胞內(nèi)藍色反應產(chǎn)物。該組結果說明，AtPIG-1基因的上游2.1kb、1.1kb的調(diào)控順序均可以誘導調(diào)控外源基因表達。
穩(wěn)定轉化后，在擬南芥葉片和根中也觀察到上述誘導表達效果。水稻中的誘導表達效果與上述類似。
本發(fā)明涉及的序列SEQ ID No1的信息長度2002堿基類型核酸鏈性單鏈拓撲結構線性分子類型cDNA序列描述SEQ ID No11 ccacgccgcg ccgcgacgcg acgcgccgtg gtcagctggt cgccggtgcg ggtgcgggtg61 cgcaatggag ccgccgacca gccacgtcac caacgcgttc tccgactcgg acagcgcgtc121 cgtggaggag gggggcgccg acgcggacgc cgacgtggag gcgctccgcc gcctctccga181 caacctcgcc gcggcgttcc gctcgcccga ggacttcgcg ttcctcgccg acgcgcgcat241 cgccgtcccg ggcggcggcg gcggcggcgg cgacctgctg gtgcaccgct gcgtgctctc301 cgcgcggagc cccttcctgc gcggcgtctt cgcgcgccgc gccgccgccg ccgcaggcgg361 cggcggcgag gatggcggcg agaggctgga gctccgggga ctcctcggcg gcggcggcga421 ggaggtggag gtcgggtacg aggcgctgcg gctggtgctc gactacctct acagcggccg481 cgtcggcgac ctgcccaagg cggcgtgcct ctgcgtcgac gaggactgcg cccacgtcgg541 gtgccacccc gccgtcgcgt tcatggcgca ggtcctcttc gccgcctcca ccttccaggt601 cgccgagctc accaacctct tccagcggcg tctccttgat gtccttgata aggttgaggt661 agataacctt ctattgatct tatctgttgc caacttatgc aacaaatctt gcatgaaact721 gcttgaaaga tgccttgata tggtagtccg gtcaaacctt gacatgatta ctcttgagaa781 gtcattgcct ccagatgtta tcaagcagat tattgatgca cgcctaagcc tcggattaat841 ttcaccagaa aacaagggat ttcctaacaa ccatgtgagg aggatacaca gagcccttga901 ctctgacgat gtagagctag tcaggatgct gctcactgaa ggacagacaa atcttgatga961 tgcgtttgca ctgcactacg ccgtcgaaca ttgtgactcc caaattacaa ccgagctttt1021 ggatctcgca cttgcagatg ttaatcatag aaacccaaga ggttatactg ttcttcacat1081 tgctgcgagg cgaagagagc ctaaaatcat tgtctccctt ttaaccaagg gggctcggcc1141 agcagatgtt acattcgatg ggagaaaagg ggttcaaatc tcaaaaagac taacaaaaca1201 aggggattac tttggggtta ccgaagaagg aaaaccttct ccaaaagata ggttatgtat1261 tgaaatactg gagcaagctg aaagaaggga cccacaactc ggagaagcat cagtttctct1321 tgcaatggca ggtgagagtc tacgaggaag gttgctgtat cttgaaaacc gagttgcttt1381 ggcgaggatt atgtttccga tggaggcaag agtagcaatg gatattgctc aagtggatgg1441 aactttggaa tttaacctgg gttctggtgc aaatccacct cctgaaagac aacggacaac1501 tgttgatcta aatgaaagtc ctttcataat gaaagaagaa cacttagctc ggatgacggc1561 actctccaaa acagtggagc tcgggaaacg ctttttcccg cgatgttcga acgtgctcga1621 caagatcatg gatgatgaaa ctgatccggt ttccctcgga agagacacgt ccgcggagaa
1681 gaggaagagg tttcatgacc tgcaggatgt tcttcagaag gcattccacg aggacaagga1741 ggagaatgac aggtcggggc tctcgtcgtc gtcgtcatcg acatcgatcg gggccattcg1801 accaaggaga tgaacaccat tgctcccaaa tagttgccat attgatagct aactgtcctc1861 ctggagctct cacctgtggt tgccttctgt caaaaaaaaa aaSEQ ID No2的信息長度4294堿基類型核酸鏈性單鏈拓撲結構線性分子類型(AtPIG-1全基因)基因組DNA序列描述SEQ ID No2AAGATCAAGAAGATGTTCACGAGTTATGGGTTTTAAAGAGCAGTTTTGAAAAGTCGTGGGTTAAAGTGAAAGATATTAAAAGCATTGGAGTAGATTTGATTACGTGGACTCCAAGCAACGACGTTGTATTGTTTCGTAGTAGTGATCGTGGTTGCCTCTACAACATAAACGCAGAGAAGTTGAATTTAGTTTATGCAAAAAAAGAGGGATCTGATTGTTCTTTCGTTTGTTTTCCGTTTTGTTCTGATTACGAGAGGGTTGATCTGAACGGAAGAAGCAACGGGCCGACACTTTAAAAAAAAAATAAAAAAAATGGGCCGACAAATGCAAACGTAGTTGACAAGGATCTCAAGTCTCAAGTCTCAATTGGCTCGCTCATTGTGGGGCATAAATATATCTAGTGATGTTTAATTGTTTTTTATAAGGTAAAAAGGAATATTGAATTTTGTTTCTTAGGTTTATGTAATAATACCAAACATTGTTTTATGAATATTTAATCTGATTTTTTGGCTAGTTATTTTATTATATCAAGGGTTCCTGTTTATAGTTGAAAACAGTTACTGTATAGAAAATAGTGTCCCAATTTTCTCTCTTAAATAATATATTAGTTAATAAAAGATATTTTAATATATTAGATATACAATAATATCTAAAGCAACACATATTTAGACACAACACGTAATATCTTACTATTGTTTACATATATTTATAGCTTACCAATATAACCCGTATCTATGTTTTATAAGCTTTTATACAATATATGTACGGTATGCTGTCCACGTATATATATTCTCCAAAAAAAACGCATGGTACACAAAATTTATTAAATATTTGGCAATTGGGTGTTTATCTAAAGTTTATCACAATATTTATCAACTATAATAGATGGTAGAAGATAAAAAAATTATATCAGATTGATTCAATTAAATTTTATAATATATCATTTTAAAAAATTAATTAAAAGAAAACTATTTCATAAAATTGTTCAAAAGATAATTAGTAAAATTAATTAAATATGTGATGCTATTGAGTTATAGAGAGTTATTGTAAATTTACTTAAAATCATACAAATCTTATCCTAATTTAACTTATCATTTAAGAAATACAAAAGTAAAAAACGCGGAAAGCAATAATTTATTTACCTTATTATAACTCCTATATAAAGTACTCTGTTTATTCAACATAATCTTACGTTGTTGTATTCATAGGCATCTTTAACCTATCTTTTCATTTTCTGATCTCGATCGTTTTCGATCCAACAAAATGAGTCTACCGGTGAGGAACCAAGAGGTGATTATGCAGATTCCTTCTTCTTCTCAGTTTCCAGCAACATCGAGTCCGGAAAACACCAATCAAGTGAAGGATGAGCCAAATTTGTTTAGACGTGTTATGAATTTGCTTTTACGTCGTAGTTATTGAAAAAGCTGATTTATCGCATGATTCAGAACGAGAAGTTGAAGGCAAATAACTAAAGAAGTCTTTTATATGTATACAATAATTGTTTTTAAATCAAATCCTAATTAAAAAAATATATTCATTATGACTTTCATGTTTTTAATGTAATTTATTCCTATATCTATAATGATTTTGTTGTGAAGAGCGTTTTCATTTGCTATAGAACAAGGAGAATAGTTCCAGGAAATATTCGACTTGATTTAATTATAGTGTAAACATGCTGAACACTGAAAATTACTTTTTCAATAAACGAAAAATATAATATACATTACAAAACTTATGTGAATAAAGCATGAAACTTAATATACGTTCCCTTTATCATTTTACTTCAAAGAAAATAAACAGAAATGTAACTTTCACATGTAAATCTAATTCTTAAATTTAAAAAATAATATTTATATATTTATATGAAAATAACGAACCGGATGAAAAATAAATTTTATATATTTATATCATCTCCAAATCTAGTTTGGTTCAGGGGCTTACCGAACCGGATTGAACTTCTCATATACAAAAATTAGCAACACAAAATGTCTCCGGTATAAATACTAACATTTATAACCCGAACCGGTTTAGCTTCCTGTTATATCTTTTTAAAAAAGATCTCTGACAAAGATTCCTTTCCTGGAAATTTACCGGTTTTGGTGAAATGTAAACCGTGGGACGAGGATGCTTCTTCATATCTCACCACCACTCTCGTTGACTTGACTTGGCTCTGCTCGTCAATGGTTATCTTCGATCTTTAACCAAATCCAGTTGATAAGGTCTCTTCGTTGATTAGCAGAGATCTCTTTAATTTGTGAATTTCAATTCATGGGAACCTGTTGATGGACAC CACCATTGAT GGATTCGCCGATTCTTATGAAATCAGCAGC ACTAGTTTCG TCGCTACCGA TAACACCGAC TCCTGTATTG TTTATCTGGC CGCCGAACAA GTACTCACGG GACCTGATGTATCTGCTCTG CAATTGCTCT CCAACAGCTT CGAATCCGTC TTTGACTCGC CGGATGATTT CTACAGCGAC GCTAAGCTTG TTCTCTCCGACGGCCGGGAA GTTTGTTTCC ACCGGTGCGT TTTGTCAGCG AGAAGCTCTT TCTTCAAGAG CGCTTTAGCC GCCGCTAAGA AGGAGAAAGACTCCAACAAC ACCGCCGCCG TGAAGCTCGA GCTTAAGGAG ATTGCCAAGG ATTACGAAGT GGGTTTCGAT TCGGTTGTGA CTGTTTTGGCTTATGTTTAC AGCAGCAGAG TGAGACCGCC GCCTAAAGGA GTTTCTGAAT GCGCAGACGA CAATTGCTGC CACGTGGCTT GCCGGCCGGCGGTGGATTTC ATGTTGGAGG TTCTCTATTT GGCTTTCATC TTCAAGATCC GTGAATTAAT TACTCTCTAT CAGAGGCACT TATTGGACGTTGTAGACAAA GTTGTTATAG AGGACACATT GGTTATACTC AAGCTTGCTA ATATATGTGG TAAAGGTTGT ATGAAGCTAT TGGATAGATGTAAAGAGATT ATTGTCAAGT CTAATGTAGA TATGGTTAGT CTTGAAAAGT CATTGCCGGA AGAGCTTGTT AAAGAGATAA TTGATAGACG
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SEQ ID No6的信息長度19堿基類型核酸鏈性單鏈拓撲結構線性分子類型寡核苷酸序列描述SEQ ID No6R5′GCTAATCAACGAAGAGACC3′SEQ ID No7的信息長度18堿基類型核酸鏈性單鏈拓撲結構線性分子類型寡核苷酸序列描述SEQ ID No7F5’GGACTCCAAGCAACGACG 3’SEQ ID No8的信息長度25堿基類型核酸鏈性單鏈拓撲結構線性分子類型寡核苷酸序列描述SEQ ID No8FACTTAAAATCATACAAATCTTATCC
權利要求
1.一種基因組DNA分子序列，其特征在于，它調(diào)控SEQ ID No2 cDNA表達的基因5’上游SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4核苷酸序列，這些序列包含受PBZ誘導的調(diào)控元件和不同的組織特異性表達元件。
2.一組載體，其特征在于它們含有權利要求1所述的核苷酸序列作為啟動子。
3.根據(jù)權利要求2所述的載體，其特征在于該載體可轉化植物，它包含一個核酸啟動子片段、與該啟動子相連編碼特定目的基因的DNA順序及合適的3’下游序列，使轉化該重組載體后的植物在化合物PBZ的作用下，特定目的基因產(chǎn)物水平上升。
4.根據(jù)權利要求2所述的載體，其特征在于所述的目的基因有編碼GUS的基因，編碼抗病基因如白葉枯病、稻瘟病等抗性基因，編碼抗昆蟲的基因，編碼蛋白酶抑制劑基因，編碼Bacillus thuringenesis昆蟲內(nèi)毒素的基因，編碼植物乙烯生物合成酶的基因，編碼植物激素生物合成酶的基因，編碼雄性不育/育性表型的基因，編碼鈣調(diào)素基因，編碼各種疫苗基因，以及編碼各種藥用或食用成分基因。
5.一種權利要求1的DNA分子序列轉化的植物，其特征在于這種轉基因植物用化合物PBZ處理引起編碼目的基因產(chǎn)物的DNA序列表達增高，該DNA序列經(jīng)操作連接在所述啟動子片段的3’端。
6.一種由權利要求5所述的轉基因植物的種子。
7.一種在植物中引起所選擇的基因產(chǎn)物表達增高的方法，其特征在于具體步驟如下a)用權利要求1所述的重組DNA結構轉化植物；b)用化合物PBZ處理轉基因植物；c)使轉基因植物在期望的時期增加所選擇的基因產(chǎn)物的表達。
全文摘要
本發(fā)明為一種受植物系統(tǒng)獲得性抗性誘導劑誘導的啟動子及其應用，屬植物分子生物學和基因工程技術領域，具體涉及一種分離和利用核酸的啟動子片段，該啟動子來源于擬南芥等植物中對PBZ及其相關化合物敏感的一些基因。將編碼所希望的目的產(chǎn)物基因的核酸序列和一個上述啟動子片段融合得到重組DNA，用這種重組DNA轉化植物，將得到新的轉基因植物。在新的植物中該重組DNA中的目的基因的表達受PBZ的化學誘導調(diào)控。
文檔編號A01H5/00GK1537944SQ20031010812
公開日2004年10月20日 申請日期2003年10月23日 優(yōu)先權日2003年10月23日
發(fā)明者蒯本科, 趙慧芳, 顧華, 王喜萍, 趙向輝 申請人:復旦大學