專利名稱：棉花雜交育種的純合顯性雄性不育系、高效恢復(fù)系載體和兩系法育種的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工廠領(lǐng)域，涉及利用植物基因工程技術(shù)進(jìn)行植物雄性不育系的人工創(chuàng)建為作物雜種優(yōu)勢(shì)的利用提供了一種有效的手段。具體地講本發(fā)明還提供了一種利用純合顯性雄性不育系和高效恢復(fù)系載體進(jìn)行棉花雜交種子制備的兩系法育種技術(shù)。
背景技術(shù)：
植物雜種優(yōu)勢(shì)的利用可大幅度地提高作物產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。棉花雜種F1代具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，然而由于棉花是典型的自花授粉植物，其雜種優(yōu)勢(shì)的利用及雜交種的制備有賴于其雄性不育系的培育。長期以來，由于缺乏理想的三系配套材料，其雜交種子的制備主要依賴于人工去雄所完成。然而，由于人工去雄授粉的勞動(dòng)成本高且難以保證去雄的徹底性，給雜交育種工作帶來了很大困難，使得棉花雜種優(yōu)勢(shì)的利用在很大程度上受到了限制。隨著基因工程技術(shù)在農(nóng)業(yè)中的廣泛應(yīng)用以及對(duì)花藥組織特異表達(dá)基因的深入研究，利用植物基因工程技術(shù)進(jìn)行植物雄性不育系的人工創(chuàng)建為作物雜種優(yōu)勢(shì)的利用提供了一種有效的手段。
在通過植物基因工程技術(shù)進(jìn)行雄性不育人工育種體系的創(chuàng)建策略中，Mariani(1990 Nature 347737，1992 Nature.357384.)等報(bào)道了利用花藥特異啟動(dòng)子在花藥中特異表達(dá)Barnase和Barstar基因分別獲得不育系和恢復(fù)系。目前也先后公布了一些有關(guān)的專利(EP0,344,029，WO 92/13956，WO 92/13957，EP 0,412,911)。然而，由于這些方法產(chǎn)生的不育系需要與其原始材料進(jìn)行回交并利用不育基因與抗除草劑基因的連鎖通過噴施除草劑殺死50％可育植株才可是育性得到保持，給不育系的繁育和制種帶來了一定的困難。另外，其育性恢復(fù)是通過利用不育基因Barnase(BN)的抑制劑Barstar(BS)抑制BN的活性而實(shí)現(xiàn)的，是一種蛋白質(zhì)水平的作用，常受到BS的表達(dá)水平、表達(dá)后蛋白折疊等因素的影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的一是為了克服目前植物基因工程雄性不育人工育種體系的不足，提供一種可獲得純合顯性雄性不育系的植物表達(dá)載體。二是提供一種RNA水平上破壞不育基因表達(dá)的棉花雄性不育高效恢復(fù)系植物表達(dá)載體。
本發(fā)明的另一目的是提供一種利用本發(fā)明的純合顯性雄性不育系植物表達(dá)載體和高效恢復(fù)系植物表達(dá)載體進(jìn)行的兩系法雜交育種技術(shù)。
本發(fā)明提供了一種由Seq ID No.7所示GST-27啟動(dòng)子序列、Seq ID No.4所示BS編碼序列、Nos終止子序列組成的可通過使用Safener使不育基因暫時(shí)失活從而獲得純和顯性雄性不育系的開關(guān)基因GBS，其序列如Seq ID No.8所示。
本發(fā)明提供了一種由Seq ID No.5 TA29啟動(dòng)子序列、Seq ID No.1BN基因序列、Nos終止子組成控制不育性狀的不育基因TBN，其序列如Seq IDNo.9所示。
本發(fā)明提供了一種由開關(guān)基因GBS、不育基因TBN組成的可獲得純合顯性雄性不育的嵌合基因TBN-GBS，其序列由Seq ID No.9和Seq ID No.8組成。
本發(fā)明提供了一種含有純合顯性雄性不育嵌合基因的植物雄性不育表達(dá)載體pBin19TN-GSS，如圖1所示。
本發(fā)明的植物雄性不育表達(dá)載體可以是本發(fā)明中構(gòu)建的pBin19TN-GSS，也可以是含有本發(fā)明中純合顯性雄性不育嵌合基因TBN-GBS的其它植物表達(dá)載體。
本發(fā)明提供了一種由Seq ID No.6所示的A9啟動(dòng)子、去除了起始密碼子的BN基因正義鏈如Seq ID No.2、反義鏈Seq ID No.3、內(nèi)含子、OCS終止子組成的。在RNA水平上破壞不育基因表達(dá)的雄性不育育性恢復(fù)基因AdsBN，其核苷酸序列由Seq ID No.6、Seq ID No.2和Seq ID No.3組成。
本發(fā)明提供了一種含有本發(fā)明的雄性不育育性恢復(fù)基因AdsBN的植物雄性不育高效恢復(fù)系表達(dá)載體p3300ND，如圖2所示。
本發(fā)明的植物雄性不育育性恢復(fù)基因表達(dá)載體可以是本發(fā)明中構(gòu)建的p3300ND，也可以是含有本發(fā)明中雄性不育育性恢復(fù)基因AdsBN的其它植物表達(dá)載體。
本發(fā)明提供了一種利用純合顯性植物雄性不育表達(dá)載體pBin19TN-GSS和植物雄性不育高效恢復(fù)系表達(dá)載體p3300ND進(jìn)行棉花雜交種子制備的兩系法育種技術(shù)。
將本發(fā)明的純合顯性植物雄性不育表達(dá)載體Bin19TN-GSS載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或基因搶轉(zhuǎn)化法獲得的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為花絲變短、柱頭突出、花粉敗育，自然生長條件下自交不實(shí)等生物學(xué)形狀，在花期噴施Safener可使育性恢復(fù)進(jìn)行自交得到純合顯性的雄性不育系。
將本發(fā)明的雄性不育高效恢復(fù)系植物表達(dá)載體p3300ND利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法或基因搶轉(zhuǎn)化法獲得的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為育性良好，能進(jìn)行正常的自交結(jié)實(shí)，對(duì)其自交結(jié)實(shí)后代在苗期通過噴施5×10-5mol/L的草丁膦除去非轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行多代的自交和草丁膦選擇獲純和的雄性不育恢復(fù)系。
將通過本發(fā)明獲得的不育系和恢復(fù)系雜交即可進(jìn)行雜交種子的制備，將含有本發(fā)明的雄性不育嵌合基因TBN-GBS、高效育性恢復(fù)基因AdsBN的植株與其它品種雜交可將其不育形狀和育性恢復(fù)形狀進(jìn)行轉(zhuǎn)育，獲得新的育種材料。


圖1.純合顯性雄性不育的植物表達(dá)載體圖2.高效恢復(fù)系的新型植物表達(dá)載體具體實(shí)施方式
為了更好的理解本發(fā)明，通過以下實(shí)施例予以進(jìn)一步地說明，但并非限定本發(fā)明。
實(shí)施例1不育基因Barnase(BN)及其抑制蛋白基因Brstar(BS)的克隆
(1)核酸酶BN基因的克隆根據(jù)Paddon，C.J等人的資料，以BN-I 5’-CgggTACCATggCACAggTTATCAAC-3’和BN-II 5’-TCTAgAgCTCgAgTTATCTgATCTTTgTAAAgg-3’為引物，以HindIII酶切的Bacillus amyloliquefaciens(中科院微生物所保藏)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為94℃變性5分鐘，94℃45秒52℃45秒72℃ 1分30秒30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHI和SacI雙酶切處理后，與pUC載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109(TaKaRa公司)后得到帶有BN基因的載體pUC-BN，經(jīng)測(cè)序，BN基因的核苷酸序列如Seq.ID No.1所示。
(2)用于恢復(fù)系基因構(gòu)建BN片斷的克隆根據(jù)Paddon，C.J等人的資料，以PBN-I 5’-AAgCTTggTACCACACgTTTgACggggTT-3’和PBN-II 5’-TCTAgAgCTCgAgTTATCTgATCTTTgTAAAgg-3’為引物，以HindIII酶切的Bacillus amyloliquefaciens(中科院微生物所保藏)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為94℃變性5分鐘，94℃45秒52℃45秒72℃ 1分30秒30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)與pGEM T-vector(TaKaRa公司)連接，BN-正義鏈的序列如Seq.ID No.2所示。
(3)不育基因抑制蛋白Brstar(BS)基因的克隆根據(jù)Hatley等人的資料，以BS-I 5′-CgggATCCATggggAAAAAAgCAgTCATTCgg-3’和BS-II 5′-gCgAgCTCTTAAgAAAgTATgATggTgATgTC-3’為引物，以HindIII酶切的Bacillus amyloliquefaciens(中科院微生物所保藏)基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為94℃變性5分鐘，94℃45秒50℃45秒72℃ 1分30秒30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)BamH I和SacI雙酶切處理后，與pUC T-vector(TaKaRa公司)載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109(TaKaRa公司)后得到帶有BS基因的載體pUCT-vector-BS，序列如Seq.ID No.4所示。
實(shí)施例2TA29、A9、GST27啟動(dòng)子的克隆
(1)煙草花藥特異啟動(dòng)子TA29的克隆根據(jù)Seunick，J等人的資料，以PTA29-I 5′-CgggATCCATCTAgCTAAgTATAACTg-3’和PTA29-II 5′-CATgCCATggTAgCTAATTTCTTTAAg-3’為引物、EcoRI和HindIII酶切的沙拇遜煙草基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為94℃變性5分鐘，94℃45秒54℃ 60秒72℃ 1分30秒30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10分鐘?；厥仗禺愋詳U(kuò)增的DNA片段。TA29序列如Seq.ID No.5所示。
(2)擬南芥花藥特異啟動(dòng)子A9的克隆根據(jù)Diane，L.H等人(1993)和Wyatt，P等人(1992)報(bào)道的擬南芥花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子A9序列，以PA9-I 5′-gAgCTCgCggCCgCAAACAAACCATgTgTTACC-3′和PA9-II 5′-CTCgAgCCATggTAATTAgATACTATATTg-3’為A9的引物；提取的擬南芥WS生態(tài)型(Arabidopsis thaliana)總DNA用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為94℃變性5分鐘，94℃ 60秒51℃45秒72℃ 1分30秒30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物與pUC18 T-vector(TaKaRa公司)相連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109(TaKaRa公司)后得到帶有A9的載體pT-vectorA9。A9啟動(dòng)子序列如Seq.ID No.6所示。
(3)化學(xué)誘導(dǎo)啟動(dòng)子GST27的克隆根據(jù)Kriete等(1996)等人的資料，PG-I 5′-gAATTCCTgAATAgACgAATAACCC-3’和PG-II 5′-ggATCCATggTgTgTgCAgCTCCTgCC-3’為引物、玉米芽總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR條件為94℃變性5分鐘，94℃ 60秒55℃45秒72℃ 1分30秒30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10分鐘?；厥仗禺愋詳U(kuò)增的DNA片段。GST27啟動(dòng)子的序列如Seq.ID No.7所示。
實(shí)施例3.
用于植物雄性不育的可以化學(xué)誘導(dǎo)純合的新型植物表達(dá)載體的構(gòu)建(1)TA29-BN cassette1)用BamH I和Nco I酶切pTvector-TA29并回收TA29片段，與同樣用BamH I和Nco I酶切并回收的pUCBN質(zhì)粒載體連接，構(gòu)成pUCTABN。
2)再用BamH I和Sac I酶切pUCTABN并回收TA29BN小片段，與同樣用BamHI和Sac I酶切的Rok II(中科院微生物所)(帶有35S)質(zhì)粒載體連接，構(gòu)成Rok35sTN。
3)再用BamH I和Sac I酶切Rok35sTN并回收TA29BN(含Nos終止子)小片段，與同樣用BamH I和Sac I酶切并回收的pBin 19(中科院微生物所)(RB和LB)質(zhì)粒載體連接，構(gòu)成pB19TN。
(2)GST inducible cassette1)用Xba I和BamH I酶切7Z-GST并回收GST小片段，與同樣用Xba I和BamHI酶切并回收的pUC35Snos質(zhì)粒載體連接，構(gòu)成pUC35S-GSTBnos。
2)pUC35S-GSTBnos經(jīng)Hind III和Xba I雙酶切再用Klenow酶切連接得到去了35S片段的pGSTnos。
3)用BamH I和Sac I酶切Tvector BS并回收BS小片段，與同樣用BamH I和Sac I酶切的pGSTnos載體連接，構(gòu)成pGSTBSnos。
(3)pBin19TNGS的構(gòu)建用EcoR I酶切pGSTBSnos并回收小片段，與同樣用EcoR I酶切的pB19TN載體連接，構(gòu)成pBin19TN-GS，如圖1所示。
實(shí)施例4.
用于植物雄性不育的高效恢復(fù)系的新型植物表達(dá)載體p3300ND的構(gòu)建1)用Sac I和Xho I酶切pT-vectorA9并回收A9片段，與用Sac I和Xho I酶切的質(zhì)粒pHANNIBAL(Plant Journal，2001，27(6)581-590)回收的載體連接，構(gòu)成pHAN-A9。
2)用Kpn I和Xho I酶切pGEMT-vectorBN-silence質(zhì)粒并回收BN片段，與Kpn I和Xho I酶切的pHAN-A9連接，構(gòu)成pHAN-A9BN。
3)用HindIII和Xba I酶切pGEMT-vectorBN-silence質(zhì)粒并回收BN片段，與Kpn I和Xho I酶切的pHAN-A9BN連接，構(gòu)成pHAN-A9BNBN。
4)用Pst I和Sac I酶切pHAN-A9BNBN并回收0.7kb的小片段，與PstI和Sac I酶切的pCAMBIA3300連接，構(gòu)成p3300ps-sc。
5)用Sac I酶切pHAN-A9BNBN并回收2kb的小片段，與Sac I酶切的p3300ps-sc連接并鑒定方向，最終得到用于植物雄性不育的高效恢復(fù)系的新型植物表達(dá)載體p3300ND，如附圖2所示。
實(shí)施例5.
棉花的遺傳轉(zhuǎn)化和植株再生與繁育(1)供轉(zhuǎn)化棉花品種和菌株用于轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株為LBA4404(pBin19TN-GSS)(本發(fā)明提供)，LBA4404(p3300ND)(本發(fā)明提供)，供試棉花品種為晉棉7號(hào)、柯字312、柯字201以及ZMJI、ZMJ2、ZMJ3、ZMJ4、ZMJ6。
(2)外植體的準(zhǔn)備棉花種子經(jīng)硫酸脫絨后，用70％的酒精浸泡1分鐘，再放入30％的過氧化氫中消毒2~3小時(shí)，用無菌水沖洗3遍后，浸泡在三角瓶中過夜。次日種子露白后接種于種苗培養(yǎng)基上(1/2MS無機(jī)鹽，0.22％的Phytogel，pH6.5)。在25□，2000LX的光照強(qiáng)度下培養(yǎng)5~7天，得到供試的無菌苗，以無菌苗的下胚軸作為轉(zhuǎn)化的外植體。
(3)外源基因的轉(zhuǎn)化與植株再生取5天苗齡的無菌苗的下胚軸，切成5~10毫米的切段，浸泡于從液體培養(yǎng)基里懸浮的OD0.4左右的菌液中10~15分鐘，接種到鋪有濾紙的MS固體培養(yǎng)基上，共培養(yǎng)48小時(shí)后，再把其轉(zhuǎn)到誘導(dǎo)與篩選愈傷組織培養(yǎng)基(MS無機(jī)鹽，10毫克/升VB1，1毫克/升VB6，1毫克/升VPP，0.1毫克/升2，4-D，0.1毫克/升KT，30克/升葡萄糖，0.22％的Phytogel，Km 50mg/L(對(duì)于LBA4404(pBin19TN-GSS))或PPT 5×10-5mol/L(對(duì)于，LBA4404(p3300ND))，500毫克/升頭孢霉素，pH6.5)上，在28□，光強(qiáng)2000 LX的條件下培養(yǎng)。
外植體在誘導(dǎo)與篩選培養(yǎng)基上得到的轉(zhuǎn)化愈傷組織長到蠶豆大小時(shí)可轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基(MS無機(jī)鹽，10毫克/升VB1，1毫克/升VB6，1毫克/升VPP，1.9克/升KNO3，30克/升葡萄糖，0.22％的Phytogel pH 6.5)，在分化培養(yǎng)基上繼代數(shù)次后，可看到胚的形成。將分化良好的胚狀體轉(zhuǎn)到成苗培養(yǎng)基(將分化培養(yǎng)基中的NH4NO3去掉，另加1克/升谷氨酰胺，0.5克/升天冬素)上，繼續(xù)發(fā)育得到再生植株。
(4)再生株的繁殖采用劈接法，大田推廣品種為砧木，轉(zhuǎn)化再生株為接穗。選5~6厘米高、并具有6~7片真葉的轉(zhuǎn)化株作為接穗，用手術(shù)刀片將其莖基部削成馬蹄型。同時(shí)將長有4~5片真葉的砧木削去其頂端部分，只保留2~3片真葉，然后從中間縱向切開1~2厘米，將削成馬蹄型的接穗直接插入，使接穗和砧木對(duì)齊。并用細(xì)塑料繩纏緊。最后將花盆一次澆足水，并扣上2升燒杯，周圍用土埋嚴(yán)，避免陽光直射。7天后將燒杯打開2公分通氣，10天后完全去掉燒杯，鍛煉2周后直接將盆移入大田。
本發(fā)明的棉花遺傳轉(zhuǎn)化再生株的繁育工藝可使轉(zhuǎn)化出愈率可平均達(dá)40％甚至60％；再生植株的基因轉(zhuǎn)化率達(dá)30％~60％，再生株成苗率可達(dá)90％以上，比再生苗直接移栽可提高長活率2~3倍。
實(shí)施例6.
轉(zhuǎn)基因棉花的分子生物學(xué)檢測(cè)(1)棉花總DNA的提取取100mg棉花葉片，加20μl巰基乙醇，加液氮研磨，迅速將植物組織粉末裝于1.5ml Eppendorff管中，加入600μl 2×CTAB提取液，搖勻，置于65□水浴中30分鐘，期間不時(shí)搖動(dòng)。加入700μl酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)，并搖動(dòng)至溶液呈乳化狀態(tài)，12000rpm離心5分鐘。加入2倍體積無水乙醇，混勻后于-20□沉淀過夜，12000rpm離心1分鐘收集沉淀，70％的乙醇洗沉淀，空氣干燥，溶于50μl TE中備用。
(2)PCR檢測(cè)將提取的棉花總DNA稀釋100-1000倍，取1μl按標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增反應(yīng)方法進(jìn)行檢測(cè)。PCR條件為94℃變性5分鐘，94℃ 60秒55℃45秒72℃ 1分30秒30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10分鐘。
(3)Southern檢測(cè)將提取的植物總DNA加入等體積的0.8M的NaOH/20mM EDTA中，100□煮沸10分鐘后通過真空點(diǎn)膜器點(diǎn)到Zeta-prob尼龍膜上，6watt的紫外燈相距1厘米照射濕膜15秒鐘使DNA片段固定。將用地高辛標(biāo)記的探針與膜上DNA雜交，之后和抗地高辛的抗體反應(yīng)，清洗后進(jìn)行ISPD化學(xué)發(fā)光檢測(cè)(具體操作見Roche公司的DIG-High Prime DNA Labeling andDetection Starter Kit II試劑盒說明書)。
實(shí)施例7.
轉(zhuǎn)基因棉花雄性不育系的生物學(xué)測(cè)定轉(zhuǎn)基因棉花雄性不育棉花植株表現(xiàn)出了花絲變短、柱頭相對(duì)突出，花藥干癟等明顯的雄性不育花的特征。以0.5％的碘化鉀花粉進(jìn)行染色，結(jié)果表明其花粉的代謝活力很低，并表現(xiàn)出了明顯的自交不結(jié)實(shí)現(xiàn)象。
實(shí)施例8.
轉(zhuǎn)基因棉花顯性純和雄性不育系的獲得通過本專利獲得的轉(zhuǎn)基因棉花雄性不育系通過在開花前和花期噴灑5×10-5mol/L的Safener可使轉(zhuǎn)基因雄性不育系誘導(dǎo)為可育，通過自交保持并進(jìn)一步純合。
實(shí)施例9.
轉(zhuǎn)基因高效恢復(fù)系的的自交純合經(jīng)本方法獲得的轉(zhuǎn)基因棉花雄性轉(zhuǎn)基因高效恢復(fù)系自交結(jié)實(shí)，其雜交后代通過噴灑5×10-5mol/L的ppt可除去非轉(zhuǎn)基因植株而使轉(zhuǎn)基因高效恢復(fù)系得以保留，進(jìn)一步獲得純合的轉(zhuǎn)基因高效恢復(fù)系。
實(shí)施例10.
轉(zhuǎn)基因棉花不育基因和恢復(fù)基因的轉(zhuǎn)育通過本發(fā)明獲得的雄性不育系及高效恢復(fù)系可通過常規(guī)的雜交技術(shù)轉(zhuǎn)育到其它目的材料。
實(shí)施例11.
利用兩系法育種體系進(jìn)行的雜交種子制備將獲得的純和顯性雄性不育系和純和的高效恢復(fù)系按4∶1比例分行種植，常規(guī)管理，從不育系材料上收獲種子，即可得到具有雜種優(yōu)勢(shì)并帶有抗除草劑ppt的雜交種子用于生產(chǎn)。
序列表<110>中國科學(xué)院微生物研究所<120>棉花雜交育種的純合顯性雄性不育系、高效恢復(fù)系載體和兩系法育種<130>
<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>339<212>DNA<213>Bacillus amyloliquefaciens<400>1ggtaccatgg cacaggttat caacacgttt gacggggttg cggattatct tcagacatat 60cataagctac ctgataatta cattacaaaa tcagaagcac aagccctcgg ctgggtggca120aaagggaacc ttgcagacgt cgctccgggg aaaagcatcg gcggagacat cttctcaaac180agggaaggca aactcccggg caaaagcgga cgaacatggc gtgaagcgga tattaactat240acatcaggct tcagaaattc agaccggatt ctttactcaa gcgactggct gatttacaaa300acaacggacc attatcagac ctttacaaag atcagataa 339<210>2<211>342<212>DNA<213>Bacillus amyloliquefaciens<400>2aagcttggta ccacacgttt gacggggttg cggattatct tcagacatat cataagctac 60ctgataatta cattacaaaa tcagaagcac aagccctcgg ctgggtggca aaagggaacc120ttgcagacgt cgctccgggg aaaagcatcg gcggagacat cttctcaaac agggaaggca180aactcccggg caaaagcgga cgaacatggc gtgaagcgga tattaactat acatcaggct240tcagaaattc agaccggatt ctttactcaa gcgactggct gatttacaaa acaacggacc300attatcagac ctttacaaag atcagataac tcgagctcta ga 342
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1.一種由GST27啟動(dòng)子控制的開關(guān)基因GBS，其具有如Seq ID No.8所示的核苷酸序列。
2.一種由權(quán)利要求1所述的基因和TBN不育基因組成的純和顯性雄性不育嵌合基因GBS-TBN，其核苷酸序列是由如Seq ID No.8所示的核苷酸序列和如Seq ID No.9所示的核苷酸序列組成。
3.一種能使不育系得到高效恢復(fù)的恢復(fù)基因AdsBN，其核苷酸序列由Seq ID No.6所示的核苷酸序列、Seq ID No.2所示的核苷酸序列和Seq ID No.3所示的核苷酸序列組成。
4.一種用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的純和顯性雄性不育基因表達(dá)載體，它含有權(quán)利要求2所述的嵌合基因GBS-TBN。
5.一種用于植物遺傳轉(zhuǎn)化高效恢復(fù)系表達(dá)載體，它含有權(quán)利要求3所述的嵌合基因AdsBN。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的純和顯性雄性不育基因表達(dá)載體是如圖1所示的pBin19TN-GSS。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高效恢復(fù)系表達(dá)載體是如圖2所示的p3300ND。
8.權(quán)利要求6或/和權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體在轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行的基因的轉(zhuǎn)育。
9.權(quán)利要求6或/和權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體在轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行的兩系法育種中應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1-9任選其一項(xiàng)在制備雜交種子中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種將不育基因與化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制的恢復(fù)基因串聯(lián)可獲得純合顯性雄性不育系植物表達(dá)載體，提供了一種利用RNAi能高效介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默的原理，在花藥中特異時(shí)空表達(dá)不育基因dsRNA的棉花雄性不育高效恢復(fù)系植物表達(dá)載體。本發(fā)明還提供了一種利用純合顯性雄性不育系和高效恢復(fù)系載體進(jìn)行棉花雜交種子制備的兩系法育種技術(shù)。
文檔編號(hào)A01H1/00GK1620863SQ200310115248
公開日2005年6月1日 申請(qǐng)日期2003年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月26日
發(fā)明者楊懷義, 王寰宇, 張惠軍, 石躍進(jìn), 朱永紅, 裴蕾, 田波 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院微生物研究所