專利名稱：新穎的食物制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制造食物制品的方法和由此獲得的食物制品，所述方法涉及至少一個(gè)加熱步驟。此外，本發(fā)明涉及適合于根據(jù)本發(fā)明的方法的新穎的酶，以及新鑒定出來的包含編碼所述新穎的酶的基因的多核苷酸序列。
對(duì)丙烯酰胺進(jìn)行商業(yè)生產(chǎn)已經(jīng)有很長的時(shí)間了，其被用于很多不同的技術(shù)應(yīng)用，因此，人們已對(duì)其毒性學(xué)背景進(jìn)行了很好的評(píng)價(jià)。丙烯酰胺被用于生產(chǎn)聚丙烯酰胺，后種化合物被應(yīng)用于飲用水生產(chǎn)、土壤穩(wěn)定、工業(yè)廢水處理和油脂提煉(winning)以及實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。
丙烯酰胺被認(rèn)為可能對(duì)動(dòng)物和人類致癌。1991年，食品科學(xué)委員會(huì)已調(diào)查過接觸食物材料的單體丙烯酰胺，在其評(píng)價(jià)中，丙烯酰胺被推斷為遺傳毒性致癌物。Bergmark et al.(Chem.Res.Toxicol.，10.78-84(1997))指出，丙烯酰胺還是煙草的煙的一種成分，這是丙烯酰胺的形成和對(duì)生物材料進(jìn)行的加熱之間的第一個(gè)聯(lián)系。近來，丙烯酰胺在多種食物和烤箱制備的食物中的存在被公開(Tareke et al.Chem.Res.Toxicol.13，517-522.(2000))，這引起了世界范圍內(nèi)的關(guān)注。進(jìn)一步的研究揭示，在多種不同的烘焙、煎炸和烤箱制備的大眾食物中都可檢測到丙烯酰胺，并且表明食物中丙烯酰胺的存在是烘焙過程的結(jié)果。
英國對(duì)于食物制品中丙烯酰胺污染的官方限制被設(shè)定為10ppb(每千克10微克)，對(duì)很多制品來說，上面顯示的值大大超過了這個(gè)設(shè)定值，尤其是谷物、面包制品和炸薯片。
在動(dòng)物試驗(yàn)中已觀察到了丙烯酰胺的服用劑量和腫瘤發(fā)生率之間的關(guān)系，其中，通過飲用水向大鼠喂飼丙烯酰胺，兩年內(nèi)大鼠死亡(Friedman，H.L.et al.，F(xiàn)undam.Appl.Pharmacol.85154-168.M.(1986)和Johnson et al.Toxicol.Appl.Pharmacol.85154-168(1986))。對(duì)加入到Fischer 344大鼠的飲用水中的丙烯酰胺的慢性毒性和致瘤性的研究。
將上述數(shù)據(jù)與Tareke et.al.(其中，與血紅蛋白(N-(2-氨基甲酰乙基)纈氨酸)結(jié)合的丙烯酰胺被用于研究含有丙烯酰胺的膳食對(duì)大鼠的作用)收集的結(jié)果結(jié)合起來，丙烯酰胺的每日吸收量就被計(jì)算為1.6μg丙烯酰胺/kg，這相應(yīng)于人類一生暴露的癌癥風(fēng)險(xiǎn)為7×10-3。
Mottram et al.Nature 419448(2002)已提出了作為Maillard反應(yīng)結(jié)果的從氨基酸和還原性糖來形成丙烯酰胺的途徑。根據(jù)此假設(shè)，丙烯酰胺可以在Maillard反應(yīng)期間形成。烘焙和焙燒期間，Maillard反應(yīng)主要用于產(chǎn)生顏色、氣味和味道。與Maillard反應(yīng)相關(guān)的是氨基酸的Strecker降解，并且到丙烯酰胺的途徑也被提出了。當(dāng)溫度超過120℃時(shí)，丙烯酰胺的形成就可以檢測到了，在大約170℃時(shí)觀察到最高的形成速率。當(dāng)天冬酰胺和葡萄糖存在時(shí)，可以觀察到最高的丙烯酰胺水平，而谷氨酰胺和天冬氨酸僅導(dǎo)致痕量的丙烯酰胺。丙烯酰胺主要來自天冬酰胺和葡萄糖這個(gè)事實(shí)可以解釋烤箱烹制的或焙烤的植物類制品等中丙烯酰胺的高水平。人們已知很多植物原材料都含有相當(dāng)高水平的天冬酰胺。馬鈴薯中，天冬酰胺是占據(jù)優(yōu)勢的游離氨基酸(940mg/kg，相當(dāng)于氨基酸總含量的40％)，在小麥面粉中，天冬酰胺以大約167mg天冬酰胺/kg面粉的水平存在，相當(dāng)于游離氨基酸總量的14％(Belitz and Grosch in Food Chemistry-Springer NewYork，1999)。
因此，就公眾健康方面而言，人們急需具有充分更低的丙烯酰胺水平或者優(yōu)選完全沒有丙烯酰胺的食物制品。第一個(gè)方面，已經(jīng)開始了一些研究活動(dòng)，以揭開食物制品中丙烯酰胺形成的機(jī)制。迄今為止，其結(jié)果還不能產(chǎn)生對(duì)該問題的滿意解決方案。其次，食物公司正在調(diào)查通過降低烤箱烹制及焙烤過程的溫度來避免丙烯酰胺形成的可能性。當(dāng)然，上述改變肯定將導(dǎo)致食物制品具有改變的口味(較少的Maillard產(chǎn)物)，而且上述改變會(huì)增加微生物例如Salmonella污染增多的風(fēng)險(xiǎn)。
本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)食物制品的方法，所述方法涉及至少一個(gè)加熱步驟，所述方法包括在所述的生產(chǎn)過程中，將一種或多種酶加入到所述食物制品的中間產(chǎn)物形式中，其中，在所述加熱步驟之前，將酶以一定量加入，所述的量對(duì)降低所述食物制品中的所述中間產(chǎn)物形式中存在的涉及所述加熱步驟中丙烯酰胺形成的氨基酸的水平是有效的。
食物制品的中間產(chǎn)物形式在本文中被定義為所述制造方法中，獲得該食物制品的最終形式之前的所產(chǎn)生的任何形式。所述中間產(chǎn)物形式可以包含所用的原材料和/或其混合物和/或其與添加劑和/或加工助劑的混合物，或其后來經(jīng)過加工的形式。例如，對(duì)食物制品面包而言，所述中間產(chǎn)物形式包含例如，小麥、小麥面粉、它們與面包的其它成分的初始混合物，所述其它成分例如是水、鹽、酵母和面包改良組合物、經(jīng)混合的面團(tuán)、經(jīng)揉捏的面團(tuán)、經(jīng)發(fā)酵的面團(tuán)和部分經(jīng)烘焙的面團(tuán)。
所述食物制品可制自至少一種植物來源的原材料，例如，馬鈴薯，煙草，咖啡，可可，水稻，谷物，例如小麥、黑麥粒、玉米、大麥、去殼麥粒、蕎麥和燕麥。此處和下文中的小麥都包括Triticum屬的所有已知的物種，例如，aestivum、durum和/或spelta。從超過一種的原材料制得的食物制品也被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，例如，包含小麥(面粉)和馬鈴薯的食物制品。根據(jù)本發(fā)明的方法可適用的食物制品的例子是任何以面粉為基礎(chǔ)的食品——例如面包、油酥制品、蛋糕、椒鹽脆餅干、面包圈、荷蘭式蜜蛋糕、曲奇餅、姜面包、姜汁蛋糕和薄脆餅干，以及任何以馬鈴薯為基礎(chǔ)的食品——例如法式薯?xiàng)l、炸薯?xiàng)l、炸薯片、炸薯餅。
已知上文提到的原材料含有相當(dāng)數(shù)量的涉及到所述制造方法加熱步驟中丙烯酰胺形成的氨基酸?；蛘?，上述氨基酸可以從所述食物制造方法中被用作添加劑的其它來源而不是原材料來產(chǎn)生，例如，從蛋白質(zhì)水解物，例如酵母提取物、大豆水解物、酪蛋白水解物等來產(chǎn)生。優(yōu)選的制造方法是對(duì)面包和其它烘焙制品的烘焙，所述其它烘焙制品是來源于小麥面粉和/或來自其它谷物來源的面粉的。另一種優(yōu)選的制造方法是對(duì)來自馬鈴薯片的炸薯片的油炸。
優(yōu)選的加熱步驟是如下這些其中，中間食物制品的至少一部分，例如，該食物制品的表面被暴露于促進(jìn)丙烯酰胺形成的溫度下，例如，110℃或更高，120℃或更高的溫度。根據(jù)本發(fā)明的方法中的加熱步驟可在烤箱中進(jìn)行，例如，在180-220℃之間的溫度，例如，用于對(duì)面包和其它烘焙制品的烘焙，或者，可在油中進(jìn)行，例如油炸馬鈴薯片，例如，在在160-190℃之間。
用于本發(fā)明方法的酶優(yōu)選是對(duì)涉及到制造方法中加熱步驟期間丙烯酰胺形成的氨基酸的側(cè)鏈進(jìn)行修飾的酶，其中，所述氨基酸的降解產(chǎn)物不會(huì)導(dǎo)致丙烯酰胺的形成，或者，至少較之該氨基酸的未降解形式，更少導(dǎo)致丙烯酰胺形成。優(yōu)選地，所述的酶對(duì)所述側(cè)鏈的至少一個(gè)氨基酸(天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和/或色氨酸)進(jìn)行修飾。所述的酶可以作為酶制劑被添加，或者可通過能生產(chǎn)所述酶的微生物來原位制得。優(yōu)選地，所述的酶制劑來自微生物，通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的發(fā)酵方法獲得。所述的微生物可以是細(xì)菌、真菌或酵母。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述方法包括加入天冬酰胺酶(EC3.5.1.1)或谷氨酰胺酶(EC 3.5.1.2)。
天冬酰胺酶可從多種不同的來源獲得，例如從植物、動(dòng)物和微生物獲得，所述微生物例如Escherichia、Erwinia、Streptomyces、Pseudomonas、Aspergillus和Baccillus的種。合適的Escherichia菌株的例子是Escherichiacoli。合適的Erwinia菌株的例子是Erwinia chrysantheml。合適的Streptomyces菌株的例子是Streptomyces lividans或Streptomyces murinus。合適的Aspergillus菌株的例子是Aspergillus oryzae、Aspergillus nidulans或Aspergillus niger。合適的Bacillus菌株的例子是Bacillus alkalophilus、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus brevis、Bacillus circulans、Bacilluscoagulans、Bacillus lautus、Bacillus lentus、Bacillus licheniformis、Bacillusmegateruim、Bacillus stearothemophilus、Bacillus subtilis或Bacillusthuringiensis。在WO03/083043中描述了從Bacillus、Streptomyces、Escheria或Pseudomonas菌株生產(chǎn)天冬酰胺酶的合適方法的例子。然而，WO03/083043并沒有公開本發(fā)明所述的天冬酰胺酶降低食物中丙烯酰胺含量的用途。
優(yōu)選地，使用食物級(jí)別的微生物，例如Aspergillus niger或Bacillussubtilis。
在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了新鑒定出來的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包括編碼新穎的天冬酰胺酶的基因，所述的天冬酰胺酶例如是能從Aspergillus niger來制造的。所述新穎的天冬酰胺酶可被用于本發(fā)明的制造食物的過程，例如用于從面團(tuán)來制造烘焙制品。
多核苷酸本發(fā)明還提供了編碼新穎的天冬酰胺酶的新穎的多核苷酸。本發(fā)明提供了編碼暫時(shí)被稱為ASPA01的天冬酰胺酶的多核苷酸，所述天冬酰胺酶具有根據(jù)SEQ ID NO3或其功能等同物的氨基酸序列。編碼ASPA01的基因序列是通過對(duì)從Aspergillus niger獲得的基因組克隆進(jìn)行測序來確定的。本發(fā)明提供了包含編碼ASPA01天冬酰胺酶的基因的多核苷酸序列以及包含其全長cDNA序列的多核苷酸序列和包含其編碼序列的多核苷酸序列。因此，本發(fā)明涉及經(jīng)過分離的包含根據(jù)SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的核苷酸序列或其功能等同物的多核苷酸。
更具體地，本發(fā)明涉及在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，優(yōu)選在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，能與根據(jù)SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的多核苷酸雜交的經(jīng)過分離的多核苷酸。有利地，此類多核苷酸可以從絲狀真菌獲得，特別是從Aspergillusniger中獲得。更具體地，本發(fā)明涉及下述經(jīng)過分離的多核苷酸，所述多核苷酸具有根據(jù)SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的核苷酸序列。
本發(fā)明還涉及下述經(jīng)過分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼根據(jù)SEQID NO3或其功能等同物的多肽的至少一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域。
在本文中使用的術(shù)語“基因”和“重組基因”指下述核酸分子其可以從染色體DNA中分離出來，并包括編碼蛋白質(zhì)例如A.niger的天冬酰胺酶的開放閱讀框?；蚩梢园ň幋a序列、非編碼序列、內(nèi)含子和調(diào)控序列。此外，基因表示如本文中定義的經(jīng)過分離的核酸分子。
使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)和本文中提供的序列信息，可以分離出本發(fā)明的核酸分子，例如，具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的核苷酸序列或其功能等同物的核酸分子。例如，用SEQ ID NO1的核酸序列或SEQ ID NO2的核苷酸序列的全部或部分作為雜交探針，使用標(biāo)準(zhǔn)的雜交和克隆技術(shù)(例如，見Sambrook，J.，F(xiàn)ritsh，E.F.，and Maniatis，T.MolecularCloningA Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989所描述)可以分離出根據(jù)本發(fā)明的核酸分子來。
此外，使用根據(jù)SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中含有的序列信息設(shè)計(jì)出來的合成寡核苷酸引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，可以分離出包括SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的全部或部分的核酸分子。
可以用cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，用適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋铮凑諛?biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)，來擴(kuò)增出本發(fā)明的核酸。由此擴(kuò)增出的核酸可被克隆進(jìn)合適的載體，并通過DNA序列分析來鑒定。
此外，相應(yīng)于根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列或者可以與根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列雜交的寡核苷酸可以通過標(biāo)準(zhǔn)的合成技術(shù)來制備，例如，用自動(dòng)DNA合成儀。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的經(jīng)過分離的核酸分子包含SEQID NO2顯示的核苷酸序列。SEQ ID NO2的序列對(duì)應(yīng)A.niger的ASPA01 cDNA的編碼區(qū)域。該cDNA包含編碼根據(jù)SEQ ID NO3的A.niger ASPA01多肽的序列。
在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的經(jīng)過分離的核酸分子包含是下述核苷酸序列的互補(bǔ)體的核酸分子，所述核苷酸序列是SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中所顯示的或是這些核苷酸序列的功能等同物。
與另一條核苷酸序列互補(bǔ)的核酸分子是與所述的另外的核苷酸序列高度互補(bǔ)的，以至于其可以與所述的另外的核苷酸序列雜交，進(jìn)而形成穩(wěn)定的雙鏈體。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及編碼本發(fā)明的多肽或其功能等同物例如生物活性片段或結(jié)構(gòu)域的經(jīng)過分離的核酸分子，以及足以用作雜交探針以鑒別編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子的核酸分子，和適于用作對(duì)核酸分子進(jìn)行的擴(kuò)增或突變的PCR引物的此類核酸分子的片段。
“經(jīng)過分離的多核苷酸”或“經(jīng)過分離的核酸”是這樣的DNA或RNA在從其中得到所述DNA或RNA的生物體的天然存在的基因組中，所述DNA或RNA與兩條(5’端的一條和3’端的一條)編碼序列直接相鄰，而對(duì)“經(jīng)過分離的多核苷酸”或“經(jīng)過分離的核酸”而言，所述DNA或RNA與這兩條編碼序列并不直接相鄰。因此，在一種實(shí)施方式中，經(jīng)過分離的核酸包括與編碼序列直接相鄰的5’非編碼(例如，啟動(dòng)子)序列的一些或全部。該術(shù)語因此包括，例如，被包括進(jìn)載體、自主復(fù)制的質(zhì)?；虿《?、原核生物或真核生物的基因組DNA等的重組DNA，或者作為不依賴其它序列的獨(dú)立分子(例如，通過PCR或限制性內(nèi)切酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA)而存在的重組DNA。該術(shù)語還包括作為雜種基因(hybrid gene)一部分的重組DNA，所述雜種基因編碼另外的多肽，所述的多肽充分去除了細(xì)胞物質(zhì)、病毒物質(zhì)或培養(yǎng)基(當(dāng)通過重組DNA技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)時(shí))，或化學(xué)前體或其它化學(xué)制品(當(dāng)化學(xué)合成時(shí))。此外，“經(jīng)過分離的核酸片段”并非是天然就作為片段存在的，而且其也不能在自然狀態(tài)被發(fā)現(xiàn)。
本文中使用的術(shù)語“多核苷酸”或“核酸分子”意在包括DNA分子(例如cDNA和基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及用核苷酸類似物生產(chǎn)出的DNA或RNA類似物。所述的核酸分子可以是單鏈的或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈的DNA?？梢允褂霉押塑账犷愃莆锘蜓苌?例如，次黃苷或硫代磷酸核苷酸)來合成所述的核酸。例如，此類寡核苷酸可被用于制備堿基配對(duì)能力有所改變或?qū)怂崦缚剐栽黾拥暮怂帷?br> 本發(fā)明的另一種實(shí)施方式提供了經(jīng)過分離的核酸分子，所述核酸分子反義于ASPA01核酸分子，例如，ASPA01核酸分子的編碼鏈。本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括了本文中描述的核酸分子的互補(bǔ)鏈。
測序錯(cuò)誤本文中提供的序列信息不應(yīng)被狹義地解釋為需要將非正確鑒別的堿基包括在內(nèi)?？梢院苋菀椎赜帽疚墓_的特定序列從絲狀真菌中分離出完整的基因，特別是從Aspergillus niger中；然后可以很容易地對(duì)所述基因進(jìn)行進(jìn)一步的序列分析，從而鑒別出測序的錯(cuò)誤來。
除非另外指明，本文中所有通過對(duì)DNA分子進(jìn)行測序測定出的核苷酸序列都是用自動(dòng)DNA測序儀來測定的，所有由此處所確定的DNA分子編碼的多肽的氨基酸序列都是通過對(duì)按照上文所述測定的DNA序列進(jìn)行翻譯來預(yù)測的。因此，如本領(lǐng)域內(nèi)所已知的那樣，對(duì)任何通過該自動(dòng)手段來測定的DNA序列而言，本文中測定的任何的核苷酸序列都可能含有一些錯(cuò)誤。典型地，通過自動(dòng)操作測定的核苷酸序列與被用來測序的DNA分子的實(shí)際核苷酸序列至少約90％相同，更典型地，至少約95％到至少約99.9％相同?？赏ㄟ^其它手段更精確地測定所述的實(shí)際序列，所述手段包括本領(lǐng)域中公知的手工DNA測序方法。如本領(lǐng)域中還已知的那樣，如果測定出的核苷酸序列較之實(shí)際序列有一個(gè)插入或缺失，在該核苷酸進(jìn)行翻譯時(shí)就會(huì)導(dǎo)致移碼(frame shift)，從插入或缺失點(diǎn)開始，預(yù)測得到的測定出的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列就將完全不同于被用于測序的DNA分子實(shí)際編碼的氨基酸序列。
本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員能夠鑒別出此類非正確鑒別的堿基，而且知道如何改正此類錯(cuò)誤。
核酸片段、探針和引物本發(fā)明的核酸分子可以僅僅包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO2中顯示的核酸序列的片段或一部分，例如，可以被用作探針或引物的片段，或編碼ASPA01蛋白質(zhì)的一部分的片段。對(duì)ASPA01基因以及cDNA的克隆測定出的核苷酸序列可用來產(chǎn)生探針和引物，所述探針和引物是為鑒定和/或克隆ASPA01家族的其它成員以及來自其它物種的ASPA01的同源體而設(shè)計(jì)的。典型地，所述探針/引物包含經(jīng)過充分純化的寡核苷酸，典型地，所述寡核苷酸包含優(yōu)選在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下，與SEQ ID NO1或SEQ IDNO2中顯示的核苷酸序列或其功能等同物的至少約12或15個(gè)，優(yōu)選約18或20個(gè)，優(yōu)選約22或25個(gè)，更優(yōu)選約30、35、40、45、50、55、60、65或75或更多的連續(xù)核苷酸雜交的核苷酸序列區(qū)域。
基于ASPA01核苷酸序列的探針可被用于檢測例如在其它生物中編碼同樣的蛋白質(zhì)或同源蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄物或基因組ASPA01序列。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述探針進(jìn)一步地包含連接到其上的標(biāo)記基團(tuán)，例如，所述標(biāo)記基團(tuán)可以是放射性同位素、熒光化合物、酶或酶的輔助因子。此類探針還可被用作診斷試驗(yàn)試劑盒的一部分，用于鑒別表達(dá)ASPA01蛋白質(zhì)的細(xì)胞。
同一性(identity)和同源性(homology)術(shù)語“同源性”或“百分比同一性(percent identity)”在本文中可互換使用。就本發(fā)明的目的而言，在此定義為確定兩條氨基酸序列或兩條核酸序列的百分比同一性，本著最優(yōu)比較的目的(例如，可以在第一條氨基酸序列或核苷酸序列上引入缺口(gap)，以與第二條氨基酸序列或核苷酸序列達(dá)到最佳的對(duì)齊)，將所述序列進(jìn)行對(duì)齊(align)。然后對(duì)相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸殘基或核苷酸進(jìn)行比較。如果第一條序列上某位置的氨基酸殘基或核苷酸與第二條序列上相應(yīng)位置的相同，那么這些分子在此位置就是相同的。兩條序列間的百分比同一性是所述序列共有的相同位置的數(shù)量的函數(shù)(即，％同一性＝相同位置的數(shù)量/位置(即重疊位置)總數(shù)×100)。優(yōu)選地，該兩條序列長度相同。
技術(shù)人員會(huì)知道有若干不同的計(jì)算機(jī)程序可被用于確定兩條序列間的同源性。例如，可以使用數(shù)學(xué)算法來完成對(duì)序列的對(duì)齊和對(duì)兩條序列間百分比同一性的確定。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用Needleman andWunsch(J.Mol.Biol.(48)444-453(1970))算法來確定兩條氨基酸序列間的百分比同一性，所述算法已被包括進(jìn)GCG軟件包(可從http//www.gcg.com獲得)的GAP程序中，其中使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，缺口權(quán)重為16、14、12、10、8、6或4，長度權(quán)重為1、2、3、4、5或6。技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到上述的所有不同參數(shù)將產(chǎn)生有細(xì)微區(qū)別的結(jié)果，但是使用不同算法時(shí)兩條序列的總體百分比同一性不會(huì)有顯著改變。
在又一種實(shí)施方式中，使用GCG軟件包(可從http//www.gcg.com獲得)的GAP程序來確定兩條核苷酸序列間的百分比同一性，其中使用NWSgapdna.CMP矩陣，缺口權(quán)重為40、50、60、70或80，長度權(quán)重為1、2、3、4、5或6。在另一種實(shí)施方式中，使用E.Meyers和W.Miller(CABIOS，411-17(1989))的算法來確定兩條氨基酸序列或核苷酸序列的百分比同一性，所述算法已被包括進(jìn)ALIGN程序(2.0版)(可從http//vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi獲得)中，其中使用PAM120加權(quán)殘基表，缺口長度懲罰(penalty)為12，缺口懲罰為4。
本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列可以進(jìn)一步地被用作“查詢序列”來開展對(duì)公眾數(shù)據(jù)庫的搜索，例如，去鑒定相關(guān)序列或家族中其它成員。可以使用Altschul，et al.(1990)J.Mol.Biol.215403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)來進(jìn)行此類搜索?？梢杂肗BLAST程序，在分?jǐn)?shù)(score)＝100，字長(word length)＝12的情況下來開展BLAST核苷酸搜索，以獲得與本發(fā)明的ASPA01核酸分子同源的核苷酸序列?？梢杂肵BLAST程序，在分?jǐn)?shù)＝50，字長＝3的情況下來開展BLAST蛋白質(zhì)搜索，以獲得與本發(fā)明的ASPA01蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。本著比較的目的，為獲得有缺口的對(duì)齊，可以利用Altschul et al.，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402中描述的Gapped BLAST。當(dāng)利用BLAST和GappedBLAST程序時(shí)，可以使用各個(gè)程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省參數(shù)。見http//www.ncbi.nlm.nih.gov。
雜交本文中用到的術(shù)語“雜交”被用來描述雜交和洗滌的條件，在所述條件下，典型地，互相之間同源性為至少約50％、至少約40％、至少約70％、更優(yōu)選為至少約80％、進(jìn)一步優(yōu)選為至少約85％到90％、更優(yōu)選為至少95％的核苷酸序列保持相互雜交的狀態(tài)。
對(duì)此類雜交條件而言，其中一個(gè)優(yōu)選的非限制的例子是在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(sodium chloride/sodium citrate，SSC)中，大約45℃下雜交，隨后在1×SSC、0.1％SDS中，50℃下進(jìn)行一次或多次洗滌，優(yōu)選在55℃下，優(yōu)選在60℃下，進(jìn)一步優(yōu)選在65℃下。
高度嚴(yán)謹(jǐn)條件包括例如，在68℃下于5×SSC/5×Denhardt’s溶液/1.0％SDS中進(jìn)行雜交，室溫下于0.2×SSC/0.1％SDS中洗滌?；蛘撸礈炜梢栽?2℃展開。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道何種條件適用于嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件及高度嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件。本領(lǐng)域中不難獲得其它關(guān)于此類條件的指導(dǎo)，例如，在Sambrook etal.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y.；和Ausubel et al.(eds.)，1995，Current Protocols in Molecular Biology，(John Wiley & Sons，N.Y.)中。
當(dāng)然，僅與poly A序列(例如mRNA的3’末端poly(A)區(qū))或僅與T(或U)殘基的互補(bǔ)性延伸區(qū)段(stretch)雜交的多核苷酸將不會(huì)被包括在用于與本發(fā)明核酸的一部分特異性雜交的本發(fā)明多核苷酸中，因?yàn)榇祟惗嗪塑账釋⑴c任何含有poly(A)延伸區(qū)段的核酸分子或其互補(bǔ)序列(例如，實(shí)際上是任何雙鏈的cDNA克隆)雜交。
獲得來自其它生物的全長DNA采用典型手段，可以對(duì)從其它生物，例如從絲狀真菌，特別是從Aspergillus的種所構(gòu)建的cDNA文庫進(jìn)行篩選。
例如，可以通過Northern印跡分析來對(duì)Aspergillus的菌株進(jìn)行篩選，以獲得同源的ASPA01多核苷酸。在檢測到與根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸同源的轉(zhuǎn)錄物之后，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，由分離自合適菌株的RNA來構(gòu)建cDNA文庫?；蛘撸梢允褂媚芘c根據(jù)本發(fā)明的ASPA01多核苷酸雜交的探針來對(duì)全基因組DNA文庫進(jìn)行篩選。
例如，可以通過使用兩套簡并的寡核苷酸引物組(primer pool)開展PCR，來分離出同源的基因序列，所述引物組是基于本文所教導(dǎo)的核苷酸序列而設(shè)計(jì)的。
用于所述反應(yīng)的模板可以是通過對(duì)mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄所獲得的cDNA，所述mRNA是從已知能表達(dá)或被懷疑能表達(dá)本發(fā)明多核苷酸的菌株中制備得到的。PCR產(chǎn)物可被用于亞克隆或測序，以確保擴(kuò)增出的序列代表新的ASPA01核酸序列或其功能等同物的序列。
然后可以通過一系列已知方法，用所述的PCR片段來分離全長cDNA克隆。例如，可對(duì)擴(kuò)增出的片段進(jìn)行標(biāo)記，并將其用于對(duì)噬菌體cDNA文庫或粘粒cDNA文庫的篩選?；蛘?，經(jīng)過標(biāo)記的片段可被用于篩選基因組文庫。
PCR技術(shù)還可被用于從其它生物中分離全長cDNA序列。例如，可以遵循標(biāo)準(zhǔn)工序，從適當(dāng)?shù)募?xì)胞源或組織源分離出RNA。用寡核苷酸引物對(duì)所述RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所述引物特異于擴(kuò)增片段的最靠近5’末端的序列，用于引導(dǎo)第一鏈合成。
然后可以用標(biāo)準(zhǔn)的末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，給得到的RNA/DNA雜交體(hybrid)“加上尾巴”(例如，用鳥嘌呤)，所述的雜交體可被RNaseH消化，然后第二鏈合成得以被引導(dǎo)(例如，用poly-C引物)。因此，可以很容易地分離出處于擴(kuò)增片段上游的cDNA序列。關(guān)于有用的克隆策略的綜述，參見例如前述的Sambrook et al.和前述的Ausubel et al.。
同源DNA片斷是否編碼ASPA01功能蛋白質(zhì)，可以使用本領(lǐng)域公知的方法方便地檢測。
載體本發(fā)明的另一個(gè)方面是關(guān)于載體的，優(yōu)選為表達(dá)載體，所述載體含有編碼ASPA01蛋白質(zhì)的核酸或其功能等同物。在本文中用到的術(shù)語“載體”指能運(yùn)送連接到其上的另一個(gè)核酸分子的核酸分子。一種載體類型是“質(zhì)?！?，“質(zhì)?！敝腑h(huán)狀的雙鏈DNA環(huán)，另外的DNA片斷可以連接到所述的環(huán)上。另一種載體的類型是病毒載體，其中，另外的DNA片斷可以連接到病毒基因組中。某些載體能在其被引入的宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體以及游離的哺乳動(dòng)物載體)。其它載體(例如，非游離的哺乳動(dòng)物載體)在被引入宿主細(xì)胞之后就被整合到了宿主細(xì)胞的基因組中，因此它們與宿主基因組一同復(fù)制。此外，某些載體能指導(dǎo)可操作地連接到其上的基因的表達(dá)。此類載體在本文中被稱為“表達(dá)載體”。一般而言，在重組DNA技術(shù)中用到的表達(dá)載體通常是質(zhì)粒的形式。在本文中術(shù)語“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用到的載體形式。然而，本發(fā)明也將包括能提供等同功能的其它形式的表達(dá)載體，例如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的核酸，所述核酸存在的形式適合于該核酸在宿主細(xì)胞中的表達(dá)，這意味著該重組表達(dá)載體包括一段或多段調(diào)控序列，所述序列是基于被用于表達(dá)的宿主細(xì)胞來選擇的，其被可操作地連接到將要表達(dá)的核酸序列上。在重組表達(dá)載體中，“可操作地連接”被用來表示人們感興趣的核苷酸序列被連接到調(diào)控序列上，所述的連接以允許該核苷酸序列表達(dá)的方式(例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中或在載體被引入的宿主細(xì)胞中)進(jìn)行。術(shù)語“調(diào)控序列”將包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件(例如，多腺苷酸化信號(hào))。例如，在Goeddel；GeneExpression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)中對(duì)此類調(diào)控序列進(jìn)行了描述。調(diào)控序列包括在很多種宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列的組成型表達(dá)的調(diào)控序列，也包括僅在某些宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)的調(diào)控序列(例如，組織特異性調(diào)控序列)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識(shí)到，對(duì)表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可能依賴于以下因素對(duì)將被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇，期望獲得的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等。本發(fā)明的表達(dá)載體可以被引入宿主細(xì)胞，以生產(chǎn)本文所述的核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽(例如，ASPA01蛋白質(zhì)，ASPA01蛋白質(zhì)的突變形式，其片段、變異體或功能等同物等)。
為了在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中表達(dá)ASPA01蛋白質(zhì)，可以對(duì)本發(fā)明的重組表達(dá)載體加以設(shè)計(jì)。例如，ASPA01蛋白質(zhì)可在細(xì)菌細(xì)胞(例如是E.coli)、昆蟲細(xì)胞(使用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。在Goeddel；Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中對(duì)合適的宿主細(xì)胞進(jìn)行了進(jìn)一步的討論?；蛘撸龅闹亟M表達(dá)載體可在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及翻譯，例如，使用T7啟動(dòng)子調(diào)控序列和T7聚合酶。
在本發(fā)明中有用的表達(dá)載體包括源自染色體、游離體和病毒的載體，例如源自細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母游離體、酵母染色體元件的載體，源自病毒，例如桿狀病毒、乳頭多瘤空泡病毒(papova virus)、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體和源自上述物質(zhì)的組合的載體，例如源自質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件的載體，例如粘粒和噬菌粒(phagemid)。
插入的DNA應(yīng)當(dāng)被可操作地連接到合適的啟動(dòng)子上，例如噬菌體的lambda PL啟動(dòng)子，E.coli的lac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子和tac啟動(dòng)子，SV40的早期啟動(dòng)子和晚期啟動(dòng)子以及逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR的啟動(dòng)子。技術(shù)人員知道其它合適的啟動(dòng)子。在一種具體的實(shí)施方式中，優(yōu)選的啟動(dòng)子是能指導(dǎo)天冬酰胺酶在絲狀真菌中高水平表達(dá)的啟動(dòng)子。此類啟動(dòng)子為本領(lǐng)域所已知。所述的表達(dá)構(gòu)建體可以含有用于轉(zhuǎn)錄起始和終止的位點(diǎn)，還在轉(zhuǎn)錄區(qū)域含有用于翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。由該構(gòu)建體表達(dá)的成熟轉(zhuǎn)錄物的編碼部分包括處于起點(diǎn)的用于起始翻譯的AUG以及恰當(dāng)?shù)囟ㄎ挥诖g的多肽末尾的終止密碼子。
可通過傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA引入原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。在此使用的“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”指一系列本領(lǐng)域內(nèi)已知的用于將外源核酸(例如DNA)引入到宿主細(xì)胞中的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、陽離子脂介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔。用于對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染的合適方法可在Sambrook，et al.(Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd，ed.Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)，Davis et al.，Basic Methods in Molecular Biology(1986)及其它實(shí)驗(yàn)手冊中找到。
對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染而言，人們已知，僅有一小部分的細(xì)胞可以將外源DNA整合到其基因組中，這取決于所用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)。為鑒別和選擇出上述整合體，通常將編碼選擇性標(biāo)志(例如對(duì)抗生素的抗性)基因與人們感興趣的基因一起引入到宿主細(xì)胞中。優(yōu)選的選擇性標(biāo)志包括賦予對(duì)藥物抗性的標(biāo)志，所述藥物例如是G418、潮霉素和甲氨蝶呤(methatrexate)。編碼選擇性標(biāo)志的核酸可以在與編碼ASPA01蛋白質(zhì)的載體相同的載體上被轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，或者，所述核酸可以在單獨(dú)的載體上被轉(zhuǎn)移進(jìn)去。經(jīng)過被引入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可通過藥物選擇來鑒別(例如，已經(jīng)插入了選擇性標(biāo)志基因的細(xì)胞將存活，而其它細(xì)胞則會(huì)死亡)。
蛋白質(zhì)在原核生物中的表達(dá)通常是在E.coli中開展的，其中使用了含有組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體，用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)。
如本文所指出的，所述表達(dá)載體將優(yōu)選含有選擇性標(biāo)志。此類標(biāo)志包括用于真核細(xì)胞培養(yǎng)的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性以及用于在E.coli和其它細(xì)菌中進(jìn)行培養(yǎng)的四環(huán)素抗性或氨芐青霉素抗性。合適的宿主的代表性例子包括細(xì)菌細(xì)胞，例如E.coli、Streptomyces和Salmonellatyphimurium；真菌細(xì)胞，例如酵母；昆蟲細(xì)胞，例如Drosophila S2和Spodoptera Sf9；動(dòng)物細(xì)胞，例如CHO、COS和Bowes黑色素瘤；以及植物細(xì)胞。用于上述宿主細(xì)胞的合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件都是本領(lǐng)域內(nèi)已知的。
載體中優(yōu)選用于細(xì)菌的是可從Qiagen獲得的pQE70、pQE60和pQE-9，可從Stratagene獲得的pBS載體、Phagescript載體、Bluescript載體、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A，可從Pharmacia獲得的ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。優(yōu)選的真核載體是可從Stratagene獲得的PWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pZT1和pSG，以及可從Pharmacia獲得的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。其它適合的載體對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
用于本發(fā)明的已知的細(xì)菌啟動(dòng)子包括E.coli的lacI和lacZ啟動(dòng)子，T3和T7啟動(dòng)子，gpt啟動(dòng)子，lambda PR、PL啟動(dòng)子和trp啟動(dòng)子，HSV胸苷激酶啟動(dòng)子，SV40的早期啟動(dòng)子和晚期啟動(dòng)子，逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR的啟動(dòng)子例如勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)的啟動(dòng)子以及金屬硫蛋白啟動(dòng)子，例如小鼠的金屬硫蛋白-I啟動(dòng)子。
將增強(qiáng)子序列插入到載體中可以增強(qiáng)編碼本發(fā)明多肽的DNA在更高等真核生物中的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子是DNA的順式作用元件，通常從10bp至300bp，其在特定的宿主細(xì)胞類型中發(fā)揮作用，以增加啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。增強(qiáng)子的例子包括處于復(fù)制起點(diǎn)晚期一側(cè)(late side)第100bp至270bD處的SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子的增強(qiáng)子、處于復(fù)制起點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤病毒增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子。
為使翻譯的蛋白質(zhì)能分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腔、胞質(zhì)間隙或胞外環(huán)境中，可以將適當(dāng)?shù)姆置谛盘?hào)插入到表達(dá)的多肽中。所述的信號(hào)對(duì)該多肽而言可以是內(nèi)源的，也可以是異源信號(hào)。
所述的多肽可以以經(jīng)修飾的形式表達(dá)，并且其不僅可以包括分泌信號(hào)，還可以包括其它的異源功能區(qū)域。因此，例如，可以將其它氨基酸特別是帶電荷的氨基酸區(qū)域加入到所述多肽的N-末端，以增加其在宿主細(xì)胞中、在純化期間或在隨后的操作及貯藏期間的穩(wěn)定性和持久性(persistence)。此外，還可以將肽部分(moieties)加入到所述多肽上，以協(xié)助進(jìn)行純化。
本發(fā)明的多肽本發(fā)明提供了具有根據(jù)SEQ ID NO3的氨基酸序列的經(jīng)過分離的多肽，可通過在合適的宿主中表達(dá)SEQ ID NO1的多核苷酸而獲得的氨基酸序列，以及可通過在合適的宿主中表達(dá)SEQ ID NO2的多核苷酸序列而獲得的氨基酸序列。此外，包含上述多肽的功能等同物的肽或多肽也被包含于本發(fā)明中。上述多肽被共同包含于術(shù)語“本發(fā)明的多肽”中。
(如通常所承認(rèn)的一樣，)術(shù)語“肽”和“寡肽”被認(rèn)為是同義的，當(dāng)上下文中需要指出通過肽鍵結(jié)合起來的至少兩個(gè)氨基酸的鏈時(shí)，兩個(gè)術(shù)語可以互換使用?！岸嚯摹边@個(gè)詞在本文中被用于指含有超過七個(gè)氨基酸殘基的鏈。本文中所有寡肽和多肽的分子式或序列都是從左至右書寫的，而且是從氨基端到羧基端的方向。本文中使用的單字母氨基酸代碼在本領(lǐng)域中是公知的，其可以在Sambrook，et al.(Molecular CloningA LaboratoryManual，2nd，ed.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)中找到。
“經(jīng)過分離的”多肽或蛋白質(zhì)被用于指從其天然的環(huán)境中移出來的多肽或蛋白質(zhì)。例如，出于本發(fā)明的目的，在宿主細(xì)胞中表達(dá)的經(jīng)重組生產(chǎn)的多肽和蛋白質(zhì)被認(rèn)為是經(jīng)過分離的；已用任何合適的技術(shù)進(jìn)行了充分純化的天然或重組多肽也被認(rèn)為是經(jīng)過分離的，所述技術(shù)例如是在Smith andJohnson，Gene 6731-40(1988)中公開的一步純化法。
可通過公知的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收及純化根據(jù)本發(fā)明的ASPA01天冬酰胺酶，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子交換層析或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析。最優(yōu)選地，使用高效液相色譜(HPLC)來進(jìn)行純化。
本發(fā)明的多肽包括天然純化的產(chǎn)物、化學(xué)合成工序的產(chǎn)物以及從原核或真核宿主中通過重組技術(shù)生產(chǎn)的產(chǎn)物，所述宿主包括例如細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明的多肽可以是經(jīng)過了糖基化的，或者可以是未經(jīng)過糖基化的，這取決于在重組生產(chǎn)工序中所使用的宿主。此外，本發(fā)明的多肽還可以包括初始修飾的甲硫氨酸殘基，在某些情況下作為宿主介導(dǎo)的過程的結(jié)果。
蛋白質(zhì)片段本發(fā)明還公開了根據(jù)本發(fā)明的多肽的具有生物活性的片段。
本發(fā)明多肽的具有生物活性的片段包括包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列與ASPA01蛋白質(zhì)的氨基酸序列充分相同或來自ASPA01蛋白質(zhì)的氨基酸序列(例如SEQ ID NO3的氨基酸序列)，所述片段包括的氨基酸較之所述的全長蛋白質(zhì)要少，其顯示了相應(yīng)全長蛋白質(zhì)的至少一種生物活性。典型地，具有生物活性的片段包含具有ASPA01蛋白質(zhì)的至少一種活性的結(jié)構(gòu)域或基元(motif)。
本發(fā)明蛋白質(zhì)的具有生物活性的片段可以是多肽，所述多肽的長度例如為10、25、50、100或更多個(gè)氨基酸。此外，可以通過重組技術(shù)來制備其它具有生物活性的部分，所述部分中被去除了所述蛋白質(zhì)的其它區(qū)域；對(duì)本發(fā)明多肽的天然形式的一種或多種生物活性而言，可以對(duì)所述部分進(jìn)行評(píng)估。
本發(fā)明還公開了編碼上述ASPA01蛋白質(zhì)的具有生物活性的片段的核酸片段。
功能等同物術(shù)語“功能等同物”和“功能變異體”在本文中可以互換使用。ASPA01 DNA的功能等同物是經(jīng)過分離的DNA片段，所述片段對(duì)展示了本文中定義的ASPA01 A.niger天冬酰胺酶特定功能的多肽進(jìn)行編碼。本發(fā)明的ASPA01多肽的功能等同物是展示了本文中定義的A.niger天冬酰胺酶的至少一種功能的多肽。因此，功能等同物也包括具有生物活性的片段。
蛋白質(zhì)或多肽的功能等同物可以含有僅對(duì)SEQ ID NO3的一個(gè)或多個(gè)氨基酸進(jìn)行了保守替代的氨基酸序列或僅對(duì)非關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行了替代、插入或缺失的氨基酸序列。因此，非關(guān)鍵氨基酸是SEQ ID NO3中可被改變的殘基，但所述改變基本不會(huì)改變生物功能。例如，對(duì)本發(fā)明的ASPA01蛋白質(zhì)而言是保守的氨基酸殘基，就被預(yù)測為是尤其不能進(jìn)行改變的殘基。此外，對(duì)根據(jù)本發(fā)明的ASPA01蛋白質(zhì)和其它天冬酰胺酶而言是保守的氨基酸，也不太可能易于被改變。
術(shù)語“保守替代”用來指一種替代，其中，所述的氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基所替換。上述族系已為本領(lǐng)域所已知，其包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸和組氨酸)，具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，具有β支鏈形式的側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。
典型地，核酸的功能等同物可以含有沉默突變或不改變被編碼多肽的生物功能的突變。因此，本發(fā)明提供了編碼ASPA01蛋白質(zhì)的核酸分子，所述蛋白質(zhì)含有氨基酸殘基的改變，所述氨基酸殘基對(duì)特定的生物活性來說是非必要的。此類ASPA01蛋白質(zhì)與SEQ ID NO3的氨基酸序列不同，但所述的蛋白質(zhì)仍然保留有至少一種生物活性。在一種實(shí)施方式中，所述經(jīng)過分離的核酸分子包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸分子，其中，所述蛋白質(zhì)包含與SEQ ID NO3中顯示的氨基酸序列具有至少約40％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性的基本同源的氨基酸序列。
例如，在Bowie，J.U.et al.，Science 2471306-1310(1990)中提供了關(guān)于如何制造表型沉默的氨基酸替代的指導(dǎo)，其中，作者指出，有兩種主要的手段可以用于研究氨基酸序列對(duì)改變的容忍度(tolerance)。第一種方法依賴于進(jìn)化過程，其中，突變或者被自然選擇所接受，或者被其拒絕。第二種方法則是利用遺傳工程向被克隆基因的特定位點(diǎn)引入氨基酸改變，然后進(jìn)行選擇或篩選，以鑒別出保留了功能性的序列。如作者所言，上述研究已揭示，蛋白質(zhì)對(duì)氨基酸替代有著驚人的容忍度。作者還進(jìn)一步指出了哪些改變可能被允許進(jìn)行于蛋白質(zhì)的特定位置上。例如，大多數(shù)隱蔽的(buried)氨基酸殘基需要非極性側(cè)鏈，而表面上的側(cè)鏈通常很少是保守的。在前述的Bowie et al和本文引用的參考文獻(xiàn)中，描述了其它的表型沉默替代。
編碼與根據(jù)SEQ ID NO3的蛋白質(zhì)同源的ASPA01蛋白質(zhì)的經(jīng)過分離的核酸分子，可以通過下述方法來制造向根據(jù)SEQ ID NO1或SEQID NO2的編碼核苷酸序列中引入一個(gè)或多個(gè)核苷酸替代、增加或缺失，從而向被編碼的蛋白質(zhì)中引入一個(gè)或多個(gè)的氨基酸替代、缺失或插入?？梢酝ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來引入此類突變，所述技術(shù)例如是定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變。
術(shù)語“功能等同物”還包括A.niger的ASPA01蛋白質(zhì)的直向同源體(orthologue)。A.niger的ASPA01蛋白質(zhì)的直向同源體是可以從其它菌株或物種中分離得到的蛋白質(zhì)，且所述蛋白質(zhì)具有相似或相同的生物活性。此類直向同源體包含與SEQ ID NO3基本同源的氨基酸序列，因此所述同源體不難被鑒別出來。
如本文所定義，術(shù)語“基本同源”指第一條氨基酸或核苷酸序列與第二條氨基酸或核苷酸序列含有足夠數(shù)目的或最低要求數(shù)目的相同或等同(例如，具有相似側(cè)鏈)的氨基酸或核苷酸，從而，所述的第一條和第二條氨基酸或核苷酸序列具有共同(common)結(jié)構(gòu)域。例如，含有具有約40％，優(yōu)選為65％，更優(yōu)選為70％，進(jìn)一步優(yōu)選為75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的同一性的共同結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列或核苷酸序列，在本文中就被定義為基本相同。
此外，編碼ASPA01家族其它成員的，因此具有與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2不同的核苷酸序列的核酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，編碼來自其它物種的ASPA01蛋白質(zhì)的，因此具有與SEQ ID NO1或SEQ IDNO2不同的核苷酸序列的核酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
使用本文中公開的cDNA或其合適的片段作為雜交探針，優(yōu)選在高度嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下，按照標(biāo)準(zhǔn)的雜交技術(shù)，可以分離出與本發(fā)明ASPA01DNA的變異體(例如，天然的等位基因變異體)及同源體相應(yīng)的核酸分子，所述分離基于所述核酸分子與本文中公開的ASPA01核酸分子的同源性。
除ASPA01序列的天然存在的等位基因變異體之外，技術(shù)人員將知道通過突變向SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的核苷酸序列引入改變，由此可以導(dǎo)致ASPA01蛋白質(zhì)的氨基酸序列改變，但ASPA01蛋白質(zhì)的功能卻沒有實(shí)質(zhì)性變化。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了經(jīng)過改進(jìn)的ASPA01蛋白質(zhì)。改進(jìn)的ASPA01蛋白質(zhì)是其中至少一種生物活性經(jīng)過了改進(jìn)的蛋白質(zhì)。此類蛋白質(zhì)可以通過向ASPA01編碼序列的全部或一部分上隨機(jī)引入突變來獲得，例如通過飽和誘變來獲得，得到的突變體可被重組表達(dá)，并被用于進(jìn)行對(duì)生物活性的篩選。例如，本領(lǐng)域提供了用于測量天冬酰胺酶酶活性的標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，因此可以很容易地選出經(jīng)過改進(jìn)的蛋白質(zhì)。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，ASPA01蛋白質(zhì)具有根據(jù)SEQ ID NO3的氨基酸序列。另一種實(shí)施方式中，ASPA01多肽與根據(jù)SEQ ID NO3的氨基酸序列基本同源，并且保留有根據(jù)SEQ ID NO3的多肽的至少一種生物活性，但因?yàn)樯鲜龅奶烊蛔儺惢蛘T變，其氨基酸序列仍有不同。
在另外一種優(yōu)選實(shí)施方式中，ASPA01蛋白質(zhì)具有由經(jīng)過分離的核酸片段編碼的氨基酸序列，所述核酸片段能與SEQ ID NO1或SEQ IDNO2的核酸雜交，所述雜交優(yōu)選于高度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾s交條件下進(jìn)行。
因此，ASPA01蛋白質(zhì)是包含與SEQ ID NO3中顯示的氨基酸序列具有至少約40％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并且其還保留有根據(jù)SEQ ID NO3的多肽的至少一種功能活性。
根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的功能等同物還可以通過多種方式被鑒定出來，例如通過對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)的突變體(例如截短突變體)的組合(combinatorial)文庫針對(duì)天冬酰胺酶活性進(jìn)行篩選。在一種實(shí)施方式中，通過核酸水平上的組合誘變產(chǎn)生了變異體的雜色文庫(variegatedlibrary)。變異體的雜色文庫可以通過多種方式來產(chǎn)生，例如，通過用酶將合成的寡核苷酸混合物連接到基因序列上，使得一套可能是蛋白質(zhì)的簡并序列可作為單個(gè)的多肽表達(dá)。有很多種方法可用于從簡并的寡核苷酸序列來生產(chǎn)可能是本發(fā)明多肽變異體的文庫。用于合成簡并寡核苷酸的方法在本領(lǐng)域中是已知的(見例如，Narang(1983)Tetrahedron 393；Itakura etal.(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura et al.(1984)Science 1981056；Ike et al.(1983)Nucleic Acid Res.11477)。
另外，本發(fā)明多肽編碼序列的片段的文庫也可用于制造多肽的雜色群(variegated population)，以在隨后對(duì)變異體的選擇中進(jìn)行篩選。例如，編碼序列片段的文庫可以通過如下方法來生成在其中對(duì)每個(gè)分子而言，切口(nick)僅出現(xiàn)大約一次的處理?xiàng)l件下，用核酸酶處理人們感興趣的編碼序列的雙鏈PCR片段；對(duì)所述雙鏈DNA進(jìn)行變性；對(duì)所述DNA進(jìn)行復(fù)性，以形成雙鏈DNA，所述雙鏈DNA可能包括來自不同切口產(chǎn)物的同義/反義對(duì)；通過S1核酸酶處理，從重新形成的雙鏈體中除去單鏈的部分；將得到的片段文庫與表達(dá)載體連接起來。通過此種方法，可以得到一種表達(dá)文庫，所述文庫編碼人們感興趣的蛋白質(zhì)的多種不同大小的N-末端片段及內(nèi)部片段。
本領(lǐng)域中已知的若干技術(shù)都可用于篩選組合文庫的基因產(chǎn)物及篩選cDNA文庫，以得到具有選定屬性的基因產(chǎn)物，所述組合文庫是通過截短點(diǎn)突變來制造的。典型地，使用最廣泛的用于篩選大基因文庫并適用于高通量分析的技術(shù)包括將所述基因文庫克隆到可復(fù)制表達(dá)載體中；用得到的載體文庫去轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞；在一定條件下表達(dá)所述的組合基因，在所述表達(dá)條件下，對(duì)人們想要的活性進(jìn)行的檢測，有助于分離出編碼其產(chǎn)物被檢測到的基因的載體。遞歸總體誘變(recursive ensemble mutagenesis，REM)技術(shù)能增強(qiáng)功能突變體在文庫中出現(xiàn)的頻率，所述技術(shù)可與篩選試驗(yàn)一起使用，以鑒定出本發(fā)明蛋白質(zhì)的變異體(Arkin and Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897811-7815；Delgrave et al.(1993)ProteinEngineering 6(3)327-331)。
除SEQ ID NO1中顯示的ASPA01基因序列之外，在給定的群中，可能存在DNA序列多態(tài)性，其可能導(dǎo)致ASPA01蛋白質(zhì)氨基酸序列的改變，這點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。此類遺傳多態(tài)性可能由于天然的等位基因變異而存在于來自不同群的細(xì)胞中，或者存在于一個(gè)群中。等位基因變異體還可以包括功能等同物。
根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的片段還可以包含不編碼功能多肽的多核苷酸。此類多核苷酸可以用作探針或用作PCR反應(yīng)的引物。
對(duì)根據(jù)本發(fā)明的核酸而言，不管其編碼功能多肽或非功能多肽，都可被用作雜交探針或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的引物。不編碼具有ASPA01活性的多肽的本發(fā)明的核酸分子的用途包括(1)從cDNA文庫中分離編碼ASPA01蛋白質(zhì)的基因，或其等位基因變異體，例如，來自其它生物而不是A.niger的cDNA文庫；(2)如Verma et al.，Human Chromosomesa Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)所述，對(duì)中期染色體擴(kuò)展(spreads)進(jìn)行的原位雜交(例如FISH)，以提供對(duì)ASPA01基因的精確染色體定位；(3)Northern印跡分析，用于檢測ASPA01的mRNA在特定組織和/或細(xì)胞中的表達(dá)；以及(4)可作為診斷工具使用的引物和探針，以分析能在給定的生物(例如組織)樣品中與ASPA01探針雜交的核酸是否存在等。
本發(fā)明中還包括一種方法，所述方法是用于獲得ASPA01基因或cDNA的功能等同物的。該方法需要獲得經(jīng)過標(biāo)記的探針，所述探針包括經(jīng)過分離的核酸，所述核酸編碼根據(jù)SEQ ID NO3的序列或其變異體的全部或一部分；用所述經(jīng)過標(biāo)記的探針對(duì)核酸片段文庫進(jìn)行篩選，其中，篩選是在允許探針與文庫中核酸片段雜交的條件下進(jìn)行的，從而形成核酸雙鏈體，并且由任何經(jīng)過標(biāo)記的雙鏈體中的核酸片段制備出全長基因序列，以獲得與ASPA01基因相關(guān)的基因。
在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的ASPA01的核酸與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2中顯示的核酸序列或其互補(bǔ)序列具有至少40％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的ASPA01的多肽與SEQ IDNO3中顯示的的氨基酸序列具有至少40％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同源性。
宿主細(xì)胞在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明描述了含有本發(fā)明中包括的核酸的細(xì)胞，例如經(jīng)過轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或重組的宿主細(xì)胞。“經(jīng)過轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”或“重組細(xì)胞”是通過重組DNA技術(shù)，向其中(或其祖代中)引入了根據(jù)本發(fā)明的核酸的細(xì)胞。原核細(xì)胞和真核細(xì)胞都被包括在內(nèi)，例如，細(xì)菌、真菌、酵母等，特別優(yōu)選的是來自絲狀真菌的細(xì)胞，特別是Aspergillusniger。
可以對(duì)宿主細(xì)胞加以選擇，選出能調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)的宿主細(xì)胞或能以特異性的、令人期待的方式對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行修飾或加工的宿主細(xì)胞。此類對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的修飾(例如糖基化)和加工(例如切割)可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的機(jī)能最優(yōu)化。
多種宿主細(xì)胞都具有特征性的及特異性的用于對(duì)蛋白質(zhì)及基因產(chǎn)物的翻譯后加工和修飾的機(jī)制。可以選出分子生物學(xué)和/或微生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟悉的合適的細(xì)胞系或宿主系統(tǒng)，以確保對(duì)所表達(dá)的外源蛋白質(zhì)的修飾和加工是令人期望的及正確的。為達(dá)成此目標(biāo)，可以使用具有胞內(nèi)加工系統(tǒng)(machinery)的真核宿主細(xì)胞，所述加工系統(tǒng)用于對(duì)初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的正確加工、對(duì)基因產(chǎn)物的糖基化和磷酰化。此類宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域中公知的。
宿主細(xì)胞還包括但不限于哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，例如CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38和脈絡(luò)叢細(xì)胞系。
如果需要的話，可通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系來生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的多肽。大量適于對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的載體都是公眾可獲得的，構(gòu)建此類細(xì)胞系的方法也為公眾所已知，例如在(前述的)Ausubel et al.中。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了可通過前文所述的本發(fā)明的方法來獲得的食物制品，或者可通過使用前文所述的用于制造食物制品的新穎的天冬酰胺酶來獲得的食物制品。通過將上述食物制品與下述生產(chǎn)方法獲得的食物制品進(jìn)行比較，上述食物制品的特征在于顯著降低的丙烯酰胺水平，所述生產(chǎn)方法中不包括以能有效降低所述加熱步驟期間涉及丙烯酰胺形成的氨基酸的水平的量添加一種或多種酶。根據(jù)本發(fā)明的方法可被用于使生產(chǎn)出的食物制品中丙烯酰胺的含量降低，較之用傳統(tǒng)方法獲得的食物制品，該含量降低優(yōu)選為超過50％，更優(yōu)選為超過20％，進(jìn)一步優(yōu)選為10％，最優(yōu)選為超過5％。
材料和方法對(duì)丙烯酰胺的測量樣品預(yù)處理用5ml milliQ水對(duì)600mg干燥均質(zhì)的樣品進(jìn)行提取。將1μg處于溶液(CIL)中的內(nèi)標(biāo)物13C3丙烯酰胺加入到提取物中。離心(6000rpm)10分鐘后，將3ml上清層上到Extreluut-3BT柱(Merck)中。用15ml乙酸乙酯從所述的柱中洗脫出丙烯酰胺。乙酸乙酯在緩和的氮?dú)饬飨抡舭l(fā)，至大約0.5ml。
色譜條件用氣相色譜來分析該乙酸乙酯溶液。用5.4ml/分鐘的持續(xù)氦氣流作為載氣，用CP-Wax 57(Varian)柱(長度為25m，內(nèi)徑0.32mm，薄膜1.2μm)來實(shí)現(xiàn)分離。不分流(split-less)注射3μl?？鞠錅囟仍?0℃保持1分鐘，之后其按照30℃/分鐘上升至220℃。220℃的溫度持續(xù)12分鐘之后，在下一次注射之前對(duì)烤箱進(jìn)行冷卻和穩(wěn)定。用甲烷作為電離氣體，使用在線化學(xué)電離質(zhì)譜儀，陽離子模式來進(jìn)行檢測。監(jiān)測特征離子m/z 72(丙烯酰胺)和m/z 75(13C3丙烯酰胺)，以進(jìn)行定量。
使用的設(shè)備GC HP6890(Hewlet Packard)MSD(物質(zhì)選擇檢測儀，mass selective detector)HP5973(Hewlet Packard)對(duì)天冬酰胺酶活性的測量根據(jù)Shirfrin et al.(Shirfrin，S，Parrott，C.L.，and Luborsky，S.W.(1974)，Journal of Biological Chemistry 249，1445-1340)，來測量天冬酰胺酶的活性。該酶試驗(yàn)的背景是對(duì)天冬酰胺酶活性導(dǎo)致釋放的NH3的測定。
為檢測釋放出的NH3，遵循下述移液管計(jì)劃表溶液A0.1M檸檬酸+0.2M Na2HPO4·2H2O，pH 5.5溶液B0.189M L-天冬酰胺(Sigma)溶液C0.006M(NH4)2SO4(Merck)溶液D25％(v/v)三氯乙酸(Merck)溶液E氨顯色試劑(Aldrich)對(duì)天冬酰胺酶活性測量而言，所述溶液必須是新鮮制備的。
表1中概括了用于校正曲線(CP＝校正點(diǎn))的溶液。
表1校正溶液計(jì)劃表
根據(jù)表1的溶液立即被顛倒，并倒置于37℃下培養(yǎng)。30分鐘后加入0.1ml溶液D來終止反應(yīng)。之后將0.1ml酶溶液加入對(duì)照酶試驗(yàn)中。溶液被立即混合，離心以去除任何沉淀物。用移液管將0.2ml上清液轉(zhuǎn)移至含有4.3ml去離子水和0.5ml溶液E的試管中。上述混合物被立即混合，一分鐘后，測量校正樣品、對(duì)照和試驗(yàn)組的A 436nm。
按照下述來制作校正曲線ΔA 436nm校正點(diǎn)＝A 436nm校正點(diǎn)-A 436nm校正點(diǎn)1通過繪制標(biāo)準(zhǔn)的ΔA 436nm對(duì)氨(NH3)濃度的曲線圖來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
酶活性按照如下來計(jì)算ΔA 436nm酶試驗(yàn)＝A 436nm試驗(yàn)-A 436nm試驗(yàn)對(duì)照用標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定被釋放的NH3的μmol單位/毫升＝(被釋放的NH3的μmol×Vs)/(Vt×ti×Ve)其中，Vs＝反應(yīng)溶液體積(計(jì)劃表中的+0.1ml溶液D)；2.2mlVt＝用于第二次反應(yīng)以測定NH3的反應(yīng)溶液體積；0.2mlti＝培養(yǎng)時(shí)間，以分鐘計(jì)；30Ve＝待測酶樣品體積；0.1比酶活性＝(單位/毫升酶)/(mg蛋白質(zhì)/ml酶)如無特別指明，一個(gè)單位的天冬酰胺酶活性被定義為在37℃時(shí)，pH 5.5下，每分鐘從L-天冬酰胺釋放出1μmol NH3。面團(tuán)的pH為大約5.5，故而該pH在測量中是優(yōu)選的。然而，對(duì)于具有不同pH值的其它底物，該不同的pH是優(yōu)選用于對(duì)天冬酰胺酶活性的測定的。
如無特別指明，用ppm表示的量基于面粉的量。
材料天冬酰胺酶獲得自Escherichia coli(Sigma，具有285單位/毫克的比活性)、Erwinia chrysanthemi(Sigma，具有100單位/毫克的比活性)、Bacillus subtilis或Aspergillus niger(發(fā)酵細(xì)節(jié)見實(shí)施例)。
CSL培養(yǎng)基由以下物質(zhì)組成(以每升中的量表示)100g玉米浸出固體(Roquette)、1g Na2HPO4·H2O、15g MgSO4·7H2O、10g葡萄糖·H2O和0.25g Basildon(消泡劑)。上述成分被溶解于去鹽水(demi-water)中，用NaOH或H2SO4將pH調(diào)為5.8；向帶有擋板和泡沫球的100ml燒瓶中填充20ml的發(fā)酵培養(yǎng)液，并在120℃滅菌20分鐘，之后，冷卻到室溫后，向每只瓶中加入200μl含有5000IU/ml青霉素和5mg/ml鏈霉素的溶液。
CSM培養(yǎng)基由以下物質(zhì)組成(以每升中的量表示)150g麥芽糖·H2O、60g大豆胨(蛋白胨)、1g Na2HPO4·H2O、15g MgSO4·7H2O、0.08g Tween 80、0.25g Basildon(消泡劑)、20g MES、1g L-精氨酸。上述成分被溶解于去鹽水中，用NaOH或H2SO4將pH調(diào)為6.2；向帶有擋板和泡沫球的500ml燒瓶中填充100ml的發(fā)酵培養(yǎng)液，并在120℃滅菌20分鐘，之后，冷卻到室溫后，向每只瓶中加入1ml含有5000IU/ml青霉素和5mg/ml鏈霉素的溶液。
實(shí)施例1 Aspergillus niger的發(fā)酵由本文提供的核苷酸序列編碼的天冬酰胺酶通過下述方法獲得構(gòu)建含有所述DNA序列的表達(dá)質(zhì)粒，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化A.niger菌株，按照如下方式來培養(yǎng)Aspergillus niger菌株。
在20ml CSL-培養(yǎng)基(100ml燒瓶，擋板)中培養(yǎng)A.niger菌株的新鮮孢子(106-107)，在34℃和170rpm下培養(yǎng)20-24小時(shí)。將5-10mlCSL預(yù)培養(yǎng)物接種到100ml CSM培養(yǎng)基(500ml燒瓶，擋板)中之后，在34℃和170rpm下對(duì)菌株進(jìn)行3-5天的發(fā)酵。
用50ml Greiner管進(jìn)行離心(30分鐘，5000rpm，4℃)，獲得不含細(xì)胞的上清液，所有后續(xù)步驟都在冰上進(jìn)行。用GF/A Whatman Glass微纖維過濾器(150mm)對(duì)上清液進(jìn)行預(yù)過濾，以去除大顆粒，用4NKOH將pH調(diào)至5(如果必要的話)，在帶有泵的0.2μm(帶蓋)過濾器上進(jìn)行過濾滅菌，以去除真菌物質(zhì)。上清液被貯藏于4℃(或-20℃)。
測量超濾物中Aspergillus niger天冬酰胺酶的含量和天冬酰胺酶活性步驟1-制備超濾物對(duì)實(shí)施例1中獲得的培養(yǎng)物的上清液進(jìn)行超濾，以獲得較高的酶濃度并去除掉可能干擾酶活性測定和烘焙試驗(yàn)的低分子污染物。在裝備有分離點(diǎn)為10kDa的過濾器的Millipore Labscale TFF系統(tǒng)中對(duì)300ml上清液進(jìn)行超濾。
用10-30ml冷的去礦物質(zhì)水對(duì)樣品進(jìn)行3-5次洗滌，這取決于樣品的顏色和體積。酶溶液的終體積為10-30ml，其被進(jìn)一步地稱為“超濾物”。
步驟2-利用A280和HPSEC測定天冬酰胺酶的濃度超濾物中Aspergillus niger天冬酰胺酶的濃度是從歸因于天冬酰胺酶的280nm處的消光(A280)和計(jì)算得到的天冬酰胺酶的分子消光系數(shù)來計(jì)算的。對(duì)A280的測量是在Uvikon XL Secomam分光光度計(jì)(Beun deRonde，Abcoude，荷蘭)中進(jìn)行的。
酶的摩爾消光系數(shù)可從每個(gè)酶分子的酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸殘基的數(shù)量來計(jì)算(S.C.Gill and P.H.von Hippel，Anal.Biochem.182，319-326(1989))。上述氨基酸的摩爾消光系數(shù)分別為1280、5690和120M-1·cm-1。本發(fā)明的Aspergillus niger天冬酰胺酶的酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸殘基的數(shù)量可從SEQ ID NO3中給出的蛋白質(zhì)序列推斷出來。表2中是計(jì)算出的本發(fā)明的Aspergillus niger天冬酰胺酶的消光系數(shù)。
表2A.niger天冬酰胺酶的消光系數(shù)
歸因于天冬酰胺酶的所述超濾物在280nm的消光取決于酶樣品的純度。該純度是用帶有TSK SW-XL柱(300×7.8mm；MW范圍為10-300kDa)的HPSEC(High Performance Size Exclusion Chromatography，高效尺寸排阻色譜)來測定的；洗脫緩沖液由pH 6.0的25mM磷酸鹽緩沖液組成，以1ml/分鐘的流速使用。注射5-100μl的樣品。測量280nm處的吸收。
歸因于本發(fā)明天冬酰胺酶的超濾物A280是從色譜圖中各個(gè)天冬酰胺酶的峰的峰表面積與280nm處吸收峰總表面積的比率得到的。然后通過將超濾物的A280乘以上述比率再除以0.3(計(jì)算得到的消光系數(shù))計(jì)算出每種天冬酰胺酶在超濾物中的濃度。所述溶液中含有40mg蛋白質(zhì)/ml。
步驟3-測定天冬酰胺酶活性pH 5.5時(shí)，Aspergillus niger天冬酰胺酶溶液顯示出了40000U/ml的活性。因此，用40mg/ml的蛋白質(zhì)含量來計(jì)算，可以得出1000單位/毫克蛋白質(zhì)的比活性。
實(shí)施例2 Aspergillus niger天冬酰胺酶的最優(yōu)pH在此實(shí)施例中，在多種不同的pH值對(duì)活性進(jìn)行測量。為保持pH恒定及校正緩沖液影響，在不同緩沖液中于同一pH值進(jìn)行了多次對(duì)天冬酰胺酶活性的測量。
三種不同的緩沖液被用于測量pH范圍為5-9時(shí)的天冬酰胺酶活性1.檸檬酸/磷酸鹽緩沖液(pH 5-6.2)；2.磷酸鹽緩沖液(pH 8.5-7.6)；和3.tris緩沖液(pH 7.2-8.9)。
底物濃度為17.2mM的天冬酰胺。表3中展示了從A.niger中獲得的天冬酰胺酶的天冬酰胺酶活對(duì)pH的關(guān)系。
表3適合的緩沖液中不同pH值下測出的Aspergillus niger天冬酰胺酶的活性。酶試驗(yàn)中檸檬酸、磷酸和三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液(tris緩沖液)的最終濃度分別為0.05、0.1和0.025M。
如數(shù)據(jù)所示，本Aspergillus niger天冬酰胺酶非常適于烘焙應(yīng)用，因?yàn)樵撁冈?.5左右的面團(tuán)pH值處顯示了相對(duì)高的酶活性。
實(shí)施例3 Escherichia coli和Aspergillus niger的天冬酰胺酶的KM和Vmax值在37℃，pH為5.5時(shí)，通過對(duì)Escherichia coli或Aspergillus niger的天冬酰胺酶的天冬酰胺酶活性分別進(jìn)行測量來測定KM和Vmax。表4中概括了上述測量的結(jié)果。
表4Escherichia coli或Aspergillus niger的天冬酰胺酶的KM和Vmax
A.niger的天冬酰胺酶較之E.coli的天冬酰胺酶顯示了明顯更高的活性。
實(shí)施例4制備batard類型的面包以及Erwinia、Escherichia coli和Aspergillus niger的天冬酰胺酶對(duì)外殼和碎屑中丙烯酰胺水平的影響用2000g面粉(100％)、1040ml水(57％)、44g新鮮的Konings酵母、40g鹽(5％)、136mg抗壞血酸(68ppm)和前述量的本發(fā)明的天冬酰胺酶來制備面團(tuán)，所述天冬酰胺酶來自Erwinia(Sigma)或Aspergillus niger。用螺旋混合機(jī)Diosna SP 12將所述成分混合成面團(tuán)(速度為1時(shí)混合2分鐘，接著在速度2，混合時(shí)間為直至總的能量輸入達(dá)到85wh)。此后，在32℃將整個(gè)面團(tuán)發(fā)酵15分鐘。接著，將350g的面團(tuán)塊用手弄圓，在32℃發(fā)酵15分鐘。之后，將面團(tuán)塊弄圓成型，接著進(jìn)行75分鐘的最終發(fā)酵。發(fā)酵之后，在面團(tuán)塊的上表面的長度方向上切出深度為1cm的切口。烘焙之前取面團(tuán)樣品以測定丙烯酰胺含量。面團(tuán)塊在烤箱中于240℃被烘焙30分鐘。
此后，從外殼(外層2mm)取樣，按照前文所述對(duì)丙烯酰胺進(jìn)行分析。所述外殼取自batard面包的上表面，選擇顯示出平均的褐色色澤的外殼部分，不要太黑也不要太白。就丙烯酰胺測定而言，下表5、6和7中展示了對(duì)每種條件下的兩塊面包塊以及一塊面包塊的兩次測量的平均值。
表5若干種天冬酰胺酶對(duì)面包中丙烯酰胺的形成的影響
從上表可以推斷出若干種天冬酰胺酶包括新穎的ASPA01的使用有降低外殼中形成的丙烯酰胺的量的效果。
表6Erwinia天冬酰胺酶的量對(duì)丙烯酰胺形成的影響
從上表可以推斷出，增加天冬酰胺酶的量會(huì)降低外殼中形成的丙烯酰胺的量。
實(shí)施例5在加有天冬酰胺的batard面包中天冬酰胺酶對(duì)丙烯酰胺水平的影響用與實(shí)施例4相同的手段來制備面團(tuán)、面包塊和樣品，其中，按照與加入天冬酰胺酶的步驟相同的步驟，將L-天冬酰胺(Sigma)加入到面團(tuán)中去，表7中給出了加入量。測定得到的樣品中的丙烯酰胺，其結(jié)果見下表。
表7額外添加天冬酰胺對(duì)外殼中丙烯酰胺形成的影響
從表7可以推斷出，將天冬酰胺這種氨基酸添加到面包中會(huì)顯著提高面包外殼中丙烯酰胺的含量。然而，天冬酰胺酶的使用會(huì)使其重新降低。
實(shí)施例6多種不同的參數(shù)對(duì)外殼中丙烯酰胺水平的影響用2000g全麥面粉(100％)(Linde-Meneba，荷蘭)或普通白面粉(Kolibri-Meneba，荷蘭)、1140ml水(57％)、47g新鮮的Koningsgist、40g鹽(1.75％)、136mg抗壞血酸(34ppm)和前述量的L-天冬酰胺(Sigma)以及從Aspergillus niger獲得的天冬酰胺酶ASPA01來制備面團(tuán)。用螺旋混合機(jī)Diosna SP 12將所述成分混合成面團(tuán)(速度為1時(shí)混合2分鐘，接著在速度2，混合時(shí)間為直至總的能量輸入達(dá)到85wh)。此后，在32℃將整個(gè)面團(tuán)發(fā)酵15分鐘。接著，將350g的面團(tuán)塊用手弄圓，在32℃發(fā)酵15分鐘。之后，將面團(tuán)塊弄圓成型，接著進(jìn)行90分鐘的最終發(fā)酵。發(fā)酵之后，在面團(tuán)塊的上表面的長度方向上切出深度為1cm的切口。在烤箱中烘焙所述的面團(tuán)塊。
使用三種烘焙過程1.240℃，30分鐘2.300℃，20分鐘3.320℃，20分鐘烘焙之后，按照實(shí)施例4所述，從面包外殼取樣。下面給出了對(duì)樣品中丙烯酰胺分析的結(jié)果。即將進(jìn)行烘焙之前對(duì)面團(tuán)中丙烯酰胺的量進(jìn)行測量。每個(gè)數(shù)據(jù)是對(duì)每種條件下一塊面包塊的兩次測量的平均值。
表8烘焙過程對(duì)基于無天冬酰胺或添加天冬酰胺酶的普通面粉的面包外殼中形成的丙烯酰胺量的影響
從表8可以推斷出，丙烯酰胺的形成取決于所使用的烘焙過程。在熱而短的過程中，外殼中的丙烯酰胺的形成就比較低溫度烘焙時(shí)明顯要高。烘焙過程3導(dǎo)致非常黑的面包塊。因此，在此烘焙條件下沒有進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。
表9對(duì)于無天冬酰胺或添加天冬酰胺酶的烘焙過程1，面粉類型對(duì)面包外殼中丙烯酰胺水平的影響
表9清晰顯示，面粉種類對(duì)形成的丙烯酰胺的量是有影響的。
表10糖對(duì)基于普通面粉的面包外殼中丙烯酰胺水平的影響和增加的丙烯酰胺量對(duì)A.niger天冬酰胺酶的效率的影響
糖的存在激發(fā)了丙烯酰胺的形成。如果額外添加了天冬酰胺的話，該效應(yīng)會(huì)更顯著。當(dāng)Aspergillus niger天冬酰胺酶被加入到富含糖的面團(tuán)系統(tǒng)中后，面包外殼中丙烯酰胺的水平會(huì)顯著降低。令人驚奇地，丙烯酰胺相對(duì)富集的面包塊的丙烯酰胺降低會(huì)更多，雖然使用的是同樣數(shù)量的來自Aspergillus niger的天冬酰胺酶。
實(shí)施例7荷蘭式蜜蛋糕的制備對(duì)荷蘭式蜜蛋糕的制備分兩個(gè)階段進(jìn)行。第一個(gè)階段，按照下述來制備預(yù)混合物(per batter)將4kg Koekzoet(Atlanta Dethmers B.V.，Groningen-荷蘭)和500g切碎的荷蘭式蜜蛋糕加入到兩升水中，加熱，直到溫度達(dá)到116C。加入5kg黑麥面粉，混合直至混合物光滑。此后，將該面團(tuán)冷卻，并在室溫貯藏1-2天。
向每2750克該預(yù)混合物加入下述成分500克Koekzoet、27.5g篩過的荷蘭式蜜蛋糕香料(spices)、22g篩過的Karam烘焙粉、16.5gVulkaan烘焙粉(全都是Atlanta Dethmers的)。此外，加入了不同數(shù)量的Aspergillus niger天冬酰胺酶，酶活性為40000U/ml(酶活性是按照實(shí)施例1在pH 5.5時(shí)來測量的)。
在SD 12型Diosna混合儀(Diosna，Dierks & Shne，Osnabrück-德國)中，以104rpm對(duì)該混合物進(jìn)行6分鐘的混合。稱取3250g混合物出來，在外面弄濕，置于蛋糕盤上烹飪。此后，在30℃保溫105分鐘。此后，在180℃對(duì)此混合物進(jìn)行60分鐘的烘焙。該荷蘭式蜜蛋糕的外層和內(nèi)部(“碎屑”)樣品被用來分析丙烯酰胺的存在情況。
烘焙之后，從外殼(外面的2mm)和碎屑(來自蛋糕中心)取樣，并按照上面描述的那樣對(duì)樣品進(jìn)行丙烯酰胺分析。對(duì)外殼樣品而言，外殼取自該蛋糕的上表面，并選擇顯示平均色澤的外殼部分。
表11荷蘭式蜜蛋糕的外殼和碎屑中丙烯酰胺的含量和不同的Aspergillus niger劑量的影響
*丙烯酰胺的降低是通過如下公式來計(jì)算的丙烯酰胺的降低＝((經(jīng)過天冬酰胺酶處理的蛋糕中丙烯酰胺的含量)/(對(duì)照的丙烯酰胺含量))×100％如本實(shí)施例中所示，較之沒有被處理的荷蘭式蜜蛋糕，Aspergillusniger天冬酰胺酶的加入使得丙烯酰胺的含量被降低至5％。此外，令人驚奇的是在荷蘭式蜜蛋糕的碎屑中發(fā)現(xiàn)了高水平的丙烯酰胺。在所有面包試驗(yàn)中，丙烯酰胺在碎屑中的量都低于丙烯酰胺分析的檢測極限(＜30ppb)，即使天冬酰胺或糖加入的情況下。
序列表<110>帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司<120>新穎的食物制造方法<130>21401WO<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3223<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>1tggggggaac ttgcatctga gagcatcata ctagttacta ctactactac tacttgccga60tgaataaaca tcctgcttgt actacgcatc gccgtcttgc tgacatggag atatattttg120ggctccgaga gttttgatag cagtagccaa ttaactagta gatgctagta ctactctagt180aatttggggg cgaatgttga atccagctca tgccaattga catctggaga tctccacgag240acaacgagat aagatgaaat attgctgtca tgggtgataa ctagatgctt cgagaaggat300tcttgaggat tgcctcatcg catgggataa tatcaccctc gggtggacct tcccggctgt360tggggcttat cgtggaagag tcacccccga tatcggtggg ccaagccctt tatcaatcat420catcctatca gtttccaccc acaagatagc ctatggaccc tgattccctt ctagccacag480agactagtac tagtctatca tgtcgactcc atgtggagaa accctgataa gaccatgtgg540aggaggagat agcaagcctc cacagaaaca atatcatctc cacctgcaat cacggttgga600ttccgaatac acccgccgcc tggcaagcac atggggtata aaatgctgaa accaggcaag660atgaattgga agagaagcca gcagagacca tcgcatccgt cttcatcatg cctctcaagc720cgattctcct gtctgccctg gccagtctcg cctcggcctc tccgctgctc tactcgcgga780ccaccaatga aaccttcgtc ttcaccaatg ccaatggcct caacttcacc cagatgaaca840ccaccctgcc gaacgtgacc attttcgcaa cgggtaggtg gaccgagtat acctcaggta900gtgcgaccga tagttaaccg caactcacag gtggtaccat cgcgggctcc gattccagct960caaccgccac gaccggctac acctccggag cagtcggggt cctgtccctc atcgatgcgg1020tgccatccat gctggatgtg gccaatgttg ccggcgtcca ggtggccaac gtgggaagcg1080aggatatcac ctctgacatc ctgatttcca tgtccaagaa gctgaaccgc gttgtatgtg1140aggacccgac catggccggt gctgtcatca cccacggcac cgacaccctc gaggagactg1200ccttcttcct ggacgccact gtcaactgtg gcaagccaat tgtcatcgtg ggtgccatgc1260gcccatccac ggccatctca gctgacgggc ccttcaatct gctcgaagcc gtgacggtgg1320ctgcctccac gtcggcgcgc gatcgcggtg ccatggtggt catgaacgat cgcattgcct1380cggcctacta tgtgaccaag accaatgcca acactatgga caccttcaag gccatggaga1440tgggctacct tggcgagatg atctccaaca cccctttctt cttctacccg cccgtcaagc1500caaccggtaa ggtggccttt gacatcacca acgtgactga gatcccccgt gtggacattc1560tgttttctta tgaggacatg cacaacgaca ccctctacaa cgccatctcc agtggtgccc1620agggaattgt ggtgagtgtg atttccttga tctctctcta taaaacttgg aatggacgct1680gatgagaata gattgccggg gctggtgctg gaggcgtcac aacctccttc aatgaggcta1740tcgaggatgt catcaaccgt ttggagatcc ctgtcgtgca gagtatgcgc acagtcaatg1800gggaagtgcc actgtcagac gtgagcagcg acaccgccac ccacatcgcc agtggatacc1860taaacccgca gaagtcccgc attctgttgg gattgctgct atcccaggga aagaatatca1920ccgaaatcgc tgacgtgttt gctctgggca cggatgcgta ggtgtcgata gaaccattgt1980atataataat gaccggatat tatgatcatg atagattgca atagaaagtg actggataca2040catcagcaaa ggataccgag ttttgccctc aggcgttcgt agaaaaagtg tatcctactg2100aagatcatga atcatgtctt atcttctggc cccctcgtat ccagggtgtt ggacatgcag2160ggtgctttgc gtctgaagga tccgagatca aattgacacg agccagagtc tgatacatcc2220ataatagtgg gtatatttga agtccattga tagtccttgt ttgtgtcggg caattgggtt2280
agctagggcc tggcttggtg gcatatcgtt ggactaatag atggtagttc aattaccgac2340gggactgtct cccgccatta ttctcacaat tcttatcagc acattttccc tgtcgcgctt2400ggatctgcaa tatttatttc cctcgtcatc acattcccac gaaaagacca tccagacatc2460ttgctcggta ttctggaccg taagactgtt ttgaaaggca aatgtaaagc gtgattggtc2520gacgtcaagc ctgaccaatc tagtaagctg gtcttacttt gggtgtagac ggaggtatta2580ggtagtatta aggcagctag ttcgcctgca ttaccaccca ggcgaggcac gccactgctg2640atcaggcgcg aaatggaacg aagtgcgagg tccacttaac atgatgcgcg cggatactaa2700ggcgaccaag accctggatt gatcgctatg attcgcggaa ccccgcgggt tcttcacggc2760tttcgataac gcaggattgg atcctcccag cctcgtctct gcaagtggga ccctgaaggg2820ctctcctgca cgtcattact cagacactcc catcttttgc ttatttgcaa tgaatcttat2880gggctgaccc tcagctcggc gtgggatgcc tgaatcgttg gtgaaagtct atttgagcaa2940tcctagcctg ctggtagagg cggatgatta taataatcaa agcaccctat cgtaaggatg3000aaggcttgtc cctggtcaac catcactctg gttattgact agttgtgttt gggagacagc3060tgaagcccat tgtcggtaat cgtccccaaa gaatctgccc ctgcatcatg gagtcaggaa3120agaccgggtt tcgcacggtc gcagaaccgc atccaacacg tctagtagaa ggaggggtag3180ggatactcat ccgtctattg tgtatatctg caacgactaa tgt 3223<210>2<211>1137<212>DNA<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1137)<400>2atg cct ctc aag ccg att ctc ctg tct gcc ctg gcc agt ctc gcc tcg48Met Pro Leu Lys Pro Ile Leu Leu Ser Ala Leu Ala Ser Leu Ala Ser1 5 10 15gcc tct ccg ctg ctc tac tcg cgg acc acc aat gaa acc ttc gtc ttc96Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Ser Arg Thr Thr Asn Glu Thr Phe Val Phe20 25 30acc aat gcc aat ggc ctc aac ttc acc cag atg aac acc acc ctg ccg144Thr Asn Ala Asn Gly Leu Asn Phe Thr Gln Met Asn Thr Thr Leu Pro35 40 45aac gtg acc att ttc gca acg ggt ggt acc atc gcg ggc tcc gat tcc192Asn Val Thr Ile phe Ala Thr Gly Gly Thr Ile Ala Gly Ser Asp Ser50 55 60agc tca acc gcc acg acc ggc tac acc tcc gga gca gtc ggg gtc ctg240Ser Ser Thr Ala Thr Thr Gly Tyr Thr Ser Gly Ala Val Gly Val Leu65 70 75 80tcc ctc atc gat gcg gtg cca tcc atg ctg gat gtg gcc aat gtt gcc288Ser Leu Ile Asp Ala Val Pro Ser Met Leu Asp Val Ala Asn Val Ala85 90 95ggc gtc cag gtg gcc aac gtg gga agc gag gat atc acc tct gac atc336Gly Val Gln Val Ala Asn Val Gly Ser Glu Asp Ile Thr Ser Asp Ile100 105 110ctg att tcc atg tcc aag aag ctg aac cgc gtt gta tgt gag gac ccg384Leu Ile Ser Met Ser Lys Lys Leu Asn Arg Val Val Cys Glu Asp Pro115 120 125acc atg gcc ggt gct gtc atc acc cac ggc acc gac acc ctc gag gag432Thr Met Ala Gly Ala Val Ile Thr His Gly Thr Asp Thr Leu Glu Glu130 135 140act gcc ttc ttc ctg gac gcc act gtc aac tgt ggc aag cca att gtc480Thr Ala Phe Phe Leu Asp Ala Thr Val Asn Cys Gly Lys Pro Ile Val
145 150 155 160atc gtg ggt gcc atg cgc cca tcc acg gcc atc tca gct gac ggg ccc528Ile Val Gly Ala Met Arg Pro Ser Thr Ala Ile Ser Ala Asp Gly Pro165 170 175ttc aat ctg ctc gaa gcc gtg acg gtg gct gcc tcc acg tcg gcg cgc576Phe Asn Leu Leu Glu Ala Val Thr Val Ala Ala Ser Thr Ser Ala Arg180 185 190gat cgc ggt gcc atg gtg gtc atg aac gat cgc att gcc tcg gcc tac624Asp Arg Gly Ala Met Val Val Met Asn Asp Arg Ile Ala Ser Ala Tyr195 200 205tat gtg acc aag acc aat gcc aac act atg gac acc ttc aag gcc atg672Tyr Val Thr Lys Thr Asn Ala Asn Thr Met Asp Thr Phe Lys Ala Met210 215 220gag atg ggc tac ctt ggc gag atg atc tcc aac acc cct ttc ttc ttc720Glu Met Gly Tyr Leu Gly Glu Met Ile Ser Asn Thr Pro Phe Phe Phe225 230 235 240tac ccg ccc gtc aag cca acc ggt aag gtg gcc ttt gac atc acc aac768Tyr Pro Pro Val Lys Pro Thr Gly Lys Val Ala Phe Asp Ile Thr Asn245 250 255gtg act gag atc ccc cgt gtg gac att ctg ttt tct tat gag gac atg816Val Thr Glu Ile Pro Arg Val Asp Ile Leu Phe Ser Tyr Glu Asp Met260 265 270cac aac gac acc ctc tac aac gcc atc tcc agt ggt gcc cag gga att864His Asn Asp Thr Leu Tyr ASn Ala Ile Ser Ser Gly Ala Gln Gly Ile275 280 285gtg att gcc ggg gct ggt gct gga ggc gtc aca acc tcc ttc aat gag912Val Ile Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Val Thr Thr Ser Phe Asn Glu290 295 300gct atc gag gat gtc atc aac cgt ttg gag atc cct gtc gtg cag agt960Ala Ile Glu Asp Val Ile Asn Arg Leu Glu Ile Pro Val Val Gln Ser305 310 315 320atg cgc aca gtc aat ggg gaa gtg cca ctg tca gac gtg agc agc gac1008Met Arg Thr Val Asn Gly Glu Val Pro Leu Ser Asp Val Ser Ser Asp325 330 335acc gcc acc cac atc gcc agt gga tsc cta aac ccg cag aag tcc cgc1056Thr Ala Thr His Ile Ala Ser Gly Tyr Leu Asn Pro Gln Lys Ser Arg340 345 350att ctg ttg gga ttg ctg cta tcc cag gga aag aat atc acc gaa atc1104Ile Leu Leu Gly Leu Leu Leu Ser Gln Gly Lys Asn Ile Thr Glu Ile355 360 365gct gac gtg ttt gct ctg ggc acg gat gcg tag1137Ala Asp Val Phe Ala Leu Gly Thr Asp Ala370 375<2l0>3<211>378<212>PRT<213>黑曲霉(Aspergillus niger)<400>3Met Pro Leu Lys Pro Ile Leu Leu Ser Ala Leu Ala Ser Leu Ala Ser1 5 10 15Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Ser Arg Thr Thr Asn Glu Thr Phe Val Phe20 25 30Thr Asn Ala Asn Gly Leu Asn Phe Thr Gln Met Asn Thr Thr Leu Pro35 40 45
Asn Val Thr Ile Phe Ala Thr Gly Gly Thr Ile Ala Gly Ser Asp Ser50 55 60Ser Ser Thr Ala Thr Thr Gly Tyr Thr Ser Gly Ala Val Gly Val Leu65 70 75 80Ser Leu Ile Asp Ala Val Pro Ser Met Leu Asp Val Ala Asn Val Ala85 90 95Gly Val Gln Val Ala Asn Val Gly Ser Glu Asp Ile Thr Ser Asp Ile100 105 110Leu Ile Ser Met Ser Lys Lys Leu Asn Arg Val Val Cys Glu Asp Pro115 120 125Thr Met Ala Gly Ala Val Ile Thr His Gly Thr Asp Thr Leu Glu Glu130 135 140Thr Ala Phe Phe Leu Asp Ala Thr Val Asn Cys Gly Lys Pro Ile Val145 150 155 160Ile Val Gly Ala Met Arg Pro Ser Thr Ala Ile Ser Ala Asp Gly Pro165 170 175Phe Asn Leu Leu Glu Ala Val Thr Val Ala Ala Ser Thr Ser Ala Arg180 185 190Asp Arg Gly Ala Met Val Val Met Asn Asp Arg Ile Ala Ser Ala Tyr195 200 205Tyr Val Thr Lys Thr Asn Ala Asn Thr Met Asp Thr phe Lys Ala Met210 215 220Glu Met Gly Tyr Leu Gly Glu Met Ile Ser Asn Thr Pro Phe phe Phe225 230 235 240Tyr Pro Pro Val Lys Pro Thr Gly Lys Val Ala Phe Asp Ile Thr Asn245 250 255Val Thr Glu Ile Pro Arg Val Asp Ile Leu Phe Ser Tyr Glu Asp Met260 265 270His Asn Asp Thr Leu Tyr Asn Ala Ile Ser Ser Gly Ala Gln Gly Ile275 280 285Val Ile Ala Gly Ala Gly Ala Gly Gly Val Thr Thr Ser Phe Asn Glu290 295 300Ala Ile Glu Asp Val Ile Asn Arg Leu Glu Ile Pro Val Val Gln Ser305 310 315 320Met Arg Thr Val Asn Gly Glu Val pro Leu Ser Asp Val Ser Ser Asp325 330 335Thr Ala Thr His Ile Ala Ser Gly Tyr Leu Asn Pro Gln Lys Ser Arg340 345 350Ile Leu Leu Gly Leu Leu Leu Ser Gln Gly Lys Asn Ile Thr Glu Ile355 360 365Ala Asp Val Phe Ala Leu Gly Thr Asp Ala370 37權(quán)利要求
1.用于生產(chǎn)食物制品的方法，其中涉及到至少一個(gè)加熱步驟，所述方法包括將一種或多種酶加入到所述生產(chǎn)方法的所述食物制品的中間產(chǎn)物形式中去，其中，所述的酶在加熱步驟之前加入，加入量對(duì)降低存在于所述食物制品的所述中間產(chǎn)物形式中涉及所述加熱步驟中丙烯酰胺形成的氨基酸的水平是有效的。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的食物制品是從至少一種植物原材料來制備的。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的植物原材料是谷物面粉，優(yōu)選是小麥面粉或者馬鈴薯。
4.如前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中，所述的酶能修飾該生產(chǎn)方法中加熱步驟期間涉及丙烯酰胺形成的氨基酸的側(cè)鏈，并且，上述氨基酸的降解產(chǎn)物不會(huì)導(dǎo)致丙烯酰胺的形成，或者，至少較之該氨基酸的未改變的形式，更少導(dǎo)致丙烯酰胺形成。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述的酶修飾天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和/或色氨酸中的至少一種的側(cè)鏈。
6.如前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述的酶以酶制劑的形式加入，或者通過能生產(chǎn)所述酶的微生物原位產(chǎn)生。
7.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的酶制劑從微生物中獲得。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的微生物是細(xì)菌、真菌或酵母。
9.如前面任何一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述的酶是天冬酰胺酶(EC 3.5.1.1)或谷氨酰胺酶(EC 3.4.1.2)。
10.一種能與SEQ ID NO1的多核苷酸雜交的經(jīng)過分離的多核苷酸。
11.如權(quán)利要求10所述的經(jīng)過分離的多核苷酸，能在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO1的多核苷酸雜交。
12.如權(quán)利要求10或11所述的經(jīng)過分離的多核苷酸，可從絲狀真菌中獲得。
13.如權(quán)利要求12所述的經(jīng)過分離的多核苷酸，可從Aspergillus niger獲得。
14.一種編碼天冬酰胺酶的經(jīng)過分離的多核苷酸，所述天冬酰胺酶包含SEQ ID NO3的氨基酸序列或其功能等同物。
15.一種經(jīng)過分離的多核苷酸，所述多核苷酸編碼天冬酰胺酶的至少一個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，所述天冬酰胺酶包含SEQ ID NO3的氨基酸序列或其功能等同物。
16.一種經(jīng)過分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO1的核苷酸序列或其功能等同物。
17.一種由SEQ ID NO1構(gòu)成的經(jīng)過分離的多核苷酸。
18.一種載體，包含如權(quán)利要求10至17所述的多核苷酸序列。
19.如權(quán)利要求18所述的載體，其中如權(quán)利要求10至17所述的多核苷酸序列被可操作地連接到調(diào)控序列上，所述調(diào)控序列適于在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)所述多核苷酸序列。
20.如權(quán)利要求19所述的載體，其中所述的合適的宿主細(xì)胞是絲狀真菌。
21.一種制造如權(quán)利要求10-17中任意一項(xiàng)所述的多核苷酸或如權(quán)利要求18-20中任意一項(xiàng)所述的載體的方法，所述方法包括以下步驟培養(yǎng)經(jīng)過所述多核苷酸或所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，從所述宿主細(xì)胞中分離出所述多核苷酸或所述載體。
22.一種經(jīng)過分離的天冬酰胺酶，其具有SEQ ID NO3或其功能等同物的氨基酸序列。
23.如權(quán)利要求22所述的經(jīng)過分離的天冬酰胺酶，可從Aspergillusniger獲得。
24.一種經(jīng)過分離的天冬酰胺酶，可通過在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，例如在Aspergillus niger中，表達(dá)如權(quán)利要求10-17中任意一項(xiàng)所述的多核苷酸或如權(quán)利要求18-20中任意一項(xiàng)所述的載體來獲得。
25.重組的天冬酰胺酶，其中包含如權(quán)利要求22-24中任意一項(xiàng)所述的任何天冬酰胺酶的功能結(jié)構(gòu)域。
26.一種用于制造如權(quán)利要求22-25中任意一項(xiàng)所述的天冬酰胺酶的方法，所述方法包括以下步驟用如權(quán)利要求10-17中任意一項(xiàng)所述的經(jīng)過分離的多核苷酸或如權(quán)利要求18-20中任意一項(xiàng)所述的載體來轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞，在允許所述多核苷酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞，以及，可選地，從所述細(xì)胞或培養(yǎng)基中純化出被編碼的多肽。
27.一種重組宿主細(xì)胞，其中包括如權(quán)利要求10-17中任意一項(xiàng)所述的多核苷酸或如權(quán)利要求18-20中任意一項(xiàng)所述的載體。
28.一種重組宿主細(xì)胞，其表達(dá)如權(quán)利要求22-25中任意一項(xiàng)所述的多肽。
29.如權(quán)利要求22-25中任意一項(xiàng)所述的天冬酰胺酶在用于如權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的生產(chǎn)食物制品的方法中的用途。
30.一種食物制品，所述食物制品可通過權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)方法或權(quán)利要求29所述的方法來獲得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種涉及到至少一個(gè)加熱步驟的食物制品制造方法，所述方法包括將一種或多種酶加入到所述生產(chǎn)方法的所述食物制品的中間產(chǎn)物形式中去，其中，所述的酶在加熱步驟之前加入，酶的加入量對(duì)降低存在于所述食物制品的所述中間產(chǎn)物形式中涉及所述加熱步驟中丙烯酰胺形成的氨基酸的水平是有效的。本發(fā)明還涉及從本發(fā)明的方法獲得的食物制品。
文檔編號(hào)A23L1/30GK1728950SQ200380107012
公開日2006年2月1日 申請日期2003年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月19日
發(fā)明者彼得·簡·阿諾爾德斯·瑪麗亞·普洛普, 萊克斯·博爾德·德, 魯特格爾·簡·洛爾延·范, 羅埃爾弗·伯恩哈德·梅瑪 申請人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司