專利名稱：水稻抗病相關(guān)基因OsDR3的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種水稻DNA片段的分離克隆、功能驗證和應(yīng)用。所述的DNA片段包含水稻抗病相關(guān)基因OsDR3，它能夠顯著提高植物抵抗病害的能力。將該片段的完整編碼區(qū)(coding sequence)與玉米中的泛素(ubiquitin)啟動子結(jié)合后直接轉(zhuǎn)入感病植物體，轉(zhuǎn)基因植株的抗病能力顯著提高。
背景技術(shù)：
植物在生長的過程中，受到多種病原物的侵害。植物病原物的種類繁多，包括病毒、細(xì)菌、霉菌和線蟲等。病原物侵入植物導(dǎo)致兩種結(jié)果(1)病原體成功的在寄主植物內(nèi)繁殖，引起相關(guān)的病癥；(2)寄主植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)，殺死病原物或阻止其生長。利用抗性基因資源改良植物的抗病性，是預(yù)防病害同時又保護(hù)環(huán)境的根本出路。
植物的抗病反應(yīng)是多基因參于調(diào)控的復(fù)雜過程。參于植物抗病反應(yīng)的基因分為兩類(1)抗病基因，又稱R(resistance)基因和(2)抗病相關(guān)基因。
根據(jù)目前人們對抗病基因功能的認(rèn)識，這類基因的產(chǎn)物主要是作為受體，直接或間接與病原蛋白相互作用，啟動植物體內(nèi)的抗病信號傳導(dǎo)路徑(Tang等，1996，Science 2742060-2063；Baker等，1997，Science 276726-733；Jia等，2000，EMBO J.194004-4014；Dangl和Jones，2001，Nature 411826-833；Nimchuk等，2001，Curr.Opin.Plant Biol.4288-294)。抗病基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)抗性強，是很好的基因資源。但由于下述原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制(1)抗病基因的資源有限，如目前知道的抵抗水稻重要病害白葉枯病的抗病基因少于30個，抵抗另一水稻重要病害-稻瘟病的抗病基因也只有大約40個；(2)抗病基因具有病原種類和病原生理小種特異性，抗病范圍有限；(3)因為病原的快速突變，一個抗病基因的作用往往幾年或者十幾年后就喪失了。
抗病相關(guān)基因是指除抗病基因外所有參于抗病反應(yīng)的基因，它們的編碼產(chǎn)物參于合成植物體內(nèi)抗病信號分子、參于信號傳導(dǎo)或參于防衛(wèi)反應(yīng)等。這類基因的共同特點是病原誘導(dǎo)后它們的表達(dá)量升高或降低，因此人們可以根據(jù)病原誘導(dǎo)前后基因的表達(dá)量的差異大規(guī)模地鑒定植物抗病相關(guān)基因(Maleck等，2000，Nature Genet.26403-410；Schenk等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9711655-11660；Zhou等，2002，Science in China 45449-467)。目前，人們對抗病相關(guān)基因的認(rèn)識有限。根據(jù)已有報道，大多數(shù)抗病相關(guān)基因單獨作用時的抗性能力可能比抗病基因小。但根據(jù)下述原因，它們是值得大力開發(fā)的基因資源(1)由于絕大多數(shù)抗病相關(guān)基因的產(chǎn)物不需要直接與病原物相互作用，這類基因是具有持久抗性的基因資源；(2)大多數(shù)抗病相關(guān)基因參于的抗病反應(yīng)沒有病原特異性，因此它們是具有廣譜抗性的基因資源；(3)這類基因的資源豐富。
植物的抗病反應(yīng)可以分為兩大類。長期以來研究者們對這兩大類抗病反應(yīng)給予了不同名稱，如垂直抗性和水平抗性(Van Der Plank等，1968，Disease Resistance in Plants，Academic，New Youk)、質(zhì)量抗性和數(shù)量抗性(Ou等，1975，Phytopathology 651315-1316)或完全抗性和部分抗性(Parlevliet，1979，Annu.Rev.Phytopathol.1203-222)。質(zhì)量抗性(或垂直抗性或完全抗性)是抗病基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)。數(shù)量抗性(或水平抗性或部分抗性)是由數(shù)量性狀位點(quantitative trait locus，QTL)調(diào)控的抗病反應(yīng)，它被認(rèn)為無病原特異性，而且抗性持久(Roumen，1994，Rice Blast Disease，Zeigler等編著，CAB International，Cambridge，UK，pp.245-265)。目前，人們對植物抗病QTL的基因本質(zhì)還不清楚。因此，雖然水稻中已經(jīng)鑒定出了大量抗病QTL，如抗白葉枯病QTL(Li等，1999，Mol.Gen.Genet.26158-63)、抗稻瘟病QTL(Wang等，1994，Genetics 1361421-1434；Chen等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1002544-2549)、抗紋枯病QTL(Li等，1995，Theor.Appl.Genet.91382-388)和抗病毒病QTL(Albar等，1998，Theor.Appl.Genet.971145-1154)等，但這些抗性QTL沒有被很好地用于水稻品種抗病性的改良。
近年研究發(fā)現(xiàn)很多抗病相關(guān)基因的染色體位置與抗病QTL相對應(yīng)，提示這些抗病相關(guān)基因可能就是相對應(yīng)的QTL?？共∠嚓P(guān)基因的染色體位置與抗病QTL相對應(yīng)這一現(xiàn)象在多種植物中都被觀察到，包括水稻(Xiong等，2002，45518-526；Ramalingam等，2003，Mol.Plant-Microbe Interact.1614-24；Wen等，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339；Chu等，2004，Mol.Gen.Genomics 217111-120)、小麥(Faris等，1999，Theor.Appl.Genet.98219-225)、豆類(Geffroy等，2000，Mol.Plant-Microbe Interact.13287-296)和馬鈴薯(Trognitz等，2002，Mol.Plant-Microbe Interact.15587-597)。這些結(jié)果為采用候選基因策略分離、克隆和利用抗病QTL的基因提供了依據(jù)。
分離克隆抗病相關(guān)基因是利用這類基因改良植物抗病性的前提。同時，與抗病基因的應(yīng)用相比，抗病相關(guān)基因的應(yīng)用能提供植物更為廣譜及長效的抗性。通過超量表達(dá)抗病相關(guān)基因進(jìn)行農(nóng)作物品種的改良，將進(jìn)一步增強植物的抗病性，拓寬植物的抗譜；這些方面是采用常規(guī)植物育種和改良技術(shù)所不能達(dá)到的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從水稻中分離克隆一個抗病相關(guān)基因完整編碼區(qū)段的DNA片段，利用這個基因改良水稻或其它植物抵御病害的能力。這個基因被命名為OsDR3(Oryza sativa defenseresponsive 3)。
本發(fā)明涉及分離和應(yīng)用一種包含OsDR3基因的DNA片段，該片段賦予植物對由白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和稻瘟病菌(Pyricularia grisea)所引起的病害產(chǎn)生抗病反應(yīng)。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相當(dāng)于SEQ ID NO1所示的DNA序列，或者其功能相當(dāng)于SEQ ID NO1所示序列的亞片段。
OsDR3基因編碼的蛋白質(zhì)具有WRKY類蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域，表明其屬于WRKY類蛋白質(zhì)家族。
可以采用已經(jīng)克隆的OsDR3基因作探針，從cDNA和基因組文庫中篩選得到本發(fā)明的基因或同源基因。同樣，采用PCR(polymerase chain reaction)技術(shù)，也可以從基因組、mRNA和cDNA中擴增得到本發(fā)明的OsDR3基因以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。采用以上技術(shù)，可以分離得到包含OsDR3基因的序列，將這一序列與合適的載體連接，可以轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明為增強植物對細(xì)菌性和真菌性病害的抗性提供了一種新的方法。這種方法包括將OsDR3基因與超量表達(dá)、組成型啟動子(如玉米泛素啟動子)連接后轉(zhuǎn)入感病植物，通過超量表達(dá)OsDR3基因拓寬和增強植物對病原菌的抗性。
將克隆的抗病相關(guān)基因轉(zhuǎn)入感病的植物，有助于產(chǎn)生新的抗病植物。特別是可以用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在植株中累加多個抗性基因，而不會產(chǎn)生傳統(tǒng)育種技術(shù)中伴隨出現(xiàn)的連鎖基因組序列?？共∠嚓P(guān)基因的克隆是克服傳統(tǒng)育種不能在植物種間轉(zhuǎn)移抗病相關(guān)基因問題的前提。
本發(fā)明能夠進(jìn)一步提供或應(yīng)用利用上述DNA片段獲得的抗病的轉(zhuǎn)基因植株和相應(yīng)的種子，以及用本發(fā)明的基因或基于該基因的重組體轉(zhuǎn)化的植株或由這類植株獲得的種子?？梢杂糜行噪s交的方式將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)入其它的植株。
在本發(fā)明的實施例部分，我們闡述了OsDR3基因的分離、功能驗證和應(yīng)用過程以及該基因的特點。


序列表SEQ ID No1.本發(fā)明分離克隆的OsDR3基因的編碼區(qū)序列。
圖1.OsDR3基因位于水稻1號染色體，其染色體位置與兩個獨立研究鑒定的抗稻瘟病QTL(Wang等，1994，Genetics 1361421-1434；Chen等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1002544-2549)相對應(yīng)。
圖2.采用RT-PCR(reverse transcription-PCR)技術(shù)分析OsDR3基因在不同水稻材料接種病原菌或接水(control，對照)后的表達(dá)特征。(A)接種稻瘟病菌后OsDR3基因的表達(dá)；(B)接種白葉枯病菌后OsDR3基因的表達(dá)；1、2、3、4、5、6、7和8分別代表接種或接水后2小時、4小時、8小時、16小時、1天、3天、5天和7天。Actin為β-肌動蛋白。
圖3.水稻品種明恢63中覆蓋OsDR3基因區(qū)段的Shotgun亞克隆的重疊圖。箭頭的位置及長度表示測序的方向和長度，序號代表Shotgun亞克隆編號。通過序列拼接得到一條長2946bp的序列。
圖4.采用GENSCAN(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)基因結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件、參照擬南芥作為分析模板分析亞克隆7G7H14序列中所包含的基因的部分結(jié)果。圖中示預(yù)測的OsDR3基因的結(jié)構(gòu)。Gn代表基因編號；Ex代表外顯子；Init代表基因起始端外顯子；Term代表基因終止端外顯子；Prom代表基本啟動子；PlyA代表PolyA；S代表DNA鏈，其中“+”表示分析過程中輸入的DNA序列鏈；Begin代表外顯子、啟動子或PolyA在輸入DNA序列中的起始位置；End代表外顯子、啟動子或PolyA在輸入DNA序列中的終止位置；Len代表外顯子、啟動子或PolyA的序列長度(bp)；Fr代表翻譯閱讀框(每條DNA序列有3個翻譯閱讀框)；I/Ac代表3’剪切位點分值；Do/T代表5’剪切位點分值；CodRg代表翻譯區(qū)分值；P代表外顯子概率；Tscr代表外顯子分值。
圖5.用RT-PCR方法分析OsDR3基因的內(nèi)含子。圖中M代表2kb ladder(從上至下的6條帶大小分別是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp)，1是以明恢63總DNA為模板(對照)的擴增產(chǎn)物(359bp)，2是以接種病原后的明恢63RNA為模板的RT-PCR擴增產(chǎn)物(264bp)。
圖6.OsDR3基因的結(jié)構(gòu)及用于超量表達(dá)遺傳轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建的DNA片段長度和結(jié)構(gòu)。線條表示內(nèi)含子；柱條表示外顯子(編碼序列)；數(shù)字表示各個結(jié)構(gòu)的堿基數(shù)。長箭頭代表遺傳轉(zhuǎn)化水稻DNA片段的長度(2879bp)和相對應(yīng)基因結(jié)構(gòu)的位置。“ATG”和“TGA”分別是翻譯起始密碼和終止密碼。
圖7.OsDR3基因編碼的WRKY類蛋白質(zhì)的氨基酸序列。單下劃線處示W(wǎng)RKY結(jié)構(gòu)域的保守氨基酸序列；雙下劃線處示鋅指結(jié)構(gòu)中的保守的半胱氨酸(C)和組氨酸(H)位點。
圖8.(A)遺傳轉(zhuǎn)化載體pU1301的結(jié)構(gòu)；(B)遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1301的結(jié)構(gòu)。
圖9.轉(zhuǎn)基因水稻植株D11UM8-47的T1代植株接種稻瘟病菌菌株V86013后表現(xiàn)出抗感分離。明恢63為抗病對照；CO39為感病對照；牡丹江8號為遺傳轉(zhuǎn)化受體材料(對照)。
圖10.用RNA雜交技術(shù)檢測顯示抗白葉枯病菌能力增強的轉(zhuǎn)基因植株中的OsDR3基因的表達(dá)量都比基因供體明恢63和基因受體牡丹江8號高。RNA雜交用探針系來自O(shè)sDR3基因cDNA的部分片段。
具體實施例方式
本發(fā)明的前期研究工作結(jié)果顯示來源于水稻品種明恢63的cDNA克隆EI12I1是OsDR3基因的cDNA片段，OsDR3是一個抗病相關(guān)基因。主要依據(jù)有以下幾個方面(1)采用cDNA芯片技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)cDNA克隆EI12I1在水稻品系IRBB10接種白葉枯病菌菌株P(guān)XO86后表達(dá)量增加了2.9倍，在水稻品系C101A51接種稻瘟病菌菌株V86013后表達(dá)量增加了7.4倍(Zhou等，The defense-responsive genes showing enhanced and repressed expression afterpathogen infection in rice(Oryza sativa L.)，2002，Science in China 45449-467)。對EI12I1克隆的插入片段進(jìn)行測序，獲得一條長822bp的cDNA序列。序列分析顯示其編碼產(chǎn)物與WRKY類蛋白質(zhì)同源程度很高。鑒于EI12I1克隆在病原菌接種前后表達(dá)量有明顯差異以及序列特征，我們認(rèn)為cDNA克隆EI12I1所代表的基因參與植物的抗病反應(yīng)調(diào)控，是一個抗病相關(guān)基因(Zhou等，2002，Science in China 45449-467)。(2)采用BLAST分析方法(Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)將這條cDNA序列與公共核苷酸數(shù)據(jù)庫GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)中已知染色體位置的水稻基因組序列比較分析，將OsDR3基因定位于水稻1號染色體，其染色體位置與已知的抗稻瘟病QTL(Wang等，1994，Genetics1361421-1434；Chen等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1002544-2549)相對應(yīng)(圖1)，提示OsDR3可能就是相對應(yīng)的抗病QTL的基因(Wen等，Three types of defense-responsive genesare involved in resistance to bacterial blight and fungal blast diseases in rice，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339)。(3)利用12種水稻材料-病原菌組合分析OsDR3基因的表達(dá)模式(表1)(Wen等，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339)。被分析的水稻材料中，C101A51、C101LAC和CO39是抗稻瘟病近等基因系(Mackell和Bonman，1992，Phytopathology82746-749)，IRBB4、IRBB13和IR24是抗白葉枯病近等基因系(Ogawa等，1988，Rice Genet.Newslett.5106-107)。在RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)分析中，OsDR3基因特異性PCR引物EI12I1F(5’-CAGTAGCTCCAAGGGGTGTC-3’)和EI12I1R(5’-TTAAAGTTGGGGTTCCCATTC-3’)是根據(jù)該基因的cDNA片段克隆EI12I1的序列設(shè)計的；另外，用水稻β-肌動蛋白(actin)的PCR引物actinF(5’-TATGGTCAAGGCTGGGTTCG-3’)和actinR(5’-CCAT GCTCGATGGG-GTACTT-3’)的擴增產(chǎn)物作為樣品RNA量的標(biāo)準(zhǔn)。RT-PCR分析結(jié)果(圖2)顯示接種稻瘟病菌或白葉枯病菌后OsDR3基因在所有抗病水稻材料中的表達(dá)量都增加了，即病原菌可誘導(dǎo)增強OsDR3基因表達(dá)。這一誘導(dǎo)最早發(fā)生在病原侵染后8小時(圖2)。而OsDR3基因的表達(dá)在感病水稻材料接種病原菌后和所有水稻材料接水(對照)后無變化。這些結(jié)果進(jìn)一步證實OsDR3是一個抗病相關(guān)基因，它不僅參于水稻抗白葉枯病反應(yīng)的調(diào)控，也參于抗稻瘟病反應(yīng)的調(diào)控(Wen等，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339)。
表1.用于RT-PCR分析的水稻材料和病原菌組合


1水稻材料明恢63和珍汕97是我國常用雜交水稻的兩個親本；其它水稻材料是國際上常用白葉枯病和稻瘟病鑒定材料(Ogawa等，1988，Rice Genet.Newslett.5106-107；Mackell和Bonman，1992，Phytopathology82746-74)，由國際水稻研究所(IRRI)惠贈。
2白葉枯病菌菌株JL691是中國菌株(Yang等，2003，Theor.Appl.Genet.1061467-1472)，其它白葉枯病菌菌株和所有稻瘟病菌菌株是國際上常用白葉枯病和稻瘟病鑒定菌株(Wen等，Three types ofdefense-responsive genes are involved in resistance to bacterial blight and fungal blast diseases in rice，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339)，由國際水稻研究所惠贈。
以下實施例進(jìn)一步定義本發(fā)明，并描敘了本發(fā)明在上述前期研究工作結(jié)果的基礎(chǔ)上分離克隆OsDR3基因以及驗證OsDR3基因功能的方法。根據(jù)以下的描述和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。
實施例1分離克隆OsDR3基因1.從抗病水稻品種明恢63中分離克隆OsDR3基因本發(fā)明以上述cDNA克隆EI12I1做探針，從明恢63 BAC文庫(Peng等，A BAC libraryconstructed to the rice cultivar‘Minghui 63’for cloning genes of agronomic importance，1998，ActaBot.Sinica 401108-1114)中篩選到一個陽性BAC克隆7G7。用限制性內(nèi)切酶Hind III消化BAC克隆7G7，將酶切片段與Hind，III處理的pUC19載體(購自美國Amersham Biosciences公司)連接，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B(購自美國Invitrogen公司)，制備亞克隆。亞克隆經(jīng)用cDNA克隆EI12I1的序列設(shè)計的PCR引物EI12I1F(5’-CAGTAGCTCCAAGGGGTGTC-3’)和EI12I1R(5’-TTAAAGTTGGGGTTCCCATTC-3’)擴增檢測，獲得一個包含目標(biāo)基因片段的亞克隆7G7H14；該亞克隆的外源插入片段長約3.6kb。
2.測序分析亞克隆7G7H14本發(fā)明采用Shotgun的方法進(jìn)行測序(Sambrook和Russell，2001，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press)。將亞克隆7G7H14用超聲波打斷，通過1％瓊脂糖凝膠電泳分離大約1kb的DNA片段，純化后用T4-DNA聚合酶補平末端；將這些片段與限制性內(nèi)切酶Sma I處理的pUC18載體(購自美國Amersham Biosciences公司)連接，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，挑克隆檢測插入片段大小。選擇插入片段在1kb左右的克隆進(jìn)行測序。
采用M13-R和M13-F通用引物(購自中國上海生工生物工程公司)、美國Perkin Elmer公司的測序試劑盒(Big Dye Kit)、分別從每個亞克隆的兩端測序。共計對17個亞克隆進(jìn)行了測序(圖3)。使用Sequeneher 4.1軟件(美國Gene Codes Corporation)拼接序列。用該軟件自動去除末端測序較差的序列和pUC18載體序列。在重疊序列長度大于40bp、重疊序列的一致性大于95％的條件下進(jìn)行序列拼接，得到一段長2946bp的序列。目標(biāo)基因區(qū)段的每一個堿基都參照重疊在該位點的多個Shotgun片段的序列來確定。
實施例2OsDR3基因結(jié)構(gòu)分析1.總RNA的抽提總RNA的抽提采用TRIzol Reagent(購自美國Invitrogen公司)。操作方法按公司提供的試劑盒說明書進(jìn)行。
2.基因內(nèi)含子的確定采用基因預(yù)測軟件GenScan(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)對亞克隆7G7H14的序列(2946bp)進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)預(yù)測分析。分析結(jié)果顯示OsDR3基因從翻譯起始密碼至終止密碼長1195bp，包含3個外顯子(exon)和2個內(nèi)含子(intron)，起始外顯子長203bp，中間外顯子長150bp，末端外顯子長598bp；在起始外顯子和中間外顯子之間存在一個長95bp的內(nèi)含子，位于中間外顯子和末端外顯子之間的第2個內(nèi)含子長149bp(圖4)。因此，預(yù)測的OsDR3基因的閱讀框(open reading frame)長951bp。
為了驗證上述基因結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果的正確性，將預(yù)測的951bp的編碼序列與OsDR3基因的cDNA片段克隆EI12I1的序列(822bp)做BLAST分析，比較發(fā)現(xiàn)兩者重疊區(qū)的核酸序列一致，靠近3’末端的一個內(nèi)含子的插入位點兩側(cè)的外顯子序列完全匹配，表明GenScan分析軟件對這個內(nèi)含子的預(yù)測是正確的。
GenScan預(yù)測的第一個內(nèi)含子長95bp，在起始外顯子和中間外顯子之間，而起始外顯子僅203bp，使得這個內(nèi)含子十分接近基因的5’末端。由于EI12I1并非一條全長cDNA，其5’末端發(fā)生缺失，只有中間外顯子的一部分序列和末端外顯子，無起始外顯子序列，故不能通過序列比較來驗證第一個內(nèi)含子的存在。為了確定預(yù)測的第一個內(nèi)含子的正確性，本發(fā)明以預(yù)測的951bp編碼序列為模板設(shè)計一對PCR引物WRKY2F(5’-AGTCCGTCGACGAGCAAG-3’，位于序列表SEQ ID NO1所示序列的1177至1194bp處)和WRKY2R(5’-GGTAGGGAGAGC CCTTGATG-3’，位于序列表SEQ ID NO1所示序列的1535至1516bp處)；即WRKY2F引物位于起始外顯子而WRKY2R引物位于中間外顯子上，剛好跨越第一個預(yù)測的內(nèi)含子。以水稻品種明恢63接種病原后的RNA為模板做RT-PCR以及以明恢63基因組DNA為模板做PCR擴增，兩者擴增片段大小相差約100bp，剛好是預(yù)測的第一個內(nèi)含子的長度(圖5)。按照pGEM-T Vector System 1 kit試劑盒(購自美國Promega公司)的使用說明書，將RT-PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B(購自美國Invitrogen公司)，通過蘭白斑篩選獲得陽性克隆。對陽性克隆進(jìn)行測序，序列長264bp。將該序列與GenScan軟件預(yù)測的編碼序列比較，兩者序列完全一致。此結(jié)果證實GenScan軟件對第一個內(nèi)含子的預(yù)測也是正確的(圖6)。
實施例3OsDR3基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析根據(jù)BLAST分析結(jié)果，OsDR3基因編碼的蛋白質(zhì)由316個氨基酸組成，具有WRKY類蛋白質(zhì)家族典型的WRKY結(jié)構(gòu)域保守氨基酸序列WRKYGQK及特征性鋅指結(jié)構(gòu)的序列C-X5-C-X23-H-X-H(其中C代表半胱氨酸，H代表組氨酸，X代表任意氨基酸)(圖7)。Eulgem等(The WRKY superfamily of plant transcription factors，2000，Trends.Plant Sci.5199-206)根據(jù)WRKY類蛋白所包含WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)目以及鋅指模體的特征將WRKY蛋白分為三類第I類包含兩個WRKY結(jié)構(gòu)域及C-X4-5-C-X22-23-H-X-H鋅指結(jié)構(gòu)，第II類包含一個WRKY結(jié)構(gòu)域及同樣的C-X4-5-C-X22-23-H-X-H鋅指結(jié)構(gòu)，第III類包含一個WRKY結(jié)構(gòu)域，其鋅指結(jié)構(gòu)不同于以上的C2-H2模式，而是C2-HC模式(C-X7-C-X23-H-X-C)。根據(jù)以上分類，可將OsDR3基因編碼的WRKY類蛋白歸入第II類。
實施例4OsDR3基因的功能驗證和應(yīng)用1.遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建所用載體是我們實驗室構(gòu)建的pU1301。pU1301是在國際上常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1301(Sun等，2004，Xa26，a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae in rice，encoding a LRR receptor kinase-like protein.Plant Journal.37517-527)基礎(chǔ)上改建的，攜帶玉米泛素組成型、超量表達(dá)啟動子的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化載體(圖8)。pCAMBIA1301載體由澳大利亞CAMBIA實驗室(Center for the Application of MolecularBiology to International Agriculture)惠贈。
采用限制性內(nèi)切酶BamHI消化的方法，將OsDR3基因從重組質(zhì)粒7G7H14上酶切下來，回收外源片段(圖6)。同時，用BamHI酶切攜帶玉米泛素啟動子的遺傳轉(zhuǎn)化載體pU1301；酶切完畢，用氯仿異戊醇(24∶1)抽提，純化酶切產(chǎn)物。然后用去磷酸化酶Alk對純化的酶切產(chǎn)物進(jìn)行去磷酸化處理。用包含OsDR3基因的酶切片段和去磷酸化的載體做連接反應(yīng)。通過酶切篩選陽性克隆，并通過Xpn I酶切篩選外源片段正向插入的陽性克隆。獲得的重組質(zhì)粒載體被命名為D11U。
采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Hiei等，Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，1994，PlantJournal 6271-282)將D11U導(dǎo)入感病水稻品種牡丹江8號(Oryza sativa ssp.japonica)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化主要步驟和試劑如下(1)試劑和溶液縮寫6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-芐基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧芐青霉素)；KT(Kinetin，激動素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(CaseinEnzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(HygromycinB，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亞砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS小量成分溶液)(2)主要溶液配方1)N6max母液[10倍濃縮液(10X)]硝酸鉀(KNO3) 28.3g磷酸二氫鉀(KH2PO4) 4.0g硫酸銨(NH4)2SO4)4.63g硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 1.85g氯化鈣(CaCl2·2H2O) 1.66g逐一溶解，然后室溫下定容至1000ml。
2)N6mix母液[100倍濃縮液(100X)]碘化鉀(KI) 0.08g硼酸(H3BO3) 0.16g硫酸錳(MnSO4·4H2O) 0.44g硫酸鋅(ZnSO4·7H2O) 0.15g室溫下溶解并定容至1000ml。
3)Fe2EDTA貯存液(100X)在一個大三角瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵(FeSO4·7H2O)2.78g在另一個大三角瓶中加入300ml蒸餾水并加熱至70℃，然后加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O)3.73g在它們都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2小時，定容至1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 4)維生素貯存液(100X)煙酸(Nicotinic acid)0.1g維生素B1(Thiamine HCl) 0.1g維生素B6(Pyridoxine HCl)0.1g甘氨酸(Glycine) 0.2g肌醇(Inositol) 10g加水定容至1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 5)MSmax母液(10X)硝酸銨(NH4NO3)16.5g硝酸鉀 19.0g磷酸二氫鉀 1.7g硫酸鎂 3.7g氯化鈣 4.4g室溫下溶解并定容至1000ml。
6)MSmix母液(100X)碘化鉀 0.083g
硼酸 0.62g硫酸錳 0.86g鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)0.025g硫酸銅(CuSO4·5H2O) 0.0025g室溫下溶解并定容至1000ml。
7)2，4-D貯存液(1mg/ml)2，4-D 100mg.
1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，室溫保存。
8)6-BA貯存液(1mg/ml)6-BA 100mg.
1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，室溫保存。
9)NAA貯存液(1mg/ml)NAA 100mg.
1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 10)IAA貯存液(1mg/ml)IAA 100mg.
1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 11)葡萄糖貯存液(0.5g/ml)葡萄糖125g蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?br> 12)AS貯存液AS 0.392gDMSO 10ml分裝至1.5ml離心管內(nèi)，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 13)1N氫氧化鉀貯存液氫氧化鉀 5.6g蒸餾水溶解定容至100ml，室溫保存?zhèn)溆谩?br> (3)培養(yǎng)基配方1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6max母液(10X) 100mlN6mix母液(100X) 10mlFe2+EDTA貯存液(100X) 10ml維生素貯存液(100X) 10ml2，4-D貯存液2.5ml脯氨酸(Proline) 0.3gCH 0.6g蔗糖(Sucrose) 30g
Phytagel 3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。
2)繼代培養(yǎng)基N6max母液(10X) 100mlN6mix母液(100X) 10mlFe2+EDTA貯存液(100X) 10ml維生素貯存液(100X) 10ml2，4-D貯存液2.0ml脯氨酸 0.5gCH 0.6g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。
3)預(yù)培養(yǎng)基N6max母液(10X) 12.5mlN6mix母液(100X) 1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X) 2.5ml維生素貯存液(100X) 2.5ml2，4-D貯存液0.75mlCH 0.15g蔗糖5g瓊脂粉(Agarose) 1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。
使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250μl AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。
4)共培養(yǎng)基N6max母液(10X)12.5mlN6mix母液(100X) 1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X) 2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液 0.75mlCH0.2g蔗糖 5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。
使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250μl AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。
5)懸浮培養(yǎng)基N6max母液(10X) 5mlN6mix母液(100X)0.5mlFe2+EDTA貯存液(100X) 0.5ml
維生素貯存液(100X) 1ml2，4-D貯存液0.2mlCH 0.08g蔗糖2g加蒸餾水至100ml，調(diào)節(jié)pH值到5.4，分裝到兩個100ml的三角瓶中，封口滅菌。
使用前加入1ml葡萄糖貯存液和100μl AS貯存液。
6)選擇培養(yǎng)基N6max母液(10X) 25mlN6mix母液(100X) 2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X) 2.5ml維生素貯存液(100X) 2.5ml2，4-D貯存液0.625mlCH 0.15g蔗糖7.5g瓊脂粉 1.75g加蒸餾水至250ml，調(diào)節(jié)pH值到6.0，封口滅菌。
使用前溶解培養(yǎng)基，加入250μl HN和400ppm CN，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。
7)預(yù)分化培養(yǎng)基N6max母液(10X) 25mlN6mix母液(100X) 2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X) 2.5ml維生素貯存液(100X) 2.5ml6-BA貯存液 0.5mlKT貯存液0.5mlNAA貯存液 50μlIAA貯存液 50μlCH 0.15g蔗糖7.5g瓊脂粉 1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，封口滅菌。
使用前溶解培養(yǎng)基，加入250μl HN和200ppm CN，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。
8)分化培養(yǎng)基N6max母液(10X) 100mlN6mix母液(100X)10mlFe2+EDTA貯存液(100X) 10ml維生素貯存液(100X) 10ml6-BA貯存液 2mlKT貯存液 2mlNAA貯存液 0.2mlIAA貯存液 0.2mlCH 1g蔗糖 30g
Phytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6.0。
煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。
9)生根培養(yǎng)基MSmax母液(10X) 50mlMSmix母液(100X) 5mlFe2+EDTA貯存液(100X) 5ml維生素貯存液(100X) 5ml蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.8。
煮沸并定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。
(4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟3.1愈傷誘導(dǎo)(1)將成熟的水稻種子去殼，然后依次用70％的乙醇處理1分鐘，0.15％氯化汞(HgCl2)15分鐘；(2)滅菌水洗種子4-5次；(3)將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；(4)置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25±1℃。
3.2愈傷繼代挑選亮黃色、緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25±1℃。
3.3預(yù)培養(yǎng)挑選緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25±1℃。
3.4農(nóng)桿菌培養(yǎng)(1)在帶有對應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105兩天，溫度28℃；(2)將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28℃搖床上培養(yǎng)2-3小時。
3.5農(nóng)桿菌侵染(1)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；(2)調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至OD6000.8-1.0；(3)將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度19-20℃。
3.6愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)(1)滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；(2)浸泡在含400ppm羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；(3)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇2-3次，每次2周。(第一次潮霉素篩選濃度為400ppm，第二次以后為250ppm)3.7分化
(1)將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7周；(2)轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度26℃。
3.8生根(1)剪掉分化時產(chǎn)生的根；(2)然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26℃。
3.9移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時在最初的幾天保持水分濕潤。
獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植株被命名為D11UM8(其中D11U為遺傳轉(zhuǎn)化載體名稱，M8代表水稻品種牡丹江8號)。本發(fā)明共獲得獨立轉(zhuǎn)基因水稻植株47株。采用剪葉法(Kauffman等，An improved technique for evaluating resistance of rice varieties to Xanthomonas oryzae，1973，Plant Dis.Rep.57537-541)，對所有轉(zhuǎn)基因植株在成株期階段接種國際上常用的白葉枯病菌菌株P(guān)XO61(Sun等，2004，Xa26，a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae inrice，encoding a LRR receptor kinase-like protein.Plant Journal.37517-527)，發(fā)現(xiàn)13株轉(zhuǎn)基因水稻植株的抗白葉枯病菌侵害能力顯著(P≤0.05)增強(表2)；與轉(zhuǎn)基因的受體水稻品種牡丹江8號相比，這些轉(zhuǎn)基因植株的病斑面積減小了28.2-60.5％。
表2.部分?jǐn)y帶OsDR3基因的轉(zhuǎn)基因水稻植株對白葉枯病菌株P(guān)XO61的反應(yīng)

(1)每株轉(zhuǎn)基因植株接種5片葉，三周后調(diào)查病斑和病葉長度，每個數(shù)據(jù)來自于5片葉的平均值。
轉(zhuǎn)基因水稻植株對稻瘟病菌的抗性也增強。對轉(zhuǎn)基因植株D11UM8-47的T1代植株離體接種國際上常用的稻瘟病菌菌株V86013(Wen等，Three types of defense-responsive genes areinvolved in resistance to bacterial blight and fungal blast diseases in rice，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)這些植株表現(xiàn)出期望的抗感分離。與對照植株牡丹江8號相比，23株T1代植株中有9株表現(xiàn)抗性明顯提高(圖9)。
本發(fā)明是采用組成型、超量表達(dá)(玉米泛素)啟動子調(diào)控OsDR3基因的表達(dá)，因此在轉(zhuǎn)基因水稻植株中OsDR3基因的表達(dá)不會受病原侵染的影響。為了驗證轉(zhuǎn)基因植株的抗性增強是否與轉(zhuǎn)入的OsDR3基因的表達(dá)量有關(guān)，本發(fā)明采用RNA雜交技術(shù)對部分轉(zhuǎn)基因水稻植株中OsDR3基因的表達(dá)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示OsDR3基因的表達(dá)量與植株的抗性密切相關(guān)。在沒有病原侵染條件下轉(zhuǎn)基因受體水稻品種(牡丹江8號)、基因供體(明恢63)和感病轉(zhuǎn)基因水稻植株中基本上都不能檢測到OsDR3基因的表達(dá)，而抗性增強的轉(zhuǎn)基因植株中都可以檢測到OsDR3基因的表達(dá)(圖10)。這些結(jié)果進(jìn)一步證明OsDR3基因參于水稻抗病反應(yīng)的調(diào)控，并且超量表達(dá)OsDR3基因可以增強水稻的抗病性。
序列表SEQ ID NO1<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>水稻抗病相關(guān)基因OsDR3<130>
<141>2004-07-23<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2946<212>DNA<213>Oryza sativa<220>
<221>Intron<222>(1295)..(1389)<223>
<220>
<221>CDS<222>(1092)..(1294)<223>
<220>
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<220>
<221>CDS<222>(1689)..(2283)<223>
<220>
<221>Intron<222>(1540)..(1688)<223>
<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>a、c、g或t<220>
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<221>misc_feature<222>(2922)..(2922)<223>a、c、g或t<220>
<221>misc_feature<222>(2937)..(2937)<223>a、c、g或t<400>1tcagngggtt tggccncctg ncgtgaaccc ccgtganatg ngattattcg tnaggtagat 60catcgatcca agttttttca cgtgtccnct tgtagtaggg atcctccncg gttngatcga120gtccrrcgcc cmgacggatt gctamcaaac aatacataat cttctctttt tttgttgttg180agatatatat gatcacgtca cagggcggca ctggttctgg aggttcgtct gtgaattaaa240ccacgctaaa gtacagggta tccgtatagt attccttctc atgtacgatc tggtgtgtat300tgtgtttcca cggggatagc agcagaagca cggggatgat tggccagatc gggttaggga360gggggtcgcc atcgccgcct gcactagatt aatcgctcgc cccggcccag aacgtcgctc420tctccgtccg tccccggctc gccaccatct cctcctccaa gacgcaactt cgagagtgag480agagagagag aatcgagaga tccaatccag tttgcgcaac gagtggcatg gcatgcaacc540gatctagaac gtcaaataaa aacaacgcca tgcgtacata cacgttcatg tgccgcgcgc600cggtgtagcg cagcgtagag agagagagag agagagagta tggtagtctt cctacgctcg660gtcagtgaca gcgtcgcggc gcataaagaa aggcatccac tagcaggagc cagcatacgc720tgccgcatat acaaacacgc atgtagccaa ggcgaggaga gagagagaga gagagagaga780gagggagatc attgaaagct gcacccatcc gtttgttcgc caccatttcc atcccctcca840tcatgagctc caattagtcg cacaccgatc ccctcctctt cttccccccc ttctcctctc900tcctcttttt ttcctcatcc gtgcgcgata ctgcgcttag tttgtgggtg gggggagtga960tcatcaccaa agccacaaag ggggcgcgga gagatattat atattctttg ggaaagcgtt 1020ggattagttt ttctcgcttt gggcttttta tccggagttg gagtgtgtgt gcgccgggag 1080tggtggtggt g atg gcg gca gga gag gag gtg atg gat cgg tcg acg tcg1130Met Ala Ala Gly Glu Glu Val Met Asp Arg Ser Thr Ser1 5 10
gcc gag gac ggg tac tgc agc gcc ggc acg gac tcg ccg cgg gcg gag1178Ala Glu Asp Gly Tyr Cys Ser Ala Gly Thr Asp Ser Pro Arg Ala Glu15 20 25tcc gtc gac gag caa ggg gcc gcc gag gag tcg tcg ccc cgg gga ggg1226Ser Val Asp Glu Gln Gly Ala Ala Glu Glu Ser Ser Pro Arg Gly Gly30 35 40 45cag aag cgg gag ctc ccc tcg ccg tcg gct tcg ccg tcg tcc ccg ctg1274Gln Lys Arg Glu Leu Pro Ser Pro Ser Ala Ser Pro Ser Ser Pro Leu50 55 60cca cct gcc gcg aag cgc ag gtacggataa tattatggct cggtctgcga 1324Pro Pro Ala Ala Lys Arg Ser65ttgattaaag ccctaggtag gatttaggga tagaggattg attggtgttt ggttggtttg 1384agcag c cgg agg tca gtg gag aag cgg gtg gtg tcc gtg ccg atc gcg1432Arg Arg Ser Val Glu Lys Arg Val Val Ser Val Pro Ile Ala70 75 80gag tgc ggc gac cgg ccg aag ggc gcc ggg gag ggg ccg ccg ccg tcg1480Glu Cys Gly Asp Arg Pro Lys Gly Ala Gly Glu Gly Pro Pro Pro Ser85 90 95gac tcg tgg gcc tgg cgc aag tac ggc cag aag ccc atc aag ggc tct1528Asp Ser Trp Ala Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Pro Ile Lys Gly Ser100 105 110ccc tac cca ag gtaattaggc tttatattca gtttggttga tattcttgag1579Pro Tyr Pro Arg115cctgttgatt agttgccgtg ctgattaatc actgcaatta gatcagttaa acggttgttg 1639aagtggcaag atttaatttg ggtttgttgc ttgtgtttat tatgctcag g ggg tac1695Gly Tyr120tac agg tgc agt agc tcc aag ggg tgt ccg gcg agg aag cag gtg gag1743Tyr Arg Cys Ser Ser Ser Lys Gly Cys Pro Ala Arg Lys Gln Val Glu125 130 135cgc agc cgc gcc gac ccc acc gtg ctg ctc gtc acc tac tcc ttc gag1791Arg Ser Arg Ala Asp Pro Thr Val Leu Leu Val Thr Tyr Ser Phe Glu140 145 150
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Glu Gln Glu Ser Glu Pro Val Val Lys Gln Glu Glu Glu Gln Lys Glu210 215 220Glu Gln Lys Ala Val Val Glu Pro Ala Ala Val Thr Thr Thr Val Ala225 230 235 240Pro Ala Pro Ala Val Glu Glu Glu Asp Glu Asn Phe Asp Phe Gly Trp245 250 255Ile Asp Gln Tyr His Pro Thr Trp His Arg Ser Tyr Ala pro Leu Leu260 265 270Pro Pro Glu Glu Trp Glu Arg Glu Leu Gln Gly Asp Asp Ala Leu Phe275 280 285Ala Gly Leu Gly Glu Leu Pro Glu Cys Ala Val Val Phe Gly Arg Arg290 295 300Arg Glu Leu Gly Leu Ala Ala Thr Ala Pro Cys Ser305 310 31權(quán)利要求
1.賦予植物對病害產(chǎn)生抗性的DNA片段，其中所述的片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相當(dāng)于SEQ ID NO1所示序列，或者與SEQ ID NO1所示序列的一部分功能等同的亞片段。
2.權(quán)利要求1的DNA片段，其核苷酸序列包含全長的OsDR3基因編碼序列，該基因編碼的蛋白質(zhì)具有WRKY類蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
3.權(quán)利要求1中的DNA片段，其中的基因編碼區(qū)與其它的基因形成嵌合基因，或者其中的基因經(jīng)過修飾改造。
4.一種增加植物對白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和稻瘟病菌(Pyricularia grisea Sacc.)抗性的方法，該方法包括將權(quán)利要求1的DNA片段連接上合適的啟動子轉(zhuǎn)入植物體或?qū)?quán)利要求1的DNA片段和其它的DNA片段組成嵌合基因轉(zhuǎn)入植物或?qū)?quán)利要求1的DNA片段經(jīng)過修飾改造后轉(zhuǎn)入植物體，增加植物對病原菌的抗性。
5.基因組中包含權(quán)利要求1、2、3中的DNA片段的轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因植物種子的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種水稻DNA片斷的分離克隆、功能驗證和應(yīng)用。所述的DNA片斷包含水稻抗病相關(guān)基因OsDR3，編碼WRKY類蛋白質(zhì)，它能夠賦予植物抵抗由病原菌引起的病害。將該片段與其外源調(diào)節(jié)序列直接轉(zhuǎn)入植物體，轉(zhuǎn)基因植物對病原菌的抵抗能力顯著增強。
文檔編號A01H5/10GK1737142SQ20041000945
公開日2006年2月22日 申請日期2004年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月19日
發(fā)明者王石平, 邱德運, 熊敏 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)