專利名稱：水稻抗病相關(guān)基因OsDR2的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種水稻DNA片段的分離克隆、功能驗(yàn)證和應(yīng)用。所述的DNA片段能夠顯著提高植物抵抗病害的能力。將該片段的完整翻譯區(qū)(codingsequence)與玉米的泛素(ubiquitin)啟動(dòng)子結(jié)合后直接轉(zhuǎn)入感病植物體，轉(zhuǎn)基因植株的抗病能力顯著提高。
背景技術(shù)：
植物在生長(zhǎng)的過程中，受到多種病原物的侵害。植物病原物的種類繁多，包括病毒、細(xì)菌、霉菌和線蟲等。病原物侵入植物導(dǎo)致兩種結(jié)果(1)病原體成功的在寄主植物內(nèi)繁殖，引起相關(guān)的病癥；(2)寄主植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)，殺死病原物或阻止其生長(zhǎng)。利用抗性基因資源改良植物的抗病性，是預(yù)防病害同時(shí)又保護(hù)環(huán)境的根本出路。
植物的抗病反應(yīng)是多基因參于調(diào)控的復(fù)雜過程。參于植物抗病反應(yīng)的基因分為兩類(1)抗病基因，又稱R(resistance)基因和(2)抗病相關(guān)基因。
根據(jù)目前人們對(duì)抗病基因功能的認(rèn)識(shí)，這類基因的產(chǎn)物主要是作為受體，直接或間接與病原蛋白相互作用，啟動(dòng)植物體內(nèi)的抗病信號(hào)傳導(dǎo)路徑(Tang等，1996，Science 2742060-2063；Baker等，1997，Science 276726-733；Jia等，2000，EMBO J.194004-4014；Dangl和Jones，2001，Nature 411826-833；Nimchuk等，2001，Curt.Opin.Plant Biol.4288-294)?？共』蚪閷?dǎo)的抗病反應(yīng)抗性強(qiáng)，是很好的基因資源。但由于下述原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制(1)抗病基因的資源有限，如目前知道的抵抗水稻重要病害白葉枯病的抗病基因少于30個(gè)，抵抗另一水稻重要病害-稻瘟病的抗病基因也只有大約40個(gè)；(2)抗病基因具有病原種類和病原生理小種特異性，抗病范圍有限；(3)因?yàn)椴≡目焖偻蛔?，一個(gè)抗病基因的作用往往幾年或者十幾年后就喪失了。
抗病相關(guān)基因是指除抗病基因外所有參于抗病反應(yīng)的基因，它們的編碼產(chǎn)物參于合成植物體內(nèi)抗病信號(hào)分子、參于信號(hào)傳導(dǎo)或參于防衛(wèi)反應(yīng)等。這類基因的共同特點(diǎn)是病原誘導(dǎo)后它們的表達(dá)量升高或減少，因此人們可以根據(jù)病原誘導(dǎo)前后基因的表達(dá)量的差異大規(guī)模地鑒定植物抗病相關(guān)基因(Maleck等，2000，Nature Genet.26403-410；Schenk等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9711655-11660；Zhou等，2002，Science in China 45449-467)。目前，人們對(duì)抗病相關(guān)基因的認(rèn)識(shí)有限。根據(jù)已有報(bào)道，大多數(shù)抗病相關(guān)基因單獨(dú)作用時(shí)的抗性能力可能比抗病基因小。但根據(jù)下述原因，它們是值得大力開發(fā)的基因資源(1)由于絕大多數(shù)抗病相關(guān)基因的產(chǎn)物不需要直接與病原物相互作用，這類基因是具有持久抗性的基因資源；(2)大多數(shù)抗病相關(guān)基因參于的抗病反應(yīng)沒有病原特異性，因此它們是具有廣譜抗性的基因資源；(3)這類基因的資源豐富。
植物的抗病反應(yīng)可以分為兩大類。長(zhǎng)期以來研究者們對(duì)這兩大類抗病反應(yīng)給予了不同名稱，如垂直抗性和水平抗性(Van Der Plank等，1968，Disease Resistance in Plants，Academic，New Youk)、質(zhì)量抗性和數(shù)量抗性(Ou等，1975，Phytopathology 651315-1316)、完全抗性和部分抗性(Parlevliet，1979，Annu.Rev.Phytopathol.1203-222)。質(zhì)量抗性(或垂直抗性或完全抗性)是抗病基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)。數(shù)量抗性(或水平抗性或部分抗性)是由數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitative trait locus，QTL)調(diào)控的抗病反應(yīng)，它被認(rèn)為無病原特異性，而且抗性持久(Roumen，1994，Rice Blast Disease，Zeigler等編著，CAB Intemational，Cambridge，UK，pp.245-265)。目前，人們對(duì)植物抗病QTL的基因本質(zhì)還不清楚。因此，雖然水稻中已經(jīng)鑒定出了大量抗病QTL，如抗白葉枯病QTL(Li等，1999，Mol.Gen.Genet.26158-63)、抗稻瘟病QTL(Wang等，1994，Genetics 1361421-1434；Chen等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1002544-2549)、抗紋枯病QTL(Li等，1995，Theor.Appl.Genet.91382-388)和抗病毒病QTL(Albar等，1998，Theor.Appl.Genet.971145-1154)等，但這些抗性QTL沒有被很好地用于水稻品種抗病性的改良。
近年研究發(fā)現(xiàn)很多抗病相關(guān)基因的染色體位置與抗病QTL相對(duì)應(yīng)，提示這些抗病相關(guān)基因可能就是相對(duì)應(yīng)的QTL?？共∠嚓P(guān)基因的染色體位置與抗病QTL相對(duì)應(yīng)這一現(xiàn)象在多種植物中都被觀察到，包括水稻(Xiong等，2002，45518-526；Ramalingam等，2003，Mol.Plant-Microbe Interact.1614-24；Wen等，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339；Chu等，2004，Mol.Gen.Genomics 271111-120)、小麥(Faris等，1999，Theor.Appl.Genet.98219-225)、豆類(Geffroy等，2000，Mol.Plant-Microbe Interact.13287-296)和馬鈴薯(Trognitz等，2002，Mol.Plant-Microbe Interact.15587-597)。這些結(jié)果為采用候選基因策略分離、克隆和利用抗病QTL的基因提供了依據(jù)。
分離克隆抗病相關(guān)基因是利用這類基因改良植物抗病性的前提。同時(shí)，與抗病基因的應(yīng)用相比，抗病相關(guān)基因的應(yīng)用能提供植物更為廣譜及長(zhǎng)效的抗性。通過超量表達(dá)抗病相關(guān)基因進(jìn)行農(nóng)作物品種的改良，將進(jìn)一步增強(qiáng)植物的抗病性，拓寬植物的抗譜；這些方面是采用常規(guī)植物育種和改良技術(shù)所不能達(dá)到的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從水稻中分離克隆一個(gè)抗病相關(guān)基因完整編碼區(qū)段的DNA片段，利用這個(gè)基因改良水稻或其它植物抵御病害的能力。這個(gè)基因被命名為OsDR2(Oryza sativa defenseresponsive 2)。
本發(fā)明涉及分離和應(yīng)用一種包含OsDR2基因的DNA片段，該片段賦予植物對(duì)由白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和稻瘟病菌(Pyricularia grisea)所引起的病害產(chǎn)生抗病反應(yīng)。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相當(dāng)于SEQ ID NO1所示的DNA序列，或者其功能相當(dāng)于SEQ ID NO1所示序列的亞片段。
可以采用已經(jīng)克隆的OsDR2基因作探針，從cDNA和基因組文庫中篩選得到本發(fā)明的基因或同源基因。同樣，采用PCR(polymerase chain reaction)技術(shù)，也可以從基因組、mRNA和cDNA中擴(kuò)增得到本發(fā)明的OsDR2基因以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。采用以上技術(shù)，可以分離得到包含OsDR2基因的序列，將這一序列與合適的載體連接，可以轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明為增強(qiáng)植物對(duì)細(xì)菌性和真菌性病害的抗性提供了一種新的方法。這種方法包括將OsDR2基因和超量表達(dá)、組成型啟動(dòng)子(如玉米泛素啟動(dòng)子)連接后轉(zhuǎn)入感病植物，通過超量表達(dá)OsDR2基因拓寬和增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的抗性。
將克隆的抗病相關(guān)基因轉(zhuǎn)入感病的植物，有助于產(chǎn)生新的抗病植物。特別是可以用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在植株中累加多個(gè)抗性基因，而不會(huì)產(chǎn)生傳統(tǒng)育種技術(shù)中伴隨出現(xiàn)的連鎖基因組序列?？共∠嚓P(guān)基因的克隆是克服傳統(tǒng)育種不能在植物種間轉(zhuǎn)移抗病相關(guān)基因問題的前提。
本發(fā)明能夠進(jìn)一步提供或應(yīng)用利用上述DNA片段獲得的抗病的轉(zhuǎn)基因植株和相應(yīng)的種子，以及用本發(fā)明的基因或基于該基因的重組體轉(zhuǎn)化的植株或由這類植株獲得的種子。可以用有性雜交的方式將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)入其它的植株。
在本發(fā)明的實(shí)施例部分，我們闡述了OsDR2基因的分離、功能驗(yàn)證和應(yīng)用過程以及該基因的特點(diǎn)。


序列表SEQ ID No1.本發(fā)明分離克隆的OsDR2基因的編碼區(qū)序列。
圖1.OsDR2基因位于水稻7號(hào)染色體，其染色體位置與已知抗稻瘟病QTL(Chen等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1002544-2549)相對(duì)應(yīng)。
圖2.采用RT-PCR(reverse transcription-PCR)技術(shù)分析OsDR2基因在不同水稻材料接種病原菌或接水(CK，對(duì)照)后的表達(dá)特征。(A)接種稻瘟病菌后OsDR2基因的表達(dá)；(B)接種白葉枯病菌后OsDR2基因的表達(dá)；1、2、3、4、5、6、7和8分別代表接種或接水后2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)、16小時(shí)、1天、3天、5天和7天。Actin為β-肌動(dòng)蛋白。
圖3.采用BLAST分析方法(Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)發(fā)現(xiàn)EI5P11克隆的cDNA序列(Query)與GenBank核苷酸數(shù)據(jù)庫中的AP003846序列(Sbjct)同源性為96％。
圖4.采用GENSCAN(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件、參照擬南芥作為分析模板分析AP003846序列中所包含的基因的部分結(jié)果。圖中示與OsDR2基因同源基因的結(jié)構(gòu)。Gn代表基因編號(hào)；Ex代表外顯子；Init代表基因起始端外顯子；Term代表基因終止端外顯子；Prom代表基本啟動(dòng)子；PlyA代表PolyA；S代表DNA鏈，其中“+”表示分析過程中輸入的DNA序列鏈；Begin代表外顯子、啟動(dòng)子或PolyA在輸入DNA序列中的起始位置；End代表外顯子、啟動(dòng)子或PolyA在輸入DNA序列中的終止位置；Len代表外顯子、啟動(dòng)子或PolyA的序列長(zhǎng)度(bp)；Fr代表翻譯閱讀框(每條DNA序列有3個(gè)翻譯閱讀框)；I/Ac代表3’剪切位點(diǎn)分值；Do/T代表5’剪切位點(diǎn)分值；CodRg代表翻譯區(qū)分值；P代表外顯子概率；Tscr代表外顯子分值。
圖5.水稻品系C101LAC中覆蓋OsDR2基因區(qū)段的亞克隆的重疊圖。圖中長(zhǎng)線條代表從水稻品系C101LAC中獲得的PCR擴(kuò)增片段的大小和限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。箭頭的位置及長(zhǎng)度表示亞克隆序列在PCR擴(kuò)增片段中的位置及長(zhǎng)度，箭頭方向表示亞克隆測(cè)序的方向，序列拼接得到一條長(zhǎng)2212bp的序列。
圖6.采用GENSCAN(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件、參照擬南芥作為分析模板分析從水稻品系C101LAC中獲得的2212bp、包含OsDR2基因的序列。分析結(jié)果顯示該序列包含OsDR2基因完整的編碼序列。圖中Gn代表基因編號(hào)；Ex代表外顯子；Init代表基因起始端外顯子；Term代表基因終止端外顯子；Prom代表基本啟動(dòng)子；PlyA代表PolyA；S代表DNA鏈，其中“+”表示分析過程中輸入的DNA序列鏈；Begin代表外顯子、啟動(dòng)子或PolyA在輸入DNA序列中的起始位置；End代表外顯子、啟動(dòng)子或PolyA在輸入DNA序列中的終止位置；Len代表外顯子、啟動(dòng)子或PolyA的序列長(zhǎng)度(bp)；Fr代表翻譯閱讀框(每條DNA序列有3個(gè)翻譯閱讀框)；I/Ac代表3’剪切位點(diǎn)分值；Do/T代表5’剪切位點(diǎn)分值；CodRg代表翻譯區(qū)分值；P代表外顯子概率；Tscr代表外顯子分值。
圖7.用RT-PCR方法分析OsDR2基因的內(nèi)含子。圖中M代表2kb ladder(由上至下的電泳帶分別為2000、1000、750、500、250和100bp)，1為RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(493bp)、2是以C101LAC總DNA為模板(對(duì)照)的擴(kuò)增產(chǎn)物(587bp)。
圖8.OsDR2基因的結(jié)構(gòu)及用于超量表達(dá)遺傳轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建的DNA片段長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)。線條表示內(nèi)含子；柱條表示外顯子(編碼序列)；數(shù)字表示各個(gè)結(jié)構(gòu)的堿基數(shù)。長(zhǎng)箭頭代表遺傳轉(zhuǎn)化水稻DNA片段的長(zhǎng)度(2212bp)和相對(duì)應(yīng)基因結(jié)構(gòu)的位置。“ATG”和“TAG”分別是翻譯起始密碼和終止密碼。
圖9.(A)遺傳轉(zhuǎn)化載體pU1301的結(jié)構(gòu)；(B)遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1301的結(jié)構(gòu)。
圖10.用RNA雜交技術(shù)檢測(cè)顯示OsDR2基因的表達(dá)增強(qiáng)與轉(zhuǎn)基因植株的抗性增強(qiáng)相關(guān)。RNA雜交用探針系采用5P11F2和5P11GSP2引物擴(kuò)增獲得的RT-PCR產(chǎn)物。
圖11.轉(zhuǎn)基因水稻植株接種稻瘟病菌IK81-3后表現(xiàn)出抗性增強(qiáng)。水稻品種牡丹江8號(hào)為遺傳轉(zhuǎn)化受體材料(對(duì)照)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的前期研究工作結(jié)果顯示來源于水稻品種明恢63的cDNA克隆EI5P11是OsDR2基因的cDNA片段，OsDR2是一個(gè)抗病相關(guān)基因。主要依據(jù)有以下幾個(gè)方面(1)采用cDNA芯片技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)cDNA克隆EI5P11在水稻品種明恢63接種稻瘟病菌株V86013后表達(dá)量增加了3.2倍(Zhou等，The defense-responsive genes showing enhanced and repressed expressionafter pathogen infection in rice(Oryza sativa L.)，2002，Science in China 45449-467)。對(duì)EI5P11克隆的插入片段進(jìn)行測(cè)序，獲得一條長(zhǎng)1634bp的cDNA序列。序列分析顯示其編碼產(chǎn)物與生長(zhǎng)素反應(yīng)類蛋白質(zhì)同源程度很高。鑒于EI5P11克隆在病原菌接種前后表達(dá)量有明顯差異以及序列特征，我們認(rèn)為cDNA克隆EI5P11所代表的基因參與植物的抗病反應(yīng)調(diào)控，是一個(gè)抗病相關(guān)基因。(2)采用BLAST分析方法(Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)將這條cDNA序列與公共核苷酸數(shù)據(jù)庫GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)中已知染色體位置的水稻基因組序列比較分析，將OsDR2基因定位于水稻7號(hào)染色體，其染色體位置與已知的抗稻瘟病QTL(Chen等，Comparative analyses of genomic locations and race specificitiesof loci for quantitative resistance to Pyricularia grisea in rice and barley，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1002544-2549)相對(duì)應(yīng)(圖1)，提示OsDR2可能就是相對(duì)應(yīng)的抗病QTL的基因(Wen等，Three types of defense-responsive genes are involved in resistance to bacterial blight and fungalblast diseases in rice，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339)。(3)利用12種水稻材料一病原菌組合分析OsDR2基因的表達(dá)模式(表1)(Wen等，2003，Mol.Gen.Genomics269331-339)。被分析的水稻材料中，C101A51、C101LAC和CO39是抗稻瘟病近等基因系(Mackell和Bonman，1992，Phytopathology 82746-749)，IRBB4、IRBB13和IR24是抗白葉枯病近等基因系(Ogawa等，1988，Rice Genet.Newslett.5106-107)。在RT-PCR(reversetranscription-polymerase chain reaction)分析中，OsDR2基因特異性PCR引物5P11F(5’ATGTACGCGCAGATGGTGT3’)和5P11R(5’-GGTTTGAGCCCAATTTAGCA-3’)是根據(jù)該基因的cDNA片段克隆EI5P11的序列設(shè)計(jì)的；另外，用水稻β-肌動(dòng)蛋白(actin)的PCR引物actinF(5’-TATGGTCAAGGCTGGGTTCG-3’)和actinR(5’-CCATGCTCGATGGG-GTACTT-3’)的擴(kuò)增產(chǎn)物作為樣品RNA量的標(biāo)準(zhǔn)。RT-PCR分析結(jié)果(圖2)顯示接種稻瘟病菌或白葉枯病菌后OsDR2基因在所有抗病水稻材料中的表達(dá)量都增加了，即病原菌可誘導(dǎo)增強(qiáng)OsDR2基因表達(dá)。這一誘導(dǎo)最早發(fā)生在病原侵染后16小時(shí)(圖2)。而OsDR2基因的表達(dá)在感病水稻材料接種病原菌后(珍汕97接種白葉枯病菌JL691除外)和所有水稻材料接水(對(duì)照)后無變化。感病水稻品種珍汕97在接種白葉枯病菌JL691后OsDR2基因也出現(xiàn)在抗病水稻品種中的表達(dá)模式，但該基因的表達(dá)量不如在抗病品種中高。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)OsDR2是一個(gè)抗病相關(guān)基因，它不僅參于水稻抗白葉枯病反應(yīng)的調(diào)控，也參于抗稻瘟病反應(yīng)的調(diào)控(Wen等，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339)。
表1.用于RT-PCR分析的水稻材料和病原菌組合

1水稻材料明恢63和珍汕97是我國(guó)常用雜交水稻的兩個(gè)親本；其它水稻材料是國(guó)際上常用白葉枯病和稻瘟病鑒定材料(Ogawa等，1988，Rice Genet.Newslett.5106-107；Mackell和Bonman，1992，Phytopathology82746-74)，由國(guó)際水稻研究所(IRRI)惠贈(zèng)。
2白葉枯病菌菌株JL691是中國(guó)菌株(Yang等，2003，Theor.Appl.Genet.1061467-1472)，其它白葉枯病菌菌株和所有稻瘟病菌菌株是國(guó)際上常用白葉枯病和稻瘟病鑒定菌株(Wen等，Three types ofdefense-responsive genes are involved in resistance to bacterial blight and fungal blast diseases in rice，2003，Mol.Gen.Genomics 269331-339)，由國(guó)際水稻研究所惠贈(zèng)。
以下實(shí)施例進(jìn)一步定義本發(fā)明，并描敘了本發(fā)明在上述前期研究工作結(jié)果的基礎(chǔ)上分離克隆OsDR2基因以及驗(yàn)證OsDR2基因功能的方法。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。
實(shí)施例1分離克隆OsDR2基因1.與OsDR2基因同源基因結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)本發(fā)明以上述cDNA克隆EI5P11的序列(1634bp)作模板，用BLAST分析方法(Altschul等，1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)檢索公共核苷酸數(shù)據(jù)庫GenBank(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫中來自水稻品種日本晴的一條位于水稻7號(hào)染色體、長(zhǎng)136,107bp的序列(GenBank注冊(cè)號(hào)AP003846)的一段(第31,101至29,570bp處)與EI5P11序列的27至1555處的同源性達(dá)到96％(E值＝0)，提示AP003846中包含與OsDR2同源的基因(圖3)。
采用GENSCAN(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件分析AP003846序列中所包含的基因。分析結(jié)果顯示與EI5P11 cDNA序列同源的基因的編碼序列位于AP003846序列的31,751至29,840bp處(圖4)。
2.從抗稻瘟病水稻品系C101LAC中分離克隆OsDR2基因本發(fā)明的上述前期研究結(jié)果已證明抗稻瘟病水稻品系C101LAC攜帶有功能的OsDR2基因(圖2)。本發(fā)明根據(jù)AP003846序列中與EI5P11 cDNA序列同源基因的編碼區(qū)兩側(cè)的序列設(shè)計(jì)PCR引物5P11F1(5’-TTTTCTTGTTCGGGGTTGAG-3’，位于AP003846序列的31,776至31,757bp處)和5P11R2(5’-CGGTTTTGGAGGACAGGTTA-3’，位于AP003846序列的29,565至29,584bp處)，從C101LAC中擴(kuò)增OsDR2基因的全長(zhǎng)編碼區(qū)，獲得一個(gè)大約2.2kb的PCR產(chǎn)物。將這一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到質(zhì)粒載體pGEM-T(購自美國(guó)Promega公司)上，命名這個(gè)重組質(zhì)粒為T5P11。
本發(fā)明分別用NcoI和PvuII限制性內(nèi)切酶消化T5P11質(zhì)粒，構(gòu)建上述PCR產(chǎn)物的亞克隆。通過1％瓊脂糖凝膠電泳回收酶切片段，純化后用T4-DNA聚合酶補(bǔ)平末端，與限制性內(nèi)切酶SmaI消化處理的去磷酸化的pUC19(購自美國(guó)Amersham Biosciences公司)載體平端連接，電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B(購自美國(guó)Invitrogen公司)，通過藍(lán)白斑篩選獲得陽性亞克隆。提取陽性亞克隆質(zhì)粒，并與空pUC19質(zhì)粒進(jìn)行電泳比較，剔除假陽性克隆及小片段克隆，或用BamHI和EcoRI雙酶切處理，檢測(cè)陽性克隆插入片段大小。
采用M13-R和M13-F通用引物(購自中國(guó)上海生工生物工程公司)、美國(guó)Perkin Elmer公司的測(cè)序試劑盒(Big Dye Kit)、分別從每個(gè)亞克隆的兩端測(cè)序。共計(jì)對(duì)6個(gè)亞克隆進(jìn)行了測(cè)序(圖5)。對(duì)這6條亞克隆的序列進(jìn)行拼接，得到一條長(zhǎng)2212bp的序列。
采用GENSCAN(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件分析這條2212bp長(zhǎng)的序列，證明它包含OsDR2基因的完整的編碼序列(圖6)。將來源于C101LAC的OsDR2基因的編碼區(qū)序列與水稻品種日本晴基因組序列AP003846上的同源基因的序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)存在一個(gè)堿基的差異(序列表SEQ ID NO1所示序列的1880bp處)，OsDR2基因中的腺嘌呤(A)替換了其日本晴中同源基因的鳥嘌呤(G)，但此堿基的差異不引起編碼的氨基酸序列的差異。
實(shí)施例2OsDR2基因結(jié)構(gòu)分析1.總RNA的抽提總RNA的抽提采用TRIzol Reagent(購自美國(guó)Invitrogen公司)。操作方法按公司提供的試劑盒說明書進(jìn)行。
2.基因內(nèi)含子的確定采用基因預(yù)測(cè)軟件GENSCAN(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)對(duì)包含OsDR2基因區(qū)段的基因組DNA序列(2212bp)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示OsDR2基因的編碼區(qū)段中存在一個(gè)內(nèi)含子(圖6)。本發(fā)明根據(jù)預(yù)測(cè)的內(nèi)含子兩側(cè)的DNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物5P11F2(5’-GTTCATCGACGAGATGACCA-3’，位于序列表SEQ ID NO1所示序列的118至137bp處)和5P11GSP2(5’-GTCGTAC GGCCGGTTCTTGA-3’，位于序列表SEQ ID NO1所示序列的704至685bp處)。用這一對(duì)PCR引物擴(kuò)增基因組DNA和RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，結(jié)果顯示RT-PCR產(chǎn)物比從基因組中擴(kuò)增出的產(chǎn)物小(圖7)，說明該區(qū)段確實(shí)存在一個(gè)內(nèi)含子。按照pGEM-T Vector System 1 kit試劑盒(購自美國(guó)Promega公司)的使用說明書，將RT-PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B(購自美國(guó)Invitrogen公司)，通過蘭白斑篩選獲得陽性克隆。對(duì)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序、并與基因組DNA序列比較，確定OsDR2基因內(nèi)含子的實(shí)際大小是94bp(圖8)，比預(yù)測(cè)的內(nèi)含子長(zhǎng)(圖6)。根據(jù)這一結(jié)果OsDR2基因編碼區(qū)被內(nèi)含子分為兩段，分別長(zhǎng)443bp和1375bp(圖8)。
實(shí)施例3OsDR2基因編碼產(chǎn)物的分析根據(jù)BLAST分析結(jié)果，OsDR2基因編碼的蛋白質(zhì)與一類生長(zhǎng)素反應(yīng)蛋白有較高的同源性。如OsDR2基因的編碼產(chǎn)物與大豆GH3基因的編碼產(chǎn)物(Hagen等，Auxin-induced expressionof the soybean GH3 promoter in transgenic tobacco plants，1991，Plant Mol.Biol.17567-579)的氨基酸一致性為67％(E值＝0)，與煙草的cDNA Nt-gh3的編碼產(chǎn)物(Roux和Perrot-Rechenmann，Isolation by differential display and characterization of a tobaccoauxin-responsive cDNA Nt-gh3 related to GH3，1997，F(xiàn)EBS Lett.419131-136)的氨基酸一致性為75％(E值＝0)，與擬南芥DFL1基因的編碼產(chǎn)物(Nakazawa等，DFL1，an auxin-responsiveGH3 gene homologue，negatively regulates shoot cell elongation and lateral root formation，andpositively regulates the light response of hypocotyls length，2001，Plant J.25213-221)的氨基酸一致性為64％(E值＝0)，與擬南芥JAR1基因的編碼產(chǎn)物(Staswick等，2002，Plant Cell 141405-1415)的氨基酸一致性為39％(E值＝e-109)，與苔蘚Physcomitrella patens的GH3-likeprotein 1(Imaizumi等，2002，Plant Cell 14373-386)的氨基酸一致性為38％(E值＝1e-87)。進(jìn)一步利用3D-PSSM方法(http//www.bmm.icnet.uk/～3dpssm/)(Kelley等，Enhancedgenome annotation using structural profiles in the program 3D-PSSM，2000，J.Mol.Biol.299499-520)對(duì)OsDR2基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的分析，顯示OsDR2蛋白在結(jié)構(gòu)上與乙酰腺嘌呤化螢火蟲熒光素酶(acyl adenylateforming firefly luciferase)相似(氨基酸一致性及E值分別是16％和0.075)。另據(jù)報(bào)道(Staswick等，2002，Plant Cell 141405-1415)，乙酰腺嘌呤化螢火蟲熒光素酶超家族在不同生物體中的成員具有序列相似性不高的特征，但生化功能卻極為類似，都能作用于含有羧基的化合物并將其乙酰腺嘌呤化。本發(fā)明采用BLAST分析方法，顯示OsDR2基因的編碼產(chǎn)物與擬南芥中能使生長(zhǎng)素(IAA)乙酰腺嘌呤化的螢火蟲熒光素酶類基因F6G17.40(GenBank注冊(cè)號(hào)NM 119902)、T26I20.12(GenBank注冊(cè)號(hào)NM 127059)、T20D16.20(GenBank注冊(cè)號(hào)NM 127881)、F24B18.13(GenBank注冊(cè)號(hào)NM 124831)、M4I22.70(GenBank注冊(cè)號(hào)NM 118860)和F17A22.14(GenBank注冊(cè)號(hào)NM 130342)的編碼產(chǎn)物的氨基酸一致性分別為70％(E值＝0)、70％(E值＝0)、67％(E值＝0)、63％(E值＝0)、63％(E值＝0)和48％(E值＝e-162)(Staswick等，Jasmonateresponse locus JAR1 and several related Arabidopsis genes encode enzymes of the firefly luciferasesuperfamily that show activity on jasmonic，salicylic，and indole-3-acetic acids in an assay foradenylation，2002，Plant Cell 141405-1415)。以上證據(jù)說明，OsDR2基因的編碼產(chǎn)物極有可能是屬于對(duì)生長(zhǎng)素反應(yīng)的、乙酰腺嘌呤化螢火蟲熒光素酶家族。
實(shí)施例4OsDR2基因的功能驗(yàn)證和應(yīng)用1.遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建所用載體是我們實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pU1301。pU1301是在國(guó)際上常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA 1301(Sun等，2004，Xa26，a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae in rice，encoding a LRR receptor kinase-like protein.Plant Journal.37517-527)基礎(chǔ)上改建的，攜帶具有組成型和超量表達(dá)特征的玉米泛素啟動(dòng)子的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化載體(圖9)。pCAMBIA1301載體由澳大利亞CAMBIA實(shí)驗(yàn)室(Center for the Application of MolecularBiology to International Agriculture)惠贈(zèng)。
采用限制性內(nèi)切酶消化的方法，將已經(jīng)克隆的OsDR2基因從重組質(zhì)粒T5P11上酶切下來，回收外源片段；用T4 DNA Polymerase和Klenow Fragment兩種酶抹平酶切片段末端。同時(shí)，用選擇性內(nèi)切酶SmaI酶切攜帶玉米泛素啟動(dòng)子的遺傳轉(zhuǎn)化載體pU1301；酶切完畢，用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提，純化酶切產(chǎn)物。然后用去磷酸化酶Alk對(duì)純化的酶切產(chǎn)物進(jìn)行去磷酸化處理。用包含OsDR2基因的酶切片段和去磷酸化的載體做連接反應(yīng)。通過酶切篩選陽性克隆，并通過限制性內(nèi)切酶Kpn I酶切篩選外源片段正向插入的陽性克隆。獲得的重組質(zhì)粒載體被命名為D25U。
采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Hiei等，Efficient transfbrmation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA，1994，PlantJournal 6271-282)將D25U導(dǎo)入感病水稻品種牡丹江8號(hào)(Oryza sativa ssp.japonica)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化主要步驟和試劑如下(1)試劑和溶液縮寫6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-芐基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧芐青霉素)；KT(Kinetin，激動(dòng)素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(CaseinEnzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亞砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6小量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS小量成分溶液)(2)主要溶液配方1)N6max母液[10倍濃縮液(10X)]硝酸鉀(KNO3) 28.3g磷酸二氫鉀(KH2PO4)4.0g硫酸銨((NH4)2SO4)4.63g硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 1.85g
氯化鈣(CaCl2·2H2O)1.66g逐一溶解，然后室溫下定容至1000ml。
2)N6mix母液[100倍濃縮液(100X)]碘化鉀(KI)0.08g硼酸(H3BO3)0.16g硫酸錳(MnSO4·4H2O)0.44g硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)0.15g室溫下溶解并定容至1000ml。
3)Fe2EDTA貯存液(100X)在一個(gè)大三角瓶中加入300ml蒸餾水和硫酸鐵(FeSO4·7H2O)2.78g在另一個(gè)大三角瓶中加入300ml蒸餾水并加熱至70℃，然后加入乙二銨四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O)3.73g在它們都溶解后混合在一起，70℃水浴中保持2小時(shí)，定容至1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 4)維生素貯存液(100X)煙酸(Nicotinic acid)0.1g維生素B1(Thiamine HCl) 0.1g維生素B6(Pyridoxine HCl)0.1g甘氨酸(Glycine) 0.2g肌醇(Inositol) 10g加水定容至1000ml，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 5)MSmax母液(10X)硝酸銨(NH4NO3) 16.5g硝酸鉀 19.0g磷酸二氫鉀 1.7g硫酸鎂 3.7g氯化鈣 4.4g室溫下溶解并定容至1000ml。
6)MSmix母液(100X)碘化鉀 0.083g硼酸 0.62g硫酸錳 0.86g鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O) 0.025g硫酸銅(CuSO4·5H2O) 0.0025g室溫下溶解并定容至1000ml。
7)2，4-D貯存液(1mg/ml)2，4-D 100mg.
1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，室溫保存。
8)6-BA貯存液(1mg/ml)6-BA 100mg.
1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，室溫保存。
9)NAA貯存液(1mg/ml)NAA 100mg.
1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 10)IAA貯存液(1mg/ml)
IAA 100mg.
1ml 1N氫氧化鉀溶解5分鐘，然后加10ml蒸餾水溶解完全后定容至100ml，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 11)葡萄糖貯存液(0.5g/ml)葡萄糖 125g蒸餾水溶解定容至250ml，滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?br> 12)AS貯存液AS 0.392gDMSO10ml分裝至1.5ml離心管內(nèi)，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 13)1N氫氧化鉀貯存液氫氧化鉀5.6g蒸餾水溶解定容至100ml，室溫保存?zhèn)溆谩?br> (3)培養(yǎng)基配方1)誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6max母液(10X) 100mlN6mix母液(100X) 10mlFe2+EDTA貯存液(100X) 10ml維生素貯存液(100X) 10ml2，4-D貯存液2.5ml脯氨酸(Proline) 0.3gCH 0.6g蔗糖(Sucrose) 30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。
2)繼代培養(yǎng)基N6max母液(10X) 100mlN6mix母液(100X) 10mlFe2+EDTA貯存液(100X) 10ml維生素貯存液(100X) 10ml2，4-D貯存液2.0ml脯氨酸 0.5gCH 0.6g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口滅菌。
3)預(yù)培養(yǎng)基N6max母液(10X) 12.5mlN6mix母液(100X) 1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X) 2.5ml維生素貯存液(100X) 2.5ml2，4-D貯存液0.75mlCH 0.15g蔗糖5g
瓊脂粉(Agarose) 1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。
使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250μl AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。
4)共培養(yǎng)基N6max母液(10X) 12.5mlN6mix母液(100X) 1.25mlFe2+EDTA貯存液(100X)2.5ml維生素貯存液(100X) 2.5ml2，4-D貯存液 0.75mlCH 0.2g蔗糖 5g瓊脂粉 1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.6，封口滅菌。
使用前加熱溶解培養(yǎng)基并加入5ml葡萄糖貯存液和250μl AS貯存液，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。
5)懸浮培養(yǎng)基N6max母液(10X) 5mlN6mix母液(100X)0.5mlFe2+EDTA貯存液(100X) 0.5ml維生素貯存液(100X) 1ml2，4-D貯存液 0.2mlCH 0.08g蔗糖 2g加蒸餾水至100ml，調(diào)節(jié)pH值到5.4，分裝到兩個(gè)100ml的三角瓶中，封口滅菌。
使用前加入1ml葡萄糖貯存液和100μl AS貯存液。
6)選擇培養(yǎng)基N6max母液(10X)25mlN6mix母液(100X) 2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X) 2.5ml維生素貯存液(100X)2.5ml2，4-D貯存液 0.625mlCH0.15g蔗糖 7.5g瓊脂粉1.75g加蒸餾水至250ml，調(diào)節(jié)pH值到6.0，封口滅菌。
使用前溶解培養(yǎng)基，加入250μl HN和400ppm CN，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。
7)預(yù)分化培養(yǎng)基N6max母液(10X) 25mlN6mix母液(100X)2.5mlFe2+EDTA貯存液(100X) 2.5ml維生素貯存液(100X) 2.5ml6-BA貯存液 0.5mlKT貯存液 0.5mlNAA貯存液 50μlIAA貯存液 50μlCH 0.15g
蔗糖 7.5g瓊脂粉 1.75g加蒸餾水至250ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.9，封口滅菌。
使用前溶解培養(yǎng)基，加入250μl HN和200ppm CN，分裝倒入培養(yǎng)皿中(25ml/皿)。
8)分化培養(yǎng)基N6max母液(10X) 100mlN6mix母液(100X) 10mlFe2+EDTA貯存液(100X) 10ml維生素貯存液(100X) 10ml6-BA貯存液 2mlKT貯存液2mlNAA貯存液 0.2mlIAA貯存液 0.2mlCH 1g蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到6.0。
煮沸并定容至1000ml，分裝到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口滅菌。
9)生根培養(yǎng)基MSmax母液(10X) 50mlMSmix母液(100X) 5mlFe2+EDTA貯存液(100X) 5ml維生素貯存液(100X) 5ml蔗糖30gPhytagel3g加蒸餾水至900ml，1N氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH值到5.8。
煮沸并定容至1000ml，分裝到生根管中(25ml/管)，封口滅菌。
(4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟3.1愈傷誘導(dǎo)(1)將成熟的水稻種子去殼，然后依次用70％的乙醇處理1分鐘，0.15％氯化汞(HgCl2)15分鐘；(2)滅菌水洗種子4-5次；(3)將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；(4)置于黑暗處培養(yǎng)4周，溫度25±1℃。
3.2愈傷繼代挑選亮黃色、緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25±1℃。
3.3預(yù)培養(yǎng)挑選緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度25±1℃。
3.4農(nóng)桿菌培養(yǎng)(1)在帶有對(duì)應(yīng)抗性選擇的LA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105兩天，溫度28℃；(2)將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28℃搖床上培養(yǎng)2-3小時(shí)。
3.5農(nóng)桿菌侵染(1)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；(2)調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至OD6000.8-1.0；(3)將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度19-20℃。
3.6愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)(1)滅菌水洗滌愈傷至看不見農(nóng)桿菌；(2)浸泡在含400ppm羧芐青霉素(CN)的滅菌水中30分鐘；(3)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇2-3次，每次2周。(第一次潮霉素篩選濃度為400ppm，第二次以后為250ppm)3.7分化(1)將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7周；(2)轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度26℃。
3.8生根(1)剪掉分化時(shí)產(chǎn)生的根；(2)然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26℃。
3.9移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時(shí)在最初的幾天保持水分濕潤(rùn)。
獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植株被命名為D25UM8(其中D25U為遺傳轉(zhuǎn)化載體名稱，M8代表水稻品種牡丹江8號(hào))。本發(fā)明共獲得獨(dú)立轉(zhuǎn)基因水稻植株48株。采用剪葉法(Kauffman等，An improved technique for evaluating resistance of rice varieties to Xanthomonas oryzae，1973，Plant Dis.Rep.57537-541)對(duì)其中30株轉(zhuǎn)基因水稻植株在成株期階段接種國(guó)際上常用的白葉枯病菌菌株P(guān)XO61(Sun等，2004，Xa26，a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae in rice，encoding a LRR receptor Kinase-like protein.Plant Journal.37517-527)，發(fā)現(xiàn)13株轉(zhuǎn)基因植株的抗性不同程度增強(qiáng)了；與轉(zhuǎn)基因的受體水稻品種牡丹江8號(hào)相比，這些抗性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株的病斑長(zhǎng)度減短了59-89％，病斑面積(病斑長(zhǎng)/病葉長(zhǎng)×％)減小29-68％(表2)。
表2.部分?jǐn)y帶OsDR2基因的轉(zhuǎn)基因水稻植株對(duì)白葉枯病菌菌株P(guān)XO61的反應(yīng)

(1)每株轉(zhuǎn)基因植株接種5片葉，兩周后調(diào)查病斑和病葉長(zhǎng)度，每個(gè)數(shù)據(jù)來自于5片葉的平均值。本發(fā)明是采用組成型、超量表達(dá)(玉米泛素)啟動(dòng)子調(diào)控OsDR2基因的表達(dá)，因此在轉(zhuǎn)基因水稻植株中OsDR2基因的表達(dá)不會(huì)受病原侵染的影響。為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因水稻植株的抗性增強(qiáng)是否與轉(zhuǎn)入的OsDR2基因有關(guān)，本發(fā)明采用RNA雜交技術(shù)對(duì)部分轉(zhuǎn)基因水稻植株中OsDR2基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示OsDR2的表達(dá)量與植株的抗性密切相關(guān)。在沒有病原侵染條件下轉(zhuǎn)基因受體水稻品種(牡丹江8號(hào))、基因供體(C101LAC)和感病轉(zhuǎn)基因植株中都不能檢測(cè)到OsDR2基因的表達(dá)，而抗性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株中都可以檢測(cè)到OsDR2基因的表達(dá)(圖10)。這些結(jié)果進(jìn)一步證明OsDR2基因參于水稻抗病反應(yīng)的調(diào)控，并且超量表達(dá)OsDR2基因可以增強(qiáng)水稻的抗病性。
轉(zhuǎn)基因水稻植株對(duì)稻瘟病菌的抗性也增強(qiáng)。對(duì)抗白葉枯病能力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因水稻植株D25UM8-3、D25UM8-27和D25UM8-28離體接種稻瘟病菌IK81-3進(jìn)行觀察，這三株轉(zhuǎn)基因水稻植株中的病斑面積都明顯小于對(duì)照植株牡丹江8號(hào)，抗稻瘟病能力明顯提高(圖11)。
序列表SEQ ID NO1<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>水稻抗病相關(guān)基因OsDR2<130>
<141>2004-08-12<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2212<212>DNA<213>Oryza sativa<220>
<221>CDS<222>(26)..(468)<223>
<220>
<221>CDS<222>(563)..(1934)<223>
<220>
<221>Intron<222>(469)..(562)<223>
<400>1ttttcttgtt cggggttgag aggca atg gcg gtg atg act gat gtg tcg acc 52Met Ala Val Met Thr Asp Val Ser Thr1 5acc ggg acg gca ctc cgg acc ccg gcg gcg ggg gcg gtg aag gag ggc100Thr Gly Thr Ala Leu Arg Thr Pro Ala Ala Gly Ala Val Lys Glu Gly10 15 20 25gac gtc gag aag ctc cgg ttc atc gac gag atg acc acc aac gtc gac148Asp Val Glu Lys Leu Arg Phe Ile Asp Glu Met Thr Thr Asn Val Asp
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Gln Ala Cys Thr Lys Arg Ile Pro Gly His Tyr Val Ile Tyr Trp Glu485 490 495Leu Leu Thr Lys Gly Ala Gly Ala Thr Val Val Asp Ala Asp Thr Leu500 505 510Gly Arg Cys Cys Leu Glu Met Glu Glu Ala Leu Asn Thr Val Tyr Arg515 520 525Gln Ser Arg Val Ala Asp Gly Ser Ile Gly Pro Leu Glu Ile Arg Val530 535 540Val Arg Pro Gly Thr Phe Glu Glu Leu Met Asp Tyr Ala Ile Ser Arg545 550 555 560Gly Ala Ser Ile Asn Gln Tyr Lys Val Pro Arg Cys Val Thr Phe Pro565 570 575Pro Ile Val Glu Leu Leu Asp Ser Arg Val Val Ser Ser His Phe Ser580 585 590Pro Ala Leu Pro His Trp Thr Pro Ala Arg Arg Ser Glu595 600 60權(quán)利要求
1.賦予植物對(duì)病害產(chǎn)生抗性的DNA片段，其中所述的片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相當(dāng)于SEQ ID NO1所示序列，或者與SEQ ID NO1所示序列的一部分功能等同的亞片段。
2.權(quán)利要求1的DNA片段，其核苷酸序列包含全長(zhǎng)的OsDR2基因編碼序列，該基因編碼的蛋白質(zhì)具有生長(zhǎng)素反應(yīng)類(乙酰腺嘌呤化螢火蟲熒光素酶)蛋白的結(jié)構(gòu)。
3.權(quán)利要求1中的DNA片段，其中的基因編碼區(qū)與其它的基因形成嵌合基因，或者其中的基因經(jīng)過修飾改造。
4.一種增加植物對(duì)白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和稻瘟病菌(Pyriculariagrisea Sacc.)抗性的方法，該方法包括將權(quán)利要求1的DNA片段連接上合適的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入植物體或?qū)?quán)利要求1的DNA片段和其它的DNA片段組成嵌合基因轉(zhuǎn)入植物或?qū)?quán)利要求1的DNA片段經(jīng)過修飾改造后轉(zhuǎn)入植物體，增加植物對(duì)病原菌的抗性。
5.基因組中包含權(quán)利要求1、2、3中的DNA片段的轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因植物種子的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種水稻DNA片斷的分離克隆、功能驗(yàn)證和應(yīng)用。所述的DNA片斷包含水稻抗病相關(guān)基因OsDR2，它能夠賦予植物抵抗由病原菌引起的病害。將該片段與其外源調(diào)節(jié)序列直接轉(zhuǎn)入植物體，轉(zhuǎn)基因植物對(duì)病原菌的抵抗能力顯著增強(qiáng)。
文檔編號(hào)A01H5/00GK1737143SQ20041000945
公開日2006年2月22日 申請(qǐng)日期2004年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月19日
發(fā)明者王石平, 丁新華, 黃麗玲 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)