專利名稱：耐鹽堿高蛋白雜種酸模的選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及再生植株中變異株的選育方法，特別是涉及耐鹽堿高蛋白雜種酸模的選育方法。
背景技術(shù)：
再生植株的變異是一種普遍的現(xiàn)象。組織培養(yǎng)誘發(fā)變異叫做體細(xì)胞無性系變異，所產(chǎn)生的變異株叫做細(xì)胞突變株。利用無性系變異，經(jīng)離體或田間篩選獲得有用的細(xì)胞突變體是一種新的細(xì)胞工程育種途徑。用離體培養(yǎng)的組織和細(xì)胞再生出完整植株是植物組織培養(yǎng)和細(xì)胞工程研究的核心。按照細(xì)胞全能性學(xué)說，植物的每一個體細(xì)胞具有相同的遺傳信息，由它們分化成的再生植株在理論上應(yīng)當(dāng)是完全相同的。但是當(dāng)植物組織和細(xì)胞脫離有機(jī)體，進(jìn)入離體培養(yǎng)的環(huán)境中，細(xì)胞分裂的不規(guī)則性會顯著增加，導(dǎo)致愈傷組織再生植株中常出現(xiàn)基因型變異，故培養(yǎng)細(xì)胞是一個很不穩(wěn)定的遺傳系統(tǒng)，變異株會有生理生化特性和農(nóng)藝性狀的變化，從而為植物改良提供了豐富的變異材料。所以，一些分化程度比較高的細(xì)胞，如葉肉細(xì)胞可以在離體條件下經(jīng)過脫分化和再分化過程，形成胚胎或植株。如中國科學(xué)院植物研究所王敬駒等自1980年以來，從大量的廣東與廣西省甘蔗品種的再生無性系中選出數(shù)十個優(yōu)良株系，其中一個株系的蔗糖含量及每畝單產(chǎn)均超過當(dāng)?shù)禺?dāng)家品種，并通過品種鑒定。又如易溫斯(Evans)和廈泊(Sharp)于1983年對230株番茄再生植株及其R2代進(jìn)行了性狀觀察和分析，最終從中選育出一些適合做番茄醬的新品種。酬道(Chowdari)等于1998年在水稻再生植株中檢測到DNA水平的變異。這些試驗都說明組織培養(yǎng)細(xì)胞可為植物改良提供豐富的變異來源，完全可以從中篩選出理想的新品種。
我國飼料作物短缺已很突出，糧食短缺為當(dāng)今世界大問題之首。發(fā)展糧草型畜牧業(yè)是當(dāng)今的發(fā)展趨勢。我國有667萬hm2耕地鹽漬化土壤和0.3億hm2鹽堿荒地。利用鹽漬土壤、鹽堿荒地、荒漠土壤種植耐鹽堿的飼料作物，是解決飼料作物短缺的好辦法。目前能夠在鹽堿地上生長的植物種類較多，但大部分植物的開發(fā)利用價值不大。
雜種酸模是一種生命力強、生長旺盛的多年生高產(chǎn)飼料作物，具有抗寒、速生的特點，富含蛋白質(zhì)、有機(jī)硒、有機(jī)鐵、有機(jī)碘和多種維生素營養(yǎng)成分。中國人臧鳳艷，吳振穎，梁麗，等論述的“雜種酸模營養(yǎng)價值的研究[J]，2003(118)，PP33-35”和王震星、孫宏偉和張杰的論文“雜種酸模不同品系生物學(xué)特性觀察(J)，1999，6(4)，PP28-32”，均論述了雜種酸模。目前我國種植的雜種酸模，多為國外品種，如魯梅克斯(Romax)k-1，其鮮草產(chǎn)量為10-15t/667m2，蛋白質(zhì)含量為29.8％，還存在耐鹽堿性差、單寧含量高引起適口性差的缺點。如果采用傳統(tǒng)的育種方法對其進(jìn)行改良，需要耗費大量的人力、物力和時間。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種耐鹽堿高蛋白雜種酸模的選育方法，其鮮草產(chǎn)量15-20t/667m2、營養(yǎng)成分含量優(yōu)于魯梅克斯k-1的，適口性好，消化率高，可廣泛用于豬、牛、羊、雞、鴨、鵝、兔、魚的飼喂、并且再生能力強、抗旱寒。
本發(fā)明的技術(shù)方案是利用體細(xì)胞無性系變異，通過愈傷組織再生基因型變異的植株，其步驟為取雜種酸模外植體、切制、消毒、培育于MS培養(yǎng)基NH4NO31650mg/L、KNO31900mg/L、KH2PO4170mg/L、CaCl22H2O 440mg/L、MgSO47H2O 370mg/L、FeSO47H2O 27.8mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、MnSO44H2O 22.3mg/L、ZnSO47H2O 8.6mg/L、H3BO36.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO42H2O 0.25mg/L、CuSO45H2O 0.025mg/L、CoCl26H2O 0.025mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、鹽酸硫胺素0.4mg/L、鹽酸吡哆素0.5mg/L、煙酸0.5mg/L上、光照、控溫、形成愈傷組織、扦插生根，其特征在于其雜種酸模外植體為一年生雜種酸模葉片、切成0.64cm2-1cm2、培育于含濃度10～30g/L的蔗糖(為植物提供碳源)、0.5-0.9％的瓊脂(作為固形劑)、0.3-0.6mg/L的6-芐基嘌呤(作為細(xì)胞分裂素)、0.7-0.9mg/L的吲哚丁酸(作為生長素)和酸堿度5-6.5的外源激素培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為26±2℃、光照強度為2000-3000lx，光照為10-14小時/天，22-28天后觀察愈傷組織的形成及分化情況，確定最佳的分化培養(yǎng)基配方，隨后進(jìn)行扦插生根，確定適合雜種酸模生根的方法。
本發(fā)明的有益效果，與魯梅克斯(Romax)k-1雜種酸模相比，不僅具有適口性好的特點，而且產(chǎn)量明顯提高(33.3％)，同時還能高抗鹽堿，在pH9.0的含鹽量6.22‰的重鹽堿地上生長良好。
具體實施例方式
(一)、雜種酸模組培繁育取天津市寧河縣一年生的雜種酸模葉片為外植體，切成1cm2大小，消毒后接種于含上述不同濃度配比的外源激素培養(yǎng)基上，25天后觀察愈傷組織的形成及分化情況。
誘導(dǎo)愈傷組織的形成和分化基本培養(yǎng)基為改良的MS，含濃度0.5mg/L的6-芐基嘌呤+0.8mg/L的吲哚丁酸、10～30g/L的蔗糖，0.7％的瓊脂和酸堿度5.8。培養(yǎng)溫度為26±2℃，光照強度為2500lx，光照為12小時/天。將分化形成的芽接種在1/2MS附加上述配比的6-芐基嘌呤和吲哚丁酸的培養(yǎng)基上，15天后觀察芽叢的形成及生長狀況。在上述種激素配比中，6-芐基嘌呤0.5mg/L+吲哚丁酸0.8mg/L的組合，不僅有利于愈傷組織的形成，而且有利于芽的分化，且芽叢生長健壯。在組培出酸模芽叢之后，即可開始扦插生根。扦插生根容器可用廉價的營養(yǎng)缽、育苗盤，也可以在其它簡易容器中進(jìn)行，扦插基質(zhì)可以是蛭石、棉花或其它物質(zhì)，扦插空間可以在培養(yǎng)室外有自然光照射的地方，也可以在培養(yǎng)室內(nèi)完成生根過程。試管內(nèi)生根培養(yǎng)基為MS，附加濃度為100mg/L萘乙酸和濃度為10g/L的蔗糖。由芽叢組培苗接種在試管內(nèi)的生根情況中可以看出試管內(nèi)生根適宜激素是萘乙酸。試管外生根采用扦插方法生根芽苗長到2-3cm(帶3-5片葉子)時，消毒后扦插在含有蛭石的淺盤器皿中，定期澆1/2MS，即定期澆濃度100mg/L萘乙酸的營養(yǎng)液，在25℃下培養(yǎng)。10天后觀察生根率。結(jié)果表明100mg/L萘乙酸對生根有利，生根率達(dá)63.3％，而高濃度的萘乙酸(200mg/L)反而抑制生根，即萘乙酸比吲哚丁酸更有利于雜種酸模的生根。隨后我們比較了試管內(nèi)生根和試管外生根組培苗的移栽成活率。試管內(nèi)生根的組培苗開瓶煉苗5天后進(jìn)行移栽。對試管外扦插生根的苗，我們采用了過渡方法，即在半無菌狀態(tài)下操作扦插過程，在有菌狀態(tài)下完成生根過程，15天后移栽。扦插過程是在超凈臺里完成的，將苗扦插在消過毒的蛭石或棉花中，生根過程是在實驗室環(huán)境條件下完成，定期澆灌含激素的營養(yǎng)液，直至生根。這成為移栽生根苗的一個煉苗過程，在生根過程中，不適宜室內(nèi)環(huán)境的苗在生根前已經(jīng)死亡，生根后的苗都是抗逆性強的苗，所以試管外生根的苗移栽成活率大于試管內(nèi)生根的苗，并且試管外扦插生根法可節(jié)約成本和空間，提高了移栽成活率，因此這是一項值得應(yīng)用和推廣的技術(shù)。
(二)、雜種酸模新品系97-1的選育試驗是在天津農(nóng)學(xué)院園藝系試驗地進(jìn)行。試材為3年生的魯梅克斯k-1和新選育出來的品系雜種酸模97-1。
試驗采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，每小區(qū)三株，重復(fù)三次。在1998-2000三年的2月25日至6月2日，對兩個品系進(jìn)行較詳細(xì)的觀察記載，觀測返青期、生育期、株高、葉生長速度(葉長和葉寬)、葉片生長與溫度關(guān)系、新葉生長所需積溫、花薹高度及生長速度、花期。每兩天觀察、測定一次。雜種酸模露地越冬后，早春開始萌動返青，偶遇霜凍時受影響不大。從2月25日開始(日均溫6℃時)，靠近根部的葉簇萌動，陸續(xù)從根莖周圍長出2-3個新嫩枝。前期生長速度慢，進(jìn)入4月以后生長速度開始加快，生長量加大。葉子生長約需60天。通過葉長和葉寬的生長曲線可以看出，無論是魯梅克斯k-1，還是97-1雜種酸模，從4月5日至葉片停止生長時為止，雖然生長速度較快，但是并沒有一個特別明顯的生長高峰出現(xiàn)，曲線趨向于比較平緩。兩個品系的分蘗數(shù)差別不大，根系都很發(fā)達(dá)，主根可深入地下50cm，直徑可達(dá)8cm，主根強健，分叉，須根較多。魯梅克斯k-1葉子生長期、抽莖期和生育期都較短，莖生長約需20天，抽莖期、開花期開始和結(jié)束的時間都比雜種酸模97-1早。魯梅克斯k-1的株形也比雜種酸模97-1小些，株高平均200cm左右，葉長平均比雜種酸模97-1短16cm，葉寬比雜種酸模97-1窄7.32cm，開花節(jié)間為第5節(jié)。而雜種酸模97-1的生長速度卻很快，生長勢強，株形較大，平均株高在230cm左右，平均葉長接近55cm，葉寬亦接近20cm，開花節(jié)間為第8節(jié)。盡管雜種酸模97-1的葉長日均生長量比魯梅克斯k-1高0.59cm，葉寬日均生長量較魯梅克斯k-1多，雜種酸模97-1莖日均生長量也比魯梅克斯k-1多出3cm。通過差異顯著性測驗得知，兩品系莖、葉的生長量都有極顯著差異，但葉片和莖稈的生長與溫度無顯著相關(guān)。雜種酸模平均長一片葉所需積溫不是很多，但由于雜種酸模97-1的生育期比魯梅克斯k-1稍長，生育各時期也比魯梅克斯延后，所以雜種酸模97-1無論是活動積溫，還是地溫都比魯梅克斯k-1要高，一般高出50℃左右。通過差異顯著性測驗得知t＝9.28＞t 0.01，兩者在單株生物學(xué)產(chǎn)量方面存在極顯著差異，即雜種酸模97-1小區(qū)的平均單株產(chǎn)量比魯梅克斯k-1高1151.80克，達(dá)到極顯著水平。通過觀察測定及結(jié)果分析得知，雜種酸模耐寒性強，返青早，前期生長緩慢，后期生長速度快，株形大，生長勢強，生物學(xué)產(chǎn)量高。尤其是篩選出的新品系雜種酸模97-1，不論是生長量和生物學(xué)產(chǎn)量均高于魯梅克斯k-1。因此在生產(chǎn)上更具推廣價值。
(三)、對雜種酸模97-1和魯梅克斯K-1不同生長時期營養(yǎng)成分的分析干物質(zhì)的測定干物質(zhì)含量的最高值出現(xiàn)在1999年4月10日，最低值出現(xiàn)在1998年11月10日。雜種酸模在生長過程中干物質(zhì)含量在抽莖期最高，越冬前含量最低。
粗蛋白的測定粗蛋白含量的最高值出現(xiàn)在1999年4月10日，最低值出現(xiàn)在1998年10月8日。隨著雜種酸模的生長，在1999年4月10日以前，為營養(yǎng)生長階段，到4月10日開始抽莖，因此此時粗蛋白含量最高，達(dá)到39.55％。從1999年4月26日，粗蛋白含量稍降低，這一階段為雜種酸模從營養(yǎng)生長到生殖生長階段。隨著抽莖、開花對養(yǎng)分的消耗，粗蛋含量下降，而且在抽莖前期與抽莖開花后粗蛋白含量差異很大。粗脂肪的測定粗脂肪含量的最高值出現(xiàn)在1999年4月26日，最低值出現(xiàn)在1998年11月10日。隨著雜種酸模的生長，粗脂肪含量在越冬后呈上升趨勢，到抽莖期達(dá)到最高，之后逐漸降低，到秋末越冬前含量最低。通過試驗比較，兩者之間營養(yǎng)成分含量差異相近，產(chǎn)量差異顯著，因此在相同面積上一雜種酸模97-1所獲得的經(jīng)濟(jì)效益較高。
(四)、雜種酸模等氮量替代豆餅飼養(yǎng)肉兔試驗為了確保試驗順利進(jìn)行，首先在一個月內(nèi)觀察了肉兔對雜種酸模的采食性能和雜種酸模對肉兔健康狀況的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兔子不僅采食，而且表現(xiàn)積極，未出現(xiàn)拉稀、消化不良等現(xiàn)象，至試驗結(jié)束也未發(fā)現(xiàn)運動異常。增重結(jié)果試驗期共48天，經(jīng)稱重，結(jié)果表明；試驗二組增得最高，試驗一組次之，均略高于對照組。但經(jīng)生物統(tǒng)計，各組之間無顯著性差異(P＞0.05)。
屠宰結(jié)果試驗結(jié)束，從三個組分別隨機(jī)選取2Kg左右的兔子各5只，進(jìn)行屠宰，其屠宰率對照組、試驗一組、二組分別為47.8％、47.4％和47.3％，基本相同。心、肝、肺平均分別重15g、95g和21g，各臟器未發(fā)現(xiàn)異常。
對健康的影響本試驗采取鮮體飼喂方式，在整個試驗期內(nèi)未發(fā)現(xiàn)任何不良影響，三組兔子采食良好、健康，成活率100％，運動狀況良好。此外，經(jīng)觀察兔子對曬干的雜種酸模也很喜食。
權(quán)利要求
1.耐鹽堿高蛋白雜種酸模的選育方法，其步驟為取雜種酸模外植體、切制、消毒、培育于MS培養(yǎng)基NH4NO31650mg/L、KNO31900mg/L、KH2PO4170mg/L、CaCl22H2O440mg/L、MgSO47H2O 370mg/L、FeSO47H2O 27.8mg/L、Na2EDTA 37.3mg/L、MnSO44H2O22.3mg/L、ZnSO47H2O 8.6mg/L、H3BO36.2mg/L、KI 0.83mg/L、Na2MoO42H2O O.25mg/L、CuSO45H2O0.025mg/L、CoCl26H2O 0.025mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、鹽酸硫胺素0.4mg/L、鹽酸吡哆素0.5mg/L、煙酸0.5mg/L上、光照、控溫、形成愈傷組織、扦插生根，其特征在于其雜種酸模外植體為一年生雜種酸模葉片、切成0.64cm2-1cm2、培育于含濃度10～30g/L的蔗糖(為植物提供碳源)、0.5-0.9％的瓊脂(作為固形劑)、0.3-0.6mg/L的6-芐基嘌呤(作為細(xì)胞分裂素)、0.7-0.9mg/L的吲哚丁酸(作為生長素)和酸堿度5-6.5的外源激素培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為26±2℃、光照強度為2000-3000lx，光照為10-14小時/天，22-28天后觀察愈傷組織的形成及分化情況，確定最佳的分化培養(yǎng)基配方，隨后進(jìn)行扦插生根，確定適合雜種酸模生根的方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1規(guī)定的耐鹽堿高蛋白雜種酸模的選育方法，其特征在于其一年生雜種酸模葉片可選用天津市寧河縣一年生的1cm2雜種酸模葉片為外植體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1規(guī)定的耐鹽堿高蛋白雜種酸模的選育方法，其特征在于其培養(yǎng)基可為培養(yǎng)基的MS，含濃度0.5mg/L的6-芐基嘌呤+0.8mg/L的吲哚丁酸、10～30g/L的蔗糖，0.7％的瓊脂和酸堿度5.8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1規(guī)定的耐鹽堿高蛋白雜種酸模的選育方法，其特征在于其培養(yǎng)溫度可為26±2℃，光照強度為2500lx，光照為12小時/天。
全文摘要
本發(fā)明涉及再生植株中變異株的選育方法，特別是涉及耐鹽堿高蛋白雜種酸模的選育方法，其特征在于其雜種酸模外植體為一年生雜種酸模葉片、切成0.64cm
文檔編號A01H4/00GK1582640SQ200410019480
公開日2005年2月23日 申請日期2004年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月4日
發(fā)明者張磊, 劉玉芹, 王震星, 桂枝 申請人:天津農(nóng)學(xué)院