專利名稱：一種建立早熟禾遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種早熟禾遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法及應(yīng)用，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域或植物基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
草地早熟禾(Poa pratensis L.)屬冷季型草坪草，是溫帶地區(qū)重要的草種之一。由于它具有色美、抗寒能力強(qiáng)、耐蔭、耐修剪等優(yōu)點(diǎn)，在我國北方地區(qū)多被用作建坪草種之一。草地早熟禾亦有自身的缺點(diǎn)，如易受病蟲危害，不耐炎熱，耐高低溫能力差，抗旱力不強(qiáng)等。這些性狀在一定程度上都可以通過基因轉(zhuǎn)化的手段得到改良。成功的基因轉(zhuǎn)化首先依賴于良好的植物受體系統(tǒng)的建立。1985年，Vasil在國際草原學(xué)大會(huì)上第一次提出利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將其他來源的特定基因?qū)肽敛莸目尚行裕瑸閼?yīng)用基因工程技術(shù)改良牧草，包括提高產(chǎn)量和利用率、增加牧草的抗逆性等奠定了理論基礎(chǔ)。通過基因工程技術(shù)培育出各種優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的牧草和草坪草新品種，對促進(jìn)無污染綠色養(yǎng)殖業(yè)和綠色畜產(chǎn)品的發(fā)展以及我國西部地區(qū)生態(tài)環(huán)境建設(shè)都會(huì)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。
早熟禾遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的難度較大，主要是由于已有的早熟禾組織培養(yǎng)和植株再生體系不能滿足轉(zhuǎn)基因的需要。草地早熟禾的組織培養(yǎng)，國內(nèi)外主要集中于愈傷組織誘導(dǎo)及其分化方面。早在1984年，McDonnel等以早熟禾(Kentucky bluegrass)成熟胚為外植體，誘導(dǎo)出愈傷組織并再生植株。1986年，Boyd等也報(bào)道了以早熟禾成熟胚為材料誘導(dǎo)愈傷組織和植株再生的工作。1988年，Van der Valk等報(bào)道了以早熟禾花序?yàn)橥庵搀w誘導(dǎo)植株再生和以成熟胚為材料誘導(dǎo)愈傷組織的工作。同年，Van der Valk等還報(bào)道了建立草地早熟禾的原生質(zhì)體懸浮培養(yǎng)體系并獲得白化苗工作。1989年，Van der Valk等報(bào)道了以花序和成熟種子為外植體建立草地早熟禾再生體系，發(fā)現(xiàn)花序比成熟種子更易于形成胚性愈傷組織。1991年，Van Ark等也報(bào)道了早熟禾成熟胚培養(yǎng)及愈傷組織誘導(dǎo)等工作。1993年，Nielsen等從早熟禾的胚性懸浮細(xì)胞再生出綠色植株。1994年，朱根發(fā)等以草地早熟禾胚軸及幼穗為外植體，研究了其培養(yǎng)條件和分化能力，發(fā)現(xiàn)草地早熟禾成熟胚愈傷組織的胚胎發(fā)生能力很差，胚軸也很難誘導(dǎo)出具較高分化能力的愈傷組織，二者均不是理想的外植體；而從幼穗中可以誘導(dǎo)出胚性愈傷組織。1995年，Van derValk等以成熟種子為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，發(fā)現(xiàn)含有6-BA(6-芐基嘌呤) 的培養(yǎng)基的誘導(dǎo)頻率要高于不含6-BA的，不同品種間的誘導(dǎo)率相差很大，通過混合使用2，4-D(2，4--二氯苯氧乙酸)和6-BA可大幅度提高體細(xì)胞胚和植株的再生率。同年，Griffia等報(bào)道了從早熟禾種子產(chǎn)生的愈傷組織可高頻率再生植株，但愈傷組織經(jīng)過繼代培養(yǎng)后植株再生頻率迅速下降。1996年，Ke等報(bào)道了早熟禾盾片培養(yǎng)再生植株的工作。2003年，佘建明等報(bào)道了在繼代培養(yǎng)中，早代選擇外表呈干燥、緊密、顆粒狀的愈傷組織能有效地克服隨著繼代培養(yǎng)時(shí)間的延長愈傷組織再生植株的能力顯著下降這一障礙。朱根發(fā)等人工作中以幼穗為外植體雖誘導(dǎo)率能達(dá)到100％(朱根發(fā)等，1994)，但由于取材受季節(jié)限制，所以很多人仍采用種子胚為外植體誘導(dǎo)愈傷組織。由于草地早熟禾成熟胚的愈傷組織分化頻率偏低和胚性愈傷組織難于繼代培養(yǎng)等原因，從而影響了草地早熟禾轉(zhuǎn)基因工作的開展。直到1999年，馬忠華等以早熟禾成熟種子為外植體，初步建立了早熟禾的基因轉(zhuǎn)化體系，獲得了轉(zhuǎn)抗生素抗性基因的植株。相對于其它植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究，早熟禾轉(zhuǎn)基因工作仍處在探索階段。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明以草地早熟禾的種子苗莖尖為試驗(yàn)材料，誘導(dǎo)其基部愈傷化膨大，切取膨大組織，放在繼代及成叢培養(yǎng)基上誘導(dǎo)發(fā)生叢生芽，叢生芽在繼代及成叢培養(yǎng)基上持續(xù)增生，提供轉(zhuǎn)基因的受體材料。采用基因槍轟擊法或農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，經(jīng)選擇獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞及植株。在此基礎(chǔ)上，確立了在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中，采用表面活性劑Silwet L-77處理和減壓處理有效提高了轉(zhuǎn)化頻率，從而建立起一個(gè)高效的基因型制約小的早熟禾轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。
本發(fā)明中，莖尖是指十到幾十微米的莖尖分生組織(shoot meristem)和大到幾十毫米的莖端(shoot tip)；而莖尖分生組織是指頂端生長錐及其鄰近的葉原基。叢生小芽是指離體培養(yǎng)莖尖基部膨大組織在繼代培養(yǎng)基上產(chǎn)生的叢生小芽及其繼代培養(yǎng)物。叢生芽塊是指離體培養(yǎng)的叢生小芽和未組織化的分裂細(xì)胞構(gòu)成的組織塊及其繼代培養(yǎng)物。
本發(fā)明中，轉(zhuǎn)基因受體是指莖尖離體培養(yǎng)產(chǎn)生的叢生芽塊及其擴(kuò)增和繼代培養(yǎng)物。
本發(fā)明中，農(nóng)桿菌(Agrobacterium，包括A.tumefaciens和A.rhizogenes)介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化程序基本上同石田(Ishida，1996)等報(bào)道的。在轉(zhuǎn)染液中添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)等酚類化合物、表面活性劑Silwet L-77(濃度為0-0.3％)和中性單糖(葡萄糖、木糖)，叢生芽塊放在懸浮農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)染液中，在0.95-0.10個(gè)大氣壓(0.95×105Pa-1×104pa)下浸染3-18分鐘，然后在培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2-15天。轉(zhuǎn)化體在含有適宜抗生素的培養(yǎng)基上抑菌，在加有合適濃度選擇劑的培養(yǎng)基上篩選，然后在繼代及成叢培養(yǎng)基上分化小苗。
本發(fā)明中，基因槍轟擊法(particle bomrdment；microprojectile；biolistics；particle gun)是籍高速度的金屬微粒將核酸分子引入活細(xì)胞中的一種遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。最初是美國康乃爾大學(xué)薩伏特(Sanford)等研制成功的火藥基因槍及轉(zhuǎn)化技術(shù)，此后有不同學(xué)者研制出的多種基因槍及不斷改進(jìn)的轉(zhuǎn)化技術(shù)。本發(fā)明研究中所用的基因槍為美國Bio-RAD公司產(chǎn)品，型號(hào)為Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System，按使用說明書操作。轟擊參數(shù)為可裂圓片與載體的距離為2.5厘米，載體與阻擋網(wǎng)的距離為0.8厘米，氦氣壓力為1100psi，真空度28inchHg，微彈飛行距離在3-9厘米間取值。
本發(fā)明中，基本培養(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)熱壓滅菌；抗生素和除草劑等活性成分過濾滅菌，在培養(yǎng)基滅菌后加入。本發(fā)明中所用培養(yǎng)基有基本培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基(KNO31900mgL-1，NH4NO31650mgL-1，CaCl2·2H2O 440mgL-1，MgSO4·7H2O 370mgL-1，KH2PO4·H2O 170mgL-1，F(xiàn)eSO4·7H2O27.8mgL-1，ZnSO4·7H2O 10mgL-1，MnSO4·4H2O 22.3mgL-1，H3BO310mgL-1，KI0.83mgL-1，Na2MoO4·2H2O 0.5mgL-1，CuSO4·5H2O 0.025mgL-1，CoCl2·6H2O 0.025mgL-1，鹽酸硫胺素10.0mgL-1，鹽酸吡哆醇1.0mgL-1，煙酸1.0mgL-1，甘氨酸2.0mgL-1，肌醇100.0mgL-1，生物素0.05mgL-1，酪蛋白水解物500mgL-1)，蔗糖30gL-1，瓊脂粉6.5gL-1，pH5.8-6.0。該培養(yǎng)基用于種子萌發(fā)。液體培養(yǎng)基則去掉瓊脂粉。
誘導(dǎo)培養(yǎng)基附加不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)(激素)組合的基本培養(yǎng)基。對于多數(shù)早熟禾基因型而言，2，4-D濃度為0.01-1.0mg.L-1，6-芐基嘌呤(6-BA)或激動(dòng)素或玉米素濃度0-5mg.L-1。采用固體培養(yǎng)基。最適的激素濃度因培養(yǎng)材料的基因型不同而在此范圍內(nèi)變動(dòng)。
繼代及成叢培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基，基本培養(yǎng)基中加入不同組合的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，2，4-D濃度一般為0-0.2mgL-1，6-BA或激動(dòng)素或玉米素濃度為0-3mgL-1，因早熟禾基因型而變動(dòng)。
生根培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基加0.002-2.0mgL-1萘乙酸(NAA)或吲哚丁酸(IBA)或吲哚乙酸(IAA)，采用固體培養(yǎng)基，用于無根小苗生根或壯苗培養(yǎng)。最適的激素濃度因培養(yǎng)材料的基因型不同而在此范圍內(nèi)變動(dòng)。
本發(fā)明中，基部膨大誘導(dǎo)培養(yǎng)和叢生芽塊培養(yǎng)在20-27℃、500-1000Lx光照(14h/d)下進(jìn)行。
本發(fā)明中，成叢率為繼代及成叢培養(yǎng)基上產(chǎn)生叢生芽的組織塊數(shù)與轉(zhuǎn)入的膨大基部組織塊數(shù)的比值，再乘以100。
本發(fā)明中，植物材料為早熟禾(Poa)，主要為經(jīng)濟(jì)價(jià)值較大的草地早熟禾(Poapratensis L.)的不同品種，如獎(jiǎng)品、新歌來得、橄欖球-A、午夜等。
本發(fā)明中，選擇劑包括除草劑(綠黃隆、草丁膦、草干膦等)、抗生素(潮霉素、卡那霉素等)。選擇劑抗性基因有除草劑抗性基因如als(突變的乙酰乳酸合成酶基因)、bar(基因)等，抗生素抗性基因如hpt(潮酶素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)、nptII(卡那霉素抗性基因)等。
本發(fā)明建立的早熟禾轉(zhuǎn)基因受體體系的方法及應(yīng)用包括如下步驟①種子滅菌和萌發(fā)程序及技術(shù)，②莖尖培養(yǎng)及其基部愈傷化誘導(dǎo)和培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基、附加成分和激素組合)，③叢生芽發(fā)生、繼代培養(yǎng)和培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基、附加成分和激素組合)，④以叢生芽塊為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，包括轉(zhuǎn)化、恢復(fù)培養(yǎng)、(抑菌)和篩選程序及技術(shù)，⑤小苗生根和移栽技術(shù)，⑥轉(zhuǎn)基因植株分子檢測技術(shù)。
種子滅菌和萌發(fā)程序及技術(shù)是指種子用70％酒精滅菌1-5分鐘，0.2％升汞10-15分鐘，無菌水沖洗3-5次。滅菌期間不斷晃動(dòng)種子，以保證表面滅菌徹底。滅菌后種子播種在濕潤的無菌濾紙上，培養(yǎng)皿封口后放在黑暗或弱光條件下于20-28℃萌發(fā)。
莖尖培養(yǎng)及其基部愈傷化誘導(dǎo)技術(shù)是指種子萌發(fā)8-15天后，切取莖尖接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)基部膨大。誘導(dǎo)培養(yǎng)在弱光下進(jìn)行，一般需培養(yǎng)20天左右。
雖然莖尖基部出現(xiàn)膨大的頻率與誘導(dǎo)培養(yǎng)基中激素變化有關(guān)，但在一定范圍內(nèi)，激素濃度對莖尖基部膨大率影響較小，一般為80-100％，但對轉(zhuǎn)入繼代及成叢培養(yǎng)基的膨大組織產(chǎn)生叢生芽影響較大。若誘導(dǎo)培養(yǎng)基中2，4-D為0.2mg.L-1、6-BA 2mg.L-1，多數(shù)基因型的膨大組織成叢率最高，獎(jiǎng)品等品種可達(dá)75％，每叢芽數(shù)也最多，可達(dá)15-25個(gè)。
誘導(dǎo)基部膨大對光較敏感。在低2，4-D濃度(＜0.1mg.L-1)、光照強(qiáng)度＞1000Lx時(shí)易分化生根，不易分化成叢，光照弱時(shí)(500Lx)膨大較易，不易生根。在較合適的2，4-D濃度時(shí)，光強(qiáng)約1000Lx時(shí)生長良好(膨大組織為淡黃綠色)，比在500Lx(膨大組織偏向白色)時(shí)更易成叢，并且每叢芽數(shù)也較多。在高濃度2，4-D時(shí)，光照強(qiáng)弱對其影響不是很大，膨大均較大，不易生根，但成叢率低。此階段應(yīng)在合適2，4-D濃度、光照較強(qiáng)下培養(yǎng)以利于以后成叢。
叢生芽發(fā)生及繼代培養(yǎng)技術(shù)是指待莖尖基部膨大后切下直徑1-3mm的膨大組織轉(zhuǎn)入繼代及成叢培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽發(fā)生，一般需培養(yǎng)15-20天。形成叢生芽塊后轉(zhuǎn)入繼代及成叢培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)。在繼代培養(yǎng)中，可根據(jù)叢生芽塊愈傷化程度調(diào)整培養(yǎng)基濃度。若未組織化細(xì)胞增生旺盛，小芽發(fā)育差，適當(dāng)降低培養(yǎng)基中的2，4-D濃度或提高6-BA等濃度；若未組織化細(xì)胞增生慢，小芽迅速發(fā)育成苗，適當(dāng)升高培養(yǎng)基中的2，4-D濃度。
莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)20-25天時(shí)取基部膨大組織產(chǎn)生叢生芽的頻率最高，每叢芽數(shù)也最多，若誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間延長，成叢率下降，這可能是由于時(shí)間太長，部分組織不能吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)，以致色澤暗淡，有些組織發(fā)褐，分化能力也降低。若誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間偏短，膨大組織產(chǎn)生叢生芽的頻率也較低，每叢芽數(shù)少，如正在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天，每叢芽數(shù)只有1-3個(gè)，可能是由于生長點(diǎn)處組織愈傷化低，去分化的細(xì)胞太少所致。
不同基因型材料對激素的敏感程度不同，其中對2，4-D的反應(yīng)差別較大，對獎(jiǎng)品和新歌來得來說，當(dāng)6-BA濃度為2mg.L-1時(shí)，0.2mg.L-12，4D濃度成叢率最高，每叢芽數(shù)最多。而橄欖球在2，4-D濃度為0.5mg.L-1時(shí)效果最好。對于大多數(shù)基因型而言，繼代及成叢培養(yǎng)基中的激素組合以0.05-0.10mg.L-12，4-D和2.0-3.0mg.L-16-BA為宜。當(dāng)2，4-D濃度較高時(shí)，基部容易產(chǎn)生愈傷化組織，叢生芽發(fā)生能力低；當(dāng)2，4-D濃度較低時(shí)，小苗易老化，產(chǎn)生新芽少。即使在最適激素濃度下繼代培養(yǎng)5次以上，小苗也變老、變粗，分化能力降低。若要保持早熟禾叢生芽旺盛增殖的狀態(tài)，可將這些叢生芽塊分成單芽或者2-3個(gè)小芽/塊接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)基部膨大，然后再轉(zhuǎn)入繼代及成叢培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽發(fā)生。
在叢生芽塊繼代培養(yǎng)的的前5-8天，若光照強(qiáng)度＞1000Lx時(shí)，組織容易生根，不利于芽的分化，而一旦形成叢生芽后，光照強(qiáng)時(shí)促進(jìn)分化。所以在繼代培養(yǎng)后的前5-8天，叢生芽塊在弱光(約500Lx)下培養(yǎng)，當(dāng)長出幾個(gè)小芽后放于光照強(qiáng)度＞1000Lx下培養(yǎng)，每叢芽數(shù)可達(dá)15-25個(gè)。
小苗生根和移栽技術(shù)是指小苗在適宜激素組合的生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。當(dāng)根長2-3cm時(shí)，將小苗放在自然光下培養(yǎng)1-2天，然后去掉封口膜煉苗1-2天，于清晨或傍晚移栽入花盆(花盆下為壤土，上部為蛭石)中，每5天澆一次1/2基本培養(yǎng)基無機(jī)鹽溶液，隔天澆水一次。移栽苗生長溫度為15-25℃。
利用本發(fā)明建立的轉(zhuǎn)基因受體體系進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的程序和方法(一)篩選劑濃度的確定將早熟禾叢生芽切成單芽接種于加有不同濃度篩選劑的繼代培養(yǎng)基(若篩選劑為抑制植物細(xì)胞某些氨基酸合成的除草劑，則培養(yǎng)基中去掉水解酪蛋白)上，每15天繼代培養(yǎng)一次，共繼代三代。在每種篩選培養(yǎng)基上接種小苗100-300株，通常取6-10個(gè)選擇劑濃度。濃度及濃度梯度因選擇劑種類和受體材料基因型不同而變化。連續(xù)篩選3代后統(tǒng)計(jì)小苗存活率。以未轉(zhuǎn)基因小苗接近全部死亡的選擇劑濃度為轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選濃度。
(二)遺傳轉(zhuǎn)化可選用農(nóng)桿菌中介法或基因槍轟擊法。
A、以農(nóng)桿菌為中介進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化將帶有雙元載體(Mini-Ti質(zhì)粒帶有植物選擇標(biāo)記基因)的根瘤農(nóng)桿菌(如AGL0和LBA4404)在附加抗生素的LB培養(yǎng)基(每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH7.0，熱壓滅菌)中28℃下震蕩培養(yǎng)，震蕩速率為170-180rpm(轉(zhuǎn)/分)，使細(xì)菌處于對數(shù)生長期(OD600＝0.4-0.6)。然后在3000rpm下離心10分鐘，棄上清液。菌體用1/2濃度的液體基本培養(yǎng)基洗滌，再離心收集。再將菌體用1/2濃度的液體基本培養(yǎng)基懸浮，稀釋5-20倍，添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)100μmolL-1和表面活性劑Silwet L-77(濃度為0-0.3％)后用于轉(zhuǎn)化。
將早熟禾叢生芽切至暴露出芽尖生長點(diǎn)，放入上述菌液中浸染并附以0.95-0.10個(gè)大氣壓(0.95×105Pa-1×104Pa)處理，浸染3-18分鐘。然后用無菌濾紙吸去菌液，將叢生芽塊轉(zhuǎn)入繼代及成叢培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2-3天，再轉(zhuǎn)到加有抗生素頭孢霉素(Cefotaxime)250mgL-1或羧芐青霉素(Carb)500mgL-1的培養(yǎng)基上于黑暗中培養(yǎng)，抑制細(xì)菌生長。在抑菌培養(yǎng)基上叢生芽塊逐漸恢復(fù)生長，10-15天后再轉(zhuǎn)入含有選擇劑的篩選培養(yǎng)基上篩選，連續(xù)篩選3代，每代15-20天。
若用不同農(nóng)桿菌菌株，適宜的轉(zhuǎn)化參數(shù)有明顯差異。選用LBA4404時(shí)，當(dāng)菌液濃度OD600＝0.4-0.6，感染時(shí)間為4-6分鐘時(shí)，叢生芽塊在恢復(fù)培養(yǎng)中的存活率高，轉(zhuǎn)基因植株比例較高。
B、采用基因槍轟擊法轉(zhuǎn)化叢生芽塊1、DNA包裹微彈和基因槍轟擊1)、從宿主菌中提取帶有目標(biāo)基因的質(zhì)粒并進(jìn)行純化，提取和純化采用標(biāo)準(zhǔn)程序及方法(參見《分子克隆》)。質(zhì)粒質(zhì)量為OD260/OD280在1.7-1.8之間。質(zhì)粒DNA濃度稀釋為1μg/μl，于-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 2)、稱取3mg 1.0μm大小的金粉，放入一個(gè)Eppendorf管中，加入1ml 70％乙醇劇烈渦旋3-5分鐘，然后靜置15分鐘，室溫下15000rpm離心5秒后去除上清液。
3)、加1ml無菌水，劇烈渦旋1分鐘，靜置1分鐘，室溫下15000rpm離心5秒后去除上清液。此步驟重復(fù)3次。
4)、第三次洗滌后的金粉，加50μl 50％滅菌甘油(終濃度為60mg/ml微彈。該制備液室溫可貯存2周)。
5)、使用時(shí)渦旋5分鐘打破金粉凝集。
6)、分散后金粉依次加入5μl質(zhì)粒DNA(1μg/μl)、50μl 12.5molL-1CaCl2、20μl 0.1molL-1亞精胺，邊旋渦邊加樣。
7)、繼續(xù)旋渦2-3分鐘，靜置1分鐘。
8)、15000rpm離心2秒后棄上清液，加140μl 70％乙醇。
9)、靜置沉淀，15000rpm離心2秒后棄上清液。
10)、加48μl無水乙醇，輕彈管壁數(shù)次，低速下渦旋2-3秒，然后取樣加在微彈載體上。微彈用量為每彈0.5mg。
11)、在直徑9cm的培養(yǎng)皿中倒入0.4cm厚的基本培養(yǎng)基，然后將叢生芽塊(0.3-0.5cm大小，繼代培養(yǎng)后7-12天)高密度放入培養(yǎng)皿中。
12)、用基因槍轟擊叢生芽塊，每皿轟擊1-2次。轟擊參數(shù)取可裂圓片與載體的距離為2.5cm，載體與阻擋網(wǎng)的距離為0.8cm，微彈飛行距離6-9cm。其它參數(shù)按使用說明書取值。
2、轉(zhuǎn)化后叢生芽組織塊的篩選和培養(yǎng)1)、轟擊后叢生芽塊在暗中恢復(fù)培養(yǎng)2-3天，然后將它們轉(zhuǎn)入成分不變的新培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周。此期叢生芽塊生長良好，轉(zhuǎn)入的目標(biāo)基因得到充分表達(dá)。
2)、將恢復(fù)培養(yǎng)后叢生芽塊轉(zhuǎn)入加有選擇劑(抗生素或除草劑)的繼代成叢培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，連續(xù)篩選三代，每代15-20天。
(三)、轉(zhuǎn)基因植株的再生和移栽從選擇培養(yǎng)基上挑選出三代篩選后存活的組織塊轉(zhuǎn)移到無選擇劑的繼代及成叢培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽形成，并通過在繼代及成叢培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)一次獲得較大的叢生芽及小苗。從叢生芽塊上切取2-3厘米的小苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。在生根培養(yǎng)基上，當(dāng)小苗根長到2-3cm時(shí)放在自然光下培養(yǎng)1-2天，然后去掉封口膜煉苗1-2天，于清晨或傍晚移栽轉(zhuǎn)基因植株的移栽和田間管理同普通試管苗。
(四)轉(zhuǎn)基因植株的分子生物學(xué)檢測提取轉(zhuǎn)化植株葉片DNA，根據(jù)目標(biāo)基因或/和選擇標(biāo)記基因的DNA序列設(shè)計(jì)PCR引物。通過PCR檢測初步確定轉(zhuǎn)基因植株。取PCR陽性的植株進(jìn)行Southern印跡法鑒定，探針取自目的基因片段。
本發(fā)明能獲得大量的具有很強(qiáng)植株再生能力的叢生芽塊，可從絕大多數(shù)基因型中高效獲得轉(zhuǎn)基因植株，且再生植株體細(xì)胞無性系變異小，多數(shù)植株生長發(fā)育正常。本發(fā)明的特點(diǎn)在于1)大幅度減少基因型障礙，可誘導(dǎo)絕大多數(shù)基因型的早熟禾莖尖基部產(chǎn)生膨大組織進(jìn)而產(chǎn)生叢生芽塊，2)培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化頻率較高，3)取材不受季節(jié)限制，4)轉(zhuǎn)基因植株絕大多數(shù)保持原基因型的特征特性。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明實(shí)施例1叢生芽塊的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)取草地早熟禾品種獎(jiǎng)品的種子用70％酒精滅菌1-2分鐘，0.2％升汞(氯化汞)10分鐘，無菌水沖洗4次，播種在濕潤的無菌濾紙上萌發(fā)，12天左右切取莖尖放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基(加入2，4-D 0.2mgL-1，6-BA 2mgL-1)上培養(yǎng)，誘導(dǎo)基部膨大，膨大率為100％。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)20天后，切下莖尖基部膨大組織(直徑1-3mm)轉(zhuǎn)入繼代及成叢培養(yǎng)基(取2，4-D 0.1mgL-1，6-BA 2mgL-1)上誘導(dǎo)叢生芽發(fā)生，15-20天后，多數(shù)膨大基部分化出叢生芽，成叢率為75％左右，每叢芽數(shù)多為15-20個(gè)。將叢生芽塊分割后轉(zhuǎn)入繼代及成叢培養(yǎng)基上，叢生芽塊細(xì)胞迅速增生，一般15天繼代培養(yǎng)一次。若要獲得較大小苗，去掉繼代及成叢培養(yǎng)基中2，4-D，保留2mgL-16-BA。在24±2℃、500-1000Lx光照(14h/d)下培養(yǎng)離體莖尖和莖尖基部膨大物及叢生芽塊。
篩選劑濃度的確定將除草劑綠黃隆(沈陽農(nóng)藥廠生產(chǎn)，有效成分25％)水溶液過濾滅菌后，加入(培養(yǎng)基溫度低于50℃時(shí))去掉酪蛋白水解物的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。綠黃隆濃度分別為0、2、4、5、6、7mgL-1，即6個(gè)梯度濃度。將誘導(dǎo)出的獎(jiǎng)品叢生芽切成單芽后放入含有不同濃度綠黃隆的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每種選擇培養(yǎng)基上接種小苗100株。每15天繼代培養(yǎng)一次，共連續(xù)篩選三代。根據(jù)篩選后的存活率，確定獎(jiǎng)品小苗的除草劑綠黃隆篩選濃度為5-6mgL-1。在此濃度下小苗存活率約為5％左右。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將帶有植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-als-betA的根瘤農(nóng)桿菌LBA4404放在附加抗生素的LB培養(yǎng)基中27℃下震蕩培養(yǎng)，使細(xì)菌處于對數(shù)生長期(OD600＝0.4-0.6)。然后離心10分鐘，棄上清液。菌體用1/2濃度的液體基本培養(yǎng)基洗滌，再離心收集。再將菌體用添加乙酰丁香酮(acetosyringone，As)100μmolL-1和表面活性劑Silwet L-77 0.02％的1/2濃度的液體基本培養(yǎng)基懸浮，稀釋10-20倍用于轉(zhuǎn)化。將繼代培養(yǎng)8天的叢生芽塊切至暴露出芽尖生長點(diǎn)，放入菌液中浸染4-6分鐘，并附以0.5×105Pa負(fù)壓處理。轉(zhuǎn)染后組織塊用無菌濾紙吸干后轉(zhuǎn)入繼代及成叢培養(yǎng)基(6-BA2mgL-1)培養(yǎng)2-3天，然后轉(zhuǎn)入加有抗生素頭孢霉素250mgL-1的抑菌培養(yǎng)基抑制農(nóng)桿菌生長，10-15天后再轉(zhuǎn)入含綠黃隆6mg L-1的篩選培養(yǎng)基篩選3代，每代15天。然后將抗性組織塊轉(zhuǎn)入繼代及成叢培養(yǎng)基上分化小苗。小苗在無激素的培養(yǎng)基上生根長大。生根小苗移入花盆，每5天澆灌一次1/2基本培養(yǎng)基的無機(jī)鹽溶液，隔天澆水一次。移栽成活的小苗取葉片用于分子生物學(xué)檢測。經(jīng)PCR和Southern印跡法分析，轉(zhuǎn)化率(產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株的芽塊數(shù)/農(nóng)桿菌感染的芽塊數(shù)*100)為5％左右。
實(shí)施例2叢生芽誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)程序同實(shí)施例1，但早熟禾品種為新哥來得。選用的繼代及成叢培養(yǎng)基中的激素組合為2，4-D 0.07mgL-1、6-BA 3mgL-1。
篩選劑濃度的確定篩選劑為潮霉素。潮霉素水溶液過濾滅菌后，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，濃度分別為0、2、4、6、8、10、12、14mgL-1，即8個(gè)梯度濃度。篩選程序和方法同實(shí)施例1。根據(jù)篩選后的存活率，確定新哥來得小苗的潮霉素篩選濃度為10mgL-1。在此濃度下小苗存活率約為3％左右。
基因槍轟擊法轉(zhuǎn)化叢生芽塊質(zhì)粒為pCAMBIA1300-hpt-antiport。提取和純化采用標(biāo)準(zhǔn)程序及方法(參見《分子克隆》)。質(zhì)粒質(zhì)量為OD260/OD280在1.7-1.8之間。質(zhì)粒DNA稀釋為1μg/μl。
微彈制備和基因槍轟擊1)、稱取3mg 1.0μm大小的金粉，放入一個(gè)Eppendorf管中，加入1ml 70％乙醇后劇烈渦旋3-5分鐘，然后靜置15分鐘。室溫下15000rpm離心5秒，去除上清液。
2)、加1ml無菌水，劇烈渦旋1分鐘，靜置1分鐘，室溫下15000rpm離心5秒，去除上清液。此步驟重復(fù)3次。
3)、無菌水洗滌后的金粉，加50μl 50％滅菌甘油(終濃度為60mg/ml微彈)。該制備液可室溫貯存2周，使用時(shí)渦旋5分鐘打破金粉凝集。
4)、分散后金粉依次加入5μl質(zhì)粒DNA(1μg/μl)、50μl 12.5molL-1CaCl2、20μl 0.1molL-1亞精胺，邊加樣邊旋渦。然后，繼續(xù)旋渦2-3分鐘，靜置1分鐘。
5)、15000rpm離心2秒，棄上清液。加140μl 70％乙醇，靜置，15000rpm離心2秒后棄上清液。
6)、加48μl無水乙醇，輕彈管壁數(shù)次，低速下渦旋2-3秒，然后取樣加在微彈載體上。微彈用量為每彈0.5mg。
7)、在直徑9cm的培養(yǎng)皿中倒入0.4cm厚的繼代及成叢培養(yǎng)基，然后將叢生芽塊(0.2-0.4cm大小，繼代培養(yǎng)后8天)高密度放入培養(yǎng)皿中。
8)、用基因槍轟擊叢生芽組織塊，每皿轟擊一次。轟擊參數(shù)取可裂圓片與載體的距離為2.5cm，載體與阻擋網(wǎng)的距離為0.8cm，微彈飛行距離6-9cm。其它參數(shù)按使用說明書取值。
轟擊后材料在暗中恢復(fù)培養(yǎng)3天，然后將材料轉(zhuǎn)入成分不變的新培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周，使轉(zhuǎn)入的目標(biāo)基因充分表達(dá)，然后轉(zhuǎn)入加有10mgL-1潮霉素的培養(yǎng)基上連續(xù)篩選3代，存活的組織塊在無潮霉素的繼代及成叢培養(yǎng)基上恢復(fù)培育10-20天，部分組織塊產(chǎn)生小苗。
轉(zhuǎn)化小苗的生根、移栽和分子生物學(xué)檢測同實(shí)施例1。
權(quán)利要求
1.一種建立早熟禾轉(zhuǎn)基因受體體系的方法，其特征在于①種子萌發(fā)小苗的莖尖離體培養(yǎng)和基部膨大組織的誘導(dǎo)及培養(yǎng)基，②培養(yǎng)莖尖基部膨大組織誘導(dǎo)叢生芽及培養(yǎng)基，③叢生芽塊繼代培養(yǎng)，④以叢生芽塊為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化及受體組織繼代培養(yǎng)時(shí)間和轉(zhuǎn)化參數(shù)；所述的轉(zhuǎn)基因受體體系是指莖尖離體培養(yǎng)產(chǎn)生的叢生芽塊及其擴(kuò)增和繼代培養(yǎng)物；叢生芽塊是指離體培養(yǎng)莖尖在含有2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)和6-BA(6-芐基嘌呤)的培養(yǎng)基上產(chǎn)生的由叢生小芽和未組織化細(xì)胞組成的組織塊及其繼代培養(yǎng)物。
2.按照權(quán)利要求1所述的建立早熟禾轉(zhuǎn)基因受體體系的方法，其特征在于，用于莖尖離體培養(yǎng)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有酪蛋白水解物500mg L-1，2，4-D 0-2.0mg L-1，激動(dòng)素(KT)或6-BA 0.1-5.0mg L-1；用于叢生芽誘導(dǎo)和叢生芽塊繼代的繼代及成叢培養(yǎng)基含有酪蛋白水解物500mg L-1，2，4-D 0-1.0mg L-1，激動(dòng)素(KT)或玉米素或6-BA0.1-4.0mg L-1；生根培養(yǎng)基含有激動(dòng)素(KT)或6-BA0.001-2.0mg L-1，萘乙酸(NAA)或吲哚丁酸(IBA)或吲哚乙酸(IAA)0.002-2.0mg L-1。
3.按照權(quán)利要求1所述的建立早熟禾轉(zhuǎn)基因受體體系的方法，其特征在于，離體莖尖取自無菌萌發(fā)的種子，待小苗長到3-5厘米時(shí)，切取莖尖接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于弱光下誘導(dǎo)莖尖基部膨大，然后將膨大組織切下轉(zhuǎn)移到繼代及成叢培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽發(fā)生，叢生芽塊在繼代及成叢培養(yǎng)基上增殖，小苗在生根培養(yǎng)基上生根長大。
4.根據(jù)權(quán)利要求1限定的早熟禾轉(zhuǎn)基因受體體系的應(yīng)用，其特征在于，用基因槍轟擊法或農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行叢生塊遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后材料恢復(fù)培養(yǎng)后，在抑菌或/和在選擇培養(yǎng)基上連續(xù)篩選，通過加壓篩選獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞及叢生芽塊，進(jìn)而再生出轉(zhuǎn)基因植株。
5.按照權(quán)利要求1或4限定的早熟禾轉(zhuǎn)基因受體體系的應(yīng)用，其特征在于，取繼代后培養(yǎng)7-12天的叢生芽塊作為轉(zhuǎn)基因受體。
6.按照權(quán)利要求1或4限定的早熟禾轉(zhuǎn)基因受體體系的應(yīng)用，其特征在于，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在0.95-0.10個(gè)大氣壓(0.95×105Pa---1×1.04Pa)下進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，在菌液中加入濃度為0-0.3％的表面活性劑Silwet L-77。
全文摘要
本發(fā)明公開一種建立早熟禾遺傳轉(zhuǎn)化體系的方法及應(yīng)用，主要步驟包括以草地早熟禾的種子苗莖尖為材料，離體培養(yǎng)誘導(dǎo)莖尖基部膨大，切取膨大組織轉(zhuǎn)入繼代及成叢培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽發(fā)生。在繼代及成叢培養(yǎng)基上叢生芽塊持續(xù)增殖，轉(zhuǎn)入成苗培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基后產(chǎn)生完整植株。取適宜生長期的叢生芽塊為受體采用基因槍轟擊法或農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因植株。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中，采用表面活性劑Silwet L－77處理和減壓處理有效提高了轉(zhuǎn)化頻率，從而建立起一個(gè)高效的基因型制約小的早熟禾轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1596617SQ20041002453
公開日2005年3月23日 申請日期2004年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月6日
發(fā)明者張舉仁, 楊愛芳, 張可煒, 尹小燕, 谷曉峰 申請人:山東大學(xué)