專利名稱：一種適用于櫛孔扇貝的四倍體制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及貝類多倍體的誘導(dǎo)和培育，特別提供了一種適用于櫛孔扇貝的四倍體制備方法。
背景技術(shù)：
利用生物技術(shù)培育優(yōu)良的養(yǎng)殖品種，是發(fā)展海水貝類養(yǎng)殖亟待解決的關(guān)鍵問題之一。三倍體貝類具有許多優(yōu)良生產(chǎn)性狀，是一類很有價值的養(yǎng)殖貝類新品系。目前通常采用理化方法人工誘導(dǎo)多倍體，倍化率變化幅度大，很難達(dá)到100％，并且人工誘導(dǎo)對誘導(dǎo)對象造成的負(fù)面影響大，表現(xiàn)為存活率低、異常發(fā)育的胚胎和幼蟲比例高。利用人工培育的四倍體，與正常二倍體雜交，可以高效獲得高倍化率的三倍體，是最有前景的三倍體貝類制備方法。
目前國內(nèi)外成熟的貝類四倍體技術(shù)僅見美國學(xué)者利用三倍體長牡蠣(通稱為太平洋牡蠣)的卵子與來自二倍體的精子受精，采用細(xì)胞松弛素B抑制受精卵第一極體的釋放，獲得了四倍體長牡蠣。該技術(shù)中通過人工解剖方法分別從三倍體和二倍體獲取卵子和精子。該技術(shù)已經(jīng)受到國際專利的保護(hù)。我國學(xué)者也采用該方法，獲得少量合浦珠母貝四倍體。但是直接從二倍體制備四倍體的技術(shù)，國內(nèi)外鮮有報(bào)道。
櫛孔扇貝三倍體性腺發(fā)育嚴(yán)重受阻，無法通過催產(chǎn)三倍體獲取卵子，而且人工解剖獲取的卵子無法完成受精。因此利用三倍體來誘導(dǎo)四倍體的技術(shù)不可行，需要探索櫛孔扇貝四倍體的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種適用于櫛孔扇貝的四倍體制備方法，人工培育櫛孔扇貝的四倍體，促進(jìn)三倍體櫛孔扇貝的開發(fā)利用。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下
1)選取性腺發(fā)育飽滿成熟，1～3齡，在自然海區(qū)棲息的二倍體櫛孔扇貝；2)分別催產(chǎn)雄貝和雌貝獲取精子和卵子，經(jīng)人工同步授精獲取受精卵，受精卵密度在10～50萬粒/L，然后進(jìn)行誘導(dǎo)加倍；3)利用細(xì)胞松弛素B或者6-二甲氨基嘌呤，處理受精卵，使其染色體數(shù)目從二倍體加倍至四倍體，用海水漂洗受精卵，利用篩絹網(wǎng)過濾去除藥物，收集受精卵，重新用海水懸??；4)在水溫18～20℃下，按常規(guī)方法培育誘導(dǎo)出的胚胎和幼蟲，直至幼蟲變態(tài)為幼貝；5)利用流式細(xì)胞術(shù)，篩選四倍體，從而獲得四倍體。其中四倍體誘導(dǎo)處理是在水溫18～20℃下，加入細(xì)胞松弛素B或者6-二甲氨基嘌呤，有效劑量分別為0.1～1mg/L和300～500μmol/L，處理時間15～20min，處理開始的時間為受精后10-15min。
對實(shí)施誘導(dǎo)處理的材料，采用活體取樣制備單細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞密度為5000～100000個/mL，加入DNA特異性熒光染料DAPI(4′，6-二聯(lián)脒-2-吲哚苯)，加入量為1～10mg/L，利用流式細(xì)胞儀檢測樣品的染色體倍性組成，篩選出四倍體。
本發(fā)明的原理在于現(xiàn)有技術(shù)中，從人工誘導(dǎo)培育的三倍體獲取卵子，利用二倍體產(chǎn)生的精子受精后，采用細(xì)胞松弛素B抑制受精卵第一極體的釋放，獲得了四倍體長牡蠣。而本發(fā)明取材于自然棲息的二倍體，采用細(xì)胞松弛素B或6-二甲氨基嘌呤處理，并且通過控制水溫、處理時間、處理開始的時間等，在抑制受精卵第一極體釋放的基礎(chǔ)上改變受精卵的染色體行為，實(shí)現(xiàn)部分受精卵的染色體數(shù)目從二倍體加倍至四倍體，經(jīng)培育后，采用流式細(xì)胞術(shù)篩選出四倍體。
本發(fā)明提供的櫛孔扇貝四倍體制備過程中，要求被處理的受精卵的發(fā)育具有較高同步性，以實(shí)現(xiàn)較高的四倍體胚胎誘導(dǎo)率。為了解決這一問題，首先選擇性腺發(fā)育成熟的親本，以保證高質(zhì)量的精子和卵子。其次，實(shí)施同步人工授精，具體而言，將雌、雄親本甄選分開，分別進(jìn)行產(chǎn)卵和排精，然后進(jìn)行人工授精，授精時的精子與卵子的比例不少于100∶1，授精后不斷攪動。
流式細(xì)胞術(shù)是對單個細(xì)胞或其他生物微粒進(jìn)行快速定量分析與分選的技術(shù)，其原理是將懸浮在液流中的單細(xì)胞逐個通過測量區(qū)，用儀器檢測細(xì)胞內(nèi)的光學(xué)參數(shù)而達(dá)到快速、大量地測定細(xì)胞的一系列物理特性和生化特性。如果單細(xì)胞樣品經(jīng)DNA特異性熒光染料處理，就可測定樣品的DNA含量，判斷其倍性。自20世紀(jì)80年代以來，國際貝類多倍體研究中廣泛利用流式細(xì)胞術(shù)檢測實(shí)驗(yàn)材料的倍性組成。本發(fā)明采用流式細(xì)胞術(shù)對幼貝進(jìn)行分析，在不殺死檢測對象的條件下，實(shí)現(xiàn)了快速、準(zhǔn)確篩選四倍體。
本發(fā)明的有益效果是1、本發(fā)明提供的四倍體制備方法，直接利用自然海區(qū)棲息具有繁殖力的自然二倍體櫛孔扇貝，經(jīng)人工授精制備受精卵，施加化學(xué)誘導(dǎo)劑處理使受精卵的染色體加倍，獲得四倍體胚胎，利用流式細(xì)胞術(shù)對誘導(dǎo)培育獲得的材料進(jìn)行活體檢測，篩選四倍體。本發(fā)明制備的四倍體櫛孔扇貝是利用染色體組操作技術(shù)獲得的特有種質(zhì)資源。
2、本發(fā)明材料來源豐富，并且四倍體誘導(dǎo)率穩(wěn)定，四倍體幼蟲的比例在30％以上。
具體實(shí)施例方式
以下給出幾個典型實(shí)施例，但本發(fā)明并不局限在以下實(shí)施例中。
實(shí)施例1利用本發(fā)明方法，制備櫛孔扇貝四倍體，具體操作為1)從自然海區(qū)選取性腺發(fā)育飽滿，性腺色澤鮮艷的1齡二倍體櫛孔扇貝；2)雌雄分選，分別實(shí)施人工催產(chǎn)獲取精子和卵子，人工授精，授精時的精子與卵子的比例為100∶1，獲得受精卵，調(diào)整其密度為10萬粒/L；3)在18℃下，受精后15min按0.5mg/L的濃度加入細(xì)胞松弛素B，處理15min；4)用海水漂洗受精卵，利用篩絹網(wǎng)過濾去除藥物，收集受精卵，重新用海水懸浮，并以常規(guī)方法孵育(孵育密度為50個/mL左右)；
5)在水溫18℃下，按常規(guī)方法培育誘導(dǎo)出的胚胎和幼蟲，直至幼蟲變態(tài)為幼貝；在受精后48h，采用流式細(xì)胞術(shù)分析表明四倍體幼蟲比例為50％；6)在完成變態(tài)的幼貝中，活體獲取少量鰓組織，振蕩過濾制備成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為5000個/mL，加入DAPI，加入量為1mg/L，采用流式細(xì)胞術(shù)逐個分析，檢測到四倍體，比例為3％。
實(shí)施例2利用本發(fā)明方法，進(jìn)行櫛孔扇貝的多倍體幼蟲樣品制備，具體操作為1)從自然海區(qū)選取性腺發(fā)育飽滿，性腺色澤鮮艷的2齡二倍體櫛孔扇貝；2)雌雄分選，分別實(shí)施人工催產(chǎn)獲取精子和卵子，人工授精，授精時的精子與卵子的比例為120∶1，獲得受精卵，調(diào)整其密度為50萬粒/L(懸浮于海水中)；3)在20℃下，受精后12min按0.1mg/L的濃度加入細(xì)胞松弛素B，處理20min；4)用海水漂洗受精卵，利用篩絹網(wǎng)過濾去除藥物，收集受精卵，重新用海水懸浮，并以常規(guī)方法孵育(孵育密度為50個/mL左右)；5)在水溫20℃下，按常規(guī)方法培育誘導(dǎo)出的胚胎和幼蟲，直至幼蟲變態(tài)為幼貝；在受精后48h，采用流式細(xì)胞術(shù)分析表明四倍體幼蟲比例為50％；6)在完成變態(tài)的幼貝中，活體獲取少量鰓組織，振蕩過濾制備成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為10000個/mL，加入DAPI，加入量為2mg/L，采用流式細(xì)胞術(shù)逐個分析，檢測到四倍體，比例為2％。
實(shí)施例31)從自然海區(qū)選取性腺發(fā)育飽滿，性腺色澤鮮艷的3齡二倍體櫛孔扇貝；
2)雌雄分選，分別實(shí)施人工催產(chǎn)獲取精子和卵子，人工授精，授精時的精子與卵子的比例為100∶1，獲得受精卵，調(diào)整其密度為10萬粒/L(懸浮于海水中)；3)在18℃下，受精后10min按1mg/L的濃度加入細(xì)胞松弛素B，處理15min；4)用海水漂洗受精卵，利用篩絹網(wǎng)過濾去除藥物，收集受精卵，重新用海水懸浮，并以常規(guī)方法孵育(孵育密度為50個/mL左右)；5)在水溫18℃下，按常規(guī)方法培育誘導(dǎo)出的胚胎和幼蟲，直至幼蟲變態(tài)為幼貝；在受精后48h，采用流式細(xì)胞術(shù)分析表明四倍體幼蟲比例為60％；6)在完成變態(tài)的幼貝中，活體獲取少量鰓組織，振蕩過濾制備成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為50000個/mL，力入DAPI，加入量為5mg/L，采用流式細(xì)胞術(shù)逐個分析，檢測到四倍體，比例為3％。
實(shí)施例4利用本發(fā)明方法，制備櫛孔扇貝四倍體，具體操作為1)從自然海區(qū)選取性腺發(fā)育飽滿，性腺色澤鮮艷的3齡二倍體櫛孔扇貝；2)雌雄分選，分別實(shí)施人工催產(chǎn)獲取精子和卵子，人工授精，授精時的精子與卵子的比例為150∶1，獲得受精卵，調(diào)整其密度為30萬粒/L(懸浮于海水中)；3)在19℃下，受精后10min加入終濃度為300μmol/L的6-二甲氨基嘌呤，處理20min；4)用海水漂洗受精卵，利用篩絹網(wǎng)過濾去除藥物，收集受精卵，重新用海水懸浮，并以常規(guī)方法孵育(孵育密度為50個/mL左右)；5)在水溫19℃下，按常規(guī)方法培育誘導(dǎo)出的胚胎和幼蟲，直至幼蟲變態(tài)為幼貝；在受精后48h，采用流式細(xì)胞術(shù)分析表明四倍體幼蟲比例為70％；
6)在完成變態(tài)的幼貝中，活體獲取少量鰓組織，振蕩過濾制備成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為80000個/mL，加入DAPI，加入量為8mg/L，采用流式細(xì)胞術(shù)逐個分析，檢測到四倍體，比例為3％。
實(shí)施例5利用本發(fā)明方法，制備櫛孔扇貝四倍體，具體操作為1)從自然海區(qū)選取性腺發(fā)育飽滿，性腺色澤鮮艷的3齡二倍體櫛孔扇貝；2)雌雄分選，分別實(shí)施人工催產(chǎn)獲取精子和卵子，人工授精，授精時的精子與卵子的比例為150∶1，獲得受精卵，調(diào)整其密度為40萬粒/L(懸浮于海水中)；3)在19℃下，受精后15min加入終濃度為500μmol/L的6-二甲氨基嘌呤，處理18min；4)用海水漂洗受精卵，利用篩絹網(wǎng)過濾去除藥物，收集受精卵，重新用海水懸浮，并以常規(guī)方法孵育(孵育密度為50個/mL左右)；5)在水溫19℃下，按常規(guī)方法培育誘導(dǎo)出的胚胎和幼蟲，直至幼蟲變態(tài)為幼貝；在受精后48h，采用流式細(xì)胞術(shù)分析表明四倍體幼蟲比例為60％；6)在完成變態(tài)的幼貝中，活體獲取少量鰓組織，振蕩過濾制備成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為100000個/mL，加入DAPI，加入量為10mg/L，采用流式細(xì)胞術(shù)逐個分析，檢測到四倍體，比例為2％。
權(quán)利要求
1.一種適用于櫛孔扇貝的四倍體制備方法，其特征在于包括如下過程1)選擇親本選取自然棲息的二倍體櫛孔扇貝，性腺發(fā)育飽滿成熟；2)獲取受精卵分別催產(chǎn)雄貝和雌貝獲取精子和卵子，經(jīng)人工同步授精獲取受精卵，受精卵密度在10～50萬粒/L，然后進(jìn)行誘導(dǎo)加倍；3)誘導(dǎo)加倍在水溫18～20℃下，利用化學(xué)誘導(dǎo)劑處理受精卵使其染色體數(shù)目從二倍體加倍至四倍體，受精后10～15min開始處理，處理時間15～20min，用海水漂洗受精卵，利用篩絹網(wǎng)過濾去除藥物；4)培育幼體在水溫18～20℃下，按常規(guī)方法培育誘導(dǎo)出的胚胎和幼蟲，直至幼蟲變態(tài)為幼貝；5)篩選四倍體采用流式細(xì)胞術(shù)逐個分析幼貝，篩選獲得四倍體。
2.按照權(quán)利要求1所述適用于櫛孔扇貝的四倍體制備方法，其特征是所述化學(xué)誘導(dǎo)劑為細(xì)胞松弛素B，或者為6-二甲氨基嘌呤。
3.按照權(quán)利要求1或2所述適用于櫛孔扇貝的四倍體制備方法，其特征是所述化學(xué)誘導(dǎo)劑的劑量，細(xì)胞松弛素B為0.1～1mg/L，6-二甲氨基嘌呤為300～500μmol/L。
4.按照權(quán)利要求1所述適用于櫛孔扇貝的四倍體制備方法，其特征是所述流式細(xì)胞術(shù)包括活體取樣，制備單細(xì)胞懸浮液，加入DNA特異性熒光染料DAPI，利用流式細(xì)胞儀檢測樣品的染色體倍性。
全文摘要
本發(fā)明公開一種適用于櫛孔扇貝的四倍體制備方法。它利用具有繁殖力的自然二倍體櫛孔扇貝，經(jīng)人工授精制備受精卵，施加化學(xué)誘導(dǎo)劑處理使受精卵的染色體加倍，獲得四倍體，利用流式細(xì)胞術(shù)活體篩選四倍體。本發(fā)明制備的四倍體櫛孔扇貝是利用染色體組操作技術(shù)獲得的特有種質(zhì)資源。本發(fā)明材料來源豐富，并且四倍體誘導(dǎo)率穩(wěn)定，四倍體幼蟲的比例在30％以上。
文檔編號A01K61/00GK1739343SQ20041005030
公開日2006年3月1日 申請日期2004年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月24日
發(fā)明者闕華勇, 張國范, 張福綏 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所