專利名稱：新型生物農(nóng)藥——松剛霉素生產(chǎn)技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及用于農(nóng)作物真菌病蟲害生物農(nóng)藥制備技術(shù)。
背景技術(shù)：
在植物病害中，真菌病害種類最多，約有3萬種，其中許多還是為害最嚴(yán)重的，如禾谷類的銹病是世界性重要病害。幾乎每種作物上都可以發(fā)現(xiàn)幾種甚至幾十種真菌病害，如水稻上發(fā)現(xiàn)的真菌病害在200種以上，其中常見的真菌病害在30種以上。各種作物常見的銹病、黑粉病、白粉病和霜霉病都是真菌引起的。目前，上述病害的防治多數(shù)仍使用化學(xué)農(nóng)藥，不但致使諸多致病菌產(chǎn)生耐藥性，用藥量不斷地加大，殘留量增高；而且由于長期使用化學(xué)農(nóng)藥，導(dǎo)致造成對(duì)環(huán)境的污染以及對(duì)人體的危害。所以傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥已成為人畜的一種新殺手。另外，由于大量使用高殘留的化學(xué)農(nóng)藥，已引起了農(nóng)畜產(chǎn)品殘留嚴(yán)重超標(biāo)，導(dǎo)致出口受阻。
現(xiàn)有生物農(nóng)藥品種結(jié)構(gòu)不合理，僅限于生物殺蟲劑，如Bt等和抗細(xì)菌農(nóng)用抗生素，如井岡霉素、春雷霉素和農(nóng)用鏈霉素等，而抗真菌生物農(nóng)藥起步甚晚，尚無高效、廣譜品種，且處于試用階段，如中生菌素和武夷霉素等。從總體上看，目前生物農(nóng)藥在整個(gè)農(nóng)藥中所占的比例還較小，而抗真菌生物農(nóng)藥幾乎是空白，加速抗真菌生物農(nóng)藥的研發(fā)已成為世界上發(fā)展生物農(nóng)藥的一種趨勢和方向。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的在于采用固體發(fā)酵新工藝生產(chǎn)松剛霉素母核—一種具有高效抗真菌性能的非多烯類醫(yī)用灰黃霉素分子結(jié)構(gòu)，實(shí)施基團(tuán)甲基羧化使該農(nóng)藥對(duì)人體無毒害、對(duì)環(huán)境無殘留、無污染，具有非常良好的生物相容性。
本發(fā)明目的可通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明采用以大米為主要原料的固體發(fā)酵生產(chǎn)具有抗真菌性能的非多烯類含氯化合物母核技術(shù)，對(duì)該母核甲基(CH3)實(shí)施羧化，使其基團(tuán)發(fā)生改變，實(shí)現(xiàn)松剛霉素由非水溶性轉(zhuǎn)為水溶性，使制劑水溶化。提高葉面的附著力，增強(qiáng)對(duì)真菌的抑制力。
松剛霉素(SoGamycin)是從蕁麻青霉(Penicillium Patulum)培養(yǎng)液得到的一種非多烯類含氯產(chǎn)物作為母核，實(shí)施甲基(CH3)羧化，呈水溶性蕁麻青霉。
該菌種的公開已記載文獻(xiàn)1)吳松剛等 中國抗生素雜志4(6)12-14 19792)吳松剛等 中國醫(yī)藥工業(yè)3(2)14 19793)吳松剛等 微生物通報(bào)(3)10 19794)吳松剛等 微生物通報(bào)6(3)10-12 19705)吳松剛等 微生物通報(bào)
10(5)202-206 19836)吳松剛等 遺傳2(4)16-18 1990福建師范大學(xué)學(xué)校(自然科學(xué)版)12(2)88-92 19967)吳松剛等 藥物生物技術(shù)2(4)28-32 1995該菌種的商業(yè)公開途徑中國科學(xué)院微生物研究所松剛霉素母核分子結(jié)構(gòu)見圖1，物理性狀為白色粉末，無臭，味微苦，溶點(diǎn)為218-224℃，具有強(qiáng)烈的抗真菌活性，甲基羧化后，實(shí)現(xiàn)水溶性特性，提高了在葉面的附著力，增強(qiáng)了對(duì)致病真菌的殺菌作用，其作用機(jī)理是松剛霉素大量被致病真菌吸收后，與其細(xì)胞的脂肪結(jié)合，不與DNA與RNA結(jié)合，達(dá)到抑制致病真菌的作用?？捎糜诜乐味喾N植物病害，諸如炭疽病，葉斑病，白粉病，霜霉病和枯萎病等。
松剛霉素母核采用現(xiàn)代固體發(fā)酵技術(shù)—厚層好氧發(fā)酵，使其細(xì)胞內(nèi)大量累積母核固有有效成份，大幅度節(jié)約能源，經(jīng)溶媒萃取后，進(jìn)行甲基羧化，其羧化過程為在一端含有一個(gè)一級(jí)胺，另一端有一個(gè)光敏感性的苯基疊氮基(Picrce)，4-(P-疊氮水揚(yáng)基氮基)丁胺(ASBA)這種交聯(lián)劑不會(huì)自發(fā)地與羧基反應(yīng)，必須利用另一個(gè)試劑來促進(jìn)鍵的形成，它不與碳化二亞胺和其他這樣的能啟動(dòng)與一個(gè)受體羧后形成鍵合的試劑體系相結(jié)合使用，一個(gè)水溶性的碳化二亞胺如EDC，是用以激活一逐步形成靶標(biāo)分子上的羧基。形成活性酯中間體，如圖3。在ASBA(圖2)存在的情況下，衍生化會(huì)發(fā)生，導(dǎo)致酰胺鍵的形成，從而產(chǎn)生一個(gè)光反應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行的修飾。ASBA的交聯(lián)劑提供了一個(gè)相當(dāng)長的間隔基(16.3A)。它的苯基疊氮部分是由一個(gè)水揚(yáng)酸的衍生物構(gòu)建的，因而具有一個(gè)激活環(huán)的羧基，這個(gè)基團(tuán)的存在，使得在交聯(lián)之前對(duì)環(huán)進(jìn)行放射性碘化作用，在光解步驟被啟動(dòng)之前，這個(gè)試劑應(yīng)在黑暗之中操作，或是采用避光處理，以防止苯基疊氮基因的降解。
本發(fā)明的母核生產(chǎn)方法的主要特點(diǎn)在于其一、以大米為主要原料，無需外源酶解，蒸熟滅菌，即可使用。
其二、采用液體種，厚層通風(fēng)固體發(fā)酵工藝，料厚可達(dá)20cm，需翻動(dòng)通風(fēng)培養(yǎng)。
其三、母核有效成份全部積累在細(xì)胞內(nèi)，發(fā)酵效價(jià)可達(dá)60000u/g以上。經(jīng)有機(jī)溶劑萃取后，即可進(jìn)行甲基羧化。見附圖3所示。
本發(fā)明的母核甲基羧化工藝，以ASBA為關(guān)鍵的交聯(lián)劑，實(shí)現(xiàn)母核由非水溶性轉(zhuǎn)為水溶性，本生產(chǎn)方法主要特點(diǎn)在于其一、母核甲基基團(tuán)的改造，選擇生物藕合技術(shù)，而ASBA作為羧基反應(yīng)性的交聯(lián)劑。取得了理想的結(jié)果。
其二、ASBA含有一個(gè)一級(jí)胺基團(tuán)，利用碳化二亞胺EDC，可藕合含羧基的化合物，在UV的照射下，啟動(dòng)光活化反應(yīng)，導(dǎo)致共價(jià)的交聯(lián)取得成功。
其三、由于母核甲基羧化，實(shí)現(xiàn)由非溶性到水溶性的轉(zhuǎn)換，從根本上解決了作為農(nóng)業(yè)殺菌劑對(duì)劑型的要求，并增強(qiáng)了其抗菌作用。


圖1為松剛霉素分子結(jié)構(gòu)圖；圖2為松剛霉素前體固體發(fā)酵原理流程圖；圖3為母核甲基羧化原理圖；圖4為母核甲基羧化流程圖；圖5為松剛霉素紫外光譜圖；本發(fā)明結(jié)合附圖各實(shí)施例作如下進(jìn)一步的說明附圖1中，為本發(fā)明母核的分子結(jié)構(gòu)，它無異于作為醫(yī)用灰黃霉素的分子結(jié)構(gòu)，是一種具有強(qiáng)烈的抗真菌性能的非多烯類抗生素，理化性質(zhì)均按我國2000年版藥典所述。
附圖2中，本工藝主要原料為大米，液體種的接種量為15％，28℃培養(yǎng)，料層厚20cm，翻動(dòng)通風(fēng)發(fā)酵，發(fā)酵周期200-240hr，萃取有機(jī)溶劑為丙酮。含量可達(dá)300000u/ml，可套用。
附圖3、4、5中，本工藝以4-(P-疊氮水揚(yáng)基氮基)丁胺為交聯(lián)劑，在UV照射下，與母核萃取液進(jìn)行羧基反應(yīng)，ASBA的濃度為0.3％，攪拌時(shí)間30’，即可完成全過程。
實(shí)施例1本發(fā)明的生產(chǎn)菌株為高度耐前體生產(chǎn)變株，發(fā)酵配方為大米∶營養(yǎng)液＝1∶0.8營養(yǎng)液中含Nacl 5％KH2PO40.2％NaNo30.6％
FeSo40.002％PH 自然液體種接種量按15％接入大米培養(yǎng)基，28℃，200-240hr本發(fā)明固體菌絲培養(yǎng)物，經(jīng)100℃烘干，用丙酮進(jìn)行萃取，萃取柱單管套用，萃取液母核含量到300000u/ml即可終止。
實(shí)施例2本發(fā)明的母核甲基羧化工藝，主要在反應(yīng)釜中進(jìn)行，該反應(yīng)釜特點(diǎn)為避光、帶攪拌、帶紫外燈的5M3罐裝置，溫度為常溫條件，交聯(lián)劑濃度為0.3％，交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間為30′，終止后，進(jìn)行真空濃縮760mmhg濃縮到晶體形成。晶體干燥100℃烘干2hr，水份＜2％，作為晶種進(jìn)行配制水溶性制劑。
本發(fā)明主要優(yōu)點(diǎn)和效益(1)選擇深層固體發(fā)酵新工藝，生產(chǎn)松剛霉素母核——醫(yī)用灰黃霉素分子結(jié)構(gòu)，較深層液體發(fā)酵工藝，電耗，能耗大幅度下降，其發(fā)酵效價(jià)高達(dá)60000u/g，從而使生產(chǎn)成本顯著下降，為農(nóng)用奠定了重要的經(jīng)濟(jì)基礎(chǔ)。
(2)本發(fā)明采用對(duì)醫(yī)用灰黃霉素分子結(jié)構(gòu)基團(tuán)甲基羧化工藝，從根本上解決了由非水溶性的農(nóng)用品質(zhì)要求，使農(nóng)用化得以實(shí)現(xiàn)。
(3)松剛霉素的問世，以其無毒害、無公害、高效、廣譜、安全、低成本的獨(dú)特優(yōu)勢，而逐步代替化學(xué)農(nóng)藥，將會(huì)取得巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
松剛霉素的應(yīng)用試驗(yàn)1
1引言本試驗(yàn)?zāi)康脑谟跈z測新型抗真菌生物農(nóng)藥——松剛霉素對(duì)甜瓜鐮刀菌的抑菌作用，從而為鑒定其防治枯萎病的能力提供科學(xué)依據(jù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)由福建省農(nóng)科院生物技術(shù)中心提供。
2材料與方法2.1材料供試菌株鐮刀菌菌株編號(hào)為132，F(xiàn)-T.1.7-030520，甜瓜，供試藥劑“松剛霉素”溶液。
2.2方法a、新型抗真菌生物農(nóng)藥——松剛霉素的稀釋用無菌水試管將“松剛霉素”稀釋100倍、300倍、600倍、900倍和1200倍，保存各稀釋液。b、含藥培養(yǎng)基的制備將100mlPDA固體培養(yǎng)基加熱熔化，待其冷卻至60℃左右時(shí)，分別加入稀釋好的“松剛霉素”溶液10ml，充分搖勻后分別各倒5塊培養(yǎng)皿。以加10ml無菌水作對(duì)照。C、接菌待培養(yǎng)基凝固后，用直徑6mm的打孔器從長勢旺盛的鐮刀菌平板上打取菌落，并各移1塊菌餅至上述制備的含藥及對(duì)照平板中央，每處理重復(fù)5次。d、觀察結(jié)果將各處理及對(duì)照放置在25℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，每天觀察菌絲的生長并用“十”字形測量菌落直徑，共測定6天，觀察菌絲體生長的情況，計(jì)算抑菌率，計(jì)算公式為抑菌率＝(CK菌落直徑-供試藥劑菌落直徑)/CK菌落直徑×100％3結(jié)果與分析從表1和表2以及以下的比較我們可以看出，不同稀釋倍數(shù)的松剛霉素對(duì)甜瓜鐮刀菌的生長都具有一定的抑制作用。稀釋100倍的抑制率最大，為78.69％，并且對(duì)菌落的生長有所影響，隨著稀釋倍數(shù)的增大，對(duì)甜瓜鐮刀菌的抑制減弱，即使我們將其稀釋到1200倍時(shí)，甜瓜鐮刀菌的生長仍然具有一定的影響，從圖1可以看出，不同稀釋倍數(shù)的松剛霉素對(duì)鐮刀菌生長的速率具有一定的影響，隨著稀釋倍數(shù)的增加，生長速率減慢。由此可見，松剛霉素對(duì)甜瓜鐮刀菌菌體的生長具有很強(qiáng)的抑制作用。
松剛霉素對(duì)甜瓜鐮刀菌菌落的形狀也具有一定的影響，同對(duì)照組相比，不同處理組的菌落形狀都呈現(xiàn)了梅花狀，不似對(duì)照組那樣呈現(xiàn)圓形。此外，不同稀釋倍數(shù)的松剛霉素對(duì)甜瓜鐮刀菌的分泌物也有影響。因?yàn)榫渌憩F(xiàn)出的顏色是由于鐮刀菌的分泌物所造成的在培養(yǎng)中，我們發(fā)現(xiàn)，不同處理組的菌落顏色有所不同，隨著稀釋倍數(shù)的增加菌落顏色與對(duì)照組很接近，而稀釋倍數(shù)少的處理組菌落不是呈現(xiàn)橙色，而是呈現(xiàn)灰白色。不同稀釋倍數(shù)的松剛霉素對(duì)甜瓜鐮刀菌的生長具有抑制，隨著稀釋倍數(shù)的減少，抑制作用增大，菌落的生長速率減少，并且對(duì)于菌落的形狀以及菌體的分泌物具有一定的影響。
松剛霉素的應(yīng)用試驗(yàn)2一、在香蕉上的使用1、試用地址廣東省廣州市番禺區(qū)萬頃沙五戶香蕉專業(yè)戶，試藥九瓶。
2、試用日期2003年7月5日，第一次用藥7月15日第二次用藥。
3、試用目標(biāo)防治香蕉葉斑病、黑星病、黑斑病、銹斑病。
4、試用結(jié)果葉斑病、黑星病無明顯效果，與常規(guī)藥同效。
5、特別效果對(duì)黑斑病、銹斑病明顯優(yōu)于其它常規(guī)藥。
6、重復(fù)使用對(duì)比兩次使用的田塊效果相同。
二、在白瓜作物上便用1、試用地址番禺區(qū)萬頃沙夏白瓜作物，專業(yè)種植戶。
2、試用日期2003年7月10日，一次性用藥，未作第二次試用。
3、試用目標(biāo)防治白粉、霜霉病，設(shè)有對(duì)比區(qū)。
4、試用結(jié)果防治白粉病效果顯著、霜霉病與常規(guī)藥相同。
5、對(duì)比無用藥區(qū)未施用松剛霉素的白瓜，白粉病高出30％，植株提早衰，產(chǎn)品差，產(chǎn)量低。
結(jié)論深圳松剛霉素經(jīng)試用及對(duì)比，有幾個(gè)病的防治效果確實(shí)明顯，而且它無毒、安全，防治病害較為廣普，可用保護(hù)性和針對(duì)性使用其它病害效果有待繼續(xù)試用觀察。
表1不同稀釋倍數(shù)的新型抗真菌生物農(nóng)藥——松剛霉素對(duì)甜瓜鐮刀菌落生長的影響觀察時(shí)間新型抗真菌生物農(nóng)藥——松剛霉素不同濃度(倍)下甜瓜鐮刀菌落生長直徑(mm)(b) CK 100300 600 1200111.68.610.6 9.8 11.4222.49.412.2 12.2 15.2338.610.8 14.6 16.6 21.4454.813.2 18.2 21.0 26.2570.015.0 20.4 24.4 31.0682.617.6 23.0 28.8 36.2抑制率 ——78.69％72.15％ 65.13％ 56.17％
表2不同稀釋倍數(shù)的新型抗真菌生物農(nóng)藥——松剛霉素對(duì)甜瓜鐮刀菌菌絲體生長的影響觀察時(shí)間新型抗真菌生物農(nóng)藥——松剛霉素不同濃度(倍)下甜瓜鐮刀菌落生長情況(b) CK 100 300 60012001菌絲最多， 菌絲稀少， 菌絲稀少， 菌絲較多，生長整齊 菌絲較多，生長整齊白色絨狀 生長不整齊 生長較為整齊2菌絲開始想 菌絲稀少， 菌絲稀少， 菌絲稀少，伸展較小 菌絲較多四周伸展 生長不整齊 生長較為整齊3菌落形狀規(guī)則， 菌絲少，生長緩 菌落形狀極不菌落形狀不規(guī)則 菌落形狀不規(guī)則菌絲生長整齊，白色 慢而不規(guī)則 規(guī)則，菌絲少菌絲生長較為整齊， 菌絲較多4菌落橙色中帶有 菌絲生長不旺盛，菌絲生長不整齊，菌落橙色， 菌落橙色，白色，生長整齊 菌落形狀不規(guī)則 菌落形狀不規(guī)則 菌絲生長較為整齊， 生長較為整齊5菌絲生長旺盛 菌落形狀不規(guī)則 菌絲生長不整齊，菌落形狀不規(guī)則 菌絲生長較為旺盛菌落呈現(xiàn)梅花狀6菌絲生長旺盛， 菌絲生長整齊， 菌落形狀不規(guī)則 菌落形狀不規(guī)則 菌落形狀不規(guī)則呈橙色 菌落呈現(xiàn)灰黑色 菌絲生長較為旺盛
權(quán)利要求
1.新型生物農(nóng)藥——松剛霉素生產(chǎn)技術(shù)，其特征在于本技術(shù)的生產(chǎn)步驟為①固體培養(yǎng)基的制備a.選擇大米為原料；b.以含NaCL4～6％，KH2PO40.1～0.3％，NaNO30.4～0.7％，F(xiàn)eSO40.001.003％的液體為營養(yǎng)液；c.將大米與營養(yǎng)液以重量比為1∶0.8的比例混勻蒸熟；d.將混勻蒸熟料在121℃壓力下滅菌30分鐘，得大米固體培養(yǎng)基；②接種a.選用蕁麻青霉(Penicillinm Patulum)液體菌種；b.在大米固體培養(yǎng)基中接種，接種量為15％，在25～30℃培養(yǎng)，料層厚15～30cm，翻動(dòng)通風(fēng)發(fā)酵，發(fā)酵固期200～240hr；c.將培養(yǎng)物固體菌絲用有機(jī)溶劑丙酮萃??；得含量可達(dá)300000u/ml的萃取液備用；③甲基羧化處理以4-(P-疊氮水揚(yáng)基氮基)丁胺為交聯(lián)劑，在UV照射下，與母核萃取液進(jìn)行羧基反應(yīng)，反應(yīng)過程交聯(lián)劑的濃度為0.3％，攪拌時(shí)間為20～40分鐘得羧基化反應(yīng)物；④水溶性制劑的制備；a.將羧基反應(yīng)物在760mmhg下真空濃縮得晶體；b.將所得晶體在90～110℃下烘干，至水份小于2％，得晶種；c.將晶種與水溶液溶解，得水溶性制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型生物農(nóng)藥——松剛霉素生產(chǎn)技術(shù)，其特征在于母核甲基羧反應(yīng)采用的工藝為①選用避光、帶攪拌、帶紫外燈的反應(yīng)釜，置入萃取液及交聯(lián)劑，交聯(lián)劑濃度為0.3％，交聯(lián)反應(yīng)時(shí)間為30分鐘；②交聯(lián)反應(yīng)后，在760mmhg條件下真空濃縮到晶體成形；③在100℃下烘至水份含量小于2％。
全文摘要
一種新型生物農(nóng)藥——松剛霉素生產(chǎn)技術(shù)，涉及農(nóng)作物真菌病蟲害生物藥制備。本技術(shù)以大米為原料，以含NaCl、KH
文檔編號(hào)A01N63/00GK1618291SQ20041005171
公開日2005年5月25日 申請日期2004年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月27日
發(fā)明者吳松剛, 劉波, 施巧琴, 王劍英 申請人:深圳市綠微康生物工程有限公司