專利名稱：苦草根莖無菌培養(yǎng)及工程苗快繁方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種快速繁殖苦草優(yōu)質(zhì)工程苗的方法。
背景技術(shù)：
苦草(Vallisneria natans)是屬于水鱉科苦草屬的一種沉水草本植物，生長在透明度大、淤泥深厚、水流緩慢的河流、湖泊等水域。該物種具有較強的水質(zhì)凈化能力，并且對水體污染有著較高的耐受性，在水生生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)重建工程中，常作為先鋒物種凈化水質(zhì)。該物種還含有較多的營養(yǎng)成分，所以也是魚蝦蟹的常用餌料，并且在養(yǎng)殖塘中該物種可以為上述水產(chǎn)品提供產(chǎn)卵、蛻殼和避難的場所，因此可廣泛應(yīng)用于魚蝦蟹的養(yǎng)殖。同時，該物種還是室內(nèi)觀賞水族箱的布景物種。
目前市場上對苦草種苗的需求量很大，在試驗和養(yǎng)殖業(yè)中都有應(yīng)用，但種源大多來自自然環(huán)境。一方面，大量打撈容易導(dǎo)致原產(chǎn)地生境的破壞；另一方面，自然生境的苦草常帶有各種雜藻雜菌，容易造成移植生境的污染和有關(guān)生理生態(tài)試驗的誤差，同樣也不利于室內(nèi)的觀賞。當(dāng)然，目前有用苦草種子播種來彌補種源的不足，但這需要合適的水生環(huán)境和較長的時間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的問題是利用植物組織培養(yǎng)方法，以苦草的繁殖體根莖為基礎(chǔ)材料，采用不同的消毒方法和培養(yǎng)基質(zhì)，獲得并在室內(nèi)大規(guī)模繁殖苦草無菌苗，然后從無菌苗進行快速擴繁。以克服該物種野外收集有限且污染嚴重的弊端，適應(yīng)我國淡水湖泊植被恢復(fù)、野外魚蝦蟹水產(chǎn)養(yǎng)殖以及室內(nèi)觀賞水族布景苦草的需要。
本發(fā)明的技術(shù)方案是1.苦草無菌幼苗的獲得從野外自然生境中采集苦草的根莖，于肥皂水中浸泡2h以上，用自來水沖洗于凈并在流水下浸泡過夜。在超凈工作室中，用0.1％的升汞浸泡一定時間，用無菌水徹底漂洗后接種于培養(yǎng)液①(表1)中，并置于組織培養(yǎng)室中培養(yǎng)。室內(nèi)平均光照強度2000lx，每日光照10h，溫度為25℃左右。期間注意觀察，隨時剔除仍然污染的材料，以免交叉感染。
2.苦草出芽誘導(dǎo)由上述步驟獲得的有明顯的根系的無菌幼苗，于超凈工作室中，轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基②中，并在表面加上一層培養(yǎng)液③。2周以后，植株開始在匍匐莖上萌芽長苗，重復(fù)上述方法，以獲得足夠多的無菌幼苗。上述擴增培養(yǎng)過程仍在組培室中進行，光照和溫度不變。
表1.苦草培養(yǎng)液①、②、③的配方

*上述培養(yǎng)液按濃度配好后均用稀HCl或NaOH調(diào)整pH到5.8，分裝到100mL三角瓶中，用封口膜包扎后于121℃、0.1MPa左右濕熱滅菌20min。
3.苦草工程苗的壯苗將上述培養(yǎng)基中5cm以上的植株取出，移栽到底部鋪有滅過菌的沙石的玻璃缸。保持水深30cm，每周換水并添加一定量Hoagland營養(yǎng)液以促進其生長。當(dāng)室外白晝氣溫20℃以上時，將玻璃缸置于室外，直接利用太陽光照；否則，將玻璃缸置于溫室中，晝夜溫度分別保持18℃和25℃以上，并在白天適當(dāng)補充人工光照。上述培養(yǎng)保持到植株長至30cm以上。
4.苦草工程苗的應(yīng)用(1)上述通過步驟2培養(yǎng)后收獲根系發(fā)達、植株長于5cm的健康苦草小苗，取出后用自來水將植株表面的殘留培養(yǎng)液徹底沖洗干凈，然后插在水族缸底部的泥沙中，既美觀又不會帶入其他不必要的雜菌雜藻。
(2)上述通過步驟2培養(yǎng)后收獲根系發(fā)達、植株長于5cm的健康苦草小苗，取出洗凈，直接應(yīng)用于試驗，避免雜菌雜藻的影響。
(3)上述通過步驟3培養(yǎng)后獲得的株高30cm以上、根系發(fā)達的健康苦草植株，作為餌料投放于魚蝦蟹塘，需根據(jù)實際食用量，以免苦草剩余太多腐爛污染水質(zhì)。
(4)通過上述步驟3培養(yǎng)后獲得株高30cm以上、根系發(fā)達的健康苦草植株，移植到水生植被恢復(fù)重建的工程區(qū)。根據(jù)水體實際的退化程度，決定其栽種量和栽種密度，可采用單一物種移植或者和其他物種的混合移植。
本發(fā)明的效果在于(1)獲得了苦草的無菌苗。野外采集的苦草原材料本身污染嚴重，而本方法先用較溫和的肥皂水洗滌浸泡，然后在流水下沖洗以初步降低污染，然后通過0.1％的升汞徹底滅菌，在培養(yǎng)液①中培養(yǎng)。該滅菌方法可以保證無菌率達80％，存活率達60％以上。
(2)建立了苦草工程苗快速繁殖途徑。經(jīng)過一段時間的馴化培養(yǎng)，苦草每2周在培養(yǎng)基②與覆蓋培養(yǎng)液③的培養(yǎng)條件下芽增殖率達1∶5以上。而每個新生的小苗，可以繼續(xù)進行以上的芽增殖操作。方法簡單，操作方便，而且所用的試劑均為常規(guī)化工產(chǎn)品，成本低廉，有利于大規(guī)模的工廠化生產(chǎn)。而且本方法是利用苦草的營養(yǎng)繁殖，避免了遺傳變異的可能性。
本項發(fā)明可不分季節(jié)，隨時為湖泊植被恢復(fù)、魚蝦蟹塘養(yǎng)殖、有關(guān)利用苦草進行的生理生態(tài)實驗以及室內(nèi)水族觀賞布景、提供足夠的苦草優(yōu)質(zhì)工程苗。
具體實施例方式
實例1.于2003年11月從蘇州東太湖采得苦草種源，剪取匍匐莖上膨大的根莖小段50個，用肥皂水浸泡2h，再用自來水洗凈，流水下沖洗過夜。在超凈工作臺中，用0.1％的升汞經(jīng)過一定時間的徹底滅菌，用無菌水洗凈，接種于培養(yǎng)液①中。在組培室中培養(yǎng)。平均光照強度2000lx，每日光照10h，溫度25℃左右。2周內(nèi)除去剔除的染菌及死亡材料18株，其余32株均能生長。將健康的成苗轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基②中并覆蓋培養(yǎng)液③，繼續(xù)在組培室中培養(yǎng)，苦草開始芽增殖。以后每隔20天將單株苦草轉(zhuǎn)接進行芽增殖。2個月后，取出小苗20株，用自來水洗凈直接應(yīng)用于室內(nèi)水族缸布景。
實例2.將上述的培養(yǎng)材料洗凈移栽到鋪有滅過菌的沙石的玻璃缸中，并在溫室中培養(yǎng)。每周換水且補充Hoagland營養(yǎng)液以壯苗。該批材料被應(yīng)用于太湖河口富營養(yǎng)化水體生態(tài)修復(fù)工程中，面積1,000m2。
權(quán)利要求
1.一種苦草無菌苗培養(yǎng)及其工程苗快速擴繁的方法，其特征為該方法由以下步驟組成(1)取用苦草的可繁殖器官根莖，經(jīng)過一系列滅菌過程，在培養(yǎng)液①中培養(yǎng)獲得苦草無菌苗；(2)將無菌苗接種于以Ms為基本成分并附加有一定量激素的培養(yǎng)基②中并覆蓋一層培養(yǎng)液③，以誘導(dǎo)生芽，并每隔20天將新生無菌苗重復(fù)步驟(2)直至獲得足夠多的材料。(3)將步驟(2)中培養(yǎng)獲得的小苗，待根系發(fā)達后轉(zhuǎn)到大玻璃缸，補充Hoagland營養(yǎng)液繼續(xù)壯苗，直到植株長至30cm以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征是培養(yǎng)液①為(1/2-1)×Ms的基本元素，0.00-4.00mg/L，0.00-2.00mg/L和0.00-2.00mg/L的6-BA，2，4-D和NAA；②為(1/2-1)×Ms的基本元素+0.8％瓊脂，0.00-4.00mg/L，0.00-2.00mg/L和0.00-2.00mg/L的6-BA，2，4-D和NAA；③為1×Ms的基本元素，0.00-4.00mg/L，0.00-2.00mg/L和0.00-2.00mg/L的6-BA，2，4-D和NAA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法培養(yǎng)的苦草工程苗在湖泊植被恢復(fù)工程中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法培養(yǎng)的苦草工程苗在魚蝦蟹養(yǎng)殖過程中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法培養(yǎng)的苦草工程苗在室內(nèi)觀賞水族養(yǎng)殖過程中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法培養(yǎng)的苦草工程苗在有關(guān)苦草生理生態(tài)實驗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。涉及一種快速繁殖苦草優(yōu)質(zhì)工程苗的方法，運用苦草組織培養(yǎng)方法，通過擴繁獲得大量的優(yōu)質(zhì)工程苗，以克服在水生植被恢復(fù)工程中大量移植苦草對原產(chǎn)地產(chǎn)生不良影響的問題，以及自然環(huán)境中苦草種源有限并且污染嚴重的問題?？嗖莶粌H為魚蝦蟹提供餌料和產(chǎn)卵避難的場所，而且作為先鋒物種，在湖泊水生生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)和重建工程中有著重要的作用。針對目前水生生態(tài)系統(tǒng)退化嚴重的現(xiàn)狀，本方法的出現(xiàn)，無疑有著重要的意義。
文檔編號A01H4/00GK1623374SQ200410066029
公開日2005年6月8日 申請日期2004年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月14日
發(fā)明者安樹青, 周長芳, 蔣金輝, 孫志毅, 錢程 申請人:南京大學(xué)