專利名稱：人工雜交靈芝的生產(chǎn)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人工雜交靈芝的生產(chǎn)及應(yīng)用，人工雜交靈芝由松杉靈芝種屬栽培種和靈芝的野外種源分離株進(jìn)行原生質(zhì)體融合而成，這種生物工藝育種的雜交菌株稱為“半島靈芝-創(chuàng)意一號”。
背景技術(shù)：
靈芝是一組藥用真菌，包括靈芝、松杉靈芝和紫芝。各物種間不能相互雜交，而且核核糖體DNA序列和線粒體的核糖體DNA基因序列也各不相同。靈芝生長的溫度范圍比松杉靈芝廣。有人發(fā)現(xiàn)這些藥用真菌可顯示出不同的藥效，它們的生化成分包括多糖和萜烯。天然靈芝在不同的地帶生長并固守著自己的領(lǐng)土。
當(dāng)前的研究中，人工引進(jìn)另一野生靈芝種屬的種質(zhì)，運用原生質(zhì)體融合技術(shù)將兩個基因組帶入同一胞漿內(nèi)，從而擴(kuò)大靈芝栽培品種的溫度生長范圍。生長溫度范圍的擴(kuò)展能促進(jìn)全年的商業(yè)產(chǎn)量，降低季節(jié)性氣候地區(qū)的投資成本。原生質(zhì)體融合生物技術(shù)有利于引進(jìn)一個或多個多基因遺傳的性狀以及未知遺傳機(jī)制的性狀，和跨越兩個生物物種間的繁殖屏障。該技術(shù)的成功仍然離不開以“適者生存”為基礎(chǔ)的自然選擇框架。對幸存者進(jìn)行人工的精挑細(xì)選后，分離出優(yōu)化的靈芝改良品種。原生質(zhì)體融合蘑菇的技術(shù)雖然在實驗室已經(jīng)開展起來，但其實際應(yīng)用尚無報道。這就可能反映實驗室菌種的弊端，例如，不能開發(fā)營養(yǎng)突變體商品，和/或低質(zhì)量人工雜交種，如不育、生長不良和/或結(jié)實率低，或雜交失敗。
此發(fā)明通過引進(jìn)野生靈芝的種質(zhì)，擴(kuò)大靈芝的生長溫度范圍，以提高靈芝品種的質(zhì)量，結(jié)果，人工雜交使生產(chǎn)靈芝的結(jié)果時間縮減了三分之一，而且繁殖出了大量的靈芝蘑菇和靈芝擔(dān)孢子。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明講述了有結(jié)實能力的蘑菇雜交種的育種方法，這種雜交種可源自兩個或以上的種屬為親代。(a)兩個或以上的靈芝品種通過原生質(zhì)體融合法產(chǎn)生雜交種；(b)篩選具有性繁殖能力的雜交種。
本發(fā)明為一個以上物種間培育出性質(zhì)穩(wěn)定、具有性繁殖能力的蘑菇雜交菌株提供了解決途徑。在蘑菇種植中，多個孢子可參與生成蘑菇種植的接種培養(yǎng)物。沒有設(shè)備和培養(yǎng)技術(shù)的蘑菇種植者都進(jìn)行這種“多孢子”接種方法。他們采集蘑菇作為多孢子接種方法的原料。但此方法只限于種內(nèi)雜交。更重要的是，此種“多孢子”栽培的產(chǎn)量不穩(wěn)定。因此，蘑菇種植的趨勢仍然是單一栽培。將兩種或更多種的原生質(zhì)體懸浮液混合起來不會阻礙原生質(zhì)體融合，但優(yōu)化品種的篩選成功與否會受到親代品種遺傅差異的影響。種內(nèi)雜交(所有物種均相同)并不難，然而在種內(nèi)雜交技術(shù)中也可采納傳統(tǒng)的育種方法。
具體來說，本發(fā)明為兩個蘑菇種屬間培育有結(jié)實能力的雜交種提供了一種目標(biāo)驅(qū)動法，此方法包括兩個步驟(a)用松杉靈芝菌株和靈芝菌株制備原生質(zhì)體融合液，(b)在存活分離菌株中篩選出具有性繁殖力的優(yōu)化雜交種。
這里的目標(biāo)驅(qū)動法用于描述這樣一種情況，即用種植計劃所設(shè)定的目標(biāo)來指導(dǎo)設(shè)計和試驗程序。目標(biāo)是指要培育的人工雜交種的理想特性或改良特性。如果關(guān)系到一種以上的特性，那么首先確定其在目標(biāo)中的重要性，然后規(guī)定試驗工作中按篩選標(biāo)準(zhǔn)確定需優(yōu)先使用的特性。因此，此方法為目標(biāo)驅(qū)動法。
例如，本研究包含許多物種特征，期望雜交種是具有穩(wěn)定的商品開發(fā)能力的菌株；一種溫度生長范圍寬、長勢快、有結(jié)實能力的靈芝。雜交種的高低溫耐受值的擴(kuò)展顯著降低了蘑菇生產(chǎn)的投資及經(jīng)營成本(通過節(jié)能)。于是，擴(kuò)展生長溫度范圍就成了最重要的目標(biāo)。溫度篩選簡單易行，這種方法為識別生長溫度范圍廣的特種雜交種提供了有力的平臺，而生長迅速的雜交種的識別是通過半定量方法選出篩選培養(yǎng)基中的最大菌落。結(jié)實質(zhì)量及其穩(wěn)固的能力為下一步的挑選標(biāo)準(zhǔn)。
應(yīng)用原生質(zhì)體融合蘑菇的技術(shù)雖然在實驗室已經(jīng)開展起來，但其實際應(yīng)用尚無報道。這就可能反映出實驗室分離技術(shù)的弊端，例如，不能開發(fā)營養(yǎng)突變體商品，和/或低質(zhì)量人工雜交種，如不育、生長不良和/結(jié)實少，或雜交失敗。
特別是，無人嘗試用靈芝和松杉靈芝做原生質(zhì)體融合。
圖形1具體描述了此方法。更具體地說，此方法還包括篩選出的雜交種所具有的分子分類法的基因序列和DNA指紋圖特征。以及營養(yǎng)和結(jié)實生長時期的形態(tài)分類學(xué)描述。
圖2具體闡明了本發(fā)明的篩選過程。
本發(fā)明還提出了在上述方法中如何選擇雜交種。具體是指雜交種的長勢迅速，并指雜交種能在較廣的溫度范圍內(nèi)生長，其生長的溫度范圍為5℃至37℃。
篩選出的雜交種稱為半島靈芝菌株創(chuàng)意一號，按照國際認(rèn)可的關(guān)于專利程序的微生物保存的布達(dá)佩斯條約中的規(guī)定，于2004年8月24日保藏，保藏編號為CGMCC No.1208。菌種為半島靈芝創(chuàng)意一號，分類命名為靈芝(ganoderma lucidum)保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址在中國北京市海淀區(qū)中關(guān)村北-條13號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼100080。
本發(fā)明還通過篩選的雜交菌株，培育出靈芝菇和靈芝擔(dān)孢子。
本發(fā)明還包括用篩選出的雜交菌株制備提取物、濃縮液、破壁孢子制劑、蘑菇片、菌絲體粉、多糖制劑、孢子油、萜烯制劑、茶、靈芝菇或孢子所釀的酒。
最后，本發(fā)明介紹了雜交菌株、靈芝菇或雜交菌株釋放的靈芝擔(dān)孢子的不同用途，包括飲食或藥用。
圖1兩物種間人工雜交過程中，運用目標(biāo)驅(qū)動法進(jìn)行菌株改良。
圖2優(yōu)化品種的分離方法的篩選原則。
圖3雜交菌株的生長溫度和速度。在完全培養(yǎng)基中，于特定溫度下進(jìn)行5天避光真菌培養(yǎng)，然后根據(jù)菌落半徑的增長大小測量生長速度。對5項重復(fù)實驗中的資料作平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。在30℃的最佳溫度下，雜交菌株的生長速度是親代栽培種的二倍。與親代栽培種不同，雜交菌株在18℃和37℃時也在生長，但40℃時兩者都會死亡。雜交菌株符號，▲。親代栽培種符號，■。
圖4應(yīng)用隨機(jī)引物的隨機(jī)擴(kuò)譜多形性DNA標(biāo)記法制作的雜交菌株和親代的DNA指紋圖。隨機(jī)引物PP4L，PS3L，PS1L，POM和UK。Lane M，GeneRulerTM100bp DNA LadderPlus，(MBI Fermentas)；H，雜交菌株；C，栽培種親代；W，野生種親代。
圖5雜交菌株核核糖體DNA基因的核苷序列(序列號1)。
圖6雜交菌株線粒體核糖體DNA基因的核苷序列(序列號2)。
圖7相差光鏡照片顯示雜交菌株的營養(yǎng)菌絲體在相鄰管絲細(xì)胞隔膜處產(chǎn)生一個鎖狀連合。具有較厚細(xì)胞壁的厚垣孢子位于末端或中間位置(在兩細(xì)胞之間)。
圖8靈芝雜交菌株的子實體(菇)。(a)桿狀原基。(b)生有中央或側(cè)莖的菌蓋具同心鮮紅色環(huán)。(c)完全成熟的蘑菇被釋放出的褐色擔(dān)孢子覆蓋而失去外表的光澤。
圖9雜交菌株的擔(dān)孢子。(a)兩個擔(dān)子的電子掃描顯微圖片，每個擔(dān)子產(chǎn)生四個擔(dān)孢子。(b)光鏡照片顯示雙層細(xì)胞壁的、褐色的、橢圓形的擔(dān)孢子。(c)電子掃描顯微圖片顯示某些擔(dān)孢子的細(xì)胞外壁薄弱出現(xiàn)“孔”狀。
下面例證能幫你更好地了解本發(fā)明。生物工藝工作者根據(jù)下面詳盡的方法和結(jié)果的討論很容易意識例證的描述闡明了本發(fā)明。
具體實施例方式松杉靈芝和靈芝通過原生質(zhì)體融合法的人工雜交。
(a)兩個親本為營養(yǎng)菌絲體，將其培育在完全培養(yǎng)基(CM)肉湯中，成份包括MgSO4·7H2O，0.5；KH2PO4，0.46；K2HPO4，1；peptone，2；D-glucose，20(g/L)，避光、溫度為28℃、轉(zhuǎn)速為120rpm條件下培養(yǎng)，并記錄時間。采用無菌技術(shù)收獲生長活躍的菌絲體，用直徑為1毫米的鎳網(wǎng)過濾，并用滲透緩沖液沖洗(0.6M的蔗糖溶液)。然后，將菌絲體培養(yǎng)在每毫升含10毫克溶壁酶(中國廣東微生物學(xué)院)的滲透緩沖液中1至3小時，用酶將真菌細(xì)胞壁溶解掉。采用相差光鏡照像法對生成的原生質(zhì)體用血球計計算數(shù)量。
等到釋放出足夠的原生質(zhì)體后，用一個塞著玻璃棉柱的注射器將未消化的菌絲體過濾出來，在2000xg的轉(zhuǎn)速下，離心濃縮10分鐘。取原生質(zhì)體的上清液，與細(xì)胞碎片分離；在6000xg的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，獲得濃縮的原生質(zhì)體小球。兩次獲得的原生質(zhì)體都重新加入滲透緩沖液中，與30％聚氧乙烯(MW 4,000；w/v)在0.01M的氯化鈣溶液中混合，避光28℃條件下放置一小時。然后，將原生質(zhì)體混合液和再生培養(yǎng)基放入滲透型緩沖液中進(jìn)行細(xì)胞壁修復(fù)，此培養(yǎng)基包含D-葡萄糖，4；酵母提取物，4；麥精，10；和瓊脂，15(g/L)。在避光28℃條件下培養(yǎng)5天后，將100個肉眼可見菌落作為純化的分離菌株取出并轉(zhuǎn)移到完全培養(yǎng)基中。
在兩個極端的生長溫度(18和35℃)下，將純化的分離菌株在完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天，完成理想雜交種的篩選。兩個親本同時經(jīng)過平行檢測。作5項重復(fù)實驗。選擇能在兩個極端溫度下存活并且生長速度超過其親代品種的雜交菌株(如圖3中的演示)。取5個篩選出的分離菌株，在蘑菇種植廠中測試有性繁殖(結(jié)實)的能力和產(chǎn)量，香港中文大學(xué)(CUHK)和半島創(chuàng)意有限公司分別重復(fù)試驗三次。香港中文大學(xué)的試驗中每分離菌株共產(chǎn)30袋，而在半島創(chuàng)意有限公司的工作坊則為大批量生產(chǎn)(每分離菌株種180袋)。
結(jié)實測試在高壓蒸汽滅菌的塑料袋中進(jìn)行，每個袋中包括500克的培養(yǎng)物，培養(yǎng)物中成份含有鋸屑，60；粉碎的椰子纖維，20；小麥麩，14；蔗糖，5；和石灰，1。在香港中文大學(xué)生物學(xué)學(xué)系的蘑菇養(yǎng)殖廠，菌絲體在避光28℃的條件下培育。而在半島創(chuàng)意有限公司的工作坊中，在10到33℃的室溫下培育，未對溫度加以控制。當(dāng)菌種生長完全覆蓋培養(yǎng)物時(根據(jù)分離菌株性能通常需要25至45天)，就會被轉(zhuǎn)移到蘑菇種植廠的結(jié)實環(huán)境艙中。靈芝菇的生長條件為12小時光照和12小時避光的光周期，85％或更高的相對濕度、溫度為28℃。工作坊的結(jié)實試驗的光周期為自然光周期，溫度波動在15到33℃之間，相對濕度為80％或更高。選出一個高產(chǎn)、結(jié)實能力穩(wěn)定的純種菌株。
(b)生物工藝雜交菌株的特征■通過隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記法標(biāo)記的DNA指紋圖用液氮冷藏上述的肉湯培養(yǎng)基的菌絲體，從中提取和純化基因組DNA。DNA樣品的濃縮純化液經(jīng)分光光度法測量，其OD260∶OD280吸收率比值應(yīng)超過1.8，同時要采用溴化乙啶著色法，通過瓊脂糖膠電泳進(jìn)一步檢測其濃度和純度。
下面為5對隨機(jī)引物的序列UK5’-CAATTTCAATGTTCCGGACC-3’(SEQ ID No.3)(序列號，3)3’-CAGTTGGTGGAAGGAAAGGA-5’(SEQ ID No.4)(序列號，4)PS3L5’-GAGCAGGGCAAGCGTTATAG-3’(SEQ ID No.5)(序列號，5)3’-CTATTCGAAACGCGGACAAT-5’(SEQ ID No.6)(序列號，6)PS1L5’-GAATGCGGTGCTTCCTACTG-3’(SEQ ID No.7)(序列號，7)3’-CCGACAGCTAAAGCGGGTAT-5’(SEQ ID No.8)(序列號，8)POM5’-AGCCGTATCTTTGCCTCAGA-3’(SEQ ID No.9)(序列號，9)3’-ATCGTCTCGAGCGAACAAGT-5’(SEQ ID No.10)(序列號，10)PP4L5’-GTCGAAATTCATGGCAAGGT-3’(SEQ ID No.11)(序列號，11)3’-CAGTATTGCGACGGTCTCAG-5’(SEQ ID No.12)(序列號，12)反應(yīng)液中含有1x聚合酶鏈反應(yīng)緩沖液II(普金埃爾莫希特斯公司)，3.5mM氯化鎂，四種核甘酸各200mM(普金埃爾莫希特斯公司)，1M引物和2.5U的TaqDNA多聚酶(寶靈曼公司)，25ng(納克)的基因組DNA(威爾士和麥克萊倫，1990；威廉等，1990；趙等，1993，1996)。加熱程序為36個嚴(yán)格的循環(huán)周期，每個周期包括，94℃2分鐘，45℃1分鐘，72℃2分鐘，最后一個循環(huán)后72℃延遲10分鐘。
以沒有DNA的對照標(biāo)準(zhǔn)同時進(jìn)行平行檢測和重復(fù)試驗以確定實驗結(jié)果的一致性和控制性。用瓊脂糖膠電泳做出DNA指紋圖，并通過凝膠成像系統(tǒng)捕捉圖像(BIO-RAD凝膠掃描儀，1000型)。
圖4表明，與原生質(zhì)體融合法中使用的親代品種的DNA指紋圖相比，雜交菌株的DNA指紋圖有所不同。
■特殊的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和DNA序列真菌特異性引物ITS(核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))4和ITS5用于擴(kuò)增核核糖體DNA區(qū)(ITS1，5.8S和ITS2)，另一對引物用于線粒體核糖體DNA擴(kuò)增，反應(yīng)在PTC-100TM型熱循環(huán)儀上進(jìn)行(MJ科研公司)。核引物序列如下分別為5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(序列號，13)和5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’(序列號，14)。線粒體引物序列如下5’CAGCAGTCAAGAATATTAGTCAATG-3’(序列號，15)and 5’-GCGGATTATCGAATTAAATAAC-3’(序列號，16)?？偭繛?0微升的反應(yīng)液包括1X反應(yīng)緩沖液VI，2.5mM氯化鎂，四種核甘酸各10mM，每個引物為10pM，2U的Thermoprime plus Taq DNA聚合酶(AB基因)以及大約100納克的基因組DNA。PCR的程序包括95℃1分鐘；60℃1分鐘；70℃1分鐘，進(jìn)行39個周期，最后一個循環(huán)后70℃延遲10分鐘。
PCR擴(kuò)增片段將進(jìn)一步用GENECLEANII KIT核酸純化系統(tǒng)進(jìn)行純化。在加入玻璃牛奶懸浮液之前，將三份碘化鈉儲備溶液加入PCR混合液中，充分混合5分鐘，離心15秒形成玻璃牛奶/DNA化合物小球。然后，用20微升的New Wash溶液洗滌三次并真空干燥。用8微升超純凈水重新溶解干燥后的小球，進(jìn)行離心前將混合液放置5分鐘。收集純DNA上清液進(jìn)入循環(huán)，用不同的熒光染料標(biāo)記擴(kuò)增的DNA，此過程在DNA測序儀上進(jìn)行(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)?；旌弦喊?微升純DNA模板；目標(biāo)基因的正向引物2微升；dRhodamine Terminator 4微升(PE應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)和超凈化水，總量為10微升。加熱程序如下共36個周期，95℃30秒進(jìn)行DNA變性，然后退至50℃，共30s，最后在70℃時延長1分鐘。
然后，放入70％乙醇(含0.5mM的氯化鎂)沉淀DNA產(chǎn)物，溫度為-20℃，共2-3小時。14000xg轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，接著用冷藏的70％乙醇洗滌離心后的小球并進(jìn)行真空干燥，然后加入12微升的模板抑制劑(PE生物系統(tǒng))，將干燥后的小球再懸浮起來。簡單離心后，收集濃縮后的樣本。然后將樣本懸浮于ABI Prism 310型基因分析儀中(PE生物系統(tǒng))，用序列分析軟件3.0版進(jìn)行處理(PE生物系統(tǒng))。
圖5和圖6顯示的是雜交菌株的核苷酸序列。經(jīng)過驗證的人工雜交菌株存放在中國香港中文大學(xué)的生物系。這種靈芝分離菌株是一種雙核體(即高等生物的雙倍體)，不是通過原生質(zhì)化過程產(chǎn)生的單倍體，并具有鎖狀連合(圖7)。與栽培種親代品種相比，其結(jié)實時間只需一個半月，將生產(chǎn)周期迅速降低。雜交菌株具備正常的有性繁殖(結(jié)實)能力，還能產(chǎn)生擔(dān)孢子(圖8和圖9)。
以下為參考文獻(xiàn)1.作者不詳1998.中國藥用真菌學(xué).北京醫(yī)科大學(xué)和中國國家醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版北京.
2.額達(dá)斯科懷哥，J.E.和吉爾伯特森，R.L.1986.靈芝複合種的靈芝和松杉靈芝的栽培研究及性遺傳.真菌學(xué)78，694-705.
3.額達(dá)斯科懷哥，J.E.和吉爾伯特森，R.L.1988.靈芝複合種的幾個物種的擔(dān)孢子，菌褶囊狀細(xì)胞和擔(dān)子果特征.真菌學(xué)80，493-507.
4.張，K.W.2001.病原靈芝的整體研究方法.碩士論文.香港中文大學(xué)香港.
5.張，W.M.W.，衛(wèi)，W.S.，朱，P.W.K.，趙，S.W.和葉，N.P.2000.靈芝提取物激活有絲分裂原激酶并誘導(dǎo)大鼠PC12神經(jīng)元腫瘤細(xì)胞的分化.FEBS通訊24409，1-6.
6.趙，S.W.，陳，Y.H.，羅，S.C.，張，K.T.&摩爾，D.1998.鎘和錳與有益的鈣元素相比會降低食用鳳尾菇的產(chǎn)量和營養(yǎng)價值.真菌學(xué)研究102，449-457.
7.趙，S.W.，張，K.W.，羅，W.M.，歐陽，H.W.，馬，S.Y.和朱，W.L.2000a.香港靈芝對環(huán)境反應(yīng)的發(fā)育可塑性.食用菌栽培與科學(xué).vol.2.ed.范格林斯溫L.J.L.D.，pp.757-761，布魯克菲爾德實驗室A.A.鮑奇馬鹿特丹.
8.趙，S.W.，關(guān)，H.S.&鄭，S.C.1993.隨意引子聚合酶鏈反應(yīng)在蘑菇，主要是香菇，的分子領(lǐng)域研究中的應(yīng)用.食用蘑菇的遺傳與種植，eds.張，S.T.，巴斯威爾，J.A.和麥爾斯，P.G.，pp.265-283.戈登和布瑞奇科學(xué)出版社.
9.趙，S.W.，羅，S.C.，程，M.L.，張，K.W.和陳，M.J.2000b.21世紀(jì)蘑菇開發(fā)的主題續(xù)性發(fā)展，廢物處理和保育.應(yīng)用和普通微生物學(xué)雜志46，269-282.
10.趙，S.W.，馬，A.M.，林，F(xiàn).C.和摩爾，D.1996.聚合酶鏈反應(yīng)所揭示的中國椎茸(香菇)栽培的遺傳均同質(zhì)性.真菌學(xué)研究100，1393-1399.
11.趙，S.W.，王，Z.M.和摩爾，D.2000c.靈芝提取物的營養(yǎng)價值以及采用小鼠淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞電泳分析系統(tǒng)對提取物的遺傳毒性和抗遺傳毒性進(jìn)行評估.食品及化學(xué)品毒理學(xué)38，173-178.
12.漢森，L.E.和霍威爾，C.R.2002.木霉菌之間原生質(zhì)體融合的生物控制效能及其他特征.真菌學(xué)研究106，321-328.
13.紅，S.-G.；程，W.和張，H.-S.2002.多孔菌的線粒體小分子核糖體DNA的擴(kuò)增及其在系統(tǒng)進(jìn)化分析的用途.真菌學(xué)94，823-833.
14.胡，H.，安，N.S.，楊，X.，李，Y.S.和康，K.S.2002.靈芝提取物在MCF-7人類乳腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞循環(huán)終止和凋亡.國際癌癥雜志102，250-253.
15.姜，J.，斯利佛瓦，V.，瓦勒徹衛(wèi)科瓦，T.，哈維，K.和斯利瓦，D.2004.靈芝抑制增殖及誘導(dǎo)人類前列腺癌細(xì)胞PC-3凋亡.國際腫瘤學(xué)雜志24，1093-1099.
16.關(guān)，H.S.，趙，S.W.，彭，K.M.和鄭，S.C.1992.采用聚合酶鏈反應(yīng)方法進(jìn)行香菇菌株分型.實驗真菌學(xué)16，163-166.
17.劉，W.C.1985杏鮑菇的種系間雜交的原生質(zhì)體融合法研究.博士論文，香港中文大學(xué)香港.
18.馬，S.Y.2002.野生靈芝群體的生態(tài)和環(huán)境污染研究.碩士論文.香港中文大學(xué)香港.
19.蒙卡佛，J.M.和利瓦登.L.1997.靈芝的種群研究.真菌類群奧斯陸.
20.蒙卡佛，J.M.，王，H.F.和許，R.S.1995.靈芝的基因發(fā)展系統(tǒng)與傳統(tǒng)的分類特征相比較.真菌學(xué)研究99，1489-1499.
21.佩貝迪，J.F.和?？怂梗琀.M.1993.原生質(zhì)體技術(shù)與食用蘑菇.食用蘑菇的遺傳與種植，eds.張，S.T.，布斯威爾，J.A.和麥爾斯，P.G.，pp.125-155.戈登和布瑞奇科學(xué)出版社.
22.利瓦登，L.2000.新熱帶區(qū)多孔菌的研究2新熱帶區(qū)漆狀菌蓋靈芝的初步探討.真菌學(xué)92，180-191.
23.王，H.X.，吳，T.B.和趙，S.W.2004.藥用靈芝菇子實體內(nèi)的獨特核糖核酸酶.生物化學(xué)與生物物理學(xué)的研究交流314，519-522.
24.王，Y.P.，索尼，K和魯?shù)路颍珽.2003.通過甘藍(lán)型油菜和海甘藍(lán)之間的不對稱體細(xì)胞雜交形成的高芥酸油菜籽的發(fā)展.遺傳學(xué)的理論及應(yīng)用106，1147-1155.
25.威爾士，J.和麥克萊倫，M.1990.用隨機(jī)引物PCR法進(jìn)行基因組指紋識別.核酸研究18，7213-7218.
26.懷特，T.J.，布魯斯，T.，李，S.和泰勒，J.1990.利用系統(tǒng)發(fā)生學(xué)進(jìn)行真菌核糖體RNA基因序列的控制與擴(kuò)增.PCR協(xié)議指導(dǎo)方法和應(yīng)用，eds河內(nèi)島，M.A.，格爾凡德，D.H.，史連斯基，J.J.和懷特，T.J.，pp.315-322.學(xué)術(shù)出版社圣地亞哥.
27.威廉，J.G.K.，庫貝利克，A.R.，利瓦克，K.J.，利佛斯基，J.A.&廷吉，S.V.1990.隨機(jī)引物的DNA多形性擴(kuò)增作為基因標(biāo)記物的優(yōu)勢.核酸研究18，6531-6536.
28.彥G.C.和吳J.Y.1999.松杉靈芝提取物的抗氧和自由基清除特性.食品化學(xué)65，375-379.
29.柳，Y.B.，李，K.H.和金，B.G.2002.通過隨機(jī)復(fù)制多型性DNA標(biāo)誌親和和不親和的鮑魚菇屬與靈芝屬的原生質(zhì)體融合物.國際藥用蘑菇雜志4，147-157.
30.袁，Y.，郭，X.，何，X.，張，B.和呂，S.2004.高產(chǎn)量、含鐵豐富的酵母菌株的育種與酵母細(xì)胞中鐵分布的研究.生物工藝學(xué)通訊26，311-315.
31.趙，J.1994可食性蘑菇原生質(zhì)體融合產(chǎn)物的分離、識別和應(yīng)用.博士論文，香港中文大學(xué)香港.
32.趙J.D.1989.中國靈芝菌科.真菌志132，1-176.J.克拉姆柏林.
序列表<110>趙紹惠<120>人工雜交靈芝的生產(chǎn)及其應(yīng)用<160>16<210>1<211>551<212>DNA<213>松杉靈芝和靈芝雜交菌株<220>
<221>Unsure<222>(1)..(551)<400>1tcgagttttg actgggttgt agctggcctc ccgaggcatg tgcacgccct gctcatccac 60tctacacctg tgcacttact gtgggcttca gacgtcgtga agcgggctct ttacggagct 120tgtagagcgt gtctgtgcct gcgtttacca caaactctat aaagtattag aatgtgtatt 180gcgatgtaac gcatctatgt acaactttca gcaacggatc tcttggctct cgcatcgatg 240aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc 300tttgaacgca ccttgcgctc cttggtattc cgaggagcat gcctgtttga gtgtcatgaa 360atcttcaact tacaaacctt tgcgggtttg taggcttgga cttggaggct tgtcggccgt 420gtttcggtcg gctcctctta aatgtattag cttgattcct tgcggatcgg ctctcggtgt 480gataatgtct acgccgtgac cgtgaagcgt tttggcgagc ttctaaccgt ctcgtttgtg 540agacagcttt a 551
<210>2<211>536<212>DNA<213>松杉靈芝和靈芝雜交菌株<220>
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<221>Unsure<222>(1)..(22)<400>16gcggattatc gaattaaata ac 2權(quán)利要求
1一種制備可結(jié)實蘑菇雜交種的人工方法，親代為兩種或兩種以上的物種，其特征在于，包括以下步驟a)融合制備的松杉靈芝和靈芝的原生質(zhì)體，然后培養(yǎng)原生質(zhì)體混合物成可存活的分離菌株；b)從可存活的分離菌株中篩選出可結(jié)實雜交種。
2權(quán)利要求1所述的方法，是目標(biāo)驅(qū)動法，其中的設(shè)計和試驗程序都是由種植程序的目標(biāo)指導(dǎo)的。
3權(quán)利要求1所述的方法，具體步驟列在圖1中。
4權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步的特征是，篩選出的雜交種具有分子分類法的基因序列和DNA指紋圖譜特征，以及營養(yǎng)和結(jié)實生長時期的形態(tài)分類學(xué)描述。
5權(quán)利要求1所述的方法，其中雜交種的篩選過程由圖2列出。
6用權(quán)利要求1所述的方法篩選的雜交菌株。
7權(quán)利要求6的雜交菌株，其特征在于，生長快速，生長溫度范圍廣。
8權(quán)利要求6的雜交菌株，為半島靈芝菌株創(chuàng)意一號，保藏編號為CGMCC No.1208。
9由權(quán)利要求6-8任一項的雜交菌株產(chǎn)生的靈芝菇或靈芝擔(dān)孢子。
10權(quán)利要求9的靈芝菇或靈芝擔(dān)孢子的產(chǎn)物，提取物、濃縮液、破壁孢子制劑、蘑菇片、菌絲體粉、多糖制劑、孢子油、萜烯制劑、茶、釀酒產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人工雜交靈芝的生產(chǎn)及應(yīng)用，人工雜交靈芝由工藝種植的松杉靈芝種屬(栽培種)(Ganoderma tsugae)和靈芝(Ganoderma lucidum)的野外種源分離株進(jìn)行原生質(zhì)體融合而成，這株生物工藝育種的雜交菌株稱為“半島靈芝”，菌株號為“創(chuàng)意一號”。在鋸屑－椰子纖維培養(yǎng)基上，此雜交菌株可在一個半月內(nèi)繁殖產(chǎn)生靈芝菇和擔(dān)孢子，在18℃和37℃都可生長，通過隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA markers，RAPD；隨機(jī)復(fù)制多型性DNA)標(biāo)記技術(shù)，此雜交菌株顯示了其獨特的DNA指紋圖，標(biāo)記中使用的隨機(jī)引物(primer，引子、引信)包括PP4L，PS3L，PS1L，POM和UK，此外其核核糖體DNA基因序列和線粒體核糖體DNA基因序列不同于親代栽培種的序列。
文檔編號A01G1/04GK1742555SQ20041007408
公開日2006年3月8日 申請日期2004年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月1日
發(fā)明者趙紹惠 申請人:趙紹惠