專利名稱：植物黃酮類化合物的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化合物的用途，具體是涉及植物黃酮類化合物的用途。
背景技術(shù)：
禽流感(Avian influenza，AI)是由A型流感病毒引起的禽鳥類的嚴重傳染性疾病，感染的動物是鵝、雞、鴨、鴿子以及一些野生鳥類等。流行病學(xué)研究顯示，禽流感病毒具有高致病性和很強的傳播能力，它不但會給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的損失，而且已經(jīng)有渠道使病毒從雞傳播到人。禽流感病毒屬于正粘病毒科流感病毒屬，具有單股負鏈RNA，禽流感病毒粒子一般為球形，其表面有兩種不同形狀的突起血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)。HA和NA是病毒表面的主要糖蛋白，具有種(亞型)的特異性和多變性，在病毒感染過程中起著重要作用。HA是決定病毒致病性的主要抗原成分，能誘發(fā)感染宿主產(chǎn)生具有保護作用的中和抗體，而NA誘發(fā)的對應(yīng)抗體無病毒中和作用，但可減少病毒增殖和改變病程。迄今已知有16種HA和10種NA，不同的HA和NA之間可能發(fā)生不同形式的隨機組合，從而構(gòu)成許許多多不同亞型。據(jù)報道現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的流感病毒亞型至少有80多種，其中絕大多數(shù)屬非致病性或低致病性，高致病性亞型主要是含H5和H7的毒株。
AI歷來被認為是人類流感的最大基因庫，是人流感病毒發(fā)生變異的新基因來源，不過在自然狀態(tài)下，AI與人流感之間的聯(lián)系需要通過中間宿主(如豬、馬、海豚等哺乳動物)來實現(xiàn)。但1997年中國香港H5N1以及1999年中國大陸、香港H9N2AIV首次突破種間障礙直接感染人甚至引起了人的死亡，不但打破了自然條件下僅有H1、H2、H3亞型流感病毒可以感染人和其它哺乳動物的常規(guī)，而且為人流感的流行增添了新的毒株亞型(H5和H9)，由此又賦予了AIV全新的公共衛(wèi)生意義。
目前，對付禽流感尤其是高致病性禽流感病毒的感染，除了用疫苗進行緊急預(yù)防外，還沒有特效的防治藥物。用于抗流感的藥物主要有神經(jīng)氨酸酶抑制劑如扎那米韋(Zanamivir)及奧司米韋(Oseltamivir)等；離子通道阻滯劑如金剛烷胺(Amantadine)和金剛乙胺(rimantadine)，它們被認為是治療和預(yù)防流感病毒的首選藥物；以及核苷類藥物三氮唑核苷即利巴韋林(Ribavirin)亦稱病毒唑。
扎那米韋是根據(jù)流感病毒NA與唾液酸的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，通過計算機分子模擬設(shè)計而成，結(jié)構(gòu)中的胍基與流感病毒NA活性部位的氨基酸通過氫鍵、靜電力及范德華力的作用，與酶緊密結(jié)合，作用強度及選擇性均較高；扎那米韋對B型流感病毒也有一定程度的結(jié)合。結(jié)構(gòu)式如式(I)。
奧司米韋是GS4071的乙酯型前藥，其親脂性的3-戊氧基側(cè)鏈與流感病毒NA活性部位的疏水性口袋有較強的親和力，阻斷了流感病毒NA對病毒感染細胞表面的唾液酸殘基的裂解，從而抑制了病毒顆粒從感染細胞的釋放，因而是一種選擇性高的流感病毒NA抑制劑。結(jié)構(gòu)式如式(II)。
鹽酸金剛烷胺，英文名Amantadine Hydrochloride Tablets，其化學(xué)名稱為三環(huán)[3，3，1，13，7]癸烷-1-胺鹽酸鹽，其結(jié)構(gòu)式如式(III)。
利巴韋林(病毒唑)，英文名Ribavirin Injection，主要成份化學(xué)名稱為1-b-D-呋喃核糖基-1H1，2，4，-三氮唑-3-羧酰胺。分子式C8H12N4O5，分子量244.21。結(jié)構(gòu)式如式(IV)。
但這些藥物都存在一定的局限性神經(jīng)氨酸酶抑制劑類能有效地抑制A、B型流感病毒，此類藥物較為昂貴限制其推廣使用；離子通道阻滯劑對A型流感病毒也具有良好的抑制作用，但存在神經(jīng)毒性、長期用藥易產(chǎn)生耐藥性，易引起流感的大流行，并對B型流感病毒無效等缺陷；三氮唑核苷(病毒唑)對RNA、DNA病毒引起的感染均有效，但此類化合物具有一定的致畸作用，限制了其在臨床的應(yīng)用。尋找安全、有效、來源廣泛，價廉低毒的抗禽流感藥物也就顯得尤為迫切和重要。
已報道黃酮類化合物具有抗氧化、抗血栓、抗癌、抗炎、調(diào)節(jié)血管滲透性、抗抑郁、抗焦慮、抗腦缺血、護肝、鎮(zhèn)痛、對消化性潰瘍的保護作用以及抗心律失常和抗心肌缺血等多種作用，但植物黃酮類化合物應(yīng)用于禽流感病毒防治尚無報道。
黃酮類化合物是一大類低分子天然植物成分，通指兩個苯環(huán)通過中央三碳鏈相互聯(lián)結(jié)而成的一系列化合物類，均具有C6-C3-C6的基本結(jié)構(gòu)，主要包括黃酮(flavone主要結(jié)構(gòu)如式(V))及其異構(gòu)體異黃酮(isoflavone)類；黃烷酮(flavanone主要結(jié)構(gòu)如式(VI))及其異構(gòu)體異黃烷酮(isoflavanone)類；查爾酮(chalcone主要結(jié)構(gòu)如式(VII))類；桑酮(Xanthone主要結(jié)構(gòu)如式(VIII))；黃酮醇(flavonol主要結(jié)構(gòu)如式(IX))類及其異構(gòu)體異黃酮醇(isoflavonol)類等。
本發(fā)明中所稱的植物黃酮類化合物的化學(xué)名稱為5，7-二羥基類黃酮，分子結(jié)構(gòu)如式(X)，其中R1為H或OH；R2為OH或3，4，5-三羥基苯甲酰(galloyl)，3，4，5-三羥基苯甲酰的結(jié)構(gòu)如式(XI)?？蓮膫鹘y(tǒng)中藥薔薇科植物中提取得到，例如碩苞薔薇(Rosa bracteata Wendl.)即含有植物黃酮類化合物。碩苞薔薇，又名苞薔薇、猴柿等，為常綠灌木，高2-5米，廣泛分布于華中和華南地區(qū)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供植物黃酮類化合物的一種用途。
本發(fā)明發(fā)明人的研究表明，植物黃酮類化合物能直接殺傷禽流感病毒，可以用于治療和預(yù)防禽流感病毒，能在制備抗禽流感病毒的藥物和添加劑中得到廣泛應(yīng)用。
在以植物黃酮類化合物為活性成分的藥物中，需要的時候還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑等。
本發(fā)明的藥物可通過口服、注射或粘膜給藥，可以制成片劑、膠囊、粉劑、顆粒、錠劑、栓劑，或口服液或無菌胃腸外懸液液體制劑等多種藥物形式，還有大或小容量注射劑、凍干粉針或無菌粉分裝劑等針劑形式。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
將植物黃酮類化合物以飼料添加劑的形式加入到禽類飼料中，可以提高禽類預(yù)防禽流感的能力。
以植物黃酮類化合物為主要成分的抗禽流感病毒的藥物或添加劑，其有效用量為20-250mg/kg體重·天；優(yōu)選劑量為60-180mg/kg體重·天。
植物黃酮類化合物作為一種天然植物成分，對禽流感病毒具有明顯的抑制作用，制備成藥物或添加劑，具有毒性小、作用強、安全有效等優(yōu)點，為禽流感病毒的防治開辟新的途徑，具有重要的社會價值、經(jīng)濟價值和廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為實驗小鼠不同組成活率比較2為小鼠肺內(nèi)病毒增殖隨時間變化曲線圖3為小鼠血清抗體隨時間變化曲線具體實施方式
實施例一、植物黃酮類化合物在MDCK細胞模型中的抗H5N1禽流感病毒作用大量研究表明，禽流感病毒能在MDCK細胞中產(chǎn)生較明顯的病變，本發(fā)明利用MDCK細胞進行體外抗H5N1亞型禽流感病毒的藥效學(xué)試驗。
MDCK細胞購于武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
高致病性H5N1禽流感病毒由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，并經(jīng)中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所鑒定，毒株編號為A/goose/Guangdong/NH/2003(H5)(分離方法來源中國疾病預(yù)防控制中心，《禽流感實驗室檢測方法》。Characterization of an Avianinfluenza A(H5N1)virus isolated from a child with a fatal respiratoryillness.Kanta Subbarao，Alexander Klimov，et al.Science(1998)，279393-396)。
將病毒原液作100倍稀釋，并在超凈工作臺中將病毒接種于10日齡的雞胚尿囊腔中，每胚0.2ml，石蠟封口，放于37℃溫箱中孵育，每12h觀察雞胚生長情況，并每天翻胚2次，將24h內(nèi)死亡的雞胚棄去，24h后死去的雞胚放入4℃冰箱，48小時后將所有的雞胚均放入4℃冰箱過夜，次日無菌收集尿囊液，3000rpm離心15min，取上清進行血凝試驗，以血凝滴度大于1∶256的病毒液作實驗材料，分裝-20℃貯存?zhèn)溆谩?br> 植物黃酮類化合物由中山大學(xué)生命科學(xué)院海洋藥物研究所提供。
稱取200mg植物黃酮類化合物溶于50ml細胞維持液中，待其充分溶解后，用0.22μM濾膜過濾除菌，無菌試驗96h(-)，分裝，4℃貯存?zhèn)溆谩?br> 1、植物黃酮類化合物和病毒唑?qū)DCK細胞的最大無毒濃度將濃度為1×105個/ml的MDCK細胞加入96孔板，每孔200μL，細胞鋪滿單層后，用維持液稀釋病毒，按10倍遞減，從病毒原液至10-9，每個濃度8個復(fù)孔，正常細胞對照加維持液，放入37℃5％CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育，觀察細胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)，采用Reed-Muench法計算TCID50。進行植物黃酮類化合物抗H5N1亞型禽流感病毒細胞實驗時以100TCID50為病毒接種量。
依次將藥物(植物黃酮類化合物和病毒唑)對倍稀釋至4μg/ml，即4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml共11個濃度。將培養(yǎng)細胞(濃度1×105個/ml)的細胞懸液200μl加入96孔微量培養(yǎng)板，37℃5％CO2培養(yǎng)，待細胞鋪滿單層后，吸出培養(yǎng)液，用無菌PBS液洗板孔3次，加入上述不同濃度的藥液，每孔200μl，每個濃度8個復(fù)孔，然后在37℃ 5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并動態(tài)觀察結(jié)果，記錄由藥物產(chǎn)生的細胞病變效應(yīng)(CPE)，計算CPE不再進展時(約48小時)藥物的半數(shù)中毒濃度(TD50)和最大無毒濃度(TD0)。并以TD0為正式實驗時的藥物起始濃度。
結(jié)果表明，高致病性H5N1禽流感病毒對MDCK細胞的TCID50為104.29/0.2ml，進行抗病毒實驗時用100TCID50即將病毒原液稀釋195倍后用于細胞實驗；植物黃酮類化合物及病毒唑的最大無毒濃度(TD0)分別為125μg/ml，100μg/ml，半數(shù)中毒濃度(TD50)分別為500μg/ml、1976μg/ml。
2、植物黃酮類化合物對MDCK細胞內(nèi)病毒的直接殺傷作用先將表1中不同濃度的植物黃酮類化合物溶液和100TCID50病毒液等體積混合，作用2h后接種于長滿單層細胞的96孔板中，每孔200μl，每個濃度8個復(fù)孔，放入37℃5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每12h觀察細胞生長情況，設(shè)病毒對照組及正常細胞對照組，待細胞對照生長正常，病毒對照CPE達(+++)以上時判定結(jié)果，拍照。實驗重復(fù)三次，每次實驗結(jié)束時將細胞板反復(fù)凍融三次，使細胞裂解，病毒釋放，分別收集每次實驗各濃度組細胞裂解液于EP管中，-20℃中凍存，進行血凝試驗，測其效價以判定病毒的增殖程度，結(jié)果如表1所示。
實驗結(jié)果表明，植物黃酮類化合物對MDCK細胞內(nèi)禽流感病毒具有直接殺傷作用，其作用的EC50為3.40±0.39μg/ml，TI值為147。血凝測定顯示與病毒對照組相比，2μg/ml即能有效抑制病毒的增殖(P＜0.05)，隨著濃度的增加，其抑制效果愈加明顯，至16μg/ml時已能完全抑制細胞病變的發(fā)生。
表1.植物黃酮類化合物I對MDCK細胞內(nèi)病毒的直接殺傷作用結(jié)果


**P＜0.01；**P＜0.05。
3、植物黃酮類化合物對MDCK細胞病毒感染的治療作用將MDCK細胞在96孔板長成單層后，接種200μL100TCID50的禽流感病毒于各孔中，放入37℃5％CO2培養(yǎng)箱中感染2h后去病毒液，用無菌PBS洗三次以去除游離的殘余病毒，再按表2加不同濃度的植物黃酮類化合物，每孔200μL，每個濃度設(shè)8個復(fù)孔，放入37℃5％CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。每12h觀察細胞生長情況，設(shè)正常細胞對照組和病毒對照組。待正常細胞對照組細胞生長正常，病毒對照組細胞CPE達(+++)以上時判定結(jié)果，拍照。實驗重復(fù)三次，每次實驗結(jié)束時將細胞板反復(fù)凍融三次，使細胞裂解，病毒釋放，分別收集每次實驗各濃度組細胞裂解液于EP管中，-20℃中凍存，進行血凝試驗，測其效價以判定病毒的增殖程度，結(jié)果如表2所示。
結(jié)果表明，當植物黃酮類化合物濃度為0.5μg/ml時，MDCK細胞的CPE達(++++)，可見細胞完全脫落并聚集；濃度為16μg/ml時，CPE為(++)；濃度為31.25μg/ml時，細胞形態(tài)與正常對照細胞無異。經(jīng)計算，植物黃酮類化合物對病毒感染細胞治療作用的EC50為4.01±0.58μg/ml，TI值為124.69。血凝測定顯示與病毒對照組相比，2μg/ml即能有效抑制病毒的增殖(P＜0.05)，隨著濃度的增加，其抑制效果愈加明顯，至31.25μg/ml時已能完全抑制細胞病變的發(fā)生。
表2.植物黃酮類化合物對MDCK細胞病毒感染的治療作用結(jié)果

4、植物黃酮類化合物對MDCK細胞病毒感染的預(yù)防作用接MDCK細胞于96孔板中，每孔200μl(1×105/ml)待各孔細胞鋪滿單層時，去生長液，按表3加用細胞維持液配制的不同濃度的植物黃酮類化合物，每個濃度8個復(fù)孔，每孔200μl，在37℃5％CO2培養(yǎng)箱中作用2h后，去含藥維持液，用滅菌PBS洗滌三次，以去除游離藥物，加入100TCID50的病毒200μl，放入37℃5％CO2培養(yǎng)箱中感染2h后去病毒液，用無菌PBS洗滌三次，除去殘余游離病毒，各孔補充200μL維持液放入37℃5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每12h觀察細胞生長情況，同時設(shè)病毒對照和正常細胞對照。待細胞對照生長正常，病毒對照CPE達(+++)以上時判定結(jié)果，拍照。實驗重復(fù)三次，每次實驗結(jié)束時將細胞板反復(fù)凍融三次，使細胞裂解，病毒釋放，分別收集每次實驗各藥物濃度細胞裂解液于EP管中，-20℃中凍存，進行血凝試驗，測其效價以判定病毒的增殖程度，結(jié)果如表3所示。
結(jié)果表明，當植物黃酮類化合物濃度為1μg/ml時，MDCK細胞CPE為(++++)；濃度為8μg/ml時，MDCK細胞CPE為(++)；濃度為31.25μg/ml時，細胞形態(tài)與正常對照細胞無異，表明植物黃酮類化合物對禽流感病毒具有明顯的預(yù)防作用。經(jīng)計算，其作用的EC50為5.54±0.74μg/ml，TI值為90.25。血凝試驗結(jié)果表明與病毒對照組相比，4μg/ml即能有效抑制病毒的增殖(P＜0.05)，隨著濃度的增加，其抑制效果愈加明顯，至31.25μg/ml時已能完全抑制細胞病變的發(fā)生。
表3.植物黃酮類化合物對MDCK細胞病毒感染的預(yù)防作用結(jié)果

5、植物黃酮類化合物對MDCK細胞的毒性植物黃酮類化合物對MDCK細胞的最大無毒濃度為100μg/ml，并在此濃度以下的一定濃度范圍內(nèi)對H5N1亞型禽流感病毒表現(xiàn)出良好的防治作用，對細胞無毒性。
實施例二、植物黃酮類化合物在雞胚模型中對H5N1禽流感病毒的抑制作用。
禽流感病毒接種雞胚后能很快引起雞胚的死亡，用10日齡雞胚作為實驗材料。
1、植物黃酮類化合物和病毒唑?qū)﹄u胚的最大無毒濃度準確稱取2g植物黃酮類化合物溶于100ml生理鹽水中，待充分溶解后，用0.22μM濾膜過濾除菌，無菌試驗96h(-)后分裝，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 以上述植物黃酮類化合物溶液作為原液，用滅菌生理鹽水作系列倍比稀釋，共作六個濃度梯度即20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml，接種于10日齡雞胚尿囊腔中，每胚0.2ml，每個稀釋度接種5個雞胚，37℃孵育96h，連續(xù)觀察雞胚生長發(fā)育情況，以雞胚存活96h的最大濃度作為藥物的最大無毒劑量。同時作陽性藥物病毒唑?qū)﹄u胚的毒性作用，病毒唑以100mg/ml為原液依次倍比稀釋共六個濃度，接種和觀察同植物黃酮類化合物。實驗時設(shè)正常生理鹽水對照。
結(jié)果表明，植物黃酮類化合物和病毒唑?qū)﹄u胚的最大無毒濃度(TD0)分別為10mg/ml、100mg/ml。
將病毒原液按10倍遞減進行稀釋，并在超凈工作臺中將病毒接種于10日齡的雞胚尿囊腔中，每胚0.2ml，石蠟封口，放于37℃溫箱中孵育，每12h觀察雞胚生長情況，并每天翻胚2次，將24h內(nèi)死亡的雞胚棄去，24h后死去的雞胚放入4℃冰箱，48小時后將所有的雞胚均放入4℃冰箱過夜，次日無菌收集尿囊液，3000rpm離心15min，取上清進行血凝試驗，計算病毒對雞胚的EID50。進行植物黃酮類化合物抗H5N1亞型禽流感病毒雞胚實驗時以100EID50為病毒接種量。
結(jié)果表明，病毒對雞胚的EID50為EID50＝105..67/0.2ml，藥物抗病毒實驗時用100EID50即將病毒稀釋2344倍。。
2、直接殺傷作用組用100EID50的病毒液與按表4的不同濃度藥物溶液等體積混勻，37℃作用2h后，接種于雞胚尿囊腔中，每胚0.2ml，每稀釋度5個雞胚，37℃孵育48h(24h死亡者為非特異性死亡)，入4℃冰箱過夜，次日收獲各雞胚尿囊液，作血凝試驗，結(jié)果如表4所示。以上實驗均同時設(shè)病毒對照及正常對照(生理鹽水)，陽性藥物病毒唑?qū)φ胀瑫r進行。
結(jié)果表明，在直接殺傷作用組中，植物黃酮類化合物濃度為10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml時均能有效地殺傷病毒，使雞胚免于受病毒的攻擊(與病毒對照組比較P＜0.01)；濃度為100mg/ml、50mg/ml病毒唑溶液均能有效地殺傷禽流感病毒(與病毒對照組血凝素效價比較，前者P＜0.01、后者P＜0.05)，而25mg/ml以下各濃度殺傷禽流感病毒效果不顯著(P＞0.05)。
3、治療作用組先每胚分別接種100EID50禽流感病毒0.1ml(每組5個雞胚)，37℃2h，再將不同稀釋度的藥物每胚0.1ml接種于雞胚尿囊腔中，37℃孵育48h，4℃冰箱過夜，次日分別收獲各雞胚尿囊液，作血凝試驗，結(jié)果如表4所示。以上實驗均同時設(shè)病毒對照及正常對照(生理鹽水)，陽性藥物病毒唑?qū)φ胀瑫r進行。
結(jié)果表明，先感染病毒再用藥，植物黃酮類化合物各濃度均能有效地抑制禽流感病毒在雞胚內(nèi)的增殖；而25mg/ml以下的病毒唑則對抑制禽流感病毒效果不顯著(P＞0.05)。
4、預(yù)防作用組將不同稀釋度的藥物0.1ml接種雞胚尿囊腔，每個藥物稀釋度5個雞胚，37℃2h，再分別接種100EID50禽流感病毒0.1ml，37℃孵育48h，入4℃冰箱過夜，次日收獲雞胚尿囊液，作血凝試驗，結(jié)果如表4所示。以上實驗均同時設(shè)病毒對照及正常對照(生理鹽水)，陽性藥物病毒唑?qū)φ胀瑫r進行。
結(jié)果表明，在先用藥物處理雞胚再接種病毒后，可見植物黃酮類化合物10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml組能有效預(yù)防禽流感病毒對雞胚的感染(P＜0.01)；病毒唑組中，除100mg/ml組能有效預(yù)防禽流感病毒對雞胚的感染(P＜0.01)外，其余各劑量組均不能有效預(yù)防禽流感病毒對雞胚的感染(P＞0.05)。
表4.實驗組不同給藥方式觀察結(jié)果


由此可見，植物黃酮類化合物在三種作用方式中對禽流感病毒的效果均優(yōu)于陽性對照藥病毒唑。
5、植物黃酮類化合物對雞胚的毒性植物黃酮類化合物對雞胚的最大無毒濃度為10μg/ml，并在此濃度以下的一定濃度范圍內(nèi)對H5N1亞型禽流感病毒均表現(xiàn)出顯著的直接作用、治療作用及一定的預(yù)防作用，對雞胚無毒性。
實施例三、植物黃酮類化合物抗H5N1亞型禽流感的小鼠試驗實驗動物SPF級ICR小鼠320只，體重20±2g，雌雄各半；由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供(合格證號0002710，許可證號SCXK(滬)2003-003)。實驗前隨機抽取20只小鼠用血凝試驗及血凝抑制試驗確認鼠群中無禽流感病毒的感染，并經(jīng)檢驗排除其它呼吸道病源感染。
動物實驗在廣東省實驗動物監(jiān)測所三級生物安全實驗室進行，符合三級生物安全實驗室標準。所有物品在進入實驗室前均經(jīng)高壓消毒或紫外線照射或浸泡消毒，實驗空間實驗前用高錳酸鉀-甲醛液徹底薰蒸。
將160只動物隨機分為8組，用于觀察小鼠存活率、血清抗體、臟器指數(shù)及病理變化、體重、體溫，分別為植物黃酮類化合物高劑量組(I組，54mg/ml)，植物黃酮類化合物中劑量組(II組，18mg/ml)，植物黃酮類化合物低劑量組(III組，6mg/ml)，極低劑量組(IV組，2mg/ml)，陽性藥物病毒唑?qū)φ战M(V組，6mg/ml)、鹽酸金剛烷胺對照組(VI組，2.5mg/ml)，病毒對照組(VII組)和正常對照組(VIII組)，每組20只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)。
另120只動物隨機分為8組，取肺及腦用于分離病毒，觀察病毒在肺、腦內(nèi)的增殖程度，分別為植物黃酮類化合物高劑量組(I組，54mg/ml)、中劑量組(II組，18mg/ml)、低劑量組(III組，6mg/ml)、極低劑量組(IV組，2mg/ml)；陽性藥物病毒唑?qū)φ战M(V組，6mg/ml)；鹽酸金剛烷胺對照組(VI組，2.5mg/ml)；病毒對照組(VII組)和正常對照組(VIII組)，每組15只。雌雄分籠飼養(yǎng)。
實驗I-VII組動物用0.1ml/20g氯胺酮(20mg/ml)肌肉注射麻醉后從鼻腔滴入含禽流感病毒尿囊液(血凝效價為1∶256)100μL，VIII組則滴入同樣量的無病毒雞胚尿囊液。2h后，I-IV組組動物分別經(jīng)胃灌入高劑量(54mg/ml)、中劑量(18mg/ml)、低劑量(6mg/ml)、極低劑量(2mg/ml)濃度的植物黃酮類化合物0.2ml；V組動物經(jīng)胃灌入病毒唑(6mg/ml)0.2ml；VI組經(jīng)胃灌入鹽酸金剛烷胺(2.5mg/ml)0.2ml；VII組、VIII組動物經(jīng)胃灌入0.5％的羧甲基纖維素鈉0.2ml。所有灌胃操作均在清晨清醒狀態(tài)下進行，每天1次，連續(xù)灌胃5天。各組動物每日飼以標準日糧，自由飲水，12h光照、黑暗間隔。每2天更換墊料，為避免交叉感染，接病毒組和正常對照組相對隔離飼養(yǎng)。實驗連續(xù)觀察15天。每天觀察各組小鼠的臨床癥狀(包括行為、毛發(fā)光澤、呼吸、食欲等)及生存情況，發(fā)現(xiàn)動物瀕死或死亡、立即采用眼球摘除法處死動物，取肺、心、肝、脾、腎等組織，準確稱重(精確到0.1g)，并將肝、腎、肺固定于10％中性緩沖福爾馬林液。
將感染病毒并開始用藥的當天作為0天，用于分離病毒的各實驗組小鼠在實驗的第0、3、4、7天各組分別處死3只小鼠，無菌取肺及腦，入EP管中，勻漿后每管加入無菌生理鹽水0.5ml，分別各取0.2ml接種10日齡雞胚，培養(yǎng)48小時后取尿囊液作病毒血凝實驗。
將感染病毒并開始用藥的當天作為0天，用于觀察小鼠存活率、血清抗體、臟器指數(shù)及病理變化、體重、體溫的各組小鼠在第0、3、6、9、12、15天對存活的各小鼠分別稱重及測量體溫，計算各時間點的體重、體溫變化情況，并在第1、4、7、11天及實驗結(jié)束時，通過斷尾法每次采集各實驗組四只小鼠尾靜脈血，分離血清作抗體分析，了解小鼠體內(nèi)抗體水平的動態(tài)變化及藥物對小鼠抗體水平的影響。血清抗體的檢測采用血凝抑制試驗方法。實驗結(jié)束時將所有鼠均剖殺，取肝、腎、脾、肺、心準確稱重后，將肝、腎、肺固定于10％中性緩沖福爾馬林液中。
計算每組小鼠死亡率、藥物保護率％藥物保護率＝＝病毒對照組小鼠死亡率—試驗組小鼠死亡率效果指數(shù)＝＝病毒對照組死亡數(shù)/藥物組死亡數(shù)病理組織學(xué)觀察小鼠肺、肝、腎等組織常規(guī)固定，石蠟包埋，切片5-8μm，HE染色后鏡檢觀察臟器病理變化。
1、小鼠死亡率比較實驗小鼠生存情況如表5所示，結(jié)果表明，植物黃酮類化合物各濃度組對禽流感病毒均有顯著的抑制作用(P＜0.05)。
表5.各組小鼠生存情況

禽流感病毒廣泛分布于世界范圍內(nèi)的諸多家禽和野禽中，同時也感染豬、馬以及鯨魚、雪貂，海豚等多種哺乳動物。其致病力的變化范圍很大，隨病毒型及亞型、動物種屬、齡期、并發(fā)感染、周圍環(huán)境及宿主免疫狀態(tài)的不同而不同。禽流感病毒感染引發(fā)的疾病可能是不明顯的或是溫和的一過性的綜合癥，也可能是100％發(fā)病率和/或死亡率的疾病。因此對于高致病性禽流感病毒而言，能夠保護受感染動物或人類免于死亡就成為藥物有效性的一個評價指標，這也是研究和開發(fā)藥物的目的。
圖I是實驗小鼠不同組成活率比較圖，結(jié)果表明，與病毒對照組相比，植物黃酮類化合物的高、中、低濃度組及鹽酸金剛烷胺對照組均能顯著地提高感染小鼠的存活率；病毒唑?qū)φ战M、植物黃酮類化合物的極低劑量組盡管也能一定程度地提高小鼠的存活率，但與病毒對照組比較無明顯差異。與傳統(tǒng)的抗病毒藥病毒唑及鹽酸金剛烷胺相比，植物黃酮類化合物的高、中、低劑量組抗禽流感病毒效果與金剛烷胺相當而優(yōu)于病毒唑。
表6是實驗小鼠不同組的存活率、死亡率等的數(shù)據(jù)統(tǒng)計表，表明在一定劑量范圍內(nèi)，植物黃酮類化合物能有效保護小鼠免受禽流感感染所引起的死亡，表中I-VIII分別為高劑量組、中劑量組、低劑量組、極低劑量組、病毒唑組、金剛烷組、病毒對照組和正常對照組。
表6.植物黃酮類化合物對禽流感小鼠模型的保護作用

與病毒對照組相比*P＜0.05。
2、小鼠臟器的病毒濃度比較小鼠肺內(nèi)病毒增殖隨時間變化情況如表7和圖II所示。與病毒對照組比較，實驗第四天，植物黃酮類化合物的54mg/ml組、18mg/ml組、6mg/ml組及金剛烷胺組能顯著抑制病毒的增殖；第七天，各藥物組均能顯著抑制病毒的增殖；腦內(nèi)除病毒對照組檢出低滴度病毒外，各藥物組均未檢出病毒。
表7.各實驗組肺內(nèi)病毒增殖隨時間動態(tài)變化(x±s)

-表示血凝試驗陰性，與病毒對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
3、小鼠血清抗體水平比較小鼠體內(nèi)血清抗體水平如表8和圖III所示。與病毒對照組比較，植物黃酮類化合物54mg/ml組、18mg/ml組及金剛烷胺組能促進小鼠抗體的分泌，其余用藥組對小鼠抗體的分泌影響輕微。
表8.各實驗組小鼠血清抗體水平情況(x±s)

-表示血凝抑制試驗陰性，與病毒對照組比較*P＜0.05。
4、小鼠臟器指數(shù)比較實驗結(jié)束時不同小鼠平均臟器系數(shù)比較如表9所示。與病毒對照組比較，各藥物組均能有效降低小鼠肺指數(shù)，對其它臟器指數(shù)的影響不大；各藥物組均能有效減輕肝、腎、肺等臟器的病變。
表9.實驗結(jié)束時不同組小鼠平均臟器系數(shù)比較(x±s)

與病毒對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01。
5、小鼠體重比較與病毒對照組比較，實驗前三天，各藥物組均能減緩小鼠體重的減輕，三天后各藥物組均能有效促進小鼠體重的回升。
6、小鼠體溫比較與病毒對照組比較，實驗前三天，各用藥組對小鼠體溫的影響不明顯，三天后各藥物組均能有效促進小鼠體溫的回升。
結(jié)果表明植物黃酮類化合物能顯著提高模型小鼠的存活率且呈劑量依賴關(guān)系；能有效地抑制病毒在模型小鼠肺內(nèi)的增殖，抑制病毒對腦的侵襲；能有效地激活機體的體液免疫系統(tǒng)，使機體內(nèi)血清抗體呈高滴度表達；能有效地促進禽流感病毒感染所致的肺，肝、腎等組織器官病變的修復(fù)；能顯著抑制模型小鼠體重的下降及促進體重的回升；能在一定程度上加速模型小鼠體溫恢復(fù)正常和縮短動物的病情。
7、植物黃酮類化合物對小鼠的毒性實驗小鼠的急性毒性實驗表明，所使用的有效抗H5N1亞型禽流感病毒濃度均對小鼠無毒。
權(quán)利要求
1.植物黃酮類化合物在制備抗禽流感病毒藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物的有效劑量為20-250mg/kg體重·天。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物的有效劑量為60-180mg/kg體重·天。
4.植物黃酮類化合物作為飼料添加劑的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述添加劑的有效劑量為20-250mg/kg體重·天。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物的有效劑量為60-180mg/kg體重·天。
全文摘要
本發(fā)明公開了植物黃酮類化合物的用途。本發(fā)明發(fā)明人的研究表明，植物黃酮類化合物能直接殺傷禽流感病毒，可以用于治療和預(yù)防禽流感病毒，能在制備抗禽流感病毒的藥物和添加劑中得到廣泛應(yīng)用。所述藥物或添加劑的有效用量為20－250mg/kg體重·天。植物黃酮類化合物作為一種天然植物成分，對禽流感病毒具有明顯的抑制作用，制備成藥物或添加劑，具有毒性小、作用強、安全有效等優(yōu)點，為禽流感病毒的防治開辟新的途徑，具有重要的社會價值、經(jīng)濟價值和廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A23K1/16GK1718182SQ20041007459
公開日2006年1月11日 申請日期2004年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月7日
發(fā)明者黃韌 申請人:廣東省實驗動物監(jiān)測所