專利名稱：東方百合脫毒小籽球的瓶內(nèi)生成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種在培養(yǎng)瓶內(nèi)生產(chǎn)東方百合脫毒小籽球的方法，屬于百合種球繁育技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
百合(Lilium)是百合科百合屬的多年生草本鱗莖植物，由于其花大色美，氣質(zhì)高雅，是世界著名的觀賞花卉，多年來，其切花銷售量一直占居了全球鮮切花銷售量的前四位。而東方百合雜種系(Oriental hybrids)是百合雜種類中花朵最大而又最美麗的一大類，花型為碗型或星狀碗型，能散發(fā)出怡人的香味，故又稱之為香水百合，深受人們的喜愛，是世界上廣泛栽培的一大類百合雜種系。在百合種球的培育過程中，東方百合種球的生產(chǎn)周期較長，由鱗片扦插繁殖到開花商品球的培育需要2.5～3年。同時常規(guī)無性繁殖中的病毒積累是制約種球繁殖、栽培及切花生產(chǎn)的一大因素，所以脫毒種苗(球)的生產(chǎn)與使用是控制百合病毒病的最基本的關(guān)鍵措施之一。在脫毒種苗(球)的生產(chǎn)過程中，已有的報道均是以脫毒苗進行繁殖和生產(chǎn)的，未見在瓶內(nèi)直接生成脫毒小籽球的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能有效縮短培育周期，減少病毒交叉感染的機會，提高百合種球質(zhì)量的東方百合脫毒小籽球的瓶內(nèi)生成方法。
本發(fā)明通過下列技術(shù)方案完成一種東方百合脫毒小籽球的瓶內(nèi)生成方法，其特征在于經(jīng)過下列步驟1)、外植體的選擇與滅菌選擇無病蟲害、生長健壯、未檢測到CMV(黃瓜花葉病毒)和LSV(百合隱癥病毒)的百合種球，在3～6℃的低溫、黑暗條件下貯藏6～8周后取出，邊剝鱗片邊用自來水沖洗，去除外部2～3層包裹不緊實的鱗片后，用濃度為0.1％的洗衣粉水浸泡2～5分鐘后，用自來水清洗干凈，在0.1～0.2％的升汞(Hgcl2)溶液中滅菌15～25分鐘，然后在1～3％的次氯酸鈉溶液中消毒10～15分鐘，用無菌水洗3～5次；2)、誘導培養(yǎng)在無菌條件下，將滅菌后的鱗片切塊接種到下列誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在溫度為25±2℃，光照時間10～12h/d，光照強度2000～3000Lx的環(huán)境條件下，培養(yǎng)20～25d后，在切口處生成不定芽MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 1.0～2.0mg/L萘乙酸(NAA) 0.1～0.5mg/L蔗糖 30000～40000mg/L瓊脂 5000～5500mg/LpH 5.5～6.03)、獲得脫毒莖尖將上述誘導產(chǎn)生的不定芽在36～40℃條件下氣熱培養(yǎng)10～30天后，在解剖鏡下剝?nèi)～@得0.2～0.5mm的莖尖；4)、增殖培養(yǎng)在無菌條件下，將步驟3)獲得的脫毒莖尖轉(zhuǎn)入下列增殖培養(yǎng)基中MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 1.0～2.0mg/L萘乙酸(NAA) 0.2～0.5mg/L蔗糖 30000～40000mg/L瓊脂 5000～6000mg/LpH 5.5～6.0在溫度為26±2℃，光照時間10～12小時/天，光照強度1500～2000Lx的條件下，培養(yǎng)20～25d，使1個莖尖生長成多個不定芽；5)、繼代培養(yǎng)將上述增殖的不定芽在無菌條件下分切為單芽或2～3個一叢，接入同樣的增殖培養(yǎng)基中，在相同的培養(yǎng)環(huán)境下進行培養(yǎng)，可得到大量的無根不定芽，增殖苗的葉色濃綠，生長健壯，基部膨大成鱗莖形；6)、瓶內(nèi)直接生成脫毒小籽球?qū)⒗^代形成的不定芽切去葉片，基部及鱗片切塊，接入下列生球培養(yǎng)基中MS基本培養(yǎng)液萘乙酸(NAA)0.05～0.1mg/L蔗糖 80000～120000mg/L瓊脂 4500～6000mg/L活性炭 500～600mg/LpH 5.5～6.0在溫度為20±2℃，黑暗條件下，培養(yǎng)60～70d，不定芽切塊及周圍直接生成直徑0.8～1.2cm，圍徑3.0～3.5cm的小籽球，每個切塊可生成小籽球2～4個。
本發(fā)明解決了下列技術(shù)難點1、針對東方百合成球周期長，病毒容易累積的難點，本發(fā)明通過上述方法，在瓶內(nèi)直接生成小籽球，其色白，鱗片緊實，無葉片，出瓶后可直接下地種植，直徑、圍徑已達到常規(guī)組培苗在田間生長3個月以上的小籽球，大大縮短了脫毒種球的培育周期，降低了生產(chǎn)成本。同時出瓶后的小籽球無葉片，易于種植前的冷藏處理，定植后成活率較高。
2、在植物組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)瓶內(nèi)的植株均以異養(yǎng)生長為主，糖是植株進行碳物質(zhì)積累的主要來源。本發(fā)明解決的第二個難點是通過在固體或液體培養(yǎng)基中添加高濃度的蔗糖(8～12g/L)，使不定芽吸收的可溶性糖迅速累積至小籽球中，瓶內(nèi)的脫毒小籽球得到了高速生長，同時提高了小籽球的品質(zhì)。
3、在常規(guī)的組培脫毒苗培養(yǎng)中，不定芽需誘導出葉片后再進行生根植株的培養(yǎng)。然而常常因為培養(yǎng)瓶內(nèi)CO2氣體的不足，使培養(yǎng)瓶內(nèi)的組培苗葉片不僅不能正常進行光合作用積累光合產(chǎn)物，相反還由于葉片的存在，消耗了基部籽球所積累的養(yǎng)分，使組培小籽球的生長受到抑制。另外，常規(guī)組培條件中提供的光照，僅是保持組培葉片中的葉綠素生成，在百合的小籽球生成中無利用價值。因此在本發(fā)明中，解決的第三個難點是采取在完全黑暗條件下進行脫毒小籽球的培育，抑制葉片的生長，避免養(yǎng)分消耗，從而使培養(yǎng)基中的養(yǎng)分全部累積至小籽球中，提高了小籽球的生長速度。
4、本發(fā)明在不同的培養(yǎng)階段，根據(jù)不同的培養(yǎng)目的，對培養(yǎng)基、蔗糖濃度、添加活性炭以及培養(yǎng)條件等關(guān)鍵因子進行調(diào)控，既達到高效增殖，又保證了小籽球的質(zhì)量，尤其在直接生球階段，采用完全黑暗條件進行培養(yǎng)60～70d，不僅節(jié)約了能源的消耗，而且培養(yǎng)環(huán)境接近于百合扦插“埋片”生成鱗片球的環(huán)境，籽球出瓶后容易處理，移栽成活率高且利于后期生長。
5、本發(fā)明利用組織培養(yǎng)中較潔凈的環(huán)境，使瓶內(nèi)脫毒小籽球無病蟲害，移栽成活容易，便于百合種質(zhì)資源在國內(nèi)甚至于國際上的交流，避免了病蟲通過種質(zhì)的交換而發(fā)生大爆發(fā)。
本發(fā)明具有下列優(yōu)點和效果通過東方百合的瓶內(nèi)直接生成脫毒小籽球技術(shù)，對整個百合種球的生產(chǎn)程序進行調(diào)整與優(yōu)化，簡化了脫毒種球的培育程序，大大縮短了東方百合脫毒的培育時間，在降低了生產(chǎn)成本的同時提高了種球質(zhì)量，加強了國產(chǎn)自育種球的市場競爭力，適于東方百合脫毒種球的規(guī)?；a(chǎn)。
本發(fā)明著重對東方百合瓶內(nèi)直接生成脫毒小籽球這一步驟中的關(guān)鍵因素進行了研究，具體地講，也就是從蔗糖的濃度以及培養(yǎng)環(huán)境的調(diào)控兩大方面進行試驗研究，其結(jié)果報告如下1、試驗材料取東方百合品種“Tiber”的種球作為供試材料。
2、方法與結(jié)果外植體的選擇、滅菌、脫毒莖尖的獲得以及增殖、繼代的整個環(huán)節(jié)同實施例，重點研究了脫毒小籽球在瓶內(nèi)的直接生成。
(1)蔗糖濃度對瓶內(nèi)小籽球生成的影響試驗不同的蔗糖濃度對瓶內(nèi)直接生成小籽球的影響，設(shè)計了2％～14％一系列的梯度濃度，在完全黑暗的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)60d，觀察籽球的生長情況及籽球大小，平均直徑的測量是用直尺測量20個小籽球的直徑后，取平均值，平均圍徑的測量先用細棉線繞籽球的最大處，再用直尺測量得出數(shù)值，同樣取20個小籽球的平均值，試驗結(jié)果見表1。
通過以上的比較試驗，得出蔗糖濃度在10％以下時，籽球大小的增大與蔗糖濃度呈正相關(guān)，到10％時各項指標均達到了最優(yōu)，生產(chǎn)的籽球數(shù)量適中，直徑和圍徑達到了最大，超過10％后，雖然每塊外植體所形成的籽球數(shù)量有所增多，但單個籽球的指標反而有所下降，且叢生狀，不利于籽球的分離與移栽，至14％時，已有部分籽球發(fā)生畸變，扁平狀。因此，在東方百合瓶內(nèi)直接生成脫毒小籽球的方法中，以添加8％～12％的蔗糖比較適宜。
(2)培養(yǎng)環(huán)境的調(diào)控采用上述調(diào)配出的最適蔗糖濃度，將切塊接入MS+NAA0.1+蔗糖10％+活性炭0.6％的生球培養(yǎng)基內(nèi)，在下面不同的培養(yǎng)條件(主要是光照的調(diào)整)，溫度為20±2℃的環(huán)境中進行培養(yǎng)，60d后測量籽球的各項指標，具體結(jié)果見表2。
表1不同蔗糖濃度下籽球的生長狀況

通過以上的試驗最終得出東方百合脫毒小籽球生成的培養(yǎng)條件以完全黑暗的條件下進行培養(yǎng)效果較好，生成的籽球數(shù)量適中，同時圍徑大于3cm的比率在試驗組合中最高，籽球質(zhì)量優(yōu)。
表2不同培養(yǎng)條件下脫毒小籽球的生長狀況

具體實施方式
為了更好地說明本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容，下面給出本發(fā)明的實施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不僅限于這些。
實施例11)、外植體的選擇與滅菌優(yōu)選生長健壯、開花性狀好、無病蟲害，無病毒癥狀表現(xiàn)的東方百合品種“Tiber”的種球作為外植體，在取材前，將準備接種的鱗莖在4℃的低溫，黑暗條件下貯藏8周后取出，邊剝鱗片邊用自來水沖洗，去除鱗莖外皮和外部2～3層包裹不緊實的鱗片后，用濃度為0.1％的洗衣粉水浸泡2分鐘，自來水清洗干凈，切去少許頂部及基部，剝成帶部分基盤的單個鱗片，在0.1％的升汞(Hgcl2)溶液中滅菌25分鐘，1％的次氯酸鈉溶液中消毒15分鐘，無菌水沖洗3次后，鱗片切塊接種；2)、誘導培養(yǎng)在無菌條件下，將滅菌后的鱗片切塊接種到下列誘導培養(yǎng)基中MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 1.0mg/L萘乙酸(NAA) 0.1mg/L蔗糖 30000mg/L瓊脂 5000mg/LpH 5.5在溫度為25±2℃，光照時間12h/d，光照強度2000Lx的環(huán)境條件下，培養(yǎng)25d，在切口處直接生成不定芽，或通過愈傷組織脫分化形成不定芽；3)、脫毒莖尖的獲得將上述誘導產(chǎn)生的不定芽在36℃條件下氣熱培養(yǎng)30天，在解剖鏡下剝?nèi)～@得0.2～0.5mm的脫毒莖尖；4)、增殖培養(yǎng)在無菌條件下，將第3)步獲得的脫毒莖尖轉(zhuǎn)入下列增殖培養(yǎng)基中MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 1.0mg/L萘乙酸(NAA) 0.2mg/L蔗糖 30000mg/L瓊脂 5000mg/LpH 5.5在溫度為26±2℃，光照時間10小時/天，光照強度2000Lx的條件下，培養(yǎng)20d，可使莖尖生長為不定芽，由1個可平均增殖為4個；
5)、繼代培養(yǎng)將第4)步增殖所得到的不定芽在無菌條件下分切為單芽或2～3芽一叢，接入同樣的增殖培養(yǎng)基中，在相同的培養(yǎng)環(huán)境下進行培養(yǎng)，可得到大量的無根不定芽，增殖苗的葉色濃綠，生長健壯，基部膨大成鱗莖形；6)、瓶內(nèi)直接生成脫毒小籽球?qū)⒗^代形成的不定芽切去葉片，基部及鱗片切塊，接入下列的生球培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)液萘乙酸(NAA) 0.05mg/L蔗糖 80000mg/L瓊脂 4500mg/L活性炭 500mg/LpH 5.5在溫度為20±2℃，黑暗條件下，培養(yǎng)70d，不定芽切塊及周圍可直接生成小籽球，平均直徑達1cm，平均圍徑達3.0cm以上，每個切塊平均可生成小籽球2.8個。
實施例21)、優(yōu)選生長健壯、開花性狀好、無病蟲害，無病毒癥狀表現(xiàn)的東方百合品種“Acapulco”的種球作為外植體，在取材前，將準備接種的鱗莖在6℃的低溫，黑暗條件下貯藏8周后取出，邊剝鱗片邊用自來水沖洗，去除鱗莖外皮和外部2～3層包裹不緊實的鱗片后，用0.1％洗衣粉水浸泡5分鐘，自來水清洗干凈，切去少許頂部及基部，剝成帶部分基盤的單個鱗片，在0.2％的升汞(Hgcl2)溶液中處理15分鐘，3％的次氯酸鈉溶液中處理10分鐘，無菌水沖洗5次后，鱗片切塊接種；2)、誘導培養(yǎng)在無菌條件下，將滅菌后的鱗片切塊接種到下列誘導培養(yǎng)基中MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 2.0mg/L萘乙酸(NAA) 0.5mg/L蔗糖 40000mg/L瓊脂 5500mg/LpH6.0在溫度為25±2℃，光照時間10h/d，光照強度3000Lx的環(huán)境條件下，培養(yǎng)20d，在切口處直接生成不定芽，或通過愈傷組織脫分化形成不定芽；3)、脫毒莖尖的獲得以第2)步誘導產(chǎn)生的不定芽作材料，針對在百合種植、生產(chǎn)危害較大的病毒病，通過40℃氣熱培養(yǎng)10天后，在解剖鏡下剝?nèi)～@得0.2～0.5mm的脫毒莖尖；4)、增殖培養(yǎng)在無菌條件下，將第3)步獲得的脫毒莖尖轉(zhuǎn)入下列增殖培養(yǎng)基中MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA) 2.0mg/L萘乙酸(NAA)0.5mg/L蔗糖 40000mg/L瓊脂 6000mg/LpH 6.0在溫度為26±2℃，光照時間12小時/天，光照強度1500Lx的條件下，培養(yǎng)25d，使莖尖生長為不定芽，由1個可平均增殖為5個；5)、繼代培養(yǎng)將第4)步增殖所得到的不定芽在無菌條件下分切為單芽或2～3芽一叢，接入同樣的增殖培養(yǎng)基中，在相同的培養(yǎng)環(huán)境下進行培養(yǎng)，可得到大量的無根不定芽，增殖苗的葉色濃綠，生長健壯，基部膨大成鱗莖形；6)、瓶內(nèi)直接生成脫毒小籽球?qū)⒗^代形成的不定芽切去葉片，基部及鱗片切塊，接入下列的生球培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)液萘乙酸(NAA) 0.1mg/L蔗糖120000mg/L瓊脂6000mg/L活性炭 600mg/LpH 6.0在溫度為20±2℃，黑暗條件下，培養(yǎng)70d，不定芽切塊及周圍直接生成小仔球，平均直徑為0.96cm，平均圍徑2.58cm，平均可生成小籽球4個。
權(quán)利要求
1.一種東方百合脫毒小籽球的瓶內(nèi)生成方法，其特征在于經(jīng)過下列步驟1)、外植體的選擇與滅菌選擇無病蟲害、生長健壯、未檢測到CMV(黃瓜花葉病毒)和LSV(百合隱癥病毒)的百合種球，在3～6℃的低溫、黑暗條件下貯藏6～8周后取出，邊剝鱗片邊用自來水沖洗，去除外部2～3層包裹不緊實的鱗片后，用濃度為0.1％的洗衣粉水浸泡2～5分鐘后，用自來水清洗干凈，在0.1～0.2％的升汞(Hgcl2)溶液中滅菌15～25分鐘，然后在1～3％的次氯酸鈉溶液中消毒10～15分鐘，用無菌水洗3～5次；2)、誘導培養(yǎng)在無菌條件下，將滅菌后的鱗片切塊接種到下列誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在溫度為25±2℃，光照時間10～12h/d，光照強度2000～3000Lx的環(huán)境條件下，培養(yǎng)20～25d后，在切口處生成不定芽MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)1.0～2.0mg/L萘乙酸(NAA) 0.1～0.5mg/L蔗糖30000～40000mg/L瓊脂5000～5500mg/LpH 5.5～6.03)、獲得脫毒莖尖將上述誘導產(chǎn)生的不定芽在36～40℃條件下氣熱培養(yǎng)10～30天后，在解剖鏡下剝?nèi)～@得0.2～0.5mm的莖尖；4)、增殖培養(yǎng)在無菌條件下，將步驟3)獲得的脫毒莖尖轉(zhuǎn)入下列增殖培養(yǎng)基中MS基本培養(yǎng)液6-芐基氨基嘌呤(6-BA)1.0～2.0mg/L萘乙酸(NAA)0.2～0.5mg/L蔗糖 30000～40000mg/L瓊脂 5000～6000mg/LpH 5.5～6.0在溫度為26±2℃，光照時間10～12小時/天，光照強度1500～2000Lx的條件下，培養(yǎng)20～25d，使1個莖尖生長成多個不定芽；5)、繼代培養(yǎng)將上述增殖的不定芽在無菌條件下分切為單芽或2～3個一叢，接入同樣的增殖培養(yǎng)基中，在相同的培養(yǎng)環(huán)境下進行培養(yǎng)，可得到大量的無根不定芽，增殖苗的葉色濃綠，生長健壯，基部膨大成鱗莖形；6)、瓶內(nèi)直接生成脫毒小籽球?qū)⒗^代形成的不定芽切去葉片，基部及鱗片切塊，接入下列生球培養(yǎng)基中MS基本培養(yǎng)液萘乙酸(NAA)0.05～0.1mg/L蔗糖 80000～120000mg/L瓊脂 4500～6000mg/L活性炭 500～600mg/LpH 5.5～6.0在溫度為20±2℃，黑暗條件下，培養(yǎng)60～70d，不定芽切塊及周圍直接生成直徑0.8～1.2cm，圍徑3.0～3.5cm的小籽球，每個切塊可生成小籽球2～4個。
全文摘要
本發(fā)明提供一種東方百合脫毒小籽球的瓶內(nèi)生成方法，它經(jīng)過外植樹體選擇、滅菌，誘導培養(yǎng)獲得脫毒莖尖，再經(jīng)增殖培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)，瓶內(nèi)直接生成脫毒小籽球。本發(fā)明針對東方百合成球周期長，病毒容易累積等難點，使東方百合在瓶內(nèi)直接生成脫毒小籽球，出瓶后可直接下地種植，且移栽成活率高。通過對整個百合種球的生產(chǎn)程序進行調(diào)整與優(yōu)化，簡化了脫毒種球的培育程序，大大縮短了東方百合脫毒的培育時間，在降低了生產(chǎn)成本的同時提高了種球質(zhì)量，加強了國產(chǎn)自育種球的市場競爭力，適于東方百合脫毒種球的規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號A01G7/00GK1762205SQ20041007951
公開日2006年4月26日 申請日期2004年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月21日
發(fā)明者瞿素萍, 屈云慧, 熊麗, 王祥寧, 吳學尉, 陳敏 申請人:云南省農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所