專利名稱：扁豆原位叢生芽組織培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種扁豆組織培養(yǎng)的方法，特別是一種扁豆原位叢生芽組織培養(yǎng)方法，用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
利用生物技術(shù)素改良作物已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的一項(xiàng)重要技術(shù)途徑。而組織培養(yǎng)是生物技術(shù)的基礎(chǔ)。組織培養(yǎng)的成功取決于是否具有良好的再生系統(tǒng)。扁豆組織培養(yǎng)研究比較少。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn)，程林梅等在《中國油料作物學(xué)報(bào)》，1998年20(2)6～8，撰文“大豆不同外植體植株再生的研究”該文對(duì)不同大豆品種的不同組織誘導(dǎo)率研究表明下胚軸＞上胚軸＞小真葉＞幼胚，再生頻率平均為34％，最高達(dá)50％。報(bào)導(dǎo)提及大豆誘導(dǎo)再生植株頻率低，重復(fù)性差。大豆組培的不定芽少，繁殖倍數(shù)低生長慢，在培養(yǎng)中品種基因型間差異大。扁豆是豆科作物，和豆科作物一樣組織培養(yǎng)具有困難，一個(gè)高效扁豆再生植株體系，是利用生物技術(shù)改良扁豆的技術(shù)關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)背景技術(shù)的不足和缺陷，克服扁豆組織培養(yǎng)中再生能力低的問題，提供一種扁豆原位叢生芽組織培養(yǎng)方法，通過高效的植株再生系統(tǒng)，使其解決在組織培養(yǎng)中扁豆不定芽少，繁殖數(shù)量低，生長慢和基因型間差異大的難點(diǎn)，達(dá)到扁豆組織培養(yǎng)的再生芽多，并通過培養(yǎng)基的培養(yǎng)使再生植株健壯的目的。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明采用扁豆再生腋芽分生組織的方法，扁豆種子經(jīng)消毒處理，放在萌發(fā)培養(yǎng)基上萌發(fā)扁豆無菌苗；將萌發(fā)的大豆在解剖鏡下用解剖刀去除下胚軸、頂尖生長點(diǎn)，保留二片子葉，并制造一定的傷口，把外植體放在長芽培養(yǎng)基上；不定芽長大切下再放在生根培養(yǎng)基上，長出根系得到再生苗后移栽到大盆，用這種培養(yǎng)基方法可以得到很多叢生的扁豆不定芽，經(jīng)培養(yǎng)后得到再生苗。
以下對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，方法步驟如下(1)種子消毒和萌發(fā)培養(yǎng)。種子用水清洗放在70％的酒精中25～35秒，取出放在10％的次氯酸鈉溶液中15～25分鐘，用無菌水清洗2～4次，消毒種子放在MSB+6-BA(6-芐基腺嘌呤)0.1～1mg/L，pH5.8，萌發(fā)培養(yǎng)基上23℃～25℃萌發(fā)3天～5天。
(2)原位叢生芽萌發(fā)和生長培養(yǎng)。萌發(fā)扁豆去除下胚軸，取出頂尖生長點(diǎn)，保留二片子葉，放在MSB+6-BA 2～4mg/L，pH5.8，長芽培養(yǎng)基上保持23℃～27℃，培養(yǎng)26天～30天，至芽長至2～4cm高。
(3)原位叢生芽的培養(yǎng)和生根。切下不定芽放在MSB+IBA(吲哚丁酸)0.1～0.5mg/L，pH5.8，生根培養(yǎng)基上23℃誘導(dǎo)生根23天～25天，移栽到大盆，經(jīng)培養(yǎng)后得到再生苗。
本發(fā)明具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步，與選用子葉、子葉節(jié)等外植體培養(yǎng)再生植株相比，本發(fā)明能產(chǎn)生叢生的不定芽、芽生長快且封頂芽少、植株生長健壯、培養(yǎng)時(shí)間縮短、各品種間組織培養(yǎng)再生差異小，重復(fù)性好，用本發(fā)明方法建立扁豆原位叢生芽高效再生系統(tǒng)適合于各種扁豆品種的組織培養(yǎng)，并能快速得到扁豆組織苗。
具體實(shí)施例方式
結(jié)合本發(fā)明方法的內(nèi)容提供以下三個(gè)實(shí)施例實(shí)施例1試驗(yàn)品種為交選扁豆1號(hào)，50粒；種子用水清洗放在70％酒精中25秒，取出在10％的次硫酸鈉15分鐘，用無菌水清洗2次，消毒種子放在MSB+6-BA 0.1mg/L，pH 5.8，萌發(fā)培養(yǎng)基上23℃萌發(fā)5天；將萌發(fā)的扁豆在解剖鏡下用解剖刀去除下胚軸、兩片子葉間頂芽和側(cè)芽的生長點(diǎn)，保留二片子葉，放在MSB+6-BA 2mg/L，pH 5.8，長芽培養(yǎng)基上保持23℃萌發(fā)30天，培養(yǎng)至2cm高；切下不定芽放在MSB+IBA 0.1mg/L，pH5.8，生根培養(yǎng)基23℃誘導(dǎo)生根25天，移栽到大盆得到再生苗；獲得交選扁豆1號(hào)再生植株356株。產(chǎn)生叢生的不定芽7-10個(gè)/棵、試管苗培養(yǎng)60天，芽生長快且封頂芽少、植株生長健壯、品種內(nèi)組織培養(yǎng)再生差異小，誘導(dǎo)再生植株頻率達(dá)到712％。
實(shí)施例2試驗(yàn)品種為泥城1號(hào)，50粒；種子用水清洗放在70％酒精中30秒，取出在10％次硫酸鈉20分鐘，用無菌水清洗3次，消毒種子放在MSB+6-BA 0.5mg/L，pH 5.8，萌發(fā)培養(yǎng)基上24℃萌發(fā)4天；將萌發(fā)的扁豆在解剖鏡下用解剖刀去除下胚軸、兩片子葉間頂芽和側(cè)芽的生長點(diǎn)，保留二片子葉，放在MSB+6-BA 3mg/L，pH 5.8，長芽培養(yǎng)基上保持25℃萌發(fā)28天，培養(yǎng)至3cm高；切下不定芽放在MSB+IBA 0.3mg/L，pH5.8，生根培養(yǎng)基上23℃誘導(dǎo)生根24天，移栽到大盆得到再生苗；獲得泥城1號(hào)，再生植株389株。產(chǎn)生叢生的不定芽7-10個(gè)/棵、試管苗培養(yǎng)56天，芽生長快且封頂芽少、植株生長健壯、品種內(nèi)組織培養(yǎng)再生差異小，誘導(dǎo)再生植株頻率達(dá)到778％。
實(shí)施例3試驗(yàn)品種為泥城2號(hào)，50粒；種子用水清洗放在70％酒精中35秒，取出放在10％次硫酸鈉25分鐘，用無菌水清洗3次，消毒種子放在MSB+6-BA 1mg/L，pH 5.8，萌發(fā)培養(yǎng)基上25℃萌發(fā)3天；將萌發(fā)的扁豆在解剖鏡下用解剖刀去除下胚軸、兩片子葉間頂芽和側(cè)芽的生長點(diǎn)，保留二片子葉，放在MSB+6-BA 4mg/L，pH 5.8，長芽培養(yǎng)基上保持27℃萌發(fā)26天，培養(yǎng)至4cm高；切下不定芽放在MSB+IBA 0.5mg/L，pH 5.8，生根培養(yǎng)基上23℃誘導(dǎo)生根23天，移栽到大盆得到再生苗；獲得泥城2號(hào)再生植株373株。產(chǎn)生叢生的不定芽7-10個(gè)/棵、試管苗培養(yǎng)52天，芽生長快且封頂芽少、植株生長健壯、品種內(nèi)組織培養(yǎng)再生差異小，誘導(dǎo)再生植株頻率達(dá)到746％。
本發(fā)明具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步，與選用子葉、子葉節(jié)等外植體培養(yǎng)再生植株相比，本發(fā)明能產(chǎn)生叢生的不定芽7-10個(gè)/棵、試管苗培養(yǎng)52-60天，芽生長快且封頂芽少、植株生長健壯、培養(yǎng)時(shí)間縮短20-30天、重復(fù)性好，各品種間組織培養(yǎng)再生差異小，誘導(dǎo)再生植株頻率達(dá)到712％-778％。用本發(fā)明方法建立扁豆原位從生芽高效再生系統(tǒng)適合于各種扁豆品種的組織培養(yǎng)，并能快速得到扁豆組織苗。
權(quán)利要求
1.一種扁豆原位叢生芽組織培養(yǎng)方法，其特性在于，采用扁豆再生腋芽分生組織的方法，扁豆種子經(jīng)消毒處理，放在萌發(fā)培養(yǎng)基上萌發(fā)扁豆無菌苗，去除下胚軸、頂尖生長點(diǎn)，保留二片子葉，把外植體放在長芽培養(yǎng)基上，不定芽長大切下再放在生根培養(yǎng)基上，長出根系得到再生苗后移栽到大盆，經(jīng)培養(yǎng)后得到再生苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的扁豆原位叢生芽組織培養(yǎng)方法，其特征是，通過步驟對(duì)其進(jìn)一步限定如下(1)種子用水清洗放在70％的酒精中25～35秒，取出放在10％的次氯酸鈉溶液中15～25分鐘，用無菌水清洗2～4次，消毒種子放在MSB+6-BA0.1～1mg/L，pH5.8，萌發(fā)培養(yǎng)基上23℃～25℃萌發(fā)3天～5天；(2)萌發(fā)扁豆去除下胚軸、頂尖生長點(diǎn)，保留二片子葉，放在MSB+6-BA2～4mg/L，pH5.8，長芽培養(yǎng)基上保持23℃～27℃，培養(yǎng)26天～30天至2～4cm高；(3)切下不定芽放在MSB+IBA0.1～0.5mg/L，pH5.8，生根培養(yǎng)基上23℃誘導(dǎo)生根23天～25天，移栽到大盆，經(jīng)培養(yǎng)后得到再生苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的扁豆原位叢生芽組織培養(yǎng)方法，其特征是，步驟(2)中，所述的萌發(fā)扁豆取出頂尖生長點(diǎn)，即將萌發(fā)的扁豆在解剖鏡下用解剖刀去除下胚軸、兩片子葉間頂芽和側(cè)芽的生長點(diǎn)。
全文摘要
一種扁豆原位叢生芽組織培養(yǎng)方法，用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用扁豆再生腋芽分生組織的方法，扁豆種子經(jīng)消毒處理，放在萌發(fā)培養(yǎng)基上萌發(fā)扁豆無菌苗，去除下胚軸、頂尖生長點(diǎn)，保留二片子葉，把外植體放在長芽培養(yǎng)基上，不定芽長大切下再放在生根培養(yǎng)基上，長出根系得到再生苗后移栽到大盆，經(jīng)培養(yǎng)后得到再生苗。本發(fā)明能促使其產(chǎn)生叢生的不定芽，芽生長快，且封頂芽少，植株生長健壯，培養(yǎng)時(shí)間縮短，各種間組織培養(yǎng)再生差異小，用本發(fā)明方法建立扁豆原位叢生芽高效再生系統(tǒng)適合于各種扁豆品種的組織培養(yǎng)，并能快速得到扁豆組培苗。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1605248SQ20041008430
公開日2005年4月13日 申請(qǐng)日期2004年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月18日
發(fā)明者武天龍, 袁娟, 馬明, 馬曉紅 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)