專利名稱：槲蕨的一種繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物的繁殖方法，特別是涉及槲蕨的一種繁殖方法。
背景技術(shù)：
《本草綱目拾遺》記載“骨碎補(bǔ)，本名猴姜，以其主傷折、補(bǔ)骨碎，故命此名。或作骨碎布，訛矣。江西人呼為胡姜，象形也?！爆F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明骨碎補(bǔ)具有多種功效1)和卡那霉素合用可減輕卡那霉素對耳蝸的毒性作用(廣西醫(yī)學(xué)院耳鼻喉科.新醫(yī)學(xué)，1977，8(4-5)168)；2)對心肌細(xì)胞具有起搏作用，并能增強(qiáng)搏動頻率(王維信等.中國藥學(xué)會慶祝建會80周年學(xué)術(shù)會議，1986，06-K-2)；3)對骨關(guān)節(jié)軟骨具有刺激細(xì)胞代償性增生的作用(趙湘洪等，中藥通報，1987，12(10)41；Lin ChunYu等，The effect of Chinese medicine on bone cell activities，American Journalof Chinese Medicine，American Journal of Chinese Medicine，2002.302/3，271-285)。
槲蕨(Drynaria fortunei(Kze.)J.Sm)，又名石巖姜、巖連姜、猴姜，屬于槲蕨科(Drynariaceae)槲蕨屬的中型附生蕨類。在我國主要分布于浙江、福建、臺灣、廣東、廣西、江西、湖北、四川、貴州、云南等地。槲蕨作為骨碎補(bǔ)正品之一被收載于《中國藥典》，現(xiàn)已成為骨碎補(bǔ)商品的主流品種(周銅水，周榮漢.骨碎補(bǔ)類生藥商品調(diào)查和性狀鑒定研究.中國中藥雜志，1998，18(12)710-712)，具有補(bǔ)腎堅骨、續(xù)傷止痛等功效，可用于治療腎虛腰痛、耳鳴耳聾、筋骨傷折等病癥(江蘇新醫(yī)學(xué)院，中藥大辭典，上海上海人民出版社，1979，1658-1660)。
目前市售的骨碎補(bǔ)藥材除現(xiàn)行《中國藥典》收載的槲蕨外，還有中華槲蕨、團(tuán)葉槲蕨、光葉槲蕨、櫟葉槲蕨、川滇槲蕨、崖姜蕨、大葉骨碎補(bǔ)、海州骨碎補(bǔ)、圓蓋陰石蕨、鱗軸小膜蓋蕨及光葉瘤蕨共12種之多，分屬于3科6屬，其中槲蕨占商品來源的70％以上(周銅水，周榮漢.骨碎補(bǔ)類生藥商品調(diào)查和性狀鑒定研究.中國中藥雜志，1998，18(12)710-712)。經(jīng)薄層色譜法(TLC)分析發(fā)現(xiàn)不同來源的骨碎補(bǔ)組成成分有所不同，表現(xiàn)為橙皮甙、柚皮甙和總黃酮的含量不同。其中，槲蕨根莖中的橙皮甙(hesperidin)、柚皮甙(naringin)及總黃酮含量在同類產(chǎn)品中均較高，而柚皮甙是骨碎補(bǔ)中具有活血去瘀、接骨療傷和增強(qiáng)心肌細(xì)胞機(jī)能作用的主要活性成分(江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典.上海上海人民出版社，1979，1658-1660；周銅水，劉曉東，周榮漢.骨碎補(bǔ)對大鼠實(shí)驗(yàn)性骨損傷愈合的影響.中草藥，1994，25(5)249-250)。此外，中國藥科大學(xué)的周銅水等還從槲蕨根莖的石油醚提取物中分離并鑒定了15種化合物，例如何帕-22(29)-烯(hop-22(29)-ene)、何帕-21-烯(hop-21-ene)、何帕-22-醇(hop-22-ol)、羊齒-9(11)-烯(fern-9(11)-ene)、24-甲基-9，19-環(huán)羊毛甾-25-烯-3β-醇(24-methyl-9，19-cyclolanost-25-en-3β-ol)、24-乙基-9，19-環(huán)羊毛甾-25-烯-3β-醇(24-ethyl-9，19-cyclolanost-25-en-3β-ol)、24-甲基-9，19-環(huán)羊毛甾-25-烯-3-酮(24-methyl-9，19-cyclolanost-25-en-3-one)、正三十二烷酸(n-dotriacontanic acid)及β-谷甾醇等(周銅水，周榮漢.槲蕨根莖脂溶性成分的研究.中草藥，1994，25(4)175-178)。
由于槲蕨的人工繁殖栽培技術(shù)相對滯后，導(dǎo)致目前市售的槲蕨藥材主要來源于浙江、湖北、廣東、廣西和四川的野生槲蕨資源。且由于市場需求量較大，使得這些地區(qū)的槲蕨資源被過度開采，野生槲蕨資源遭到嚴(yán)重破壞。
槲蕨的人工繁殖方法有分株繁殖和組織培養(yǎng)方法。其中，分株繁殖的生長周期長且效率低，組織培養(yǎng)的成本較高，因而上述兩種方法均不利于藥用槲蕨的規(guī)?；a(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種培育周期較短、成本較低廉的槲蕨的繁殖方法。
本發(fā)明所提供的槲蕨的繁殖方法，是將槲蕨的孢子經(jīng)消毒后，接種于1/2MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，獲得孢子體苗，再經(jīng)移栽得到槲蕨。
所述1/2MS固體培養(yǎng)基包含的大量和微量元素為MS培養(yǎng)基全量的1/2，鐵鹽和有機(jī)物的含量與MS培養(yǎng)基相同，用0.5％(W/V)的瓊脂固化，調(diào)pH值至5.8。
消毒所用的消毒液為含有濃度為0.1-0.2％吐溫-80和4-6％NaOCl的溶液。
所述吐溫-80的濃度優(yōu)選為0.1％，NaOCl的濃度優(yōu)選為5％；在此濃度下，所需的消毒時間為4min。
所述接種方法為在無菌條件下，先用無菌水將1/2MS固體培養(yǎng)基的表面濕潤，使其表面形成一薄層水膜(以傾斜三角瓶時匯集在底部的水不能讓滴管吸上連續(xù)的水滴為宜)，然后將無菌的孢子以懸濁液的形式均勻接種在培養(yǎng)基上。
所述孢子的培養(yǎng)條件為在25±2℃下，先暗培養(yǎng)24-72h，然后將其轉(zhuǎn)至光照下繼續(xù)培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2000-2300lx(光源為熒光燈)，光照時間為10-14h·d-1；所述培養(yǎng)溫度優(yōu)選為25℃；所述暗培養(yǎng)時間優(yōu)選為24h；所述光照時間優(yōu)選為12h·d-1。
所述孢子體苗移栽的方法可包括以下步驟1)將無菌孢子體苗置于自然光照下煉苗6-8d，再置于空氣中在相同的光照條件下煉苗6-8d；2)將其移栽至經(jīng)消毒的素砂中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照強(qiáng)度為2000-2300lx，光照時間為10-14h·d-1；3)25-35d后將其定植到穴盤中(培養(yǎng)基質(zhì)的成分及混合比例為草炭土∶蛭石∶細(xì)砂∶有機(jī)肥＝4∶2∶2∶1)，置溫室培養(yǎng)，并按其生長特性對孢子體苗進(jìn)行栽培管理；4)待幼苗長出3-4片葉時，可結(jié)合分株上盆。
所述孢子體苗的栽培管理條件為夏秋季遮蔭，春冬季保持白天溫度21-26℃，夜間溫度10-15℃，空氣濕度70-90％，緩苗20-35d后每月施一次稀液肥。
本發(fā)明是以孢子為材料，利用組織培養(yǎng)技術(shù)，再結(jié)合對蕨類植物的專有栽培管理措施，建立的槲蕨的孢子繁殖方法。彌補(bǔ)了現(xiàn)有槲蕨繁殖技術(shù)培育周期長、成本高和效率低的不足，開辟了一條人工繁殖槲蕨的新途徑，并填補(bǔ)了國內(nèi)槲蕨孢子無菌培養(yǎng)方法的空白。利用本發(fā)明的方法，用少量的孢子材料，即可快速繁育出大量孢子體，90天即可成苗，成苗率可達(dá)95％，使槲蕨的規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)成為可能，從而滿足市場對槲蕨的需求，同時可減少對其野生資源和環(huán)境的破壞。此外，本發(fā)明還為開展該物種遺傳育種和保護(hù)生物學(xué)等方面的研究提供了良好的試驗(yàn)體系，具有廣泛的應(yīng)用前景。


圖1為定植到穴盤中的孢子體苗圖2為定植到牛眼盆中的孢子體苗圖3為引種到溫室中的槲蕨具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、槲蕨的孢子培養(yǎng)培養(yǎng)基1/2MS培養(yǎng)基大量和微量元素為MS培養(yǎng)基全量的1/2，鐵鹽和有機(jī)成分的濃度與MS培養(yǎng)基相同，0.5％(W/V)瓊脂，pH5.8。煮沸后分裝至100mL三角瓶中，然后121℃，高壓蒸汽滅菌20min。
一、槲蕨孢子的滅菌取成熟的槲蕨孢子5mg置于1.5mL離心管內(nèi)，滴入無菌水，充分振蕩使成懸濁液，靜置2h后，4000r/min離心1min，棄上清；然后向離心管內(nèi)滴入約1.2mL的5％NaOCl溶液(每100mL該溶液中含0.1mL吐溫-80)對孢子進(jìn)行消毒滅菌，4min后，4000r/min離心1min，棄上清；最后用無菌水沖洗4-5次，獲得無菌的孢子懸濁液。
二、無菌孢子的接種及培養(yǎng)在無菌條件下，先用無菌水將上述配制的1/2MS培養(yǎng)基的表面濕潤，使其表面形成一層薄薄的水膜(以傾斜三角瓶時匯集在底部的水不能讓滴管吸上連續(xù)的水滴為宜)，然后用滴管將步驟一獲得的無菌孢子懸濁液均勻接種在培養(yǎng)基上。接種后，在25℃下，先暗培養(yǎng)24h，然后將其轉(zhuǎn)至光照下繼續(xù)培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2000-2300lx(光源為熒光燈)，光照時間為12h·d-1。
三、槲蕨幼孢子體苗的移栽及管理培養(yǎng)12天后，孢子開始萌發(fā)，30-35天形成配子體，90天形成孢子體苗，待孢子體長出1片葉(葉長約1-2cm)時，將三角瓶置于自然光照下煉苗7d，再打開瓶蓋煉苗7d，然后用鑷子輕輕夾出試管苗，洗凈培養(yǎng)基后，將其移栽至經(jīng)1‰多菌靈消毒4h的素砂中，并置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)室溫度設(shè)為25℃，光照強(qiáng)度2000-2300lx(光源為熒光燈)，光照時間為12h·d-1；1個月后將其定植到穴盤中(培養(yǎng)基質(zhì)的成份及混合比例為草炭土∶蛭石∶細(xì)砂∶有機(jī)肥＝4∶2∶2∶1)，如圖1所示，置溫室培養(yǎng)，夏秋遮蔭，春冬季保持白天溫度21-26℃，夜間溫度10-15℃，空氣濕度70-90％，緩苗1個月后每月施一次稀液肥，待幼苗長出3-4片葉時，可結(jié)合分株進(jìn)行上盆，定植到牛角盆的孢子體幼苗如圖2所示。待其成活后，還可對其進(jìn)行引種栽培，如圖3所示，圖中可看到其營養(yǎng)葉及根莖。
權(quán)利要求
1.一種槲蕨的繁殖方法，是將槲蕨的孢子經(jīng)消毒后，接種于1/2MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，獲得孢子體苗，再經(jīng)移栽得到槲蕨。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的繁殖方法，其特征在于所述1/2MS固體培養(yǎng)基包含的大量和微量元素為MS培養(yǎng)基全量的1/2，鐵鹽和有機(jī)物的含量與MS培養(yǎng)基相同，用0.5％(W/V)的瓊脂固化，調(diào)pH值至5.8。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的繁殖方法，其特征在于所述消毒液為含有0.1-0.2％吐溫-80和4-6％NaOCl的溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的繁殖方法，其特征在于所述吐溫-80的濃度為0.1％，NaOCl的濃度為5％。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的繁殖方法，其特征在于所述吐溫-80的濃度為0.1％，NaOCl的濃度為5％時，消毒時間為4min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的繁殖方法，其特征在于所述孢子的培養(yǎng)條件為在25±2℃下，先暗培養(yǎng)24-72h，然后將其轉(zhuǎn)至光照下繼續(xù)培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2000-23001x，光照時間為10-14h·d-1。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的繁殖方法，其特征在于所述培養(yǎng)溫度為25℃。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的繁殖方法，其特征在于所述暗培養(yǎng)時間為24h。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的繁殖方法，其特征在于所述光照時間為12h·d-1。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9任一所述的繁殖方法，其特征在于所述移栽過程中對孢子體苗的管理條件為夏秋季遮蔭，春冬季保持白天溫度21-26℃，夜間溫度10-15℃，空氣濕度70-90％，緩苗20-35d后每月施一次稀液肥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種槲蕨的繁殖方法，是將槲蕨的孢子經(jīng)消毒后，接種于1/2MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，獲得孢子體苗，再經(jīng)移栽得到槲蕨。所述消毒液為含有0.1－0.2％吐溫－80和4－6％NaOCl的溶液。所述孢子的培養(yǎng)條件為在25±2℃下，先暗培養(yǎng)24－72h，然后將其轉(zhuǎn)至光照下繼續(xù)培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2000－2300lx，光照時間為10－14h·d
文檔編號A01G7/00GK1788549SQ200410098498
公開日2006年6月21日 申請日期2004年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月13日
發(fā)明者石雷, 徐艷 申請人:中國科學(xué)院植物研究所