專利名稱：免疫低下的嚙齒類動(dòng)物作為雙色腫瘤模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及免疫低下的轉(zhuǎn)基因嚙齒類動(dòng)物(包括無(wú)胸腺裸鼠)的產(chǎn)生及用途，所述動(dòng)物可被觀察到在多處組織表達(dá)熒光蛋白，并保持它們的免疫低下的狀態(tài)。所述嚙齒類動(dòng)物可用于進(jìn)行細(xì)胞和組織的全身光學(xué)成像(wholebody optical imaging)，包括觀察存在于所述嚙齒類動(dòng)物中的腫瘤及轉(zhuǎn)移，尤其是帶有兩種不同發(fā)射光譜的熒光蛋白的腫瘤。
背景技術(shù)：
不存在底物但存在刺激性照射(stimulating radiation)時(shí)可發(fā)光的熒光蛋白已被用作研究工具多年。了解最多并最先被使用的此種蛋白是從維多利亞發(fā)光水母(Aequorea victoria)分離的綠色熒光蛋白(GFP)，但大量這種蛋白已從其他來(lái)源分離或通過(guò)合成獲得，它們顯示了多種發(fā)射峰值(emissionmaxima)，所以術(shù)語(yǔ)GFP已被用于描述在可見光的全部光譜，包括紅，藍(lán)，和黃中出現(xiàn)的蛋白。見例如Delagrave，S.等，BioTechnology(1995)13151-154；Heim，R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)9112501-12504。已經(jīng)成功修飾了若干生物體來(lái)表達(dá)這些熒光蛋白。所述生物體包括隱形秀麗線蟲(Caenorhabditis elegans)(Chalfie，M.等，Science(1994)263802-805)，黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)(Wang，S.等，Nature(1994)369400-403)，斑馬魚(zebrafish)(Peters，K.G.等，Dev.Biol.(1995)171252-257；Amsterdam，A.等，Dev.Biol.(1995)171123-129)，網(wǎng)柄菌(Dictyostelium)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)(Sheen，J.等，Plant J.(1995)8777-784；Hu，W.，F(xiàn)EBS Lett.(1995)36933-1-334)。
Okabe，等，F(xiàn)EBS Lett.(1997)407313-319，已將野生型GFP插入pCAGGS(包含雞的β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和巨細(xì)胞病毒增強(qiáng)子，β-肌動(dòng)蛋白內(nèi)含子和牛的珠蛋白聚腺苷酸化信號(hào)-Niwa，H.，Gene(1991)108193-199)并產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因小鼠系(Ikawa，M.，F(xiàn)EBS Lett.(1995)375125-128；和Ikawa，M.，Dev.Growth Diff；(1995)37455-459)。盡管觀察到20種以上的這些轉(zhuǎn)基因小鼠品系的肌肉和胰中發(fā)射出明亮的綠光，GFP表達(dá)不是普遍存在的，并且其他組織的光發(fā)射不是肉眼可見的。然而，當(dāng)修飾的形式(EGFP)被用于這種表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，轉(zhuǎn)基因小鼠在整個(gè)機(jī)體(從植入前的胚胎到成熟階段)中表達(dá)EGFP轉(zhuǎn)基因。
與綠色的雄性精子受精的野生型卵子在兩細(xì)胞階段不是綠色的，但在隨后的胚胎發(fā)生階段之后變綠。新生體(Newborn)發(fā)綠色熒光。血管在攜帶EGFP的品系中被歸類為‘明亮的’。這些動(dòng)物的毛發(fā)不是綠色的。轉(zhuǎn)基因小鼠除了毛發(fā)和紅細(xì)胞外為均一的綠色。腦，肝，腎，腎上腺和睪丸，肺，肌肉，心臟，小腸，和脂肪組織，胸腺，脾和睪丸細(xì)胞在用藍(lán)色激發(fā)光照射時(shí)發(fā)綠色熒光。
轉(zhuǎn)基因小鼠品系除了EGFP表達(dá)量顯著以外是正常的；因此EGFP不具有毒性。
本發(fā)明所述顯示熒光的免疫低下的嚙齒類動(dòng)物的一個(gè)實(shí)施例見Yang，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2003)10014259-14262(十一月第25期)報(bào)道。
本文引用的文獻(xiàn)不是為了承認(rèn)它們是確認(rèn)的現(xiàn)有技術(shù)。所有對(duì)于日期的陳述或關(guān)于文件內(nèi)容的描述都是基于申請(qǐng)人能獲得的信息，并非承認(rèn)所述文件的日期和內(nèi)容都是正確的。
發(fā)明概述出于未知原因，免疫低下的轉(zhuǎn)基因嚙齒類動(dòng)物，如無(wú)胸腺的nu/nu小鼠是稀少的。本發(fā)明公開了在此種免疫低下的嚙齒類動(dòng)物中產(chǎn)生熒光蛋白的方法。所得的嚙齒類動(dòng)物可用于細(xì)胞和組織的體內(nèi)成像，尤其作為移植的細(xì)胞或組織(如腫瘤)的受體，可以在轉(zhuǎn)基因嚙齒類動(dòng)物的GFP表達(dá)細(xì)胞和組織的背景下觀察所述細(xì)胞或組織。所以，移植的細(xì)胞或組織表達(dá)可以看得到的指示物(indicator)，例如但不限于另一種熒光蛋白。可通過(guò)與本發(fā)明轉(zhuǎn)基因嚙齒類動(dòng)物的GFP表達(dá)細(xì)胞和組織背景相對(duì)比來(lái)觀察移植的細(xì)胞或組織。所述的移植細(xì)胞或組織可包含腫瘤細(xì)胞或另外是癌性的細(xì)胞，從而可監(jiān)測(cè)它們的生長(zhǎng)性質(zhì)和/或擴(kuò)散。
也可用免疫低下的轉(zhuǎn)基因嚙齒類動(dòng)物來(lái)篩選多種物質(zhì)對(duì)于宿主嚙齒類動(dòng)物組織和移植細(xì)胞或組織之間相互作用的影響。所述物質(zhì)的例子包括調(diào)控宿主-移植物相互作用或調(diào)控所移植的細(xì)胞或組織的生長(zhǎng)和擴(kuò)散的藥物或侯選藥物。
也可用所述嚙齒類動(dòng)物作為表達(dá)GFP的細(xì)胞或組織的來(lái)源來(lái)進(jìn)一步研究和/或移植到其它動(dòng)物或胚胎。可選的，此種移植是一系列移植，并且可以作為一個(gè)實(shí)施方案用來(lái)研究衰老。移植的細(xì)胞可包括胚胎干細(xì)胞和成年干細(xì)胞。
一實(shí)施方案中，表達(dá)GFP的嚙齒類動(dòng)物是無(wú)胸腺的nu/nu小鼠，它是通過(guò)將表達(dá)GFP的小鼠與nu/nu小鼠雜交來(lái)獲得的。然后收集F1代并彼此雜交來(lái)產(chǎn)生后代，其中包括表達(dá)GFP的nu/nu小鼠。然后用來(lái)自F1×F1雜交的表達(dá)GFP的雄性和雌性nu/nu小鼠產(chǎn)生表達(dá)GFP的nu/nu小鼠后代。所得的小鼠可與不表達(dá)GFP的nu/nu小鼠雜交，來(lái)維持表達(dá)GFP的nu/nu小鼠。
用同樣的策略可以得到其他免疫低下的嚙齒類動(dòng)物，如免疫低下的大鼠，其中免疫低下的品系與經(jīng)修飾能表達(dá)熒光蛋白的正常品系雜交。
因此本發(fā)明一方面針對(duì)免疫低下的轉(zhuǎn)基因嚙齒類動(dòng)物，其在基本所有組織中表達(dá)第一種熒光蛋白同時(shí)維持其免疫低下的表型。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明針對(duì)移植了異體(heterologous)組織的此嚙齒類動(dòng)物，所述組織經(jīng)修飾可表達(dá)發(fā)射光譜不同于第一種熒光蛋白的第二種熒光蛋白。另一方面，本發(fā)明針對(duì)轉(zhuǎn)基因嚙齒類動(dòng)物，它在基本所有組織中表達(dá)第一種熒光蛋白的編碼基因，并且它已經(jīng)移植了表達(dá)第二種熒光蛋白的異體組織，該第二種熒光蛋白與所述第一種熒光蛋白發(fā)射光譜不同。
本發(fā)明另一方面涉及通過(guò)與嚙齒類動(dòng)物接觸來(lái)分析藥物對(duì)腫瘤宿主相互作用的影響的方法，該嚙齒類動(dòng)物表達(dá)第一種熒光蛋白且攜帶表達(dá)顏色不同的第二種熒光蛋白的腫瘤細(xì)胞，該方法包括使所述嚙齒類動(dòng)物與藥物或方案(protocol)接觸，并觀察對(duì)宿主中包含的腫瘤細(xì)胞的作用。
附圖簡(jiǎn)述


圖1是植入免疫低下的小鼠后常位(orthotopically)生長(zhǎng)的人結(jié)腸癌的全身成像。該腫瘤表達(dá)紅色熒光蛋白，宿主顯示出發(fā)綠光的熒光蛋白的全身表達(dá)。
圖2A-2D顯示了免疫低下的宿主中巨噬細(xì)胞的實(shí)時(shí)相互作用，所述巨噬細(xì)胞用綠色熒光蛋白標(biāo)記，癌細(xì)胞用紅色熒光標(biāo)記。該圖顯示了初始接觸(圖2A)，吞沒(engulfment)(2B)，巨噬細(xì)胞中吞沒的癌細(xì)胞(2C)，及被巨噬細(xì)胞消化的癌細(xì)胞(2D)。
圖3顯示了本發(fā)明轉(zhuǎn)基因小鼠與非轉(zhuǎn)基因裸鼠的對(duì)比。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及表達(dá)GFP的免疫低下的嚙齒類動(dòng)物如無(wú)胸腺的nu/nu小鼠以及其制備方法和用途。所述嚙齒類動(dòng)物在基本所有組織中表達(dá)GFP，優(yōu)選其水平使其發(fā)射的光可被肉眼看見。所述嚙齒類動(dòng)物是免疫低下的(例如無(wú)胸腺的nu/nu小鼠)，并可用作例如接受人腫瘤組織或其他異種移植物的宿主。
用與本文所述類似的技術(shù)，可得到表達(dá)GFP的其他免疫低下的嚙齒類動(dòng)物，如大鼠。
為了方便，術(shù)語(yǔ)“GFP”不僅用作呈現(xiàn)綠色的熒光蛋白的首字母縮寫，而且一般用作能夠應(yīng)偶然的(incident)激發(fā)照射而發(fā)光的任何顏色的熒光蛋白的首字母縮寫。從上下文可清楚知道GFP是用來(lái)表示一般意義還是用來(lái)指代事實(shí)上發(fā)射綠色熒光的蛋白。
這里所用的“GFP”指發(fā)射任意波長(zhǎng)的熒光蛋白以及GFP和維多利亞水母綠色熒光蛋白的“增強(qiáng)”形式。移植細(xì)胞或組織帶有可以觀察到的指示物，如熒光染料，如本領(lǐng)域所公知的那樣，通過(guò)進(jìn)行選擇，可以使移植細(xì)胞或組織中所用的熒光蛋白與宿主表達(dá)的熒光蛋白顏色不同。作為非限制的例子，如果綠色GFP在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因嚙齒類動(dòng)物中表達(dá)，那么移植的細(xì)胞或組織可表達(dá)紅色熒光蛋白(RFP)。
另外，在移植多種細(xì)胞或組織時(shí)，本發(fā)明提供用不同顏色進(jìn)行標(biāo)記的方法，使得可以觀察和/或同步跟蹤細(xì)胞或組織。其他熒光顏色的非限制性例子包括黃色，藍(lán)色和紅外(far-red)。其他熒光指示物的表達(dá)可選特異于細(xì)胞種類，基因或過(guò)程(processs)。提供此種特異性方法的非特異性例子包括，可操作連接編碼熒光指示物的序列，使其受如下啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)控制，所述啟動(dòng)子包括，細(xì)胞特異性啟動(dòng)子，對(duì)具體激活事件有反應(yīng)的啟動(dòng)子，調(diào)節(jié)具體目標(biāo)基因表達(dá)的啟動(dòng)子，和調(diào)節(jié)與目標(biāo)細(xì)胞過(guò)程有關(guān)的基因產(chǎn)物表達(dá)的啟動(dòng)子。
也可用免疫低下的嚙齒類動(dòng)物作為表達(dá)GFP的細(xì)胞和/或組織的來(lái)源。所述組織的非限制性例子包括胚胎或胚胎組織；干細(xì)胞，和腦，肝，腎，腎上腺，睪丸(包括睪丸細(xì)胞)，肺，肌肉，心，小腸，卵巢和脾的細(xì)胞或組織以及脂肪組織。
對(duì)經(jīng)過(guò)修飾包含與宿主熒光蛋白發(fā)射光譜不同的熒光蛋白的組織進(jìn)行移植，也可用具有免疫能力的受試者在有限范圍進(jìn)行。為了在具有免疫能力的受試者中進(jìn)行這方面的本發(fā)明，被移植的組織必須是同系的(syngeneic)，或者觀察必須限于對(duì)免疫反應(yīng)或其他反應(yīng)，包括移植物排斥的短期研究。
本發(fā)明表達(dá)GFP的免疫低下的轉(zhuǎn)基因嚙齒類動(dòng)物可用于，按照Yang等(“Visualizing Gene Expression by Whole-Body Fluorescence Imaging.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)9712278-12282)所述方式，觀察基因表達(dá)，該文獻(xiàn)描述了通過(guò)非侵入性技術(shù)觀察完整動(dòng)物中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。此系統(tǒng)允許在完整活體小鼠的主要器官中快速觀察轉(zhuǎn)基因表達(dá)，它簡(jiǎn)單，迅速并且經(jīng)濟(jì)上可承受(eminently affordable)。在GFP轉(zhuǎn)基因背景下，一種具有不同顏色的熒光蛋白在腦，肝，胰，前列腺和骨等的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并且它的熒光記錄(encoded)在全身光學(xué)影像中。作為非限制的例子，較高分辨率的成像可用透視表面熒光解剖顯微鏡(trans-illuminated epifluorescence dissecting microscope)來(lái)進(jìn)行，并且低分辨率的成像可采用熒光盒進(jìn)行，并用經(jīng)熱電冷卻的顏色電荷-關(guān)聯(lián)(color charge-coupled)裝置相機(jī)直接觀察，或使用較簡(jiǎn)單的基于LED的裝置。
本發(fā)明提供攜帶待測(cè)表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因熒光嚙齒類動(dòng)物，其是將表達(dá)型載體攜帶的編碼熒光蛋白的核酸(例如但不限于8×1010噬斑形成單位/ml的編碼熒光蛋白的腺病毒表達(dá)系統(tǒng)，其在20-100μl PBS和10％甘油中)直接注射到組織如腦，肝，胰，前列腺，或骨髓中來(lái)提供的。注射后5-8小時(shí)內(nèi)，組織如腦中表達(dá)的GFP的熒光變?yōu)榭梢杂^察，以視頻速度(video rates)記錄全身成像。GFP的熒光持續(xù)增加至少12小時(shí)，并在組織如肝中保持可檢測(cè)狀態(tài)最多達(dá)4個(gè)月。實(shí)時(shí)記錄可以在不需要外源對(duì)比物質(zhì)(其中載體編碼的GFP與嚙齒類動(dòng)物組織中表達(dá)的GFP不同)，放射性底物，或長(zhǎng)時(shí)期加工的條件下進(jìn)行。此方法僅需將表達(dá)的待測(cè)編碼序列或啟動(dòng)子與載體攜帶的GFP融合或可操作連接，來(lái)研究適當(dāng)標(biāo)記的基因在相對(duì)不透明的生物體，或如本文一樣，在熒光嚙齒類動(dòng)物中的治療和診斷潛力。
另一方面，也可按Yang等(″Whole-Body Optical Imaging of GreenFluorescent Protein-Expressing Tumors and Metastases，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)971206-1211)所述方式給轉(zhuǎn)基因嚙齒類動(dòng)物成像并應(yīng)用，該文獻(xiàn)描述了全身光學(xué)成像系統(tǒng)。此種系統(tǒng)首次可在完整動(dòng)物內(nèi)連續(xù)觀察監(jiān)控細(xì)胞生長(zhǎng)和擴(kuò)散，包括被移植的(及任選的癌性的)細(xì)胞或組織所表現(xiàn)的那些，它們?cè)诒景l(fā)明中用表達(dá)的具有不同顏色的GFP標(biāo)記。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，熒光嚙齒類動(dòng)物包含在活體嚙齒類動(dòng)物中生長(zhǎng)并轉(zhuǎn)移的被移植的發(fā)熒光腫瘤。這些腫瘤的非限制例子包括如Yang等(如上述)所述穩(wěn)定表達(dá)很高水平GFP的人和嚙齒類動(dòng)物的腫瘤。所用的腫瘤表達(dá)除嚙齒類宿主中表達(dá)的GFP以外的GFP。如上指出，本發(fā)明免疫低下的熒光嚙齒類動(dòng)物優(yōu)選此方法，從而使對(duì)宿主的雙標(biāo)記能維持很長(zhǎng)時(shí)間；然而，對(duì)于短期研究或用同系腫瘤來(lái)做的研究，例如將嚙齒類動(dòng)物腫瘤植入嚙齒類動(dòng)物，甚至可以用具有免疫能力的轉(zhuǎn)基因熒光嚙齒類動(dòng)物。
作為非限制的例子，將B16F0-GFP小鼠的黑色素瘤細(xì)胞注射到6周齡的免疫低下的熒光嚙齒類動(dòng)物的尾靜脈或門靜脈。用全身光學(xué)成像來(lái)顯示轉(zhuǎn)移的損傷如在腦，肝和骨中產(chǎn)生的損傷。B16F0-GFP細(xì)胞易于觀察，從而可以在這些器官的每一個(gè)中實(shí)時(shí)、定量測(cè)量腫瘤生長(zhǎng)。
另一非限制的例子中，可通過(guò)手術(shù)常位植入AC3488-GFP人結(jié)腸癌。用全身光學(xué)成像來(lái)實(shí)時(shí)顯示原發(fā)結(jié)腸癌的生長(zhǎng)及其在肝和骨骼中的轉(zhuǎn)移損傷。
本發(fā)明也提供用免疫低下的熒光嚙齒類動(dòng)物來(lái)鑒定或篩選癌癥生長(zhǎng)的調(diào)控物質(zhì)的方法。一實(shí)施方案中，這些方法可用來(lái)鑒定潛在的化療物質(zhì)的抑制作用。所以，本發(fā)明在免疫低下的熒光嚙齒類動(dòng)物中的腫瘤發(fā)展模型是通過(guò)植入，優(yōu)選常位植入腫瘤的癌細(xì)胞或完整節(jié)片(intact portion)來(lái)建立的，該腫瘤表達(dá)與轉(zhuǎn)基因宿主所提供的背景的發(fā)射波長(zhǎng)不同的熒光蛋白。一旦建立了模型，給予宿主侯選化療物質(zhì)或方案，并直接觀察其對(duì)腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移的影響。
也可用免疫低下的熒光嚙齒類動(dòng)物獲得有關(guān)血管生成事件的影像，方法按Yang等(″Whole-Body and Intravital Optical Imaging of Angiogenesis inOrthotopically Implanted Tumors，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2001)982616-2621)所述。所以本發(fā)明也提供了腫瘤誘導(dǎo)的血管形成的分析方法。這些方法通過(guò)將用GFP標(biāo)記的腫瘤植入熒光嚙齒類動(dòng)物，可以作為測(cè)量血管生成事件的常位移植模型的一種適應(yīng)。使用與宿主GFP發(fā)出的顏色不同的GFP，通過(guò)體內(nèi)(intravitally)檢查或通過(guò)全身發(fā)光(luminence)實(shí)時(shí)檢查，宿主的表達(dá)GFP的毛細(xì)血管對(duì)比腫瘤的熒光清楚可見。這優(yōu)選用人的腫瘤來(lái)進(jìn)行，從而可對(duì)常位植入的人胰腺腫瘤進(jìn)行活體成像，以此顯示，在本發(fā)明免疫低下且被標(biāo)記的宿主中，在原發(fā)和轉(zhuǎn)移位置經(jīng)血管生成事件而生成的毛細(xì)血管。在19天內(nèi)，在單個(gè)嚙齒動(dòng)物中，對(duì)常位生長(zhǎng)的人前列腺腫瘤做階段性體內(nèi)成像，可確定血管生成事件的定量時(shí)間變化。
例如，通過(guò)將發(fā)熒光的Lewis肺癌細(xì)胞注射到足墊的皮下位置，可顯示腫瘤血管生成事件的全身光學(xué)成像。所述足墊相對(duì)透明，帶有相對(duì)較少的血管，從而可對(duì)完整動(dòng)物中的腫瘤血管生成(如通過(guò)增加毛細(xì)血管密度而實(shí)施的血管生成)進(jìn)行定量成像。
另一實(shí)施方案中，表達(dá)GFP的人乳腺腫瘤MDA-MB-435可常位植入脂肪墊，然后對(duì)其成像來(lái)線性檢測(cè)血管密度在延長(zhǎng)的時(shí)間段(如最長(zhǎng)達(dá)到或超過(guò)20周)內(nèi)的改變，尤其是增加。也可用這些有效的并且與臨床相關(guān)的血管生成型裸鼠模型，實(shí)時(shí)體內(nèi)評(píng)估在生理微環(huán)境中抑制或促進(jìn)腫瘤血管生成的物質(zhì)，其可如上述，通過(guò)觀察所述物質(zhì)對(duì)血管生成的影響來(lái)進(jìn)行。
另一方面，本發(fā)明嚙齒類動(dòng)物可用與Yang等(″Direct External Imaging ofNascent Cancer，Tumor Progression，Angiogenesis，and Metastasis on InternalOrgans in the Fluorescent Orthotopic Model，″Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2002)993824-3829)所述類似的方式來(lái)應(yīng)用，來(lái)克服外部成像靈敏度的局限，該局限是由于干擾組織(intervening tissue)，最尤其是皮膚使光散射造成的。因此本發(fā)明提供在光通路中造成皮瓣(skin-flap)來(lái)明顯降低信號(hào)衰減并提高檢測(cè)靈敏度很多倍。組織的可觀察深度明顯增加，并且現(xiàn)在可清楚觀察很多以前隱藏的腫瘤。
所述皮瓣可以可逆地打開和閉合。一般在麻醉動(dòng)物后，在皮膚上作弧形切口并剝離皮下結(jié)締組織以便使皮瓣游離。可通過(guò)縫合來(lái)閉合該瓣。因此本發(fā)明使得可以對(duì)于腫瘤模型系統(tǒng)的內(nèi)在器官進(jìn)行觀察。
直接通過(guò)打開的皮瓣觀察標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞的能力很大程度地增強(qiáng)了本發(fā)明模型系統(tǒng)的靈敏度和分辨率。所述模型可簡(jiǎn)單用于監(jiān)測(cè)狀況進(jìn)展或用作工具來(lái)評(píng)估潛在的治療劑(therapeutics)，以及評(píng)估效果，所述效果有可能比不治療導(dǎo)致更差的結(jié)果。本發(fā)明中，提供了化合物和/或方案來(lái)測(cè)試動(dòng)物并與不存在所述化合物和/或方案的對(duì)照比較。在這些實(shí)驗(yàn)條件存在時(shí)的腫瘤發(fā)展、血管生成和/或轉(zhuǎn)移的增強(qiáng)，表明所述化合物和/或方案對(duì)受試者有害；類似地，對(duì)任何這些性質(zhì)的抑制可以導(dǎo)致將所述化合物和/或方案鑒定為潛在的治療劑。
一個(gè)實(shí)施方案中，將表達(dá)熒光蛋白的單個(gè)的腫瘤細(xì)胞通過(guò)頭皮皮瓣接種在腦影像上。代表少數(shù)細(xì)胞的肺腫瘤微聚焦(microfoci)通過(guò)胸壁上的皮瓣來(lái)觀察，而對(duì)側(cè)的(contralateral)微轉(zhuǎn)移通過(guò)相應(yīng)的皮瓣來(lái)成像。胰的腫瘤及它們的血管生成性微血管借助于腹膜壁皮瓣成像。肝部的皮瓣可以允許對(duì)源于常位植入腫瘤的生理相關(guān)微轉(zhuǎn)移成像。由門內(nèi)注射(intraportal injection)造成的肝部單個(gè)的腫瘤細(xì)胞也可檢測(cè)到。表達(dá)兩種不同的GFP的細(xì)胞或組織，如宿主組織與移植組織或兩種移植組織，也可通過(guò)使用皮瓣來(lái)觀察。尤其優(yōu)選的是使用下腹部皮瓣來(lái)觀察前列腺組織或周圍區(qū)域。
為帶有GFP的移植物提供細(xì)胞或組織的方法是已知的?？捎脴?biāo)準(zhǔn)方法提供帶有一種或更多種熒光蛋白的表達(dá)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞?？蓪⑺黾?xì)胞體外轉(zhuǎn)導(dǎo)并在體外或體內(nèi)生長(zhǎng)成腫瘤，再將所得腫瘤移植到模型受試者。所述細(xì)胞可被注射或可通過(guò)手術(shù)移植。當(dāng)需要腫瘤進(jìn)展的模型時(shí)，優(yōu)選外科常位移植。但也可使用其他提供帶有經(jīng)修飾的腫瘤細(xì)胞的模型的方法，所述經(jīng)修飾的腫瘤細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)熒光蛋白。另外，可提供帶有病毒載體，尤其是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的本發(fā)明攜帶內(nèi)源性腫瘤或引入的腫瘤的嚙齒類動(dòng)物來(lái)表達(dá)GFP蛋白，該蛋白發(fā)出的光與宿主內(nèi)已存在的腫瘤被感染后該宿主所發(fā)出的光不同。這尤其與易感染腫瘤的哺乳動(dòng)物模型相關(guān)，所述模型如美國(guó)專利4,736,866所述的“癌小鼠(oncomouse)”。此載體優(yōu)選被局部地并直接地引入已經(jīng)存在的腫瘤。
一般，依賴于對(duì)熒光發(fā)射的觀察的任何關(guān)于腫瘤發(fā)展、血管生成和/或轉(zhuǎn)移的模型可采用本發(fā)明熒光嚙齒類動(dòng)物和方法。
很多例子中，用單色來(lái)觀察單一腫瘤的轉(zhuǎn)移。但是本發(fā)明方法包括同時(shí)觀察兩種或更多腫瘤，其每一個(gè)都用不同顏色的熒光蛋白來(lái)標(biāo)記。用此方法，不僅能對(duì)多個(gè)腫瘤的發(fā)展進(jìn)行觀察，而且可直接觀察到每種腫瘤對(duì)其他腫瘤的影響或干擾。
本發(fā)明的方法有多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)。首先，增強(qiáng)的靈敏度允許在熒光宿主細(xì)胞和組織的背景中觀察僅一個(gè)或兩個(gè)移植細(xì)胞。第二，可直接觀察血管生成，這對(duì)于評(píng)估提議的化合物和方案的治療有效性極為重要。第三，可以同時(shí)觀察多個(gè)移植組織(如腫瘤)。這一點(diǎn)特別重要，因?yàn)楦鱾€(gè)組織或腫瘤之間有干擾現(xiàn)象。由于可使用多種不同顏色，因而可直接觀察不同組織或腫瘤的相互作用。第四，因?yàn)榭梢栽诿庖叩拖碌臒晒鈬X類動(dòng)物中在相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行觀察，故可區(qū)分活躍增殖的細(xì)胞和休眠的細(xì)胞。因此，用本發(fā)明方法可確定休眠細(xì)胞的存在。
另一方面，可給熒光宿主注射可檢測(cè)的，優(yōu)選可視的化合物，從而在裸鼠組織的GFP背景下產(chǎn)生圖像。非限制的例子是，將可視的指示物，如染料注射到本發(fā)明小鼠的血流中，以便觀察所有或部分的循環(huán)系統(tǒng)。這尤其合適于嚙齒動(dòng)物的紅細(xì)胞不表達(dá)可視GFP的情況，這時(shí)血流不發(fā)射可檢測(cè)的光。
如下例子是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明而不是為了限制。
實(shí)施例1產(chǎn)生表達(dá)GFP的裸鼠C-57 B6-GFP小鼠(Okabe，M.等，F(xiàn)EBS Lett(1997)467313-319)與nu/nu小鼠雜交。所述C-57/B6-GFP小鼠得自O(shè)saka大學(xué)的微生物疾病研究院(Research Institute for Microbial Diseases)。這些小鼠表達(dá)維多利亞發(fā)光水母(A.victoria)GFP，其受雞beta-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和CMV增強(qiáng)子控制。除紅細(xì)胞及毛發(fā)以外的所有組織在激發(fā)光下都發(fā)綠色熒光。
收集F1代并彼此雜交。得到一雌一雄兩只稀有的GFP nu/nu小鼠。讓GFP nu/nu雄鼠和GFP nu/nu雌鼠彼此雜交得到一窩6只GFP nu/nu小鼠。
GFP nu/nu雄鼠與雌性nu/nu非GFP小鼠雜交。得到九只nu/nu裸鼠后代。它們均在組織中表達(dá)熒光。見圖3，它對(duì)比了非GFP nu/nu和GFP nu/nu小鼠。
實(shí)施例2產(chǎn)生帶紅色熒光蛋白的腫瘤將紅色熒光蛋白(RFP)，DsRed2(Clontech)插入pLNCX2(Clontech)的EglI和NotI位點(diǎn)。
將飽和量的所得載體pLNCX2-DsRed2與DOTAP試劑(BoehringerMannheim)和匯合度70％的PT67包裝細(xì)胞的沉淀混合物溫育18小時(shí)。PT67細(xì)胞是NIH 3T3-衍生且表達(dá)10A1病毒包膜的包裝細(xì)胞系，它在補(bǔ)充了10％熱滅活FBS的DMEM(Irvine Scientific)中培養(yǎng)。此時(shí)補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，通過(guò)熒光顯微鏡檢查細(xì)胞。為選擇產(chǎn)生高滴度逆轉(zhuǎn)錄病毒上清、并發(fā)明亮熒光的細(xì)胞，將表達(dá)RFP的包裝細(xì)胞在存在500-2,000μg/ml逐步增加的G418(Life Technologies，Grand Island，NY)時(shí)培養(yǎng)7天。
將PT67細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清和RPMI 1640或含10％FBS(GeminiBiological Products)的其他培養(yǎng)基(GIBCO)的1∶1沉淀混合物與匯合度20％的所需腫瘤細(xì)胞系溫育72小時(shí)。此時(shí)補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，用胰蛋白酶/EDTA收獲腫瘤細(xì)胞并以比率1∶15在選擇性培養(yǎng)基中再次培養(yǎng)，該選擇性培養(yǎng)基包含50μg/ml的G418。為選擇發(fā)明亮熒光的細(xì)胞，將G418的水平逐步增加到800μg/ml。用胰蛋白酶/EDTA和克隆柱(Bel-Art Products)分離表達(dá)RFP的克隆，并用常用培養(yǎng)方法在無(wú)選擇性物質(zhì)時(shí)將其擴(kuò)增并轉(zhuǎn)移。
如此獲得的腫瘤細(xì)胞為紅色熒光細(xì)胞，包括如下嚙齒類動(dòng)物B16F0黑色素瘤細(xì)胞；小鼠MMT060562乳房腫瘤細(xì)胞；小鼠Dunning前列腺癌細(xì)胞；人PC-3前列腺癌細(xì)胞；和人HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞。
實(shí)施例3腫瘤進(jìn)展的雙標(biāo)記模型HCT-116-RFP-即標(biāo)記了紅色熒光蛋白的人結(jié)腸癌細(xì)胞用胰蛋白酶消化法收獲，用冷的無(wú)血清培養(yǎng)基洗三次并用無(wú)血清RPMI培養(yǎng)基1640重懸。通過(guò)左下腹切口來(lái)暴露結(jié)腸，將所述細(xì)胞在收獲40分鐘內(nèi)注射到實(shí)施例1制備的6周齡轉(zhuǎn)基因雌性GFP裸鼠中。用25μl注射器將50μl的106HCT-116-RFP細(xì)胞注射到降結(jié)腸的漿膜以下。腹壁的切口用6-0外科手術(shù)縫線進(jìn)行單層縫合。手術(shù)過(guò)程中所述動(dòng)物一直被克他命(ketamine)麻醉。
在用470nm的纖維光學(xué)發(fā)光(Lightools Research，Encinitas，CA)所照射的熒光盒子中進(jìn)行全身成像。通過(guò)長(zhǎng)通濾過(guò)器(long-pass filter)GG475(ChromaTechnology，Brattleboro，VT)在Hamamatsu C5810三-片(three-chip)冷色CCD相機(jī)(Hamamatsu Photonics，Bridgewater，NJ.)上收集發(fā)射的熒光。直接在IBMPC上捕捉1,024/724像素的高分辨率影像，用Image Pro Plus 3.1軟件(MediaCybernetics，Silver Spring，MD)對(duì)影像的對(duì)比度和亮度進(jìn)行加工并分析。
圖1顯示了植入后10周常位生長(zhǎng)的HCT-116-RFP人結(jié)腸癌的全身影像。該影像用CCD相機(jī)在熒光盒子中獲得。如所示，此系統(tǒng)可容易地區(qū)分腫瘤和宿主。
實(shí)施例4巨噬細(xì)胞與前列腺腫瘤的相互作用用胰蛋白酶消化法收獲PC-3-RFP，即標(biāo)記了紅色熒光蛋白的人前列腺癌細(xì)胞，用冷的含血清培養(yǎng)基洗三次，并置于冰上。在40分鐘內(nèi)將30μl的106個(gè)細(xì)胞注射到實(shí)施例1中獲得的免疫低下的小鼠的膀胱和前列腺中，其過(guò)程如下作下腹中線切口，將膀胱和前列腺暴露；注射后用6-0外科手術(shù)縫線將切口閉合，所述動(dòng)物一直被異氟烷(isoflurane)麻醉。
為了觀察，將新鮮組織切成大約1mm3的片并壓到玻片上作熒光顯微鏡檢。在顯微觀察中，用裝配了100-W汞燈電源的Olympus BH 2-RFCA熒光顯微鏡同時(shí)觀察GFP和RFP的熒光。通過(guò)D425/60集束濾過(guò)器(bind passfilter)，470 DCXR二向色反射鏡產(chǎn)生激發(fā)光。通過(guò)長(zhǎng)通濾過(guò)器GG475(ChromaTechnology)收集發(fā)射的熒光。用Hamamatsu C5810三-片冷色CCR相機(jī)(Hamamatsu Photonics)捕捉1,024/724像素的高分辨率影像并直接儲(chǔ)存在IBM PC中。用Image Pro Plus 3.1軟件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)加工影像的對(duì)比度和亮度并分析。
通過(guò)轉(zhuǎn)基因裸鼠發(fā)出的綠色熒光，可以顯示巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互作用，見圖2。植入35天后拍攝了此圖像。A圖顯示了接觸RFP癌細(xì)胞的宿主GFP巨噬細(xì)胞；B圖顯示了GFP巨噬細(xì)胞正在吞沒RFP癌細(xì)胞；C圖顯示了被GFP巨噬細(xì)胞吞沒的RFP癌細(xì)胞，D圖顯示了被巨噬細(xì)胞最后消化了的RFP癌細(xì)胞。
實(shí)施例5研究發(fā)出熒光、并具有免疫能力的小鼠當(dāng)應(yīng)用同系的移植物時(shí)，用雙色成像對(duì)具有免疫能力的受試者進(jìn)行短期研究。在Okabe描述的鼠模型中產(chǎn)生了C57/B6-GFP小鼠。用106個(gè)表達(dá)RFP的小鼠B16F0黑色素瘤細(xì)胞，106個(gè)表達(dá)RFP的小鼠MMT060562乳房腫瘤細(xì)胞和106個(gè)表達(dá)RFP的Dunning(大鼠)前列腺癌細(xì)胞進(jìn)行研究。用這些技術(shù)，可在注射B16F10-RFP黑色素瘤細(xì)胞后3周觀察到活體腫瘤組織中的血管生成，并且也可觀察到宿主樹突細(xì)胞和新鮮腫瘤組織中的腫瘤細(xì)胞的相互作用。在乳腺癌模型中可觀察到淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。
因此可以觀察到腫瘤血管發(fā)生早期事件以及免疫系統(tǒng)與移植腫瘤相互作用的雙色影像。
權(quán)利要求
1.免疫低下的轉(zhuǎn)基因嚙齒類動(dòng)物，其在基本所有組織中表達(dá)第一種熒光蛋白，并維持其免疫低下的表型。
2.權(quán)利要求1的嚙齒類動(dòng)物，其為小鼠。
3.權(quán)利要求2的小鼠，其為nu/nu小鼠。
4.權(quán)利要求1的嚙齒類動(dòng)物，其移植了異體組織，所述組織被修飾以表達(dá)第二種熒光蛋白，該第二種熒光蛋白與第一種熒光蛋白發(fā)射光譜不同。
5.權(quán)利要求4的嚙齒類動(dòng)物，其中所述第一種熒光蛋白為綠色，且第二種熒光蛋白為紅色。
6.權(quán)利要求4的嚙齒類動(dòng)物，其中所述異體組織包含腫瘤細(xì)胞。
7.權(quán)利要求6的嚙齒類動(dòng)物，其中所述腫瘤細(xì)胞被常位移植到所述嚙齒類動(dòng)物中。
8.權(quán)利要求7的嚙齒類動(dòng)物，其中所述腫瘤細(xì)胞是腫瘤的完整節(jié)片。
9.藥物對(duì)腫瘤-宿主相互作用的影響的分析方法，其包括將權(quán)利要求6的嚙齒類動(dòng)物與所述藥物接觸，通過(guò)觀察所述第一種和第二種熒光蛋白的發(fā)射獲得腫瘤-宿主細(xì)胞相互作用的影像，并將所得影像與不接觸所述藥物的嚙齒類動(dòng)物比較。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述觀察是獲得完整動(dòng)物活體的全身影像。
11.轉(zhuǎn)基因嚙齒類動(dòng)物，其在基本所有組織中表達(dá)第一種熒光蛋白的編碼基因，并且其已經(jīng)移植了表達(dá)與所述第一種熒光蛋白發(fā)射光譜不同的第二種熒光蛋白的異體組織。
12.權(quán)利要求11的嚙齒類動(dòng)物，其為小鼠。
13.權(quán)利要求11的嚙齒類動(dòng)物，其中所述第一種熒光蛋白為綠色且第二種熒光蛋白為紅色。
14.權(quán)利要求11的嚙齒類動(dòng)物，其中所述異體組織包含同系的腫瘤細(xì)胞。
15.權(quán)利要求14的嚙齒類動(dòng)物，其中所述腫瘤細(xì)胞被常位移植到所述嚙齒類動(dòng)物中。
16.權(quán)利要求15的嚙齒類動(dòng)物，其中所述腫瘤細(xì)胞是腫瘤的完整節(jié)片。
17.藥物對(duì)腫瘤-宿主相互作用的影響的分析方法，其包括將權(quán)利要求11的嚙齒類動(dòng)物與所述藥物接觸，通過(guò)觀察所述第一種和第二種熒光蛋白的發(fā)射獲得腫瘤-宿主細(xì)胞相互作用的影像，并將所得影像與不接觸所述藥物的嚙齒類動(dòng)物比較。
18.權(quán)利要求17的方法，所述觀察是獲得完整動(dòng)物活體的全身影像。
19.繁殖表達(dá)第一種熒光蛋白的細(xì)胞或組織的方法，其包括從權(quán)利要求1的嚙齒類動(dòng)物分離組織并將它們移植到另一個(gè)動(dòng)物或胚胎中。
20.權(quán)利要求19的方法，其還包括一系列的再分離和再移植，所述再移植是將所述組織移植到另一動(dòng)物或胚胎中。
全文摘要
本發(fā)明描述免疫低下的嚙齒類動(dòng)物，其經(jīng)過(guò)修飾在基本所有組織中表達(dá)熒光蛋白。這些嚙齒類動(dòng)物可用作基因表達(dá)，腫瘤進(jìn)展和血管生成的模型。本發(fā)明也提供了模型系統(tǒng)，其中發(fā)射第一種顏色的熒光的異體組織被移植到宿主，該宿主經(jīng)過(guò)修飾在基本所有組織中發(fā)射第二種顏色的熒光。
文檔編號(hào)A01K67/027GK1947006SQ200480009199
公開日2007年4月11日 申請(qǐng)日期2004年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月7日
發(fā)明者楊萌, 埃利吉奧·雷諾斯, 徐明旭, 姜平 申請(qǐng)人:抗癌公司