專利名稱：所需蛋白在植物根系及細胞培養(yǎng)物中的表達的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種重組表達盒以及在根系和植物細胞培養(yǎng)物中或通過其分泌生產蛋白的方法。
背景技術：
植物根系適合于從土壤中吸收水分和營養(yǎng)物質，并為整個植株適宜的生長和發(fā)育提供這些必需的組分。植物根系還執(zhí)行特殊的功能，從而有助于總的植物的產量，對于塊根或塊莖作物來說，植物根系組成主要的植物產量。雖然根系的增殖生長由細胞周期調控來決定，而且細胞周期蛋白的表達或者例如乙烯和植物生長激素的植物激素能夠促進根系的生長，但是其他的調控因子對于新的根系生長似乎也是必需的。
啟動子的強度和特異性是內源性基因表達的特征，并且對于異源基因表達的基因工程來說十分重要。有限數(shù)量的啟動子允許高水平的轉基因表達，通常通過在所有類型的組織中普遍存在的組成型表達來實現(xiàn)?；ㄒ嘶ㄈ~病毒(CaMV)35S啟動子是一種具備上述特征的啟動子并且得到了極其廣泛的應用，但是很少比較用于轉基因表達的不同組成型啟動子。盡管已經鑒定出根系的多種組織特異性基因，但是對啟動子元件的分析和鑒定并未顯示出它們在產生廣泛的根系表達方面具有統(tǒng)一的模式。根系生長和形態(tài)發(fā)生的細胞和發(fā)育機制已經在擬南芥中得到了有效地闡明。然而，有關用于廣泛的根系特異性表達的組成型啟動子的信息仍然較少。
已經克隆了紫花苜蓿MsPRP2的基因組序列(Deutch和Winicov，1995)以及啟動子區(qū)(Bastola et al.，1998)。該MsPRP2基因編碼一個前端帶有信號序列的細胞壁蛋白，其轉錄產物以根系特異性方式表達。在正常生長狀態(tài)下，MsPRP2的轉錄產物在根系和愈傷組織中組成型表達。另外，MsPRP2的啟動子包含與紫花苜蓿根系特異性轉錄因子Alfin1結合的序列(Bastola et al.，1998)。Alfin1在轉基因紫花苜蓿中的過表達，使得內源性MsPRP2基因在根系中受其自身啟動子調控的表達增加，而在葉和莖中沒有出現(xiàn)這種情況(Winicov和Bastola，1999)，這與MsPRP2啟動子在根系中起作用是一致的。Alfin1和MsPRP2的過表達使轉基因紫花苜?？偟母瞪L加強(Winicov，2000)。
為引入農藝或環(huán)境上需要的特征以及產生需要的生物藥物和營養(yǎng)藥物的植物基因工程已經通過使用某些調控基因而實現(xiàn)。植物基因工程被越來越多地用于農業(yè)，從而使植物能夠抵御各種脅迫和害蟲、提高產量并增加特定的用以強化農產品的性狀。植物中營養(yǎng)藥物的潛在形式，例如高水平的天然維生素、它們的前體或其他有益的有機化合物，似乎無限制地被人類和動物消耗。最近，在醫(yī)藥分子農業(yè)的進展方面的熱點是從植物中生產生物藥物、抗體和可食用疫苗(Daniell等，2001)。正在對植物細胞和組織培養(yǎng)物進行生物工程處理，從而表達具有商業(yè)價值的分子。
對于成功導入并表達異源基因來說，最重要的因素之一是構建在任何轉基因構建體中的啟動子的強度和特異性，因為這對轉基因的高水平表達來說是至關重要的。目前，只有極少數(shù)啟動子可以用于轉基因植物的開發(fā)。最高水平的表達通常通過在所有的組織中普遍表達來實現(xiàn)。大多數(shù)基于上述目的的轉基因構建體采用源自病毒的啟動子來實現(xiàn)高水平表達，而高水平表達是轉基因植物成功用于其特定目的所需的。
已經克隆了基因的轉錄產物，并且在耐鹽紫花苜蓿的細胞中增強，也在整株植物中用鹽在mRNA水平上誘導。一個是Alfinl，它編碼一個可能的鋅指調控蛋白(Winicov，1993)。另一個是MsPRP2，它是一個單拷貝基因，編碼一個具有富含疏水半胱氨酸的羧基末端的蛋白，該羧基末端可以作為細胞壁和膜之間的接頭分子(Winicov和Deutch，1994；Deutch和Winicov，1995)。有趣的是，這兩個基因主要都在根系表達，而且當植物在87或171mm NaCl中連續(xù)生長時，MsPRP2也具有很強的鹽誘導性。Alfinl是MsPRP2啟動子的一個轉錄因子。

發(fā)明內容
已經發(fā)現(xiàn)，Alfinl基因和MsPRP2啟動子是紫花苜?；蚪M中的一對調控基因，它們能夠強烈促進自身基因的表達。
一種用于指導異源蛋白在植物根系中表達的新的表達盒，至少包括兩個部分編碼MsPRP2啟動子或其片段的核苷酸，它含有SEQ IDNO1中的部分；含有編碼異源蛋白的基因的核苷酸，與該MsPRP2核苷酸有效連接。一個能夠指導異源蛋白在植物根系中表達的表達盒包括a)編碼MsPRP2啟動子或其片段的核苷酸；b)任選地編碼一個核糖體結合位點的核苷酸；c)任選地編碼一個分泌信號的核苷酸；d)編碼一個異源蛋白的核苷酸，所述蛋白的核苷酸與該MsPRP2啟動子有效連接。該表達盒進一步包括編碼轉錄因子Alfinl的核苷酸；Alfinl核苷酸與另一個啟動子有效連接，從而該另一個啟動子能夠引起轉錄因子Alfinl的過表達。同時公開的還有一種用前述的表達盒轉染的植物、一種具有前述表達盒的植物細胞培養(yǎng)物以及一種用前述的表達盒轉染的植物細胞培養(yǎng)物。
在另一實施方案中，公開了一種植物細胞中重組蛋白的生產方法。該方法包括如下步驟用一種表達盒轉染的植物細胞的培養(yǎng)，該表達盒含有下列部分編碼MsPRP2的一個啟動子或其片段的核苷酸和編碼該蛋白的核苷酸，所述蛋白的核苷酸與MsPRP2啟動子的核苷酸有效連接；轉化細胞的培養(yǎng)，在此過程中轉化的細胞產生該蛋白。
在另一實施方案中，公開了一種從植物細胞中產生一種分泌蛋白的方法。該方法首先培養(yǎng)用蛋白產生表達盒轉染的植物細胞，該表達盒包括以下部分i.編碼MsPRP2啟動子或其片段的核苷酸，ii.編碼一種分泌信號的核苷酸，它位于MsPRP2或其片段的下游；iii.編碼蛋白的核苷酸，所述蛋白的核苷酸與MsPRP2啟動子的核苷酸有效連接。下一步是培養(yǎng)轉化的細胞，在此過程中轉化的細胞產生該蛋白。
在另一個實施方案中，公開了在根系中產生異源蛋白的植物的種子。該種子從轉基因植物細胞制得，該植物用編碼MsPRP2啟動子或其片段的核苷酸、編碼該蛋白的核苷酸以及可選的編碼植物分泌信號的核苷酸轉化，并且該蛋白的核苷酸與MsPRP2啟動子的核苷酸和分泌信號有效連接。
在另一個實施方案中，公開了一種生物改造土地的方法，該方法要求種植上述攜帶或不攜帶分泌信號的種子。
上述的以及出現(xiàn)在下文中的其他目的，很容易通過本發(fā)明實現(xiàn)。本發(fā)明中的方法非常新穎，并易于通過以下代表性的實施方案中的具體說明來理解，尤其是當結合附圖閱讀時，其中相同的部分在所有的視圖中具有相同的數(shù)字。


圖1為在花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子或植物MsPRP2啟動子控制下表達水母綠色熒光蛋白(GFP)的構建體示意圖。
圖2顯示了MsPRP2編碼區(qū)上游的基因組核苷酸序列，最后一個密碼子是翻譯起始密碼子。
圖3顯示了圖1中部分構建體的核苷酸序列。包括核糖體結合部位以及MsPRP2信號序列和GFP編碼序列。
圖4為表現(xiàn)出不同水平GFP熒光的轉化體的百分比的三維條形圖，該熒光水平依賴于啟動子和存在MsPRP2分泌信號序列。
圖5A-5H為說明GFP從細胞中分泌的GFP熒光細胞(圖5A-5D)以及相應的培養(yǎng)基(圖5E-5H)的照片。左邊顯示的是用于轉化細胞的構建體。
圖6A-6D為用CaMV 35S或MsPRP2啟動子轉化的野生型和Alfin1過表達的細胞中的GFP熒光的照片。
圖7A-7H為產熒光的根系的照片。圖7A-7H顯示根尖(圖7A)、包括表皮和維管結構在內的中根(圖7B和7C)以及根毛和根的致密部(圖7D)的GFP熒光。圖7A-7D顯示的是以MsPRP2promsig-GFP構建體轉化的野生型根。圖7E-7H顯示的是CaMV35Sprom-MsPRP2sig-GFP構建體表達的GFP熒光(圖7E和7F)和MsPRP2promsig-GFP構建體表達的熒光(圖7G和7H)之間的比較。圖7E-7H顯示了自MsPRP2promsig-GFP構建體(圖7H)過表達Alfin1(圖7F和7H)的LS-1轉化的植物中，GFP熒光升高的效應。
圖8A-8F為轉化葉的FITC和相應的FITC/TRITC組的照片。顯示了以下情況中的GFP表達量，即從有(圖8B和8F)或沒有(圖8A和8E)信號序列的CaMV 35S啟動子表達，或者從存在(圖8D和8H)或不存在(圖8C和8F)Alfin1過表達的紫花苜蓿MsPRP2啟動子-信號構建體表達。
具體實施例方式
本發(fā)明是關于MsPRP2啟動子及其在使轉基因在植物、根系以及細胞培養(yǎng)物中高水平表達中的用途。提供了能夠被細胞轉錄和翻譯系統(tǒng)有效識別從而產生高水平的異源蛋白的啟動子序列，該異源蛋白由克隆到該啟動子附近的cDNA序列編碼。這些啟動子序列，最初作為紫花苜蓿中MsPRP2基因的基因組序列的一部分而被克隆，它另外能使過表達Alfinl基因的植物中轉基因的表達水平增加兩倍。由于MsPRP2啟動子和Alfinl主要在紫花苜蓿的根系中起作用，因此本發(fā)明對在植物根系中靶向表達的基因將有重要的應用。由MsPRP2啟動子、具有翻譯中的植物核糖體結合位點的MsPRP25’非翻譯序列和該MsPRP2用于細胞壁定位的信號序列組合而成的核苷酸序列提供了一種轉基因在細胞培養(yǎng)物和植物根系中表達和分泌的有效方法。
MsPRP2啟動子可以用于在各種類型的細胞中表達異源基因，包括沿著根系從根尖到根毛、整個根的主體以及培養(yǎng)的植物細胞中。對根系的特異性與同CaMV 35S啟動子相關的普遍表達模式形成了對比。異源基因在來自MsPRP2啟動子的轉基因植物細胞中的表達水平可以與來自CaMV 35S啟動子的表達水平相媲美，尤其當細胞過表達Alfinl時。
本發(fā)明一個重要的方面是，提供MsPRP2信號序列來促進GFP在轉基因植物根系中的分泌，如MsPRP2啟動子-信號-GFP構建體一樣表達異源GFP。MsPRP2信號序列可以單獨或者與MsPRP2啟動子組合用于植物構建體。當在來自MsPRP2啟動子或其他啟動子的植物中表達時，MsPRP2信號序列引起與其相連的異源蛋白的分泌。由于如下所示的表達的MsPRP2信號序列，將GFP分泌到周圍瓊脂中的轉化體的細胞內GFP較少。高水平的基因表達在下文中通過測定轉基因植物中最終的異源蛋白表達量來闡明。
這些結果支持MsPRP2啟動子和信號序列在植物根系和細胞培養(yǎng)物中異源基因的表達和分泌中的新穎性和實用性。
實施例通過參考附加的實施例可以對本發(fā)明有更好的理解，所述實施例僅為說明目的，不可理解為限制本發(fā)明的范圍。所有的構建體都采用標準的分子生物學技術產生。
為了確保對GFP蛋白的等量表達的測定，構建對照構建體用于轉基因分析，GFP蛋白的表達依賴于轉錄(啟動子的強度和效率)、翻譯(控制核糖體結合和翻譯起始的5’非翻譯區(qū)(UTR)的效率)以及表達后的轉錄產物和蛋白質的穩(wěn)定性。所有的構建體都具有相同的GFP編碼序列、相同的決定mRNA穩(wěn)定性的3’UTR以及相同的決定翻譯效率的來自MsPRP2基因的5’UTR。這些構建體可以用來檢測啟動子和信號效率的變異；并且當啟動子為MsPRP2啟動子時，由于Alfin1過表達而導致的表達增強如下文所示。所有的構建體都克隆到二元載體pGA643上并導入紫花苜蓿的細胞中。
實施例1本實施例闡明了構建體的制備和用途，該構建體含有用于在植物中表達異源基因的MsPRP2啟動子和信號系統(tǒng)。圖1顯示了連接產物的序列和示意圖，它包括一個位于連接點處的脯氨酸殘基，該連接點來自引物引入的Xmal位點，并且使MsPRP2啟動子/信號片段可以用作與其他要表達的異源基因亞克隆的盒?！?5S-prom”區(qū)代表CaMV35S啟動子；相鄰的陰影區(qū)為MsPRP2基因的核糖體結合位點；接下來的陰影區(qū)為MsPRP2信號序列；標有GFP的區(qū)編碼綠色熒光蛋白；最右邊的區(qū)為轉錄終止序列。在用線取代分泌信號序列的地方，表示沒有分泌信號序列。
總之，GFP(S65T)序列(Haseloff et al.，1997)位于MsPRP2啟動子中的-652至+75片段(圖2；SEQ ID NO1)或者CaMV 35S啟動子的轉錄調控下。然而，由于MsPRP2(+1/+75bp)序列包括一個可能的信號序列，該序列使FGP定位于細胞壁或分泌(Deutch和Winicov，1995)，因此我們還在一個CaMV 35S啟動子構建體中將這個可能的信號序列克隆到了GFP附近(圖1中最上面一個構建體)。這使我們能夠監(jiān)測信號序列對轉基因表達的GFP在細胞內的蓄積所產生的任何影響。
用具有MsPRP2啟動子和信號序列(-652至+75)的片段構建構建體，其中+1是MsPRP2編碼序列中起始ATG中的A(Bastola et al.，1998)。構建采用PCR進行，用#1正向引物(SEQ ID NO2)在分子的5’端引入XbaI位點，#1反向引物(SEQ ID NO3)在分子的3’端引入XmaI位點。所有引物列于表1。
表1


異源GFP(S65T)基因采用PCR亞克隆，用#2正向引物(SEQID NO4)在5’端引入一個XmaI位點，用#2反向引物(SEQ ID NO5)在3’端引入一個BglП位點。產生的PCR產物GFP(S65T)cDNA編碼完整的GFP蛋白，其NH2端不合蛋氨酸，COOH端以賴氨酸結尾，并且沒有任何KDEL序列，該序列能夠使產物滯留在轉基因植物的細胞質/內質網中。GFP和MsPRP2啟動子信號片段在XmaI位點處連接。圖1為示意圖，圖3給出了該連接產物的序列(GFP-MsPRPpromsig)，它包括一個位于連結點處的脯氨酸殘基，該連結點由引物引入的XmaI位點形成，并且使MsPRP2啟動子/信號片段可以用作其他要表達的異源基因亞克隆的表達盒。GFP-MsPRPpromsig構建體被進一步克隆到二元載體pGA643(An et al.，1988)上，并用XbaI和BglП消化(Anet al.，1988)。
將MsPRP2啟動子的效率和強度與CaMV 35S啟動子相比較，而CaMV 35S啟動子是用于表達異源基因的最常用，也是最強的啟動子之一。將GFP(S65T)cDNA亞克隆插入用XbaI和BglП消化的pGA643中，這兩個位點靠近載體的35S啟動子。但是，使用#3正向引物(SEQID NO6)通過PCR將MsPRP25’UTR(-28至+1)的片段加到GFP(S65T)序列的5’端，從而提供一個高效的植物核糖體結合位點，以使來自35S和MsPRP2啟動子的兩種產物的翻譯水平相當。#3正向引物(SEQ ID NO6)還向pGA643中引入了克隆所必需的XbaI位點，并使從原MsPRP2序列的ATG開始，上游的第24個核苷酸從T變成A。該GFP(S65T)PCR反應的反向引物與上述的向pGA643中引入克隆所必需的BglП位點的相同。
為了在pGA643的CaMV 35S啟動子控制下表達具有MsPRP2信號序列和5’UTR的GFP，又構建了其他對照構建體。這通過利用#4正向引物(SEQ ID NO7)在插入序列的5’端引入一個XbaI位點而實現(xiàn)，如圖3所示該引物從GFP-MsPRPpromsig構建體的618位開始。所有的構建體都通過測序進行驗證。
按上述方法用土壤桿菌轉化紫花苜蓿并挑選轉化體(Winicov和Bastola，1999)。對來自野生型親代(#1)或Alfin1-過表達LS-1植物的紫花苜蓿葉盤的轉化、愈傷組織的培養(yǎng)以及植物的再生均按上述方法進行(Winicov和Bastola，1999)。由于LS-1植物已經攜帶了抗卡那霉素基因，因此可以通過熒光區(qū)分表達GFP的轉化愈傷組織，并且發(fā)現(xiàn)最初既含有轉化的也含有未轉化的細胞。但是，經過三到四個月的繼代培養(yǎng)后，大部分由GFP構建體轉化的LS-1株系都含有了80％或更高的表達GFP的細胞。這可能是由于在二次轉化之后，抗卡那霉素的基因增加了一倍。
實施例2本實施例闡明了實施例1在紫花苜蓿中制備的構建體的表達和信號功能，以及與含有CaMV 35S啟動子或MsPRP2啟動子的構建體在表達上的比較。這些結果在圖4中闡明。
內源性的MsPRP2基因在紫花苜蓿的愈傷組織和根系中表達，特別是在脅迫下或在Alfin1過表達的植物中(Winicov和Bastola，1999)。但是，將MsPRP2啟動子-信號序列用于在紫花苜蓿中表達異源基因以前并未建立。我們通過比較MsPRP2啟動子控制下與CaMV 35S啟動子控制下的GFP(S65T)在紫花苜蓿對照轉基因植物和LS-1植物中的表達，來測試MsPRP2啟動子的強度。CaMV 35S啟動子在所有的組織，根和葉中同樣普遍表達。
從培養(yǎng)的轉化的LS-1株系和#1紫花苜蓿株系中，取150至500mg愈傷組織，置于1ml提取緩沖液中(10mM Tris-EDTA，pH8.0)，用由勻漿器(約800rpm)驅動的塑料杵在4℃下均質1分鐘，制備提取物。離心(16,000g，4℃，20分鐘)除去細胞殘骸。上清用于測定熒光和蛋白。
GFP在轉化的紫花苜蓿愈傷組織的提取物中的表達通過用SPEXFluoroMaxTM熒光光譜儀(Metuchen，NJ)進行熒光檢測(λex＝489nm；λem＝508nm)來定量。將熒光(FU)計算成光量子X106/ml/g濕重愈傷組織。將重組的EGFP蛋白(Clontech，Palo Alto，CA)置于1ml提取緩沖液中，用于使稀釋液在線性范圍(0.05-0.4μg/ml)內標準化。
從這些轉化的愈傷組織得到的細胞提取物的GFP熒光檢測值顯示轉化株系的個體之間具有顯著的差別。由于部分葉綠體的形成，在用空載體轉化的愈傷組織的提取物中，觀察到了低水平的殘余熒光。大部分用MsPRP2和CaMV 35S啟動子轉化的株系顯示出的數(shù)值遠高于用對照載體轉化得到的數(shù)值。圖4顯示每一種構建體的轉化體的熒光數(shù)據。從含有CaMV 35S啟動子構建體的轉化體中得到的GFP熒光水平最高，該構建體用于產生細胞內GFP。但是，在GFP鄰近出現(xiàn)的MsPRP2信號序列會導致含有CaMV 35S啟動子的轉化體的細胞內GFP熒光水平降低。
這些結果提示，帶有MsPRP2信號序列的GFP向細胞外的分泌，會導致細胞內GFP水平的降低。在用MsPRP2-啟動子-信號構建體轉化的愈傷組織中也觀察到了高水平的GFP熒光。很顯然，使用CaMV35S和MsPRP2啟動子的情況下，當GFP的轉錄產物包括MsPRP2信號序列時，從細胞提取物中得到了幾乎相當水平的GFP。這些結果表明，本研究所使用的MsPRP2啟動子片段的確是一種異源基因表達的強啟動子。由于MsPRP2信號序列會影響GFP在細胞內的蓄積，我們進一步鑒定了它對來自CaMV 35S和MsPRP2啟動子的GFP表達的作用。
實施例3通過對單個的轉化細胞和轉化的愈傷組織周圍的瓊脂培養(yǎng)基采用共焦熒光顯微技術，對由MsPRP2信號序列引起的細胞內GFP的表達和分泌進行了更具體的研究。
愈傷組織的單個細胞以及轉基因植物的根和葉的熒光圖像用帶有Leica TCS-NT共焦激光掃描頭及Leica10X和40X物鏡的Leica DMRBE落射熒光顯微鏡成像，掃描頭上裝有氪-氬激光裝置(具有488和514nm的發(fā)射譜線)。愈傷組織細胞在含Schenk和Hildebrand(1972)生長培養(yǎng)基的載玻片上制成標本。每個標本都通過40X(1.0NA)的浸油物鏡在488nm處掃描。使用熒光過濾裝置(最大發(fā)射波長為520nm)得到了在不同平面上的連續(xù)掃描圖像，熒光強度用LeicaTCS-NT軟件進行量化。在整個細胞范圍內收集共焦點的Z系列，以產生單角度投影。
以512×512像素的分辨率收集根和葉組織的圖像，對經由葉片的八個空間大小相同的部分中的每一個都操作四次。兩個通道用來分辨來自GFP熒光和葉綠素熒光的不同光譜信號。對準的標本用最大激發(fā)波長分別為494和554nm，最大發(fā)射波長分別為520和576nm的FITC-TRITC濾過系統(tǒng)掃描。該FITC/TRITC聯(lián)合濾波器用于分辨轉化的葉中的綠色(GFP)和紅色(葉綠體)熒光信號。FITC可單獨用于根組織。熒光強度采用256級灰度進行數(shù)字編碼。
圖5A-5D顯示了用不同構建體轉化的野生型(#1)紫花苜蓿細胞的熒光，這些構建體含有攜帶或不攜帶MsPRP2信號序列的CaMV35S和MsPRP2啟動子。圖5E-5H顯示了轉化細胞周圍的培養(yǎng)基和在MsPRP2信號序列存在時GFP的分泌。從性質上來說，用顯微鏡方法從GFP熒光檢測得到的結果與從細胞提取物的熒光檢測得到的結果相似。當GFP轉錄產物也編碼信號序列時，具有CaMV 35S和MsPRP2啟動子的細胞的細胞內GFP水平相似。
實施例4本實施例闡明來自MsPRP2啟動子的信號序列對按實施例1制備的轉基因GFP的分泌的影響。愈傷組織附近的培養(yǎng)基中的GFP分泌可以用帶有ISEE軟件的Nikon Eclipse TE 300倒置顯微鏡監(jiān)測。通過使用熒光過濾棱鏡(FITC)的40X ELWD Plan Fluor/O.6NA的物鏡觀察制備物。用Quantix(Photometrics，美國)和/或SonyCCD相機拍照。
在圖5E和5F中，愈傷組織周圍的生長培養(yǎng)基顯示除了殘留在瓊脂上的細胞發(fā)出的熒光外，用載體或CaMV 35S轉化的細胞沒有分泌GFP到培養(yǎng)基中。其他組(圖5G和5H)證實了MsPRP2信號序列與每一種啟動子的組合都會導致GFP向培養(yǎng)基中大量分泌，并且確定了MsPRP2信號在分泌中起作用。這就是為什么只要當MsPRP2信號序列存在，來自CaMV 35S啟動子構建體的細胞內GFP水平就比較低的原因。本實驗證明了MsPRP2信號序列在異源蛋白分泌中的功能，因此可以將這種新的MsPRP2序列用于在植物中表達其他的異源基因。
此外，在主要在根系中表達Alfin1的植物中，MsPRP2啟動子把大部分表達都限制在了根系中。Alfin1過表達的植物在為分泌工程產品而設計的植物或細胞系統(tǒng)中將會有很高的實用性。MsPRP2序列與其他用于植物轉化的啟動子，在定位于根系并由根系分泌的產物方面也有所不同。盡管CaMV 35S啟動子的片段(-90到+1)已經顯示出對根系中的基因存在優(yōu)先調控，但是與完整的CaMV 35S啟動子的活性相比，這種活性很低(Benfey et al.，1989)，因此沒有太大的用處。
實施例5本實施例的目的是為了確定Alfin1的過表達是否能夠增強MsPRP2啟動子對GFP的作用，其中Alfin1編碼一個可能的轉錄因子。轉基因紫花苜蓿LS-1(以前被轉化以過表達Alfin1(Winicov，2000；Winicov和Bastola，1999))的葉盤用MsPRP2-啟動子-信號-GFP構建體和CaMV 35S-啟動子-GFP構建體轉化，以后者作為對照。
測定(按上述方法)野生型紫花苜蓿(#1)和表達Alfin1的LS-1背景細胞的細胞內GFP熒光。圖6A-6D顯示Alfin1同時在LS-1植物中的過表達能夠促進來自MsPRP2啟動子的GFP的表達，而對來自CaMV 35S啟動子的GFP沒有促進作用。表2顯示了許多不同的個體轉化系的細胞內GFP熒光的定量數(shù)據，這些轉化系包括了各種背景并具有各種啟動子的構建體。由于分泌作用，這兩種啟動子之間的細胞內GFP熒光的絕對值是不同的，正如以上所提及的。
表2定量激光掃描共焦熒光法(FU)測定獨立轉化的細胞系的愈傷組織中的細胞GFP熒光

*每個細胞范圍所表達的平均GFP熒光來自CaMV 35S啟動子的轉基因細胞所表達的細胞內GFP熒光在野生型(#1)和表達Alfin1的LS-1細胞之間沒有顯著的差別，這表明CaMV 35S啟動子的功能對細胞Alfin1水平的變化不敏感(表2)。與之形成對比的是，當與野生型紫花苜蓿(#1)相比較時，GFP在來自MsPRP2啟動子的細胞中的表達在所有從過表達Alfin1的LS-1背景(圖6D)所分離到的轉基因系中較高，如圖6C和表2所示。盡管來自MsPRP2構建體的GFP持續(xù)分泌，但是仍然能夠觀察到細胞內GFP的升高。這些結果進一步證實了Alfin1在來自本研究中所使用的MsPRP2啟動子及其片段的基因表達中的正調控作用。
以上結果支持我們對MsPRP2的評價，即MsPRP2是異源基因表達的強啟動子，尤其當存在過量的Alfin1時。
實施例6本實施例闡明了MsPRP2啟動子對沿著根系的各種類型的細胞的組織特異性。從轉化的愈傷組織中再生植物，愈傷組織中GFP的表達按上述方法檢測。圖7A-7H中給出了數(shù)據。
圖7A-7D、7G以及7H顯示GFP在用MsPRP2-信號-GFP構建體轉化的紫花苜蓿的根系中具有廣泛的高表達。在野生型植物的根尖到根的致密部分都檢測到了GFP(圖7A-7D和7G)，包括在根毛中的表達(圖7A-7D)。從組織水平上看，在根的表皮和中心區(qū)，包括維管系統(tǒng)中都有表達。據觀察，皮層中的GFP水平略低。在這些實驗中，CaMV 35S對照構建體也包括MsPRP2信號-GFP序列并顯示于圖7E和7F中，從而消除由于分泌而導致的細胞內GFP的差異。圖7E顯示了GFP在野生型紫花苜蓿中的表達，圖7F顯示了GFP在過表達Alfin1的轉化LS-1植物中的表達。GFP在細胞壁和根表層中的濃度說明MsPRP2信號序列對引起轉基因產物GFP從根系中的分泌具有連續(xù)而強大的作用。此外，圖7G-7F的比較說明，來自MsPRP2啟動子的GFP的表達在過表達Alfin1的LS-1植物中增強，然而未觀察到Alfin1對來自CaMV 35S啟動子的GFP的表達有影響(圖7E和7F)。這些結果與從細胞培養(yǎng)得到并顯示在圖4中的結果是一致的。上述結果說明由此處所使用的MsPRP2啟動子引起的GFP表達在不同類型的細胞中廣泛存在并且強烈。
實施例7
由于內源性的MsPRP2表達具有根系特異性，并且過去對葉中過表達Alfin1的轉基因植物所做的工作(Wincov和Bastola，1999)，并未顯示內源性的MsPRP2在同一轉基因植物的葉中表達，因此我們通過葉中的MsPRP2啟動子-信號構建體，對表達模式進行了嚴密的分析。這樣，在葉中的表達既可以檢驗我們的MsPRP2啟動子片段的根系特異性，又能夠說明Alfin1是否是GFP由組成型MsPRP2啟動子控制在葉中表達所必須的唯一根系特異性轉錄因子。圖8A-8F顯示了表達GFP的野生型(#1)植物的葉中的GFP熒光的比較，該GFP由CaMV 35S啟動子、CaMV 35S啟動子-MsPRP2信號或者MsPRP2啟動子-信號的構建體控制表達。所有用來測試葉中GFP表達的轉基因植物都表現(xiàn)出很強的GFP根系表達。
與CaMV 35S啟動子的廣泛活性相一致，我們發(fā)現(xiàn)在使用CaMV35S啟動子的野生型植物的轉基因葉中，GFP的表達很高，如圖8A-8H中的FITC和FITC/TRITC組圖所顯示。GFP在胞質溶膠中蓄積并被排斥在含有高熒光葉綠素的葉綠體之外。但是，當存在MsPRP2信號序列時，GFP的蓄積似乎有所不同(圖8A-8H)。當信號序列存在時，GFP的熒光水平顯著降低并被局限在一定區(qū)域內，這與從細胞質中分泌是一致的。當信號序列存在時，我們僅檢測到在葉中的維管組織附近有局部的GFP蓄積，這可能是由于在葉組織中的快速轉運和降解。當存在MsPRP2信號序列時，GFP局部表達的出現(xiàn)在野生型(#1)和LS-1來源植物的轉基因植物中是相同的(數(shù)據未列出)，并且在一些轉化的愈傷組織中也可以看到。
與之相對比的是，野生型(#1)來源的轉基因植物的葉中未檢測到GFP熒光(圖8C-8G)，而該植物的根系具有來自MsPRP2啟動子的很高的GFP表達水平。此外，在根系高水平表達來自MsPRP2啟動子的GFP的轉基因LS-1植物的葉中未檢測到GFP熒光，如圖8D和8H所示，即使這些植物的葉中表達Alfin1(Wincov和Bastola，1999)。上述結果與前面的數(shù)據一致，所述數(shù)據顯示Alfin1的過表達對轉基因紫花苜蓿葉中的內源性MsPRP2啟動子沒有影響(Winicov和Bastola，1999)。
工業(yè)實用性在這里所公開的表達盒在商業(yè)上具有一些重要的優(yōu)點。它使植物生物學家能夠利用被控制在植物的根系中并且優(yōu)先在植物根系中起作用的異源基因來轉化植物。由于具有分泌信號，轉化的植物可以從根系中分泌該異源蛋白。
由于該表達盒使用植物來源的啟動子，而不是病毒啟動子，因此具有很高的實用性，因為病毒啟動子已經被認為能夠污染附近的農作物。
另一個優(yōu)點是能夠把蛋白的表達限制在根系范圍內。這可以通過多種方式應用。首先，這種有用的產物能夠用于塊根作物，例如馬鈴薯、山藥和胡蘿卜。其次，使地上農產品不含根結合蛋白。再次，該異源蛋白能夠阻止害蟲對根的侵害。
本發(fā)明的第三個優(yōu)點就是根分泌，這是分子農業(yè)的一個亞類，它依賴于植物根系或者培養(yǎng)的細胞或組織(例如發(fā)根)分泌有價值的化合物的能力。與之對比的是，大部分被用作精細化學藥品、藥物、保護農作物的化合物和化妝品成分等的重組蛋白以及其他有價值的天然產物一直用溶劑和昂貴的純化方法從植物中提取得到。然而，水栽法培養(yǎng)的植物根系以及培養(yǎng)的植物細胞和組織能夠將所需的產物分泌到簡單的介質中，而從介質中的純化大大簡化。而且，由于轉基因植物不需要被收獲以獲取蛋白，所以它們能夠在長時間內產生并分泌蛋白。植物也是優(yōu)選的蛋白來源，因為它們能夠進行乙?；?、磷酸化和糖基化，以及其他的翻譯后蛋白修飾，這是許多真核蛋白的生物學活性所必須的。
盡管某些優(yōu)選的實施方案和方法已經在這里公開，但是對本領域技術人員顯而易見的是，可以對該實施方案和方法進行變更或修改而不偏離本發(fā)明的實質和范圍。
其中所有的參考文獻及參考書都引入本文。
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權利要求
1.一種能夠指導異源蛋白在植物根系中表達的表達盒，該表達盒包括a)編碼MsPRP2啟動子或其片段的核苷酸，所述啟動子或其片段包括SEQ ID NO1中的部分；以及b)包含一種異源蛋白的基因的核苷酸，該核苷酸與MsPRP2的核苷酸有效連接。
2.一種能夠指導異源蛋白在植物根系中表達的表達盒，該表達盒包括a)編碼MsPRP2啟動子或其片段的核苷酸；b)任選的編碼核糖體結合位點的核苷酸；c)任選的編碼分泌信號的核苷酸；以及d)編碼異源蛋白的核苷酸，所述蛋白核苷酸與所述MsPRP2啟動子的核苷酸有效連接。
3.權利要求1的表達盒，進一步包括編碼轉錄因子Alfin1的核苷酸，所述Alfin1的核苷酸與另一個啟動子有效連接，從而該另一個啟動子引起轉錄因子Alfin1的過表達。
4.一種用權利要求1、2或3的表達盒轉染的植物。
5.一種用權利要求1、2或3的表達盒轉染的植物細胞培養(yǎng)物。
6.一種在植物細胞中生產重組蛋白的方法，該方法包括a.培養(yǎng)用一種表達盒轉染的植物細胞，該表達盒包括i.編碼MsPRP2啟動子或其片段的核苷酸；ii.編碼蛋白的核苷酸，所述蛋白的核苷酸與所述MsPRP2啟動子的核苷酸有效連接；以及b.培養(yǎng)轉化的細胞，在此過程中該轉化的細胞產生所述的蛋白。
7.一種從植物細胞中生產分泌蛋白的方法，該方法包括a.培養(yǎng)用一種表達盒轉染的植物細胞，該表達盒包括i.編碼MsPRP2啟動子或其片段的核苷酸；ii.編碼分泌信號的核苷酸，該分泌信號位于MsPRP2啟動子或其片段的下游；以及iii.編碼蛋白的核苷酸，所述蛋白的核苷酸與MsPRP2啟動子的核苷酸有效連接；b.培養(yǎng)轉化的細胞，在此過程中該轉化的細胞產生所述的蛋白。
8.一種在根系中產生異源蛋白的植物種子，該種子包括轉基因植物細胞，該細胞用編碼MsPRP2啟動子或其片段的核苷酸、編碼該蛋白的核苷酸以及任選的植物分泌信號轉化，并且該蛋白的核苷酸有效連接于MsPRP2啟動子的核苷酸和分泌信號。
9.一種生物改造土地的方法，該方法包括種植權利要求8的攜帶或者不攜帶分泌信號的轉基因種子。
全文摘要
一種新的用于指導異源蛋白在植物根系中表達的表達盒，至少包括兩部分編碼MsPRP2啟動子或其片段的核苷酸，所述啟動子或其片段包括SEQ ID NO1的部分；以及含有異源蛋白基因的核苷酸，所述核苷酸與MsPRP2核苷酸有效連接。一種能夠指導異源蛋白在植物根系中表達的表達盒，包括a)編碼MsPRP2啟動子或其片段的核苷酸；b)任選的編碼核糖體結合位點的核苷酸；c)任選的編碼分泌信號的核苷酸；d)編碼異源蛋白的核苷酸，所述蛋白的核苷酸與MsPRP2啟動子的核苷酸有效連接。所述表達盒進一步包括編碼轉錄因子Alfin1的核苷酸；該Alfin1的核苷酸與另一個啟動子有效連接，從而該另一個啟動子引起轉錄因子Alfin1的過表達。同時公開的還有用前述表達盒轉染的植物和植物細胞。還公開了產生植物細胞結合蛋白或者分泌蛋白的方法，以及由轉化的植物細胞制得的種子。
文檔編號A01H5/00GK1791677SQ200480013935
公開日2006年6月21日 申請日期2004年3月22日 優(yōu)先權日2003年3月21日
發(fā)明者I·威尼克夫 申請人:亞利桑那董事會(代表亞利桑那州立大學)