專利名稱：一種提高組培植物材料生根率和移栽成活率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高組培植物材料生根率和移栽成活率的方法，特別適宜不易生根植物和珍稀植物材料的組培，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物組織培養(yǎng)的成功例子最早可以追述到1934年White培養(yǎng)番茄離體根尖成功；隨著植物生長所需各種物質(zhì)的確定，越來越多的植物被成功培養(yǎng)，這項技術(shù)的應(yīng)用也越來越廣泛。植物組織培養(yǎng)一方面可為遺傳工程提供理想的受體材料，另一方面又可為常規(guī)的植物改良程序提供一種新的手段。例如，無論轉(zhuǎn)基因受體還是轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選和再生，都需要有組織培養(yǎng)技術(shù)作為支撐；石刁柏等雌雄異株的植物可以利用花藥培養(yǎng)獲得單性群體；利用原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得有性雜交難以獲得的雜種；利用莖尖培養(yǎng)獲得脫病毒苗；利用組培快繁技術(shù)生產(chǎn)花卉苗木等等。無論是那種方式的應(yīng)用，一般組培最終都需要獲得完整的植株。大部分組培材料，特別是通過叢生芽快繁的植物體，一般需要將無根小苗切下，植入生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)生不定根后獲得完整植株，多數(shù)植物利用常規(guī)的生根方法都可以獲得長有不定根根系的再生植株，但是有的植物，由于基因型或其他方面的影響，常規(guī)方法生根非常困難，成為研究和應(yīng)用的瓶頸。另外由于常規(guī)的生根方法是在含有大量水分、養(yǎng)分的培養(yǎng)基中生根，再生的植株可以不通過根系，僅需通過小苗的切口就可獲得營養(yǎng)，所以形成的根常常是沒有功能的，出瓶前往往需要較長時期的煉苗，移栽成活率也不高，對于原生質(zhì)體融合雜種這類非常珍貴的材料來說，這是致命的缺憾。
不定根的生長一般是根原基首先被誘導(dǎo)發(fā)生，然后繼續(xù)發(fā)育長大形成完整的根。常規(guī)方法和后來改進(jìn)的各種方法如濾紙橋等方法都是在同一種環(huán)境介質(zhì)中，使無根小苗的基部產(chǎn)生根原基并繼續(xù)發(fā)育生長，常常有一些物種無法得到理想的結(jié)果，因此開發(fā)一種利用植物不定根發(fā)育的兩個階段，給予不同的條件，使得難于生根的植物種類，得以生根原本可以生根的植株能夠獲得更加強(qiáng)壯、有功能的根系，提高移栽成活率是非常有意義的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是通過改進(jìn)常規(guī)一直在培養(yǎng)基上生根的過程，在含有生長素的固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)根原基的產(chǎn)生，然后將以產(chǎn)生根原基的切段移入保持一定濕度的培養(yǎng)罐促進(jìn)根原基的繼續(xù)發(fā)育和生長，待幼根伸出后，切口及附近的愈傷組織也基本干燥，傷口得以封閉，此時，直接將小苗移入培養(yǎng)介質(zhì)中或是繼續(xù)轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基中壯苗，壯苗時，只將幼根插入培養(yǎng)基，而切口不接觸培養(yǎng)基，養(yǎng)分不會由切口向上輸送，切口也進(jìn)一步愈合，大量的根會迅速伸向培養(yǎng)基，同時這些再生的不定根的功能得以建立。這樣，就可以提高組培植物材料生根率和移栽成活率的方法。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明的培養(yǎng)基為常規(guī)的根原基誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基和壯苗固體培養(yǎng)基；采用的容器還包括氣相培養(yǎng)罐；其中根原基誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基為1/2濃度的Ms培養(yǎng)基附加萘乙酸0.01-1.0mg/L、蔗糖20g/L、瓊脂0.7％，用1N的NaOH將pH調(diào)節(jié)至5.8-6.5，按照常規(guī)方法裝瓶滅菌后備用。
促根原基生長氣相培養(yǎng)罐為將一小張濾紙(三角瓶約需1cm×4cm，小罐頭瓶約需1.5cm×6cm)用蒸餾水完全浸濕后貼容器內(nèi)側(cè)壁上，封口后維持壓力0.1-0.15Mpa，溫度121℃，滅菌20分鐘后備用；壯苗培養(yǎng)基為1/2濃度的Ms培養(yǎng)基，蔗糖20g/L、瓊脂0.7％，用1N的NaOH將pH調(diào)節(jié)至5.8-6.5，按照常規(guī)方法裝瓶滅菌后備用。
本發(fā)明的方法，包括在固體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)組培帶芽莖段的根原基產(chǎn)生；氣相培養(yǎng)罐中促進(jìn)根原基生長、切口封閉；氣相罐中促進(jìn)根原基生長、切口封閉步驟；固體培養(yǎng)基上壯苗、幼根功能建立的步驟；其中(1)在固體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)組培帶芽莖段的根原基產(chǎn)生步驟中，培養(yǎng)條件為在室溫下培養(yǎng)10-15天；(2)氣相培養(yǎng)罐中促進(jìn)根原基生長、切口封閉步驟為將產(chǎn)生根原基的切段放入氣相罐中，在室溫下培養(yǎng)2-5天，直至切口處的愈傷組織開始發(fā)白變干、并有幼根開始伸出；氣相罐為容器內(nèi)壁上貼有用蒸餾水完全浸濕后的濾紙，封口后維持壓力0.1-0.15Mpa，溫度121℃，滅菌20分鐘后備用；(3)固體培養(yǎng)基上壯苗、幼根功能建立的步驟中移入壯苗培養(yǎng)基時，只將幼根插入培養(yǎng)基，而切口不接觸培養(yǎng)基，待大量根系產(chǎn)生后再移栽。
本發(fā)明的方法具體如下根原基的固相誘導(dǎo)步驟將從生芽或帶芽小莖段切下，將切口端插入根原基誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在室溫下培養(yǎng)10-15天，直至觀察到切口處包含多個根原基的愈傷組織產(chǎn)生(如圖1所示)。
氣相法促進(jìn)傷口封閉、根原基繼續(xù)發(fā)育形成幼根的步驟將已經(jīng)產(chǎn)生根原基的切段放入帶濾紙條的氣相培養(yǎng)罐中，在室溫下培養(yǎng)2-5天，直至切口處的愈傷組織開始發(fā)白變干，并有幼根開始伸出(如附圖2所示)。
壯苗、移栽步驟已生幼根的莖段可以直接出瓶移入滅菌的常規(guī)的培養(yǎng)介質(zhì)中，也可以也可以根據(jù)需要將其先轉(zhuǎn)入壯苗培養(yǎng)基中壯苗；移入壯苗培養(yǎng)基時，將幼根插入培養(yǎng)基，而切口不接觸培養(yǎng)基，防止切口接觸培養(yǎng)基吸收養(yǎng)分，確保小苗繼續(xù)生長發(fā)育的養(yǎng)分完全是由新形成的這些根吸收，待大量根系產(chǎn)生后再移栽。
本發(fā)明與常規(guī)生根方法及濾紙橋法的比較指標(biāo)為表1.利用不同生根方法對材料莖段的生根效果比較

表1中的指標(biāo)為幾種珍貴又較難生根的植物材料，如小麥與高冰草原生質(zhì)體雜交再生苗、小麥與燕麥原生質(zhì)體雜交再生苗等。
從表1中的指標(biāo)可以明顯地看到，本發(fā)明對于那些極寶貴又難生根的植物材料具有明顯的促進(jìn)生根、提高移栽成活率的作用。
本發(fā)明具有方法簡單、效果佳、有廣泛應(yīng)用領(lǐng)域等優(yōu)點，特別適宜于較為珍稀或難于生根的植物材料的組培。


圖1為叢生芽切段基部在固相培養(yǎng)基中培養(yǎng)8-15天的組織切片觀察結(jié)果。
圖中A為培養(yǎng)15天后的切段基部愈傷組織橫切面，示愈傷組織團(tuán)塊中的根原基；B為培養(yǎng)8天的切段基部愈傷組織縱切面，示根原基原始細(xì)胞；D、E為培養(yǎng)15天后發(fā)育到一定程度的根原基。
圖2為氣相培養(yǎng)過程中，幼根形成，在壯菌培養(yǎng)基上，大量的根繼續(xù)長出。
圖中A為氣相培養(yǎng)2天后，切口處愈傷組織的縱切面，可見到幼根開始伸出；B為氣相培養(yǎng)4天后，切段基部愈傷組織干燥發(fā)白，幼根伸出。C為小心將已生根材料移入壯苗培養(yǎng)基，僅將幼根插入培養(yǎng)基，切口不接觸培養(yǎng)基，根系大量發(fā)育。
具體實施例方式以下是本發(fā)明的實施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實施例一1、游離具有胚性的小麥品種濟(jì)南177、高冰草的原生質(zhì)體，利用常規(guī)的PEG法誘導(dǎo)融合，在等滲液體培養(yǎng)基上使得雜種細(xì)胞再生細(xì)胞壁，恢復(fù)分裂形成小細(xì)胞團(tuán)；其中一個克隆在添加BA0.5-1.5mg/L的Ms培養(yǎng)基上分化形成叢生無根苗5株，將帶芽小莖段切下，將切口端插入根原基誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在室溫下培養(yǎng)10天左右切口基部可見愈傷組織出現(xiàn)。
2、將1中的切段放入帶濾紙條的氣相培養(yǎng)罐中，室溫下培養(yǎng)2天，切口處的愈傷組織開始發(fā)白變干，有一株開始伸出幼根，至第5天，5株均有幼根伸出，生根率達(dá)到100％。
3、已生幼根的莖段移入壯苗培養(yǎng)基，僅將幼根插入培養(yǎng)基，而切口不接觸培養(yǎng)基，防止切口接觸培養(yǎng)基吸收養(yǎng)分，確保小苗繼續(xù)生長發(fā)育的養(yǎng)分完全是由新形成的這些根吸收，待大量根系產(chǎn)生后再移栽。移栽成活率達(dá)到100％。
4、移栽成活并收獲種子，在這些后代中已經(jīng)分別篩選到具有高抗鹽性、高耐早、具有新麥谷蛋白亞基的多個株系。新的麥谷蛋白亞基基因已經(jīng)成功克隆。
實施例二基本同實施例一。不同之處為1、參與體細(xì)胞融合的雙親為小麥品種濟(jì)南177和燕麥的原生質(zhì)體，其中一個克隆在添加BA0.5-1.5mg/L的Ms培養(yǎng)基上分化形成叢生無根苗16株，將帶芽小莖段切下，將切口端插入根原基誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在室溫下培養(yǎng)12天切口基部可見愈傷組織出現(xiàn)。
2、在室溫下氣相培養(yǎng)罐中培養(yǎng)4天，11株無根苗均形成幼根，生根率達(dá)到87％。
3、11株已生根小苗移栽，成活9株成活率達(dá)到82％。
4、移栽成活并收獲種子，分子標(biāo)記、基因組原位雜交表明這些小苗為雜種細(xì)胞后代。
實施例三基本同實施例一。不同之處為1、紅葉石楠組培形成的從生芽，室溫下在根原基誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，帶芽小莖段15天切口基部可見愈傷組織形成。
2、在室溫下氣相培養(yǎng)罐中培養(yǎng)3天，使得120株無根苗均形成幼根，生根率達(dá)到100％。
3、不經(jīng)壯苗，直接移栽至蛭石/珍珠巖培養(yǎng)介質(zhì)中成活率達(dá)到92％。
權(quán)利要求
1.一種提高組培植物材料生根率和移栽成活率的方法，包括在固體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)組培帶芽莖段的根原基產(chǎn)生；固體培養(yǎng)基上壯苗、幼根功能建立步驟；其特征在于該方法還包括氣相培養(yǎng)罐中促進(jìn)根原基生長、切口封閉步驟；其中(1)在固體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)組培帶芽莖段的根原基產(chǎn)生步驟中，培養(yǎng)條件為在室溫下培養(yǎng)10-15天；(2)氣相培養(yǎng)罐中促進(jìn)根原基生長、切口封閉步驟為將產(chǎn)生根原基的切段放入氣相培養(yǎng)罐中，在室溫下培養(yǎng)2-5天，直至切口處的愈傷組織開始發(fā)白變干、并有幼根開始伸出；氣相培養(yǎng)罐為容器內(nèi)壁上貼有用蒸餾水完全浸濕后的濾紙，封口后維持壓力0.1-0.15Mpa，溫度121℃，滅菌20分鐘后備用；(3)固體培養(yǎng)基上壯苗、幼根功能建立的步驟中已生幼根的莖段移入壯苗培養(yǎng)基時，只將幼根插入培養(yǎng)基，而切口不接觸培養(yǎng)基，待大量根系產(chǎn)生后再移栽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高組培植物材料生根率和移栽成活率的方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。本方法包括在固體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)組培帶芽莖段的根原基產(chǎn)生；氣相培養(yǎng)罐中促進(jìn)根原基生長、切口封閉；固體培養(yǎng)基上壯苗、幼根功能建立的步驟。其中根原基產(chǎn)生步驟中，培養(yǎng)條件為在室溫下培養(yǎng)10－15天；氣相培養(yǎng)罐中培養(yǎng)條件為在室溫下培養(yǎng)2－5天，氣相培養(yǎng)罐為容器內(nèi)壁上貼有用蒸餾水完全浸濕后的濾紙，封口滅菌后用；已生幼根的莖段移入壯苗培養(yǎng)基時，只將幼根插入培養(yǎng)基，而切口不接觸培養(yǎng)基，待大量根系產(chǎn)生后再移栽。本發(fā)明具有方法簡單、效果佳、有廣泛應(yīng)用領(lǐng)域等優(yōu)點，特別適宜于較為珍稀或難于生根的植物材料的組培。
文檔編號A01H4/00GK1709043SQ20051001082
公開日2005年12月21日 申請日期2005年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月24日
發(fā)明者陳穗云, 肖春杰 申請人:云南大學(xué)