專利名稱：一種提高苜蓿體細胞胚胎發(fā)生率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)方法技術(shù)領(lǐng)域，是一種培養(yǎng)苜蓿體細胞胚胎的方法。
背景技術(shù)：
苜蓿為多年生宿根性草本植物，是著名的優(yōu)良牧草，具有營養(yǎng)價值高、適口性好、消化率高、抗寒、抗旱、耐瘠薄、抗風(fēng)沙等特點。在生產(chǎn)上常常因為病蟲草害的發(fā)生嚴重影響苜蓿草的產(chǎn)量和品質(zhì)。
隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因轉(zhuǎn)入植物中改良某些不良性狀已經(jīng)成為現(xiàn)代分子育種的重要方法之一，組織培養(yǎng)技術(shù)是轉(zhuǎn)基因工作的基礎(chǔ)。苜蓿組織培養(yǎng)的現(xiàn)狀是利用子葉和葉片等外植體可以直接形成體細胞胚，也可以通過愈傷組織或懸浮細胞培養(yǎng)形成。其常規(guī)程序如下1、種子滅菌隨機選取飽滿種子在流水下沖洗30min，70％酒精振蕩30～60s，然后放入0.1％升汞振蕩滅菌8～15min，無菌水沖洗5遍，滅菌濾紙吸水，然后接種到1/2MS培養(yǎng)基上，萌發(fā)無菌苗。培養(yǎng)條件光周期為16h，光照強度1000～2000lx，晝夜溫度為25/18℃。
2、無菌苗子葉或葉片接種于附加2.0mg/L的2，4_D，并且補加適宜濃度的NAA、KT和BA等激素的MS培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)體細胞胚胎發(fā)生。添加一些有機物有利于提高體細胞胚胎發(fā)生率，但提高幅度極其有限，并且也不適用于所有的苜蓿品種。體細胞胚胎發(fā)生率計算公式體細胞胚胎發(fā)生率(％)＝獲得體細胞胚胎發(fā)生的子葉(葉片)塊數(shù)/接種的子葉(葉片)總塊數(shù)×100％3、獲得的體細胞胚在MS0(MS+3％蔗糖+0.8％瓊脂pH 5.8)培養(yǎng)基上萌發(fā)成完整植株。
以上為苜蓿獲得體細胞胚胎發(fā)生的基本程序，但是有三種結(jié)果(1)一些品種不能獲得體細胞胚胎發(fā)生；(2)一些品種獲得了體細胞胚胎發(fā)生，但是發(fā)生率低，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因時轉(zhuǎn)化率低；(3)一些品種獲得了體細胞胚胎發(fā)生，發(fā)生率很高，但是重復(fù)率低。
出現(xiàn)上述結(jié)果的原因是苜蓿體細胞胚胎發(fā)生強烈依賴于其基因型，而苜蓿為異源4倍體植物，自交高度不結(jié)實，異交率非常高，大多數(shù)品種是通過混合選育而成的，因此每個品種的遺傳背景非常復(fù)雜，甚至可以說，每一粒種子就是一個單獨的基因型，因此即使是同一苜蓿品種，不同種子的體細胞胚胎發(fā)生能力也有很大的差別。而現(xiàn)在的實驗方法都是隨機選取某一品種的種子萌發(fā)出無菌苗，然后利用所有無菌苗子葉或葉片進行體細胞胚胎發(fā)生誘導(dǎo)，最后統(tǒng)計得到的體細胞胚胎發(fā)生率就是隨機選取的每個種子體細胞胚胎發(fā)生率的平均數(shù)。也就是說，苜蓿的體細胞胚胎發(fā)生率是由實驗時隨機選取的各個種子自身的體細胞胚胎發(fā)生率決定的，因此具有不定性，出現(xiàn)上述三種結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是公開一種提高體細胞胚胎發(fā)生率的方法。
本發(fā)明解決技術(shù)問題的方案是選取苜蓿種子，萌發(fā)無菌苗；切斷植株上部扦插于MS0培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到2株遺傳背景完全一致的植株，連續(xù)繁殖，成為一個無性系；取各無性系植株葉片，誘導(dǎo)體細胞胚胎發(fā)生，統(tǒng)計體細胞胚胎發(fā)生率；將體細胞胚胎發(fā)生率為70％～100％的無性系植株連同培養(yǎng)瓶開瓶蓋煉苗，移到營養(yǎng)土中培育后移栽到田間；取田間成活植株葉片誘導(dǎo)體細胞胚胎發(fā)生，產(chǎn)生的體細胞胚按常規(guī)程序萌發(fā)，獲得完整的再生植株。
具體由以下步驟完成1、隨機選取飽滿的苜蓿種子，按照常規(guī)程序獲得無菌苗。
2、每一粒種子的無菌苗萌發(fā)5～15天，苗高7～12cm時，都在3～8cm處切斷，植株的上部扦插于MS0培養(yǎng)基上，5～15天即可得到2株遺傳背景完全一致的植株。如此連續(xù)繁殖2～5次，每一粒種子就擴繁了4～32株遺傳背景完全一致的植株，成為一個無性系，一共得到20～60個無性系。
3、獲得無性系后5～10天，取各無性系植株葉片，按照常規(guī)程序誘導(dǎo)體細胞胚胎發(fā)生，統(tǒng)計體細胞胚胎發(fā)生率。
4、將體細胞胚胎發(fā)生率為70％～100％的無性系植株連同培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)室內(nèi)開瓶蓋煉苗7～14天，洗凈植株根部瓊脂，移到裝有營養(yǎng)土的花盆中，10～30天移栽到田間。
5、取田間成活植株葉片流水下沖洗10～30min，70％酒精振蕩30～60s，然后放入0.1％升汞振蕩滅菌3～15min，無菌水沖洗3～5遍，滅菌濾紙吸水，然后按常規(guī)程序誘導(dǎo)體細胞胚胎發(fā)生，發(fā)生率為70％～100％，產(chǎn)生的體細胞胚按常規(guī)程序萌發(fā)，獲得完整的再生植株。
本發(fā)明從苜蓿的遺傳背景分析入手，在苜蓿無菌苗子葉或葉片體細胞胚胎發(fā)生技術(shù)基礎(chǔ)之上，通過對苜蓿品種的個體種子體細胞胚胎發(fā)生能力的篩選，大幅度提高了苜蓿體細胞胚胎發(fā)生率，并且具有可重復(fù)性。
實例實例1提高龍牧803苜蓿體細胞胚胎發(fā)生率種子滅菌隨機選取50粒飽滿種子，在流水下沖洗30min，70％酒精振蕩30s，然后放入0.1％升汞振蕩滅菌15min，無菌水沖洗3遍，滅菌濾紙吸水，然后接種到1/2MS培養(yǎng)基上，萌發(fā)無菌苗。培養(yǎng)條件光周期為16h，光照強度1000～2000lx，晝夜溫度為25/18℃。
每一粒種子的無菌苗萌發(fā)7天，苗高10cm時，都在5cm處切斷，植株的上部扦插于MS0培養(yǎng)基上，7天即可得到2株遺傳背景完全一致的植株。如此連續(xù)繁殖3次，每一粒種子就擴繁了8株遺傳背景完全一致的植株，成為一個無性系，一共得到50個無性系。
獲得無性系7天，每個無性系都從無菌苗上切取葉片75塊，近軸面向上接種于培養(yǎng)基LM1(MS基本培養(yǎng)基+2.4-D2.0mg/L+KT0.25mg/L+CH2000mg/L+3％蔗糖pH 5.8)誘導(dǎo)體細胞胚胎發(fā)生，24±1℃，16光照/d培養(yǎng)。觀察體細胞胚胎發(fā)生情況，觀察方法從接種時開始算起30d、40d、50d、60d各觀察1次，統(tǒng)計有體細胞胚胎發(fā)生的葉片塊數(shù)，最后統(tǒng)計所有無性系體細胞胚胎發(fā)生率。見下表。
龍牧803苜蓿50個無性系葉片體細胞胚胎發(fā)生率統(tǒng)計



26號無性系的體細胞胚胎發(fā)生率為100％。將此無性系植株連同培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)室內(nèi)開瓶蓋鍛煉1周，洗凈植株根部瓊脂，移到裝有營養(yǎng)土的花盆中，1個月后移栽到田間。
4、取田間移栽成活的植株葉片流水下沖洗30min，70％酒精振蕩60s，然后放入0.1％升汞振蕩滅菌5min，無菌水沖洗3遍，滅菌濾紙吸水，然后按常規(guī)程序誘導(dǎo)體細胞胚胎發(fā)生，發(fā)生率為100％，。
實例2提高公農(nóng)1號苜蓿、公農(nóng)2號苜蓿、草原1號苜蓿、草原2號苜蓿、敖漢苜蓿、龍牧801苜蓿體細胞胚胎發(fā)生率種子滅菌每個品種都隨機選取50粒飽滿種子，在流水下沖洗30min，70％酒精振蕩30s，然后放入0.1％升汞振蕩滅菌15min，無菌水沖洗3遍，滅菌濾紙吸水，然后接種到1/2MS培養(yǎng)基上，萌發(fā)無菌苗。培養(yǎng)條件光周期為16h，光照強度1000～2000lx，晝夜溫度為25/18℃。
每一粒種子的無菌苗萌發(fā)7天，苗高10cm時，都在5cm處切斷，植株的上部扦插于MS0培養(yǎng)基上，7天即可得到2株遺傳背景完全一致的植株。如此連續(xù)繁殖3次，每一粒種子就擴繁了8株遺傳背景完全一致的植株，成為一個無性系，一共得到50個無性系。
獲得無性系7天，每個無性系都從無菌苗上切取葉片75塊，近軸面向上接種于培養(yǎng)基LM1(MS基本培養(yǎng)基+2.4-D2.0mg/L+KT0.25mg/L+CH2000mg/L+3％蔗糖pH 5.8)，24±1℃，16光照/d培養(yǎng)。觀察體細胞胚胎發(fā)生情況，觀察方法從接種時開始算起30d、40d、50d、60d各觀察1次，統(tǒng)計有體細胞胚胎發(fā)生的葉片塊數(shù)，最后統(tǒng)計出每個品種所有無性系的體細胞胚胎發(fā)生率。
取每個品種中無性系體細胞胚胎發(fā)生率高的無菌苗，連同培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)室內(nèi)開瓶蓋鍛煉1周，洗凈植株根部瓊脂，移到裝有營養(yǎng)土的花盆中，1個月后移栽到田間，獲得成活植株。
5、取田間成活植株的葉片流水下沖洗30min，70％酒精振蕩60s，然后放入0.1％升汞振蕩滅菌5min，無菌水沖洗3遍，滅菌濾紙吸水，然后按常規(guī)程序誘導(dǎo)體細胞胚胎發(fā)生。6個苜蓿品種體細胞胚胎發(fā)生率及提高的百分率統(tǒng)計見下表。
6個苜蓿品種體細胞胚胎發(fā)生率提高百分率統(tǒng)計

權(quán)利要求
1.一種提高苜蓿體細胞胚胎發(fā)生率的方法，其特征由以下步驟完成，選取苜蓿種子，萌發(fā)無菌苗；切斷植株上部扦插于MS0培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到2株遺傳背景完全一致的植株，連續(xù)繁殖，成為一個無性系；取各無性系植株葉片，誘導(dǎo)體細胞胚胎發(fā)生，統(tǒng)計體細胞胚胎發(fā)生率；將體細胞胚胎發(fā)生率為70％～100％的無性系植株連同培養(yǎng)瓶開瓶蓋煉苗，移到營養(yǎng)土中培育后移栽到田間；取田間成活植株葉片誘導(dǎo)體細胞胚胎發(fā)生，產(chǎn)生的體細胞胚按常規(guī)程序萌發(fā)，獲得完整的再生植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高苜蓿體細胞胚胎發(fā)生率的方法，由以下步驟完成(1)、隨機選取飽滿的苜蓿種子，按照常規(guī)程序獲得無菌苗；(2)、每一粒種子的無菌苗萌發(fā)5～15天，苗高7～12cm時，都在3～8cm處切斷，植株的上部扦插于MS0培養(yǎng)基上，5～15天即可得到2株遺傳背景完全一致的植株，如此連續(xù)繁殖2～5次，每一粒種子就擴繁了4～32株遺傳背景完全一致的植株，成為一個無性系，一共得到20～60個無性系；(3)、獲得無性系后5～10天，取各無性系植株葉片，按照常規(guī)程序誘導(dǎo)體細胞胚胎發(fā)生，統(tǒng)計體細胞胚胎發(fā)生率；(4)、將體細胞胚胎發(fā)生率為70％～100％的無性系植株連同培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)室內(nèi)開瓶蓋煉苗7～14天，洗凈植株根部瓊脂，移到裝有營養(yǎng)土的花盆中，10～30天移栽到田間；(5)、取田間成活植株葉片流水下沖洗10～30min，70％酒精振蕩30～60s，然后放入0.1％升汞振蕩滅菌3～15min，無菌水沖洗3～5遍，滅菌濾紙吸水，然后按常規(guī)程序誘導(dǎo)體細胞胚胎發(fā)生，發(fā)生率為70％～100％，產(chǎn)生的體細胞胚按常規(guī)程序萌發(fā)，獲得完整的再生植株。
全文摘要
一種提高苜蓿體細胞胚胎發(fā)生率的方法，涉及植物組織培養(yǎng)方法技術(shù)領(lǐng)域，選取苜蓿種子，萌發(fā)無菌苗；切斷植株上部扦插于MS
文檔編號A01H1/00GK1759666SQ20051001722
公開日2006年4月19日 申請日期2005年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月28日
發(fā)明者劉艷芝, 王中偉, 王玉民, 董英山, 呂德?lián)P 申請人:吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院