專利名稱：一種木本植物花藥培養(yǎng)胚狀體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種木本植物花藥培養(yǎng)胚狀體的方法，具體地說，是通過花藥培養(yǎng)技術(shù)獲得胚狀體的方法。
背景技術(shù)：
申請(qǐng)?zhí)?2158575.X發(fā)明名稱為“一種花藥或花粉培養(yǎng)獲得單倍體植株的方法”，公開了一種將花藥直接接種于液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行花藥漂浮培養(yǎng)。首先，該方法是針對(duì)所有植物的話，沒有實(shí)用價(jià)值，因?yàn)閷?duì)于花藥花粉培養(yǎng)而言，植物種類不同，培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方法決不相同，各種植物上得到的結(jié)果只對(duì)本植物有效。其次，它沒有清楚說明是通過何種途徑實(shí)現(xiàn)植株再分化?；ㄋ幓ǚ叟囵B(yǎng)實(shí)現(xiàn)植株再生的途徑有兩條，一是愈傷組織直接再分化形成芽；二是再分化形成胚狀體，胚狀體萌發(fā)成苗。最后，就花藥花粉培養(yǎng)而言，獲得的植株不一定就是單倍體，還存在一個(gè)篩選的過程。
枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)為薔薇科(Rosaceae)枇杷屬(Eriobotrya)植物，別名盧橘，是我國亞熱帶地區(qū)的珍稀特產(chǎn)水果。果實(shí)的成熟期一般在4～6月，正值水果淡季，果實(shí)色澤美觀、果肉鮮美可口，深受消費(fèi)者的喜愛，市售價(jià)格較高；據(jù)劉國強(qiáng)等統(tǒng)計(jì)，我國枇杷約有14個(gè)種，600多個(gè)品種。目前，我國枇杷的品種選育途徑有以下幾種(1)實(shí)生選種。如由龍泉驛區(qū)林業(yè)局選育出的特晚熟枇杷新品種“紅燈籠”；福建省果樹研究所選育出的高產(chǎn)、早熟新品種“長紅3號(hào)”；少核、可食率高的“太城4號(hào)”；江西科委選育出的抗寒優(yōu)質(zhì)品種“楊梅洲四號(hào)”；江蘇吳縣果樹研究所選出的果大、質(zhì)優(yōu)的白沙枇杷“冠玉”等。(2)雜交育種。如由福建省農(nóng)科院果樹研究所以大果型“解放鐘”為父本，“香甜”為母本雜交育成的“香鐘11號(hào)”；以解放鐘為母本，早熟日本枇杷“森尾早生”作父本雜交育成的“早鐘6號(hào)”。(3)引種。我國從日本引進(jìn)的枇杷品種有“瑞穗”、“茂木”、“森尾早生”、“田中”、“戶越”等，最近又從西班牙引進(jìn)一些新的品種，這些品種的引進(jìn)豐富了我國枇杷的種質(zhì)資源，為培育新的品種奠定了基礎(chǔ)。(4)生物技術(shù)育種。由于枇杷童期長，常規(guī)育種難度大，通過生物技術(shù)育種可以加速育種進(jìn)程。萬志剛等對(duì)白沙枇杷“冠玉”的莖尖培養(yǎng)、孔素萍等對(duì)“大五星”枇杷的胚培養(yǎng)都加快了良種繁育速度；彭曉軍、陳振光、林順權(quán)等通過對(duì)枇杷胚乳的離體培養(yǎng)試驗(yàn)，獲得了再生植株；林慶良、林順權(quán)、陳發(fā)興等進(jìn)行的枇杷原生質(zhì)體培養(yǎng)，為通過原生質(zhì)體融合技術(shù)培育枇杷新品種奠定了基礎(chǔ)；(5)其它育種途徑。如黃金松等利用秋水仙素作為誘變劑獲得了四倍體枇杷“閩三號(hào)”；李孫逵、鄭少泉等用60Co-γ射線輻射源分別處理了枇杷種子和枝條，有利的變異主要是少核、高可溶性固形物、細(xì)肉質(zhì)、豐產(chǎn)和短枝等類型，幾率為0.48％，同時(shí)可提早結(jié)實(shí)。
但是由于枇杷的特殊習(xí)性，屬多年生木本果樹，有較長的營養(yǎng)生長時(shí)期，少則數(shù)年，多則數(shù)十年，然后才能生殖繁衍，這就使得按常規(guī)雜交育種方法進(jìn)行枇杷育種周期長，且效率低，需要一種新的育種方法改變目前的現(xiàn)狀。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了一種木本植物花藥培養(yǎng)胚狀體的方法，本發(fā)明的另一技術(shù)方案是提供了采用該方法獲得的木本植物的胚狀體。
本發(fā)明提供了一種木本植物花藥培養(yǎng)胚狀體的方法，它是取木本植物花藥內(nèi)的花粉小孢子的發(fā)育處于單核晚期，在無菌條件下，接種于愈傷細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以分化形成胚狀體。
進(jìn)一步地，所述的木本植物是枇杷屬植物。
更進(jìn)一步地，所述的木本植物是枇杷Eriobotrya japonica Lindl.。
其中，所述的枇杷花藥胚狀體的制備方法包括如下步驟a、取處于單核早期到單核晚期小孢子的枇杷花蕾，低溫處理，刮去表面絨毛，清洗、消毒滅菌；b、從a步驟中消毒滅菌后的花蕾中取出花藥，在無菌條件下接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在23±1℃黑暗條件下誘導(dǎo)枇杷花藥脫分化形成愈傷組織；c、取b步驟的愈傷組織，接種于胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，愈傷組織再分化，形成胚性愈傷組織；d、再按c步驟方式培養(yǎng)，胚性愈傷組織再分化形成本發(fā)明胚狀體。
其中，a步驟所述的低溫處理為4℃黑暗條件下低溫處理48小時(shí)。溫度必須保持4℃恒定不變。
其中，b步驟所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+7％蔗糖+0.5mg/L 2，4-D+2.0mg/LBA。
其中，c步驟所述的胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+3％蔗糖+0.05mg/L ZT+0.02mg/LIBA+0.02mg/L NAA。
培養(yǎng)基原料及濃度的選擇決定了分化的效果。
其中，c步驟所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下為光照2000lux，16h/d，共4周。整個(gè)培養(yǎng)過程對(duì)培養(yǎng)條件要求嚴(yán)格一致，各參數(shù)不能出現(xiàn)波動(dòng)，溫度、光照和培養(yǎng)過程中光照和黑暗時(shí)間對(duì)花藥愈傷組織的再分化產(chǎn)生極顯著影響，最終導(dǎo)致愈傷組織失去再分化能力。
枇杷花蕾的采集時(shí)間與預(yù)處理溫度、時(shí)間和方法的不同，培養(yǎng)條件(愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)間黑暗條件、溫度23±1℃)、(誘導(dǎo)胚狀體再分化時(shí)暗培養(yǎng)和光培養(yǎng)的時(shí)間比)、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基類型、激素種類和配比等。這些方面均是各種植物花藥培養(yǎng)是的區(qū)別點(diǎn)，也是本發(fā)明方法的技術(shù)特征。
本發(fā)明還提供了采用該方法獲得的木本植物的胚狀體。
本發(fā)明還提供了采用該方法獲得的枇杷花藥的胚狀體。
本發(fā)明制備胚狀體所采用的途徑為采用細(xì)胞工程手段，誘導(dǎo)枇杷花藥內(nèi)小孢子脫分化形成愈傷組織，通過特定的基本培養(yǎng)基、植物激素的種類、濃度和配比及培養(yǎng)條件，實(shí)現(xiàn)愈傷組織的再分化，形成胚狀體。
本發(fā)明明確了花藥培養(yǎng)獲得胚狀體，花藥培養(yǎng)育種，是將花粉培育成單倍體植株，再經(jīng)染色體自然或人工加倍得到純合二倍體的一種育種法。這種染色體加倍產(chǎn)生的純合二倍體，在遺傳上非常穩(wěn)定，不發(fā)生性狀分離，因此，花培育種能極早穩(wěn)定分離后代、縮短育種年限。由于單倍體選擇的顯性方差減少，加性方差成倍增加，所以，在同一選擇周期中，單倍體選擇效率要比二倍體高得多。同時(shí)，花培加倍后的純合二倍體植株，可排除雜合體中顯性因子掩蓋隱性因子造成的干擾，提高選擇的準(zhǔn)確性和可靠性。由于花粉植株是由單倍體直接加倍形成的，故隱性性狀得以純合表現(xiàn)，而且花粉植株不論來源于F1或F2，其當(dāng)代株系均表現(xiàn)豐富的多樣性，如株高、生育期、育性及抗性等。這些性狀相互交叉，組成了具有多種形態(tài)特征的花培株系，因此，花培育種既可充分利用植物的種質(zhì)資源，又可獲得性狀的多樣性?；ㄋ幣郀铙w是育種(獲得單倍體、純合二倍體和多倍體枇杷種質(zhì)資源)、組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)研究(研究胚胎的發(fā)生和發(fā)育)、轉(zhuǎn)基因研究與應(yīng)用(生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物)、快速繁殖(生產(chǎn)優(yōu)良種苗)、人工種子生產(chǎn)(遺傳性狀優(yōu)良個(gè)體推廣)等方面的優(yōu)良材料和載體。
采用生物技術(shù)輔助育種，可大大加快木本果樹的育種速度和進(jìn)程，對(duì)隱性基因而言，常規(guī)育種F2代中，隱性基因純合的幾率為(1/4)n，其中n為目的隱性基因的個(gè)數(shù)。通過花藥培養(yǎng)獲得單倍體，再對(duì)單倍體進(jìn)行染色體加倍，即可完成一次選育。通過單倍體育種技術(shù)，可迅速獲得基因純合的個(gè)體，尤其是對(duì)隱性基因的利用，F(xiàn)2代隱性基因純合個(gè)體的獲得的幾率為(1/2)n。節(jié)約數(shù)十年的時(shí)間?？纱蟠蠹涌扈凌擞N工作的進(jìn)程；提高枇杷優(yōu)良品種的選育效率。
本發(fā)明實(shí)現(xiàn)枇杷花藥愈傷組織的再分化，得到胚狀體，為枇杷遺傳工程建立起良好的育種材料，大大加快枇杷育種進(jìn)程，提高選育效率，節(jié)約大量人力物力，具有重大的理論和現(xiàn)實(shí)意義為生物技術(shù)的上游技術(shù)(轉(zhuǎn)基因)奠定了良好的基礎(chǔ)，為組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)研究、快速繁殖(生產(chǎn)優(yōu)良種苗)、人工種子生產(chǎn)(遺傳性狀優(yōu)良個(gè)體推廣)等方面的優(yōu)良材料和載體。
顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式
實(shí)驗(yàn)例1 本發(fā)明木本植物花藥培養(yǎng)胚狀體的方法(1)取含有處于單核早期到單核晚期小孢子的枇杷花蕾，用無菌水洗凈，然后用濕紗布包裹后放入密閉容器，置于4℃黑暗條件下低溫處理48小時(shí)；必須確定適宜于花粉培養(yǎng)的小孢子發(fā)育時(shí)期，發(fā)育時(shí)期的不同，小孢子在離體培養(yǎng)時(shí)的表現(xiàn)也不同，直接影響到花藥培養(yǎng)的成功與否。
(2)使用手術(shù)刀刮去枇杷花蕾表面絨毛，置于3％Tween溶液中清洗一遍，然后用蒸餾水沖洗3～4次。
(3)在潔凈工作臺(tái)上，用0.1％升汞消毒8分鐘，然后用無菌水沖洗花蕾4～5次。
枇杷花蕾上密被厚厚的絨毛，對(duì)微生物提供了良好的庇護(hù)，很不利于消毒滅菌。通過試驗(yàn)，必須確定合理的消毒殺菌程序，這樣才能徹底殺滅微生物而不至于傷及枇杷花藥，直接決定能否成功建立起外植體材料。
(4)在培養(yǎng)皿中，使用手術(shù)刀及槍形鑷子，剝開枇杷花蕾，小心取出花藥并徹底除去花藥上附帶的花絲并剔除受傷的花藥。消毒滅菌后，將花藥從花蕾中完好的取出，并確?；ńz被徹底清除。因?yàn)橐坏┗ㄋ幈谑軅蚧ńz未被清除徹底，將導(dǎo)致花藥壁或花絲這些二倍體優(yōu)先形成愈傷組織，而影響試驗(yàn)?zāi)康牡倪_(dá)到。
(5)將枇杷花藥在無菌條件下接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+7％蔗糖+0.5mg/L2，4-D+2.0mg/L BA)上，每只三角瓶接種20枚花藥，置于23±1℃黑暗條件下誘導(dǎo)枇杷花藥脫分化形成愈傷組織。適宜的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，是決定花粉小孢子能否脫分化的關(guān)鍵。適宜的培養(yǎng)基、植物激素的種類和配比及培養(yǎng)條件能改變花粉小孢子的發(fā)育方向，從而實(shí)現(xiàn)脫分化，形成愈傷組織。為下一步的再分化打下基礎(chǔ)。
(6)通過4周的暗培養(yǎng)，愈傷組織生長并漲破花藥壁。切取長出的愈傷組織，接種于胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+3％蔗糖+0.05mg/L ZT+0.02mg/L IBA+0.02mg/L NAA)上，光照2000lux，16h/d。4周后愈傷組織開始再分化，形成胚性愈傷組織；再經(jīng)4周培養(yǎng)，胚性愈傷組織再分化形成胚狀體。
進(jìn)行花藥花粉離體培養(yǎng)的目的在于實(shí)現(xiàn)植株再生。枇杷花藥脫分化形成愈傷組織是基礎(chǔ)，愈傷組織再分化才使目的，愈傷組織再分化有兩條途徑，一是直接分化途徑；二是胚狀體途徑。其中以胚狀體途徑意義最為重大，胚狀體可用于組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)研究、轉(zhuǎn)基因研究、快速繁殖、人工種子生產(chǎn)等方面。實(shí)現(xiàn)脫分化形成胚狀體的關(guān)鍵在于合適的培養(yǎng)基種類；植物激素的種類、組合、濃度和配比；適宜的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方法。
實(shí)驗(yàn)例2 本發(fā)明木本植物花藥培養(yǎng)胚狀體的方法中培養(yǎng)基的篩選表12，4-D對(duì)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

所有的枇杷花藥均培養(yǎng)在MS基本培養(yǎng)基上，附加70g/L蔗糖和2.0mg/L BA。進(jìn)行最適2，4-D濃度的篩選。
表2蔗糖濃度對(duì)花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響

所有的枇杷花藥均培養(yǎng)在MS基本培養(yǎng)基上，附加0.5mg/L 2，4-D和2.0mg/LBA。進(jìn)行最適蔗糖濃度的篩選。
表3ZT，NAA和IBA對(duì)花藥愈傷組織再分化形成胚狀體的影響

所有的枇杷花藥愈傷組織均培養(yǎng)在MS基本培養(yǎng)基上，附加0.01，0.05，0.10和0.50mg/L ZT、0.01，0.02，和0.04mg/L NAA與0.01，0.02，0.04mg/L的組合，蔗糖濃度均為30g/L，進(jìn)行再分化培養(yǎng)基最佳植物激素組合的篩選。
結(jié)果欄中采用鄧肯氏多重比較方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，相同字母代表差異不顯著，不同字母代表差異顯著。小寫字母P＝0.05，大寫字母P＝0.01。(％愈傷組織、％胚狀體誘導(dǎo)后的abc或ABC，P＝0.05或P＝0.01時(shí)差異顯著性，不同字母代表實(shí)驗(yàn)結(jié)果間差異顯著，相同字母表示結(jié)果差異不顯著。)通過上述試驗(yàn)可知，雖然培養(yǎng)基中原料為常規(guī)原料，但是選擇不同，濃度配比不同，直接影響了化胚狀體的得率。
附MS培養(yǎng)基配方大量元素二水合氯化鈣(CaCl2)440.0mg/L、磷酸二氫鉀(KH2PO4)170.0mg/L、硝酸鉀(KNO3)1900.0mg/L、七水合硫酸鎂(MgSO4.7H2O)370.0mg/L、硝酸銨(NH4NO3)1650.0mg/L。微量元素五水合硫酸銅(CuSO4.5H2O)0.025mg/L、鐵鹽(FeNaEDTA)36.7mg/L、硼酸(H3BO3)6.2mg/L、一水合硫酸錳(MnSO4.H2O)16.9mg/L、七水合硫酸鋅(ZnSO4.7H2O)8.6mg/L、四水合鉬酸鈉(Na2Mo4.4H2O)0.25mg/L、碘化鉀(KI)0.83mg/L。有機(jī)物甘氨酸(Glycine)2.0mg/L、肌醇(Myo-inositol)100mg/L、煙酸(Nicotinic acid)0.5mg/L、VB60.5mg/L、VB10.1mg/L。
2，4-D2，4-dichlorophenoxyacetic acid(2，4-2氯苯氧乙酸)；BAbenzyladenine(芐基嘌呤)；IBAindolebutyric acid(吲哚丁酸)；NAAα-naphthaleneacetic acid(萘乙酸)；KTkenetin(激動(dòng)素)；MS mediumMurashige and Skoog(1962)(MS)medium(MS培養(yǎng)基)；ZTzeatin(玉米素)。
權(quán)利要求
1.一種木本植物花藥培養(yǎng)胚狀體的方法，其特征在于取木本植物花藥內(nèi)的花粉小孢子的發(fā)育處于單核晚期，在無菌條件，23±1℃黑暗條件下接種于愈傷細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以分化形成胚狀體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的木本植物花藥培養(yǎng)胚狀體的方法，其特征于所述的木本植物是枇杷屬植物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的木本植物花藥培養(yǎng)胚狀體的方法，其特征在于所述的木本植物是枇杷Eriobotrya japonica Lindl.。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的木本植物花藥培養(yǎng)胚狀體的方法，其特征在于它包括如下步驟a、取處于單核早期到單核晚期小孢子的枇杷花蕾，4℃黑暗條件下浸泡48小時(shí)，刮去表面絨毛，清洗、消毒滅菌；b、從a步驟中消毒滅菌后的花蕾中取出花藥，在無菌條件下接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在23±1℃黑暗條件下誘導(dǎo)枇杷花藥脫分化形成愈傷組織；c、取b步驟的愈傷組織，接種于胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，愈傷組織再分化，形成胚性愈傷組織；d、再按c步驟方式培養(yǎng)，胚性愈傷組織再分化形成本發(fā)明胚狀體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的木本植物花藥培養(yǎng)胚狀體的方法，其特征在于b步驟所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+7％蔗糖+0.5mg/L 2，4-D+2.0mg/L BA。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的木本植物花藥培養(yǎng)胚狀體的方法，其特征在于c步驟所述的胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+3％蔗糖+0.05mg/L ZT+0.02mg/L IBA+0.02mg/LNAA。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的木本植物花藥培養(yǎng)胚狀體的方法，其特征在于c步驟所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下為溫度23±1℃，光照2000lux，16h/d，共4周。
8.采用權(quán)利要求1所述的方法獲得的木本植物的胚狀體。
9.采用權(quán)利要求4所述的方法獲得的枇杷花藥的胚狀體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種木本植物花藥培養(yǎng)胚狀體的方法，它是取木本植物花藥內(nèi)的花粉小孢子的發(fā)育處于單核晚期，在無菌條件下，接種于愈傷細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以分化形成胚狀體。所述的木本植物是枇杷屬植物。本發(fā)明方法加快枇杷育種進(jìn)程，提高枇杷優(yōu)良品種的選育效率。
文檔編號(hào)A01G1/00GK1663359SQ20051002047
公開日2005年9月7日 申請(qǐng)日期2005年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月7日
發(fā)明者王永清, 李俊強(qiáng), 吳葒, 周蘭英, 鄧群仙, 陳紅 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)