專利名稱：一種對表皮葡萄球菌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)YycG蛋白的抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作用于表皮葡萄球菌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)關(guān)鍵新蛋白YycG的小分子抑制物；YycG小分子抑制物的分子結(jié)構(gòu)；該類小分子抑制物作為藥物化合物預(yù)防或治療相關(guān)細菌感染性疾病的方法，其特征在于使用該類小分子抑制物作為活性成分的母核結(jié)構(gòu)，篩選預(yù)防和/或治療藥物。
背景技術(shù)：
對全基因組測序的表皮葡萄球菌ATCC12228株進行分析發(fā)現(xiàn)其具有16對雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。雙組分調(diào)控系統(tǒng)主要存在于各種原核生物細胞，調(diào)控生物生長、毒力等多種生物學(xué)功能，而真核細胞中未能發(fā)現(xiàn)有同源蛋白。細菌的雙組分調(diào)控系統(tǒng)包括組氨酸蛋白激酶和反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，組氨酸蛋白激酶在受到外界刺激后激活，將信號轉(zhuǎn)遞給下游蛋白以調(diào)控細菌的相關(guān)生物學(xué)活性。我們對表皮葡萄球菌雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中的YycG蛋白(YycG組氨酸蛋白激酶)進行了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)三維模擬，并根據(jù)此模型，利用對接軟件進行虛擬，獲得能夠抑制表皮葡萄球菌等革蘭陽性細菌生長和抑制生物膜形成的小分子抑制物。
S.epidernidis已成為移植手術(shù)中發(fā)生醫(yī)源性感染的最主要因素。除此之外，由于抗生素的濫用，出現(xiàn)了更嚴(yán)重的多抗性和抗萬古霉素的S.epidernidis。而S.epidernidis產(chǎn)生抗藥性的主要原因是附著在醫(yī)療器械表面的細菌分泌保護性的生物膜，該生物膜可以阻礙傳統(tǒng)的抗生素穿過作用于細菌，發(fā)揮殺菌效果。除了醫(yī)療器械上的S.epidernidis，感染宿主體內(nèi)的S.epidernidis分泌的生物膜可以阻礙宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。因此特異性具有破壞生物膜和殺傷細菌的新型抗生素在發(fā)揮殺菌作用上具有更廣泛的前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種對細菌YycG組氨酸激酶抑制劑。
本發(fā)明的另一目的是提供該種該種小分子抑制物的醫(yī)學(xué)用途包括破壞生物膜和殺傷細菌的雙重功能。
本發(fā)明是這樣實施的本發(fā)明提供針對細菌YycG組氨酸激酶抑制劑AG52具有如下結(jié)構(gòu)
本發(fā)明通過蛋白結(jié)構(gòu)分子模建和虛擬高通量篩選技術(shù)來篩選表皮葡萄球菌組氨酸蛋白激酶YycG蛋白潛在的小分子抑制物(化合物)，經(jīng)體外生物學(xué)實驗證實其中1個小分子化合物能有效抑制幾種臨床常見的革蘭陽性球菌生長和抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成，且對哺乳動物細胞無明顯毒性。
本發(fā)明實驗方法是采用96孔板生物膜形成體外模型，將表皮葡萄球菌生物膜形成陽性株ATCC35984于不同的小分子化合物混合(終濃度200μM)，接種于96孔板上，同時以表皮葡萄球菌生物膜形成陰性株ATCC12228為陰性對照，37℃培養(yǎng)20小時后，細菌在孔內(nèi)形成生物膜的強弱可用結(jié)晶紫染色后在OD570讀數(shù)判斷。此外，用美國的NCCLS(the NationalCommittee for Clinical Laboratory Standards)推薦的標(biāo)準(zhǔn)試管稀釋法檢測小分子化合物的最小抑菌濃度(MIC)，用MTT法檢測小分子化合物對哺乳動物細胞的毒性作用，用96孔板法檢測小分子化合物對人紅細胞的溶血作用。該小分子化合物對表皮葡萄球菌生物膜形成的影響見表1。該小分子化合物對幾種臨床常見的革蘭陽性球菌的生長抑制作用，即最小抑菌濃度見表2。該小分子化合物對哺乳動物細胞的毒性作用見表3。該小分子化合物與目的蛋白表皮葡萄球菌組氨酸激酶YycG保守功能域片段的結(jié)合平衡常數(shù)以及抑制組氨酸蛋白激酶YycG的自身磷酸化活性的半數(shù)抑制率濃度見表4。該小分子化合物對人紅細胞的溶血作用見圖1。
表1結(jié)果說明該小分子化合物在體外能明顯抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成，與不加化合物的對照組相比降低生物膜形成30％以上。
表2結(jié)果說明該小分子化合物能明顯抑制幾種臨床常見的革蘭陽性球菌生長，通過標(biāo)準(zhǔn)試管稀釋法獲得的該小分子化合物的最小抑菌濃度列于表2。
表3結(jié)果說明該小分子化合物對Vero細胞生長的半數(shù)抑制率在200μM以上，在最小抑菌濃度該小分子化合物對Vero細胞的生長抑制率為1％，基本上無毒性。
表4結(jié)果說明該小分子化合物與目的蛋白表皮葡萄球菌組氨酸激酶YycG保守功能域片段有很強的結(jié)合力(結(jié)合平衡常數(shù)KD＜10-5M＝，且能明顯抑制蛋白組氨酸激酶YycG的自身磷酸化活性(半數(shù)抑制濃度＜50μM＝。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.發(fā)現(xiàn)一個小分子化合物AG52在體外能明顯抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成，同時能顯著抑制幾種臨床常見的革蘭陽性球菌的生長。
2.該小分子化合物在最小抑菌濃度時對哺乳動物細胞基本無毒性，且對人紅細胞無明顯的溶血作用。
3.該小分子化合物與目的蛋白表皮葡萄球菌組氨酸激酶YycG保守功能域片段有很強的結(jié)合力，且能明顯抑制蛋白組氨酸激酶YycG的自身磷酸化活性。
4.該小分子化合物有望通過進一步化學(xué)結(jié)構(gòu)的改造，開發(fā)為抗革蘭陽性球菌感染的新藥。
5.該小分子化合物具有破壞生物膜和殺傷細菌的雙重功能，因此它可以作為醫(yī)療器械消毒液，包括室內(nèi)的消毒試劑，特別是手術(shù)室消毒以及移植手術(shù)中免疫佐劑。


圖1小分子化合物AG52對人紅細胞的溶血作用。1％DMSO+紅細胞為陰性對照，1％細胞穿透液Triton-100+細胞為陽性對照。小分子化合物的MIC值為4μg/ml。Tet四環(huán)素，參考文獻報道其MIC值取0.3μg/ml；Cip環(huán)丙沙星，參考文獻報道其MIC值取0.25μg/ml。
圖1結(jié)果說明該小分子化合物在最小抑菌濃度(MIC)和4倍MIC濃度時，對人紅細胞沒有明顯的溶血作用。
具體實施例方式
下面結(jié)合實驗例對本發(fā)明進一步詳細描述但不限制本發(fā)明。
實施例采用96孔板生物膜形成體外模型，將表皮葡萄球菌生物膜形成陽性株ATCC35984與小分子化合物混合(終濃度200μM)，接種于96孔板上，同時以表皮葡萄球菌生物膜形成陰性株ATCC12228為陰性對照，37℃培養(yǎng)20小時后，細菌在孔內(nèi)形成生物膜的強弱可用結(jié)晶紫染色后在OD570讀數(shù)判斷。此外，用美國的NCCLS(the National Committee for ClinicalLaboratory Standards)推薦的標(biāo)準(zhǔn)試管稀釋法檢測小分子化合物的最小抑菌濃度(MIC)，用MTT法檢測小分子化合物對哺乳動物細胞的毒性作用，用96孔板法檢測小分子化合物對人紅細胞的溶血作用。詳細實驗方法如下一.表皮葡萄球菌生物膜形成體外檢測實驗1、將表皮葡萄球菌接種于新鮮的TSB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。
2、將細菌1∶200用新鮮的TSB培養(yǎng)基稀釋，和小分子化合物混合(終濃度200μM，溶劑DMSO終濃度為1％)，接種于96孔板，每孔200μl，每個樣品采用三復(fù)孔上樣，37℃靜置培養(yǎng)20小時。因小分子化合物溶解于DMSO中，因此設(shè)1％DMSO+表皮葡萄球菌生物膜陽性株為陽性對照，設(shè)1％DMSO+表皮葡萄球菌生物膜陰性株為陰性對照。
3、棄去菌液，用PBS洗板3次，晾干，每孔加200μl 2％結(jié)晶紫室溫染色5分鐘。
4、棄去多余染液，將板晾干，酶標(biāo)儀OD570讀數(shù)，每個樣品讀數(shù)取三復(fù)孔的均值。
5、計算小分子化合物對表皮葡萄球菌生物膜的抑制率6、 二、細菌生長抑制實驗(試管稀釋法)1、將細菌接種于新鮮的MH培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜。
2、將菌液1∶100接種于新鮮的MH培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長早期，用新鮮的MH培養(yǎng)基稀釋至OD600＝，每管1ml，加入不同濃度梯度的小分子化合物(溶劑DMSO終濃度保持1％)，37℃培養(yǎng)18小時。因小分子化合物溶解于DMSO中，因此設(shè)1％DMSO+細菌為對照，以無菌培養(yǎng)基為空白對照。
3、取出與空白對照比較，細菌不生長的濃度最低的一管即為該小分子化合物的最小抑菌濃度。
三、MTT法檢測細胞毒性1、將新鮮培養(yǎng)的Vero細胞接種于96孔板，每孔100ul細胞(約5×104細胞)，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)24小時，使細胞長成單層。
2、棄去培養(yǎng)基，加入100ul/每孔新鮮的MEM培養(yǎng)基，其中含有不同濃度的小分子化合物(溶劑DMSO終濃度保持1％)，每個樣品采用四復(fù)孔上樣，37℃，5％CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24小時。因小分子化合物溶解于DMSO中，因此設(shè)1％DMSO+細胞為對照。
3、每孔加入10ul MTT標(biāo)記物，37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)4小時。
4、將96孔板取出讀取OD570值，每個樣品讀數(shù)取四復(fù)孔的均值，計算不同濃度的小分子化合物對Vero細胞生長的抑制率5、 半數(shù)抑制量IC50值采用Logit法計算。
四、小分子化合物與目的蛋白結(jié)合及抑制磷酸化實驗1、將重組表達、純化的目的蛋白表皮葡萄球菌組氨酸激酶YycG保守功能域片段偶聯(lián)在能量共振生物傳感芯片(Biacore CM5型芯片)上，將待測的小分子化合物按一定的梯度稀釋，讓其流過芯片與蛋白相互作用，觀察小分子化合物與蛋白結(jié)合的情況，計算出結(jié)合平衡常數(shù)KD。
2、小分子化合物抑制組氨酸激酶YycG自身磷酸化的實驗用美國PROMEGA公司的Kinase-GloTMLuminescent Kinase Assay Kit(Cat.No.V6711，Promega，Madison，USA)完成。將4μg重組表達、純化的目的蛋白組氨酸激酶YycG保守功能域片段與梯度稀釋的小分子化合物在25℃作用20分鐘，然后加入100μMATP(反應(yīng)總體積50ul)在25℃作用20分鐘后將反應(yīng)混合物加入96孔酶標(biāo)板，每孔50ul，加入Kinase-GloTMReagent每孔50ul室溫靜置10分鐘，讀取化學(xué)發(fā)光值表示反應(yīng)剩余的ATP的量，實驗設(shè)不加小分子化合物組為對照組。最后計算小分子化合物對目的蛋白磷酸化的抑制率 半數(shù)抑制濃度IC50值采用Logit法計算。
五、紅細胞溶血實驗1、將分離的健康人紅細胞用無菌生理鹽水洗3遍，并稀釋至5％。
2、加入不同濃度的小分子化合物(溶劑DMSO終濃度保持1％)于5％紅細胞懸液中，每孔200ul接種于96孔板上，每個樣品采用三復(fù)孔。因小分子化合物溶解于DMSO中，因此設(shè)1％DMSO+細胞為陰性對照，設(shè)1％細胞穿透液Triton-100+細胞為陽性對照，并設(shè)兩種常用抗生素四環(huán)素和環(huán)丙沙星作對照。
3、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1小時，離心后取100ul上清移入另一塊干凈的96孔板，OD570讀數(shù)，每個樣品讀數(shù)取三復(fù)孔的均值。
一.小分子化合物AG52對表皮葡萄球菌生物膜形成的影響見表1表1結(jié)果說明該小分子化合物在體外能明顯抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成，與不加化合物的陽性對照相比，能降低生物膜形成30％以上。
二.小分子化合物AG52對幾種臨床常見的革蘭陽性球菌生長的抑制作用見表2表2結(jié)果說明該小分子化合物對幾種臨床常見的革蘭陽性球菌(表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌及變異鏈球菌)生長有明顯的抑制作用，其最小抑菌濃度列于表2。
三.小分子化合物AG52對Vero細胞的毒性作用見表3表3結(jié)果說明在細胞水平，該小分子化合物的半數(shù)抑制率在200μM以上，在最小抑菌濃度時對Vero細胞的生長抑制率為1％，基本沒有毒性。
四.小分子化合物AG52與目的蛋白結(jié)合力及抑制蛋白磷酸化的作用見表4表4結(jié)果說明該小分子化合物與目的蛋白表皮葡萄球菌組氨酸激酶YycG保守功能域片段有很強的結(jié)合力(結(jié)合平衡常數(shù)KD＜10-5M)，且能明顯抑制蛋白組氨酸激酶YycG的自身磷酸化活性(半數(shù)抑制濃度＜50μM＝。
五.小分子化合物AG52對人紅細胞的溶血作用見圖1圖1結(jié)果說明與陰性對照、陽性對照及兩種常用抗生素對照相比，該小分子化合物在最小抑菌濃度(MIC)和4倍MIC濃度時，對人紅細胞沒有明顯溶血作用。
表1小分子化合物AG52對表皮葡萄球菌生物膜形成的影響(X±S)

a陽性對照指1％DMSO+表皮葡萄球菌生物膜形成陽性株b陰性對照指1％DMSO+表皮葡萄球菌生物膜形成陰性株表2小分子化合物AG52對幾種臨床常見的革蘭陽性球菌生長的抑制作用

表3小分子化合物AG52對Vero細胞的毒性作用

a括號中為小分子化合物AG52對表皮葡萄球菌的最小抑菌濃度表4小分子化合物AG52與目的蛋白表皮葡萄球菌組氨酸激酶YycG保守功能域片段結(jié)合力及抑制蛋白磷酸化的作用

aKD值為結(jié)合平衡常數(shù)，代表小分子化合物與目的蛋白表皮葡萄球菌組氨酸激酶YycG保守功能域片段結(jié)合力，其值越小表示結(jié)合力越強bIC50值即半數(shù)抑制濃度，代表小分子化合物抑制反應(yīng)體系中半數(shù)組氨酸激酶YycG保守功能域片段自身磷酸化時的濃度
權(quán)利要求
1.一種結(jié)構(gòu)式如下的化合物的用途對表皮葡萄球菌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中YyCG蛋白具有抑制作用
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述化合物的用途，其特征在于對革蘭氏陽性球菌具有抑制作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物的用途，其特征在于在制備和治療由革蘭氏陽性球菌引起的疾病的藥物中應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物的用途，其特征在于抑制葡萄球菌生物膜的形成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物的用途，其特征在于配制成消毒液作為醫(yī)療器械消毒包括室內(nèi)消毒及移植手術(shù)中免疫佐劑。
全文摘要
本發(fā)明揭示四個小分子化合物對表皮葡萄球菌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中YyCG蛋白具有抑制作用，抑制葡萄球菌生物膜的形成，抑制革蘭氏陽性球菌，在制備和治療由革蘭氏陽性球菌引起疾病的藥物中應(yīng)用，配制成消毒液作為醫(yī)療器械消毒包括室內(nèi)消毒及移植手術(shù)中免疫佐劑。
文檔編號A01N43/90GK1875974SQ20051002665
公開日2006年12月13日 申請日期2005年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月10日
發(fā)明者蔣華良, 羅小民, 沈旭, 瞿滌, 張健, 秦智強, 楊曉梅 申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所, 復(fù)旦大學(xué)