專利名稱：一種水稻體細胞無性系誘變育種方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)和作物育種領域，特指基于組織培養(yǎng)且結(jié)合高濃度2，4-D處理的體細胞無性系篩選育種的方法。
背景技術(shù)：
基因突變在生物界中廣泛存在。其中，自發(fā)突變是指自然條件下發(fā)生的突變，是生物變異的重要來源，也是自然進化的基礎。無論是低等生物，還是高等動植物及人類，都可能發(fā)生自然突變。自發(fā)突變?yōu)槿祟愄峁┝藰O有價值的育種材料。例如在水稻育種中，上世紀60年代水稻矮桿突變的發(fā)現(xiàn)揭開了矮化育種的序幕；細胞質(zhì)雄性不育株的發(fā)現(xiàn)使水稻三系法雜種優(yōu)勢的利用成為現(xiàn)實；而光(溫)敏核不育水稻的發(fā)現(xiàn)則為采用兩系法利用水稻亞種間的雜種優(yōu)勢鋪平了道路，從而降低了雜交育種的成本。然而自發(fā)突變的頻率是很低的，在高等生物中，大約10萬個到1億個生殖細胞中才會有一個生殖細胞發(fā)生突變，突變頻率是10-5～10-8，且許多突變細胞通過表型無法鑒定而丟失，很難進行系統(tǒng)收集。通過自發(fā)突變育種是一個極其漫長的過程，而且還需要一定的運氣和機遇，因此，該方法在作物育種中受到了極大的限制，只能是可遇而不可求。
隨著分子生物學的不斷發(fā)展，基因的克隆和轉(zhuǎn)化已是一種常規(guī)的生物技術(shù)手段，通過基因槍的轟擊和農(nóng)桿菌的介導等方法已成功地在單雙子葉植物中進行了基因的轉(zhuǎn)化，并篩選培養(yǎng)出了許多轉(zhuǎn)基因作物品種。然而在轉(zhuǎn)基因過程中，轉(zhuǎn)入了一種外源的選擇標記基因，如抗抗生素基因和抗除草劑基因等，使轉(zhuǎn)基因作物存在著一種潛在的風險，引起了人們極大的關注。為了不使這種選擇抗性標記基因在自然環(huán)境中擴散開來，國家和政府制定了較為嚴格的審查程序，須經(jīng)多年的審查方可在大田釋放和推廣。加之現(xiàn)在有些消費者擔心轉(zhuǎn)基因食品帶來的潛在危害，從而對轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品加以抵制。因此，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在作物育種中也受到了一定的限制。
上個世紀遺傳學上最重要的發(fā)現(xiàn)之一就是突變能夠被誘發(fā)。利用物理因素、化學藥劑、太空射線以及組織培養(yǎng)等方法可以誘導生物發(fā)生突變。物理誘變和化學誘變雖然是穩(wěn)定高效的誘變方式，但往往造成多個基因的突變，從而導致多個性狀發(fā)生改變，甚至使無性系親本的某些優(yōu)良性狀丟失，而且后代穩(wěn)定慢。體細胞無性系在培養(yǎng)過程中常常發(fā)生基因突變，變異體基本保持源品種的優(yōu)良特性，多數(shù)為單基因變異，后代穩(wěn)定快。但是，通過組織培養(yǎng)的體細胞變異，其變異頻率隨培養(yǎng)時間延長而提高，而且隨著培養(yǎng)時間的延長，其愈傷組織的分化頻率也急劇下降，往往導致再生苗分化的極度困難。因此，尋找一種愈傷組織誘變處理比較溫和，而且有較高的分化頻率，并能保持原無性系親本的許多優(yōu)良農(nóng)藝性狀且后代穩(wěn)定較快的新型育種方法顯得極為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種誘變效率高，愈傷組織的分化頻率高，育種周期短，且不具有任何潛在風險的簡便易行的新型水稻育種方法。
植物體細胞無性系在組織培養(yǎng)過程中，其染色體會發(fā)生斷裂和重排以及DNA的甲基化，也可導致點突變和轉(zhuǎn)座元素的激活跳躍。因此，通過組織培養(yǎng)可以激發(fā)染色體DNA的斷裂和重排，以及激活內(nèi)源轉(zhuǎn)座子或反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的跳躍插入，從而提高突變頻率。組織培養(yǎng)的體細胞變異頻率隨培養(yǎng)時間的延長而提高。但是隨著培養(yǎng)時間的延長，其愈傷組織的分化頻率也急劇下降，往往導致再生苗分化的極度困難。在組織培養(yǎng)過程中，通過提高繼代培養(yǎng)基中的2，4-D濃度，可提高無性系的變異頻率，并縮短了培養(yǎng)時間。因此，以高濃度2，4-D繼代誘變胚性愈傷組織1個周期(約25天)后，顯著提高了誘變頻率和分化頻率，再結(jié)合一定的選擇壓力對細胞突變體進行篩選可實現(xiàn)一定程度的定向誘變，從而提高了誘變效率，縮短了育種周期。
本發(fā)明的目的是通過下述方法實現(xiàn)的水稻體細胞無性系在組織培養(yǎng)過程中，提高繼代培養(yǎng)基中2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)濃度進行繼代誘變處理，使體細胞突變，再結(jié)合在低溫、高溫、高鹽、病蟲害的選擇壓力下對突變體進行篩選，實現(xiàn)無性系篩選育種。
所述的提高繼代培養(yǎng)基中2，4-D濃度進行繼代誘變處理則是指胚性愈傷組織于基本培養(yǎng)基MS+2，4-D 3.5-4.5mg/L培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)1個周期后，以24-26天為1個培養(yǎng)周期；再轉(zhuǎn)移至正常的繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)。其中誘變處理最優(yōu)的2，4-D濃度為4mg/L。
所述的胚性愈傷組織為繼代2-3個周期的胚性愈傷組織。
本發(fā)明以水稻的幼穗和成熟胚為外植體，在培養(yǎng)基中進行正常的愈傷組織的誘導、繼代，再經(jīng)高濃度2，4-D的MS培養(yǎng)基繼代誘變，再轉(zhuǎn)移至正常的繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后于分化培養(yǎng)基中進行分化及再生苗的生根。同時在培養(yǎng)基中離體培養(yǎng)過程中或再生苗在大田栽培過程中結(jié)合一定的選擇壓力以獲得所需農(nóng)藝性狀的突變株。
經(jīng)誘變得到的體細胞突變體根據(jù)需要采取不同的選擇壓力(如高溫、低溫、高鹽、病蟲害等)進行篩選，可實現(xiàn)一定程度的定向誘變。該篩選過程可在離體培養(yǎng)中進行，也可在大田栽培中進行。
體細胞突變體R1代經(jīng)一定的選擇壓力篩選后，于抽穗期套袋自交結(jié)實，并將符合目標性狀的變異株分單株采種。然后在相同選擇壓力下對R2，R3代再進行篩選，直至篩選到符合目標性狀且性狀不再分離的變異株為止。該變異株即為體細胞無性系誘變得到的品種。
本發(fā)明以高濃度2，4-D誘變處理繼代2-3個周期的胚性愈傷組織即可達到本發(fā)明目的。在作物育種中，利用這種方法誘導作物發(fā)生突變，并結(jié)合一定的選擇壓力進行篩選，從而加速了育種進程，同時也避免了因引入外源抗性標記基因所帶來的風險。
本發(fā)明方法具有操作簡便，誘變效率高，突變后代性狀穩(wěn)定快，并且不需要象轉(zhuǎn)基因技術(shù)那樣的昂貴的儀器設備，也因沒有引入外源基因而沒有任何潛在的環(huán)境及生態(tài)風險等優(yōu)點。針對不同的作物品種，只需將誘導、繼代、分化和生根培養(yǎng)基的激素濃度稍加改變，即可以通過本發(fā)明方法能快速高效地誘變出新的具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的作物品種。因此，本發(fā)明方法在作物育種及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有十分廣泛的應用前景。
通過本發(fā)明方法，我們以新型兩系溫敏核不育系株1S的幼穗和成熟胚誘導出了愈傷組織，再以高濃度2，4-D進行繼代誘變，然后對誘變后的愈傷組織進行分化和生根培養(yǎng)獲得了再生植株。經(jīng)過田間的篩選鑒定，于R3代就獲得性狀穩(wěn)定的矮桿突變株SV14S，而且還保留了株1S所具有的其它優(yōu)良農(nóng)藝性狀。同時，通過本發(fā)明方法我們以三系保持系中9B的幼穗誘導的愈傷組織，經(jīng)高濃度2，4-D進行繼代誘變處理后，然后經(jīng)繼代、分化和生根培養(yǎng)，獲得再生植株，并經(jīng)過田間的篩選鑒定，于R4獲得了性狀優(yōu)良且穩(wěn)定的突變株。
通過我們一系列的實驗證實，本發(fā)明方法是十分簡便可靠的，它具有誘導效率高，后代穩(wěn)定快，在作物育種中具有很好的應用前景。
本發(fā)明的優(yōu)點在于1.本發(fā)明方法所需的組織培養(yǎng)技術(shù)是一種應用廣泛的生物技術(shù)手段，且其成本低，技術(shù)要求不高，易于使用者掌握及該方法的推廣。
2.在提高誘導效率中所使用的2，4-D價廉易購，而且在使用中操作簡便，不需要昂貴的儀器設備和較高的技術(shù)要求。
3.由于沒有外源基因的導入，因而也沒有轉(zhuǎn)基因作物所具有的潛在的生態(tài)環(huán)境安全和食品健康安全等問題。通過此發(fā)明方法，一旦獲得具有優(yōu)良性狀的突變品種，就能很快獲準大田釋放和推廣。
4.體細胞無性系經(jīng)高濃度2，4-D的繼代誘變處理可大幅度提高變異頻率和誘導效率，同時又能很大程度地保留源作物品種的優(yōu)良性狀，再結(jié)合一定的選擇壓力可實現(xiàn)一定程度的誘發(fā)突變，從而大大縮短育種周期。一般來說，誘變突變體只需經(jīng)3代左右篩選即可定型。


圖1為幼穗誘導出的愈傷組織。
圖2為成熟胚誘導出的愈傷組織。
圖3為繼代時間對綠苗分化頻的影響。
圖4為分化培養(yǎng)圖。
圖5為SV14S和株1S的田間表型。
具體實施例方式
以下實施系列旨在說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明做限制。
實施例1.材料于田間采集花粉母細胞形成期的幼穗立即用于接種培養(yǎng)或儲存于4℃的冰箱中備用。若以成熟胚為外植體，則應選取活力較強(于4℃儲存不超過3年)飽滿無霉變的種子。
2.培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件選用MS為基本培養(yǎng)基，蔗糖濃度為3％，用0.7％的瓊脂固化，pH為5.8～6.2，在121℃濕熱高壓滅菌20min，在不同發(fā)育階段添加不同的激素(見表1)。培養(yǎng)溫度為25±1℃，光照強度為2000lx，光照時間為12小時/天。
表1.培養(yǎng)基種類與成分

注2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)；6-BA(6-芐基腺嘌呤)；IAA(吲哚-3-乙酸)；NAA(α-萘乙酸)3、愈傷組織的誘導將幼穗外層葉片剝?nèi)?，留旗葉鞘，置于70％酒精中浸泡1～2min，再置于0.1％HgCl2中滅菌7～10min。在超凈工作臺上用無菌水沖洗3～5次，除去旗葉鞘，將幼穗切成1cm左右的小段，接種于誘導培養(yǎng)基中以獲得愈傷組織(圖1)。若以成熟胚為外植體，則將水稻種子剝?nèi)シf殼，先用70％酒精浸泡1～2min，再置于0.1％HgCl2中滅菌7～10min，在超凈工作臺上用無菌水沖洗3~5次，接種于誘導培養(yǎng)基中以獲得愈傷組織(圖2)。
4.愈傷組織的繼代培養(yǎng)以25天為一個培養(yǎng)周期，挑取顏色淡黃，質(zhì)地致密的胚性愈傷組織于繼代培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng)。通過組織培養(yǎng)的體細胞變異，其變異頻率隨培養(yǎng)時間延長而提高。但是隨著培養(yǎng)時間的延長，其愈傷組織的分化頻率也急劇下降(見圖3)。因此，為了保持較高的分化頻率，我們以繼代2-3個周期的胚性愈傷組織來進行高濃度2，4-D的誘變處理。
5.高濃度2，4-D的誘變處理將誘導得到的愈傷組織經(jīng)繼代培養(yǎng)2-3個周期后，選取淡黃色，質(zhì)地致密的胚性愈傷組織培養(yǎng)于MS+2，4-D 4mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)1個周期(約25天)。高濃度2，4-D的誘變處理只能是1個培養(yǎng)周期左右，若處理時間過長，愈傷組織的分化頻率則顯著降低，甚至褐化壞死。1個周期后，再選取淡黃色致密的愈傷組織轉(zhuǎn)移至正常的繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)1個周期。
6.愈傷組織的分化培養(yǎng)挑取經(jīng)正常的繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)1個周期后的淡黃色、質(zhì)地致密的胚性愈傷組織于分化培養(yǎng)基進行分化培養(yǎng)(圖4)。對于繼代次數(shù)較多且較難分化的愈傷組織，當愈傷組織顯綠后可作適當?shù)母稍锾幚硪源龠M分化。
7.分化苗的生根培養(yǎng)將分化苗培養(yǎng)于生根培養(yǎng)基中誘導生根。大約1周左右就有大量的不定根長出。
8.練苗移栽將生根后的水稻苗于栽種前20天左右移出培養(yǎng)室，揭去三角瓶的封口膜，往三角瓶中加入少量水覆培養(yǎng)基以防霉菌生長。這樣練苗一個星期后，即可移栽于大田，移栽后一周內(nèi)注意保溫和遮陽，避免陽光直射，待生根定植后即可按常規(guī)方法管理。
9.突變體的篩選將R1代再生苗經(jīng)練苗后分株系移栽于大田中，再根據(jù)需要采取不同的選擇壓力(如高溫、低溫、高鹽、病蟲害等)進行篩選，抽穗期套袋使其自交結(jié)實。將符合目標性狀的變異株分單株采種。將R2代按株行再種于大田中，于各生長發(fā)育時期考查其主要農(nóng)藝性狀，對于符合目標性狀而其它優(yōu)良農(nóng)藝性狀不發(fā)生改變的株系再采種。再將R3代按株行種于大田，對其目標性狀和其它優(yōu)良農(nóng)藝性狀進行考查，若其性狀得以穩(wěn)定，則該突變株系即是我們所需的優(yōu)良誘變品種。若是性狀還不穩(wěn)定，則仍需進行R4、R5代篩選，直至性狀穩(wěn)定。一般來說經(jīng)篩選至R3代后性狀已經(jīng)保持穩(wěn)定了。
通過本實施例，我們從株1S的愈傷組織中經(jīng)高濃度2.，4-D誘變后篩選到了一系列矮桿溫敏核不育系(見表2)，其中SV14S的株高較矮而其它優(yōu)良農(nóng)藝性狀基本不變，是一個優(yōu)良的矮化溫敏雄性核不育品種(圖5)。同時，通過本實施例我們以三系保持系中9B的幼穗誘導的愈傷組織，經(jīng)高濃度2，4-D進行繼代誘變處理后，然后經(jīng)繼代、分化和生根培養(yǎng)，獲得再生植株，并經(jīng)過田間的篩選鑒定，于R4獲得了性狀優(yōu)良且穩(wěn)定的突變株SV9B。目前，其性狀正在田間做進一步的鑒定。
表2.體細胞變異系(R3)株高考察統(tǒng)計結(jié)果

權(quán)利要求
1.一種水稻體細胞無性系誘變育種方法，水稻體細胞無性系在組織培養(yǎng)過程中，提高繼代培養(yǎng)基中2，4-二氯苯氧乙酸濃度進行繼代誘變處理，使體細胞突變，再結(jié)合在低溫、高溫、高鹽、病蟲害的選擇壓力下對突變體進行篩選，實現(xiàn)無性系篩選育種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水稻體細胞無性系誘變育種方法，所述提高繼代培養(yǎng)基中2，4-二氯苯氧乙酸濃度進行繼代誘變處理則是指胚性愈傷組織于基本培養(yǎng)基MS+2，4-二氯苯氧乙酸3.5-4.5mg/L培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)1個周期后，以24-26天為1個培養(yǎng)周期；再轉(zhuǎn)移至正常的繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種水稻體細胞無性系誘變育種方法，所述繼代誘變處理2，4-二氯苯氧乙酸濃度為4mg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種水稻體細胞無性系誘變育種方法，胚性愈傷組織為繼代2-3個周期的胚性愈傷組織。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水稻體細胞無性系誘變育種方法，所述的體細胞是指水稻的幼穗或成熟胚的細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水稻體細胞無性系誘變育種方法，選用的培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，誘導培養(yǎng)基為MS+2，4-二氯苯氧乙酸2mg/L，繼代培養(yǎng)基為MS+6-芐基腺嘌呤0.2mg/L+2，4-二氯苯氧乙酸2mg/L，分化培養(yǎng)基為MS+6-芐基腺嘌呤2mg/L，生根培養(yǎng)基為MS+吲哚-3-乙酸0.5mg/L+α-萘乙酸0.5mg/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水稻體細胞無性系誘變育種方法，經(jīng)誘變得到的體細胞突變體根據(jù)需要采取不同的低溫、高溫、高鹽、病蟲害的選擇壓力進行篩選，可實現(xiàn)一定程度的定向誘變，從而縮短育種周期；該篩選過程可在離體培養(yǎng)中或大田栽培中進行。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水稻體細胞無性系誘變育種方法，體細胞突變體R1代經(jīng)選擇壓力篩選后，于抽穗期套袋自交結(jié)實，并將符合目標性狀的變異株分單株采種。然后在相同選擇壓力下對R2，R3代再進行篩選，直至篩選到符合目標性狀且性狀不再分離的變異株為止。
全文摘要
一種水稻體細胞無性系誘變育種方法，是指利用組織培養(yǎng)技術(shù)并結(jié)合高濃度2，4－D處理和選擇壓力進行的水稻體細胞無性系篩選育種的方法。體細胞無性系在組織培養(yǎng)過程中往往發(fā)生體細胞變異，其變異頻率隨培養(yǎng)時間延長而提高。經(jīng)高濃度2，4－D的MS培養(yǎng)基中繼代誘變，其變異頻率顯著提高。本發(fā)明方法以水稻的幼穗和成熟胚為外植體，在MS基本培養(yǎng)基中進行愈傷組織的誘導，愈傷組織再經(jīng)高濃度2，4－D繼代處理，能顯著提高變異頻率，再結(jié)合一定的選擇壓力對細胞突變體進行篩選，實現(xiàn)了一定程度的定向誘變，從而提高了誘變效率，縮短了育種周期。本發(fā)明方法具有簡便可靠，誘導效率高，后代穩(wěn)定快，育種周期短等優(yōu)點，在作物育種中具有廣泛的應用前景。
文檔編號A01H1/06GK1748479SQ200510032230
公開日2006年3月22日 申請日期2005年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月10日
發(fā)明者劉選明, 楊遠柱, 林建中, 陳彩艷, 唐冬英 申請人:湖南大學