專利名稱：平鯛雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及平鯛雌核發(fā)育的誘導(dǎo)方法，具體來說涉及平鯛雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù)：
許多海水魚類如牙鲆和鮟鱇魚等，在生長過程中都表現(xiàn)出明顯的性別差異，通常雌性比雄性生長快得多，因此實現(xiàn)全雌育種和養(yǎng)殖成為水產(chǎn)科技界和產(chǎn)業(yè)部門共同追求的目標(biāo)。日本在牙鲆全雌克隆誘導(dǎo)育種中運(yùn)用了染色體組操作技術(shù)，并已取得成功。
雌核發(fā)育是一種特殊的生殖方式，指卵子依靠自身的細(xì)胞核發(fā)育成個體的生殖行為，精子只對卵子起激活作用，而不參與個體發(fā)育，精子的遺傳物質(zhì)對其后代性狀不起控制作用，產(chǎn)生的后代承傳母性親本性狀，因此可以加快純系建立，提高育種速度，培育全雌新品系(種)。但是，用熱休克溫度法誘導(dǎo)虹鱒雌核發(fā)育二倍體，僅能獲得0.21％的孵化率(李忠勝等，動物學(xué)雜志，1997，32(5))；用冷休克溫度法誘導(dǎo)團(tuán)頭魴雌核發(fā)育二倍體的孵化率僅為0～5.67％(鄒曙明等，水產(chǎn)學(xué)報，2001，25(4))；有學(xué)者應(yīng)用活體化學(xué)誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)泥鰍雌核發(fā)育二倍體，雖然獲得較高的雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)率，但所用的試劑為秋水仙素或細(xì)胞松弛素B，這些生化試劑毒性強(qiáng)，操作上有一定危險性，注射生化試劑的魚不能食用，而且還可能對環(huán)境產(chǎn)生不利影響。
平鯛是我國沿海重要經(jīng)濟(jì)魚類，生長快，食性雜，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，為港灣、河口海水增養(yǎng)殖的優(yōu)良物種，其雌性也具有生長快的特點，因此平鯛的全雌單性種苗養(yǎng)殖在生產(chǎn)上有重要意義和應(yīng)用價值，然而目前對平鯛雌核發(fā)育研究仍屬空白，暫無可用的實際技術(shù)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種孵化率高且無危害的平鯛雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法。
本發(fā)明通過將稀釋的雄性平鯛的精子用紫外線輻射失活，再與正常的卵子混合受精，得到的雌核發(fā)育單倍體卵子經(jīng)過冷休克處理，最終得到平鯛雌核發(fā)育二倍體。雌核發(fā)育激活率達(dá)95％～99％，誘導(dǎo)率達(dá)96％～100％，孵化率47.3％～57.6％，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
本發(fā)明的平鯛雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法，其特征是包括以下步驟(1)用稀釋液稀釋平鯛精液并激活精子，稀釋后的精液厚度為1.5～2.5mm，精子密度0.5×108～1.5×108個·mL-1；(2)稀釋后的精子用紫外線輻射失活，輻射強(qiáng)度是400～750μW·cm-2，同時用振蕩器使稀釋液中的精子均勻分散；(3)失活的精液與正常的卵子充分混合受精；
(4)用冰海水對受精的卵子進(jìn)行冷休克處理，整個過程在黑暗中進(jìn)行，使平鯛雌核發(fā)育單倍體染色體組加倍成為雌核發(fā)育二倍體。
本發(fā)明的優(yōu)選條件是步驟1所述的精子稀釋液中精液與稀釋液的體積比為1∶60，所述的稀釋液最好是在黑暗環(huán)境下沉淀凈化、砂濾和高溫消毒的自然海水，鹽度為26～30；步驟2所述的振蕩器振蕩頻率是150～250次·min-1，所述的紫外線輻射，持續(xù)時間50～120s；步驟3所述的正常的卵子可以是離體20min以內(nèi)的卵子，所述的受精過程在微弱光強(qiáng)下進(jìn)行，最好加入適量海水，使精液終密度達(dá)1.0×107～5×107個·mL-1；步驟4在卵子受精后3～7min內(nèi)開始冷休克，冰海水溫度2～6℃，冷休克持續(xù)時間11～19min，最好在卵子受精后4～6min內(nèi)開始冷休克，冰海水溫度3℃，冷休克持續(xù)時間15min。
經(jīng)過冷休克處理后的卵子逐漸過渡到自然海水中，清洗卵子，漫射光下孵育。孵化出膜的仔魚在19～20℃的靜水環(huán)境下培養(yǎng)到第五天，投喂經(jīng)海水小球藻強(qiáng)化培養(yǎng)的輪蟲，密度保持10～15個·mL-1，育苗水體加入適量的小球藻。輪蟲用清潔的海水洗滌，經(jīng)孔徑100μm的篩絹過濾篩選和濃集，篩選出的多數(shù)為剛孵化出的幼體和小型輪蟲，開口的仔魚能輕易攝取食物，順利通過內(nèi)、外源營養(yǎng)轉(zhuǎn)化的敏感時期，10日齡后的仔魚可以攝取200μm的輪蟲，直接投喂，不必篩選。
在選取精子稀釋液時，用高溫消毒的自然海水作稀釋液并激活精子，經(jīng)紫外線輻射后的精子的快速活動比例達(dá)到40％～80％，活動持續(xù)時間較長；而采用生理鹽水或平衡鹽溶液等常用的稀釋液稀釋平鯛精液，精子呈休眠狀態(tài)，經(jīng)紫外線輻射后用高溫消毒的自然海水激活，快速活動的精子比例明顯較少，活動持續(xù)時間短，經(jīng)120s時間輻射的精子幾乎不能活動，喪失激活卵子的能力。在相同紫外線輻射劑量下，不同稀釋液中精子的活力為高溫消毒海水＞1.0％NaCl PS＞Ringer BSS＞Cortland BSS＞Hanks BSS。如果受精后不冷休克，其胚胎單倍體率為100％，顯示精子經(jīng)700μW.cm-2的紫外線輻射100s后可以完全遺傳失活，其單倍體胚胎發(fā)育緩慢，胚體粗短，形態(tài)怪異，發(fā)育過程中陸續(xù)死亡潰解，孵化率僅0.7％。出膜的仔魚軀體短，彎曲，卵黃較小，圍心腔大，表現(xiàn)出典型的單倍體綜合癥特征，形態(tài)上極易與雌核發(fā)育二倍體胚胎和仔魚區(qū)別。當(dāng)受精后在4～6min冷休克，其受精率、孵化率均較高，單倍體畸形數(shù)量低，單倍體胚體基本不能出膜而陸續(xù)死亡，其雌核發(fā)育二倍體孵化率達(dá)到30％以上。冷休克溫度為2～6℃的受精率和孵化率均較高，可以作為冷休克誘導(dǎo)平鯛雌核發(fā)育的適宜溫度。在冷休克溫度為3℃，初始冷休克時間為5min的抑制條件下，其影響趨勢基本表現(xiàn)為隨著冷休克持續(xù)時間的增加，受精率下降，持續(xù)時間為11～19min的受精率和孵化率均較高，分別為46.9％～65.9％和31.7％～42.4％，在此范圍內(nèi)，冷休克持續(xù)時間的變化對平鯛雌核發(fā)育二倍體的受精率和孵化率影響不顯著(P＞0.05)，當(dāng)持續(xù)時間超過19min后，受精率和孵化率均明顯下降，顯然，冷休克持續(xù)時間過長雖然能抑制第二極體排放，同樣也影響受激活的卵子的代謝活動，從而影響卵子的第一次分裂，導(dǎo)致發(fā)育受損，孵化率低。由此可見，11～19min作為冷休克持續(xù)時間進(jìn)行平鯛雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)是適宜的。
本發(fā)明的優(yōu)點是所用的精子稀釋液即經(jīng)濟(jì)又無任何污染，能有效地激活精子，精子經(jīng)過紫外線輻射后仍然保持較高的活力和對卵子雌核發(fā)育的啟動能力。冷休克抑制卵子第2極體排放，使染色體組加倍，產(chǎn)生雌核發(fā)育二倍體，雌核發(fā)育激活率達(dá)95％～99％，誘導(dǎo)率達(dá)96％～100％，孵化率47.3％～57.6％，仔魚發(fā)育正常，能開口攝食，順利通過內(nèi)、外源營養(yǎng)轉(zhuǎn)變的敏感時期，繼續(xù)生長和發(fā)育。而且本方法簡便易掌握，安全而穩(wěn)定，能加速基因純化，培育新品種(系)，不產(chǎn)生遺傳污染和環(huán)境污染。
具體實施例方式
以下的實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不限于下述實施例。
實施例1精子稀釋液的篩選分別用高溫消毒的自然海水，1.0％NaCl生理鹽水(PS)，Ringer平衡鹽溶液(BSS)，Cortland平衡鹽溶液(BSS)和Hanks平衡鹽溶液(BSS)稀釋4滴(0.2mL)平鯛純精液，精液與稀釋液比例為1∶60，稀釋后的精液厚度2mm，精子經(jīng)稀釋液激活后，在20.0℃的水溫中，在強(qiáng)度為700μW.cm-2的紫外線下持續(xù)輻射0～180s，比較使用不同精子稀釋液時精子的活動情況，結(jié)果見表1。
表1平鯛精子在不同稀釋液及不同的紫外線輻射時間中的活動情況

實施例2遺傳失活的精子激活卵子產(chǎn)生雌核發(fā)育單倍體在水溫20℃中，從1尾雌魚中輕輕擠出經(jīng)激素誘導(dǎo)排放到卵巢腔不久(約1～2小時)的優(yōu)質(zhì)成熟卵子2mL，與經(jīng)過700μW.cm-2×100s劑量的紫外線輻射遺傳失活的1mL精液充分混合受精，加入適量的海水，使精子的終濃度在107個·mL-1以上，啟動平鯛雌核發(fā)育，操作在微弱光線下進(jìn)行，設(shè)1個平行組。受精后2h，卵子胚盤已經(jīng)分裂，用Nikon體視顯微鏡檢查結(jié)果表明卵子激活率95％～99％；受精后20h左右，胚體出現(xiàn)，單倍體胚體畸形怪異，與正常二倍體的胚胎形態(tài)顯著不同，容易區(qū)別。經(jīng)體視顯微鏡檢查，結(jié)合染色體核型分析結(jié)果表明雌核發(fā)育單倍體誘導(dǎo)率100％。
實施例3初始冷休克時間的確定精卵分別來自3對發(fā)育良好的3齡雌雄親體，親魚在養(yǎng)殖海區(qū)網(wǎng)箱中強(qiáng)化培養(yǎng)，生殖季節(jié)轉(zhuǎn)移到室內(nèi)繁殖池，經(jīng)激素催熟誘導(dǎo)，結(jié)合溫光調(diào)控順利排卵，每尾雌魚分別排出優(yōu)質(zhì)卵子40～50mL，約6～8萬粒。
設(shè)立8個實驗組，每個實驗組由2mL卵子與1mL經(jīng)過700μW.cm-2×100s劑量的紫外線輻射遺傳失活的精液混合受精，實驗組1在受精后2min進(jìn)入冷休克，實驗組2在受精后3min進(jìn)入冷休克，實驗組3在受精后4min進(jìn)入冷休克，實驗組4在受精后5min進(jìn)入冷休克，實驗組5在受精后6min進(jìn)入冷休克，實驗組6在受精后7min進(jìn)入冷休克，實驗組7在受精后9min進(jìn)入冷休克，實驗組8在受精后11min進(jìn)入冷休克。另外取2mL卵子與經(jīng)過稀釋液稀釋的1mL正常精液混合受精作為正常精卵結(jié)合組，2mL卵子與1mL經(jīng)過700μW.cm-2×100s劑量的紫外線輻射遺傳失活的精液混合受精作為無冷休克對照組。分別對比8個實驗組，正常精卵結(jié)合組和無冷休克對照組的受精率，單倍體率和孵化率。結(jié)果見表2，其中受精率指受精后胚胎發(fā)育至原腸期時活胚胎占漂浮卵子的百分率，上角字母表示Tukey’s多重比較的結(jié)果，同一行的不同字母標(biāo)記表示差異顯著(P＜0.05)表2不同初始冷休克時間對平鯛雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)的影響

實施例4設(shè)立8個實驗組，每個實驗組由2mL卵子與1mL經(jīng)過700μW.cm-2×100s劑量的紫外線輻射遺傳失活的精液混合受精，實驗組1在水溫0℃冷休克，實驗組2在水溫1℃冷休克，實驗組3在水溫2℃冷休克，實驗組4在水溫3℃冷休克，實驗組5在水溫4℃冷休克，實驗組6在水溫5℃冷休克，實驗組7在水溫6℃冷休克，實驗組8在水溫8℃冷休克。另外取2mL卵子與經(jīng)過稀釋液稀釋的1mL正常精液混合受精作為正常精卵結(jié)合組，2mL卵子與1mL經(jīng)過700μW.cm-2×100s劑量的紫外線輻射遺傳失活的精液混合受精作為無冷休克對照組。分別對比8個實驗組，正常精卵結(jié)合組和無冷休克對照組的受精率，單倍體率和孵化率。結(jié)果見表3，其中上角字母表示Tukey’s多重比較的結(jié)果，同一行的不同字母標(biāo)記表示差異顯著(P＜0.05)表3不同溫度冷休克對平鯛卵子雌核發(fā)育二倍體的影響

實施例5冷休克持續(xù)時間的確定設(shè)立7個實驗組，每個實驗組由2mL卵子與1mL經(jīng)過700μW.cm-2×100s劑量的紫外線輻射遺傳失活的精液混合受精，實驗組1冷休克11min，實驗組2冷休克13min，實驗組3冷休克15min，實驗組4冷休克17min，實驗組5冷休克19min，實驗組6冷休克25min，實驗組7冷休克30min。另外取2ml卵子與經(jīng)過稀釋液稀釋的1mL正常精液混合受精作為正常精卵結(jié)合組，2mL卵子與1mL經(jīng)過700μW.cm-2×100s劑量的紫外線輻射遺傳失活的精液混合受精作為無冷休克對照組。分別對比7個實驗組，正常精卵結(jié)合組和無冷休克對照組的受精率，單倍體率和孵化率。結(jié)果見表4。
表4不同冷休克持續(xù)時間對平鯛雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)的影響

實施例6染色體倍性檢測設(shè)立1個實驗組，1個正常精卵結(jié)合組和1個無冷休克對照組。實驗組由2mL卵子與1mL經(jīng)過700μW.cm-2×100s劑量的紫外線輻射遺傳失活的精液混合受精，正常精卵結(jié)合組由2mL卵子與經(jīng)過稀釋液稀釋的1mL正常精液混合受精，無冷休克對照組由2mL卵子與1mL經(jīng)過700μW.cm-2×100s劑量的紫外線輻射遺傳失活的的精液混合受精。當(dāng)胚胎發(fā)育到低囊胚至原腸期時，分別取150～200粒發(fā)育良好的卵子進(jìn)行染色體制片和顯微鏡下鏡檢，倍性鑒定。
實施例7平鯛雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)實施效果精卵分別來自2對發(fā)育良好的3齡雌雄親體，親魚在養(yǎng)殖海區(qū)網(wǎng)箱中強(qiáng)化培養(yǎng)，生殖季節(jié)轉(zhuǎn)移到室內(nèi)繁殖池，經(jīng)激素催熟誘導(dǎo)，結(jié)合溫光調(diào)控順利排卵，每尾雌魚排出優(yōu)質(zhì)卵子50mL左右，約8萬粒。
設(shè)立2個實施組，每個實施組的材料來自1對發(fā)育良好的3齡雌雄親體的卵子和精液，每個實施組包括1個冷休克實驗組，1個正常精卵結(jié)合組和1個無冷休克對照組。實驗組分別由2mL卵子和1mL經(jīng)過700μW.cm-2×100s劑量的紫外線輻射遺傳失活的精液混合受精。實驗組1按照以下條件進(jìn)行冷休克經(jīng)過700μW.cm-2×100s劑量的紫外線輻射遺傳失活的精子與卵子混合受精4min后，移入溫度為3℃的低溫冰海水，持續(xù)冷休克15min，操作過程在黑暗中進(jìn)行。實驗組2按照以下條件進(jìn)行冷休克經(jīng)過700μW.cm-2×100s劑量的紫外線輻射遺傳失活的精子與卵子混合受精5min后，移入溫度為4℃的低溫冰海水，持續(xù)冷休克15min，操作過程在黑暗中進(jìn)行。正常精卵結(jié)合組由2mL卵子與經(jīng)過稀釋液稀釋的1mL正常精液混合受精。無冷休克對照組分別由2mL卵子與1mL經(jīng)過700μW.cm-2×100s劑量的紫外線輻射遺傳失活的精液混合受精。
經(jīng)過冷休克處理后的雌核發(fā)育二倍體卵子逐漸過渡到正常溫度的自然海水中，清洗卵子，剔除沉卵和死卵，避免陽光直射，按照魚類受精卵常規(guī)培養(yǎng)方法孵育。平鯛雌核發(fā)育二倍體仔魚發(fā)育正常，能順利通過內(nèi)、外源營養(yǎng)階段，開口攝食。按實施例6方法進(jìn)行倍性鑒定，實驗組與對照組比較的結(jié)果見表5，其中卵子激活率指胚盤分裂為二細(xì)胞時的卵子占漂浮卵子的百分率。
表5平鯛雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)實施效果

權(quán)利要求
1.一種平鯛雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法，其特征是包括以下步驟(1)用稀釋液稀釋平鯛精子，稀釋后的精液厚度為1.5～2.5mm，精子密度0.5×108～1.5×108個·mL-1；(2)精子在稀釋液中生理激活后，用紫外線輻射遺傳失活，輻射強(qiáng)度是400～750μW·cm-2，同時用振蕩器使精子稀釋液中的精子均勻分散；(3)失活的精液與正常的卵子充分混合受精；(4)用冰海水對受精的卵子進(jìn)行冷休克處理，整個過程在黑暗中進(jìn)行，使平鯛雌核發(fā)育單倍體染色體組加倍成為雌核發(fā)育二倍體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的一種平鯛雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法，其特征是步驟1所述的精子稀釋液中精液與稀釋液的體積比為1∶60，所述的稀釋液是在黑暗環(huán)境下沉淀凈化、砂濾和高溫消毒的鹽度為26～30的自然海水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種平鯛雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法，其特征是步驟2所述的紫外線輻射，持續(xù)時間50～120s，所述的振蕩器振蕩頻率是150～250次·min-1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種平鯛雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法，其特征是步驟3所述的正常的卵子是離體后20min以內(nèi)的卵子，所述的受精過程在微弱光強(qiáng)下進(jìn)行，并加入適量海水，使精液終密度達(dá)1.0×107～5×107個·mL-1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種平鯛雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法，其特征是步驟4是在卵子受精后3～7min內(nèi)開始冷休克，冷休克持續(xù)時間11～19min，所述的冰海水溫度2～6℃。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種平鯛雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法，其特征是在卵子受精后4～6min內(nèi)開始冷休克，冷休克持續(xù)時間15min，所述的冰海水溫度是3℃。
全文摘要
本發(fā)明涉及平鯛雌核發(fā)育二倍體的誘導(dǎo)方法，其特征是先用稀釋液稀釋平鯛精液并激活精子，精子密度0.5×10
文檔編號A01H1/06GK1685806SQ200510034399
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月29日
發(fā)明者蔡澤平, 張俊彬 申請人:中國科學(xué)院南海海洋研究所