專利名稱：野菱優(yōu)質(zhì)工程苗快繁方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種快速繁殖野菱優(yōu)質(zhì)工程苗的方法。
背景技術(shù)：
野菱(Trapa incisa)是屬于菱科菱屬的一年生浮葉水生草本植物。它喜溫、喜水和充足的陽光，生長期較長。底部松軟肥沃，腐殖質(zhì)含量高，淤泥沉積厚的河塘、溝渠、湖泊都適宜種養(yǎng)。該物種對水體污染有著較高的耐受性，在水生生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)與重建工程中，可用于凈化水質(zhì)；該物種還含有較多的營養(yǎng)成分，可做果、蔬、糧食用；并且具有較高的藥用價值。
野菱已經(jīng)被列為國家二級重點保護野生植物，對野菱種質(zhì)資源的保護已日益迫切。一方面，野菱種子在自然條件下的萌發(fā)率比較低，另一方面，水體的強度污染，也導(dǎo)致野菱的自然分布日益稀少。當(dāng)前，市場上對野菱種苗的需求量很大，在試驗和生態(tài)工程中都有應(yīng)用，但種源大多來自自然環(huán)境，大量打撈容易導(dǎo)致原產(chǎn)地生境的破壞；雖然可用野菱種子種植來彌補，但種植不僅需要合適的水生環(huán)境和較長時間，而且還受本身種子萌發(fā)率低的限制。另外，自然生境的野菱常帶有各種雜藻雜菌，容易造成移植生境的污染和有關(guān)生理生態(tài)試驗的誤差。
迄今國內(nèi)外未見有關(guān)野菱無菌苗的人工擴繁培養(yǎng)的研究與報道。本方法是利用野菱的胚芽，采用不同的消毒方法和培養(yǎng)基質(zhì)，產(chǎn)生無菌苗，并且從無菌苗進行快速擴繁。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用植物組織培養(yǎng)方法，獲得并在室內(nèi)大規(guī)模繁殖野菱優(yōu)質(zhì)工程苗，應(yīng)用于國家重點保護野生植物的種質(zhì)資源保護工作，并克服該物種野外收集有限且污染嚴(yán)重的弊端，適應(yīng)我國淡水湖泊植被恢復(fù)、生態(tài)工程育苗以及野菱生理生態(tài)研究的需要。
本發(fā)明的技術(shù)方案是1.野菱無菌幼苗的獲得從野外自然生境中采集野菱的果實，置于2℃-4℃中冷藏一周，打破休眠。隨后，取出其中的胚芽，于肥皂水中浸泡2h，用自來水沖洗干凈并在流水下浸泡過夜。在超凈工作室中，用75％酒精浸泡20s，用無菌水漂洗后再放入AgNO3中浸泡7-10min，用無菌水徹底漂洗后接種于培養(yǎng)液①，見表1，并置于組織培養(yǎng)室中培養(yǎng)。室內(nèi)平均光照強度2000lx，每日光照10h，溫度為25℃。期間注意觀察，隨時剔除仍然污染的材料，以免交叉感染。
2.野菱出芽誘導(dǎo)由上述步驟獲得的有明顯的根系的無菌幼苗，于超凈工作室中，轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基②中。2周以后，植株開始長壯，并在莖節(jié)處萌發(fā)新芽。待植株長到1cm，將其轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基③，刺激植株更多的萌發(fā)新芽，重復(fù)上述方法，以獲得足夠多的無菌幼苗。上述擴增培養(yǎng)過程仍在組培室中進行，光照和溫度不變。
表1.野菱培養(yǎng)液①、②、③配方

*上述培養(yǎng)液按濃度配好后均用稀HCl或NaOH調(diào)整pH到5.8，分裝到100mL三角瓶中，用封口膜包扎后于120℃、0.1MPa左右濕熱滅菌20min。
3.野菱工程苗的壯苗將上述培養(yǎng)基中約5cm的野菱無菌苗取出，移栽到底部鋪有滅過菌的沙石的培養(yǎng)缸中。保持水深20cm，每周換水并添加10％的Hoagland營養(yǎng)液以促進其生長。當(dāng)室外白晝氣溫20℃以上時，將培養(yǎng)缸置于室外，直接利用太陽光照；否則，將培養(yǎng)缸置于溫室中，晝夜溫度分別保持18℃和25℃，并在白天適當(dāng)補充人工光照至2500lx。上述培養(yǎng)保持到植株長至20cm以上。
4.野菱工程苗的應(yīng)用(1)通過上述步驟2培養(yǎng)后，收獲根系發(fā)達、植株長于20cm的健康野菱小苗，取出洗凈，直接應(yīng)用于試驗，避免雜菌雜藻的影響。
(2)通過上述步驟3培養(yǎng)后，獲得的株高30cm以上、根系發(fā)達的健康野菱植株；收獲時盡量保持其根系的完整，投放到水生植被恢復(fù)重建的工程區(qū)，并根據(jù)實地的退化程度，決定其栽種量和栽種密度，并可采用單一物種移植或者和其他物種混合移植。
本發(fā)明的效果在于
1)獲得了野菱的無菌苗。野外采集的野菱原材料本身污染嚴(yán)重，而本方法先用較溫和的肥皂水洗滌浸泡，然后在流水下沖洗以初步降低污染，然后通過75％酒精和AgNO3徹底滅菌，在培養(yǎng)液①中培養(yǎng)。該滅菌方法可以保證無菌率達80％，存活率達60％以上。
2)建立了野菱工程苗快速繁殖途徑。經(jīng)過一段時間的馴化培養(yǎng)，野菱每2w在培養(yǎng)基②和③的培養(yǎng)條件下的芽增殖率達1∶3以上(即每個單株苗經(jīng)2w的培養(yǎng)，至少可以獲得3株苗)。而每個新生的小苗，可以繼續(xù)進行以上的芽增殖操作。技術(shù)簡單，操作方便，而且所用的試劑均為常規(guī)化工產(chǎn)品，成本低廉，有利于大規(guī)模的工廠化生產(chǎn)。而且本方法主要利用的是野菱的營養(yǎng)繁殖，避免了遺傳變異的可能性。
3)本項發(fā)明可不分季節(jié)，隨時為湖泊植被恢復(fù)和利用野菱進行的生理生態(tài)實驗，提供足夠的優(yōu)質(zhì)工程苗，在湖泊水生生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)和重建工程中發(fā)揮重要作用。
具體實施例方式
實例1于2004年12月從南京溧水采得野菱種源，剖取其胚芽30個，用肥皂水浸泡2h，再用自來水洗凈，流水下沖洗過夜。在超凈工作臺中，用75％酒精和AgNO3經(jīng)過一定時間的徹底滅菌，用無菌水洗凈，接種于培養(yǎng)液①中。于組培室中培養(yǎng)，平均光照強度2000lx，每日光照10h，溫度25℃。2周內(nèi)除去剔除的染菌及死亡材料4芽，其余26芽均能生長。健康的幼苗轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基②，繼續(xù)在組培室中培養(yǎng)，野菱開始長壯，出現(xiàn)芽增殖。再轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基③，野菱的芽大量增殖，長出新個體。以后每隔20d將單株野菱轉(zhuǎn)接進行芽增殖。60d獲得幼苗6300余株。
實例2將上述的培養(yǎng)材料洗凈移栽到鋪有滅過菌的沙石的培養(yǎng)缸中，并在溫室中培養(yǎng)。每周換水且補充Hoagland營養(yǎng)液以壯苗。20d內(nèi)獲得健康工程苗6000余株，該批材料被應(yīng)用于太湖富營養(yǎng)化水體生態(tài)修復(fù)工程中。
權(quán)利要求
1.一種野菱無菌苗培養(yǎng)及其工程苗快速擴繁的方法，其特征為該方法由以下步驟組成(1)從野外自然生境中采集野菱的果實，置于2℃-4℃中冷藏一周，打破休眠；隨后，取出其中的胚芽，于肥皂水中浸泡2h，用自來水沖洗干凈并在流水下浸泡過夜；在超凈工作室中，用75％酒精浸泡20s，用無菌水漂洗后再放入AgNO3中浸泡7-10min，用無菌水徹底漂洗后，接種于含有0.50mg/LIAA的1/2×Ms基本元素的培養(yǎng)液，并置于組織培養(yǎng)室中培養(yǎng)；室內(nèi)平均光照強度2000lx，每日光照10h，溫度為25℃，獲得野菱無菌苗；(2)將無菌苗接種于含有2.00mg/L 6-BA和0.10mg/L NAA的1/2×Ms基本元素的培養(yǎng)液，促使植株長壯、發(fā)芽；待幼苗高1cm時，再轉(zhuǎn)入含有0.10mg/L6-BA和2.00mg/L NAA的1×Ms基本元素的培養(yǎng)液中，以誘導(dǎo)萌發(fā)更多新芽，并每隔20d將新生無菌苗重復(fù)步驟(2)，直至獲得足夠多的材料；(3)將上述培養(yǎng)步驟(2)中約5cm的野菱無菌苗取出，移栽到底部鋪有滅過菌的沙石的培養(yǎng)缸中，保持水深20cm，每周換水并添加10％的Hoagland營養(yǎng)液以促進其生長，直到植株長至20cm以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1方法擴繁的野菱工程苗在淺水湖泊濕地生態(tài)修復(fù)和生理生態(tài)試驗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。運用組織培養(yǎng)方法，通過擴繁獲得大量的野菱優(yōu)質(zhì)工程苗，以克服在水生植被恢復(fù)工程中大量移植野菱對原產(chǎn)地產(chǎn)生不良影響，以及自然環(huán)境中野菱種源稀缺并且污染嚴(yán)重的問題。野菱作為國家重點保護野生植物，其本身具有藥用價值，在湖泊水生生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)和重建工程中也有著重要的作用。針對目前水生生態(tài)系統(tǒng)退化嚴(yán)重的現(xiàn)狀，本方法的出現(xiàn)有著重要的意義。
文檔編號A01G7/00GK1692699SQ20051004037
公開日2005年11月9日 申請日期2005年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年6月3日
發(fā)明者安樹青, 蔡穎, 關(guān)保華, 王秉萱 申請人:南京大學(xué)