專利名稱：一種通過多基因轉(zhuǎn)化提高甜菜耐鹽耐旱性和抗除草劑綠黃隆特性的方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬農(nóng)作物的生物工程育種領(lǐng)域，具體說，涉及一種通過多基因轉(zhuǎn)化提高甜菜耐鹽耐旱性和抗除草劑綠黃隆特性的方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
諸自然逆境中，干旱對世界作物產(chǎn)量的影響占居首位，其危害相當(dāng)于其它自然災(zāi)害之和。鹽漬化也是影響作物產(chǎn)量的主要環(huán)境因素。我國約二分之一國土面積處干旱、半干旱區(qū)。即使在非干旱地區(qū)的主要農(nóng)業(yè)區(qū)，也不時受到旱災(zāi)侵襲。在我國16億畝耕地中，鹽堿地有1億多畝，中低產(chǎn)田約10億畝。其中大部分中低產(chǎn)田也是由于干旱和鹽堿所致。此外有3億畝鹽堿荒地有待開發(fā)利用；灌溉地區(qū)次生鹽漬化田地還在逐年增加。土壤鹽漬化造成甜菜播種面積減小和產(chǎn)量銳減，農(nóng)民急需耐鹽高產(chǎn)甜菜品種。隨著我國淡水資源的逐年匱乏和氣候變暖，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育耐鹽耐旱甜菜具有重要的戰(zhàn)略意義。
干旱和鹽堿構(gòu)成了對植物的滲透脅迫，導(dǎo)致植物缺水和脂質(zhì)過氧化，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損和正常代謝活動不能進(jìn)行。鹽脅迫還引起離子毒害效應(yīng)。植物的耐鹽性和耐旱性既相互關(guān)聯(lián)又存在差異，分別是由多基因控制的復(fù)雜性狀，涉及到多條代謝途徑，其中部分基因在進(jìn)化上高度保守。近年來植物耐鹽機(jī)理的研究取得了突破性進(jìn)展，已從不同生物中克隆出一批耐鹽相關(guān)基因，其中一些基因轉(zhuǎn)入植物后能明顯提高植株耐鹽性。植物耐旱基因鑒定及定位研究也取得較大進(jìn)展。
采用基因工程技術(shù)提高作物耐鹽耐旱性的研究目前集中在四個方面1)滲透保護(hù)與滲透調(diào)節(jié)，2)氧自由基的消除，3)離子均衡的調(diào)控，4)胞內(nèi)信號傳遞通道的調(diào)節(jié)。離子均衡的調(diào)控機(jī)制又可分為抑制Na+的吸收；向胞外排出Na+；維持細(xì)胞K+營養(yǎng)；將胞質(zhì)中有害Na+泵入并儲存在液泡中，實現(xiàn)區(qū)域化分布。
作物一般都具有或大或小的滲透調(diào)節(jié)功能，以適應(yīng)環(huán)境中滲透壓的變化。這種功能包括細(xì)胞中的滲透調(diào)節(jié)物(脯氨酸、甜菜堿、多羥基醇類等)的積累、膜通透性的變化等。在干旱和鹽脅迫下，一些植物細(xì)胞內(nèi)積累甘氨酸甜菜堿類物質(zhì)以維持細(xì)胞的正常膨壓和減輕離子毒害。甘氨酸甜菜堿合成酶基因的高強(qiáng)度表達(dá)及甜菜堿積累可大幅度提高植物的耐鹽耐旱性。近年的一些研究表明，一些編碼滲透調(diào)節(jié)劑合成酶的基因?qū)氲街参锖竽苁辜?xì)胞內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)劑濃度提高，使植株對脅迫表現(xiàn)出更好的抗性。但滲透調(diào)節(jié)劑提高的濃度均很小，不會產(chǎn)生明顯的滲透調(diào)節(jié)作用，推測是滲透調(diào)節(jié)劑保護(hù)了細(xì)胞結(jié)構(gòu)和酶活性所致。將betA基因轉(zhuǎn)入煙草(Lilius等)、將BADH(甜菜醛脫氫酶)基因轉(zhuǎn)入草莓和煙草(陳受宜等)，植株的耐鹽性均明顯提高。糖類合成酶如甘露醇合成酶基因轉(zhuǎn)入煙草等植物提高了植株的耐鹽性(Tarczynski等，Liu等，Shen等)，海藻糖合成酶基因轉(zhuǎn)入煙草提高了植株的耐旱性(Pilon-Smits等)。
在復(fù)雜機(jī)制控制下的多條途徑參與了細(xì)胞質(zhì)中Na+濃度的調(diào)節(jié)。多數(shù)鹽生植物消除Na+毒害的主要機(jī)制是將吸收的Na+定位于液泡來降低胞質(zhì)中Na+的濃度，即離子區(qū)域化機(jī)制尤為重要。在甜土植物中，部分物種缺乏Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，部分物種Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性低。因此，通過遺傳改良使甜土植物在液泡中積累大量Na+已成為植物耐鹽基因工程的策略。NHX1基因編碼擬南芥等植物液泡膜上的Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。該蛋白是細(xì)胞內(nèi)離子區(qū)域化的關(guān)鍵酶。將帶有強(qiáng)啟動子的AtNHX1基因轉(zhuǎn)入擬南芥(Apes等)和番茄(Zhang等)中實現(xiàn)過量表達(dá)，獲得了耐鹽性大幅度提高的植株。
采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物耐鹽耐旱性是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)課題，已有大量的工作。將維持細(xì)胞內(nèi)離子平衡的基因、合成滲透保護(hù)物質(zhì)的基因、能減輕細(xì)胞內(nèi)自由基危害的基因等導(dǎo)入植物，提高了植物的耐鹽耐旱性，為培育耐鹽耐旱作物新品種開辟了一條有效途徑。但多數(shù)工作是以模式植物為材料進(jìn)行的，只有轉(zhuǎn)AtNHX1基因的耐鹽番茄和油菜具有良好的應(yīng)用價值。從策略和技術(shù)上講，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高作物耐鹽耐旱性已具有成熟的技術(shù)路線和必要的實施條件。
噴施除草劑已成為降低甜菜生產(chǎn)成本的重要措施，但適合甜菜田使用的選擇性除草劑種類少。單一品種長期使用導(dǎo)致抗性雜草產(chǎn)生。因此，培育出抗除草劑的甜菜品種可增加甜菜地使用的高效無毒除草劑品種。als基因來源于擬南芥菜，根據(jù)已報道序列(Muzar BJ et al，1987；Haughn GW et al，1988)通過PCR擴(kuò)增及定點(diǎn)突變技術(shù)獲得197位脯氨酸改變?yōu)槔i氨酸的突變基因。als基因是結(jié)構(gòu)基因，編碼乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase)。該酶是分支氨基酸合成途徑中的第一個關(guān)鍵酶，除草劑綠黃隆能有效的抑制該酶活性，使植物因缺乏分支氨基酸而死亡。人類和哺乳類動物因缺乏乙酰乳酸合成酶而不受綠黃隆影響。本發(fā)明所用的基因為突變型(197位脯氨酸改變?yōu)槔i氨酸)，編碼的乙酰乳酸合成酶對綠黃隆抑制作用不敏感，因此，賦予轉(zhuǎn)基因植物綠黃隆抗性。該基因長3250bp，編碼399個氨基酸。由于綠黃隆是一種低(無)毒高效廣譜性除草劑，不污染環(huán)境，抗綠黃隆甜菜品種的培育成功，可使綠黃隆在甜菜地安全使用，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益?？咕G黃隆甜菜的推廣，還可通過不同除草劑的交替使用來防止抗除草劑雜草的產(chǎn)生。
甜菜是二年生異花授粉作物。在其生活的第一年，主要是進(jìn)行營養(yǎng)生長，生長繁茂的葉叢和肥大的塊根，并在根中積累營養(yǎng)物質(zhì)。在生活的第二年，以生殖生長為主，由根頭上生出花枝，在花枝上形成花器官，經(jīng)過異花授粉和受精形成聚花果，即種球。甜菜具有耐旱、耐寒、耐鹽堿等特點(diǎn)，適應(yīng)性廣，抗逆性強(qiáng)。它的一些野生種起源于海濱，抗逆性強(qiáng)。甜菜是重要的制糖原料，世界上約40％的糖來源于甜菜。除制糖外，甜菜還有很高的經(jīng)濟(jì)價值。甜菜制糖的副產(chǎn)品可以搞綜合加工。甜菜的莖葉、青頭、根尾、甜菜制糖廢絲，都含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，可釀酒，也是牲畜的好飼料。畜牧業(yè)的發(fā)展和鹽堿地的開發(fā)利用需要耐鹽耐旱的甜菜品種。由于育種周期長和抗性檢測較復(fù)雜等原因，采用常規(guī)育種技術(shù)至今未培育出適合濱海鹽堿地種植或用淡海水灌溉的品種。如果能培育出耐鹽性強(qiáng)的飼用甜菜新品種，不僅可充分開發(fā)利用濱海鹽堿地，推動養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，而且能有效改善生態(tài)環(huán)境。迄今國內(nèi)外未報道獲得耐鹽或/和耐旱性顯著提高且抗除草劑綠黃隆的具有實用價值的轉(zhuǎn)基因甜菜。
甜菜轉(zhuǎn)基因研究工作在國內(nèi)外均受到重視，已經(jīng)有一些成功的報道。用于甜菜遺傳轉(zhuǎn)化的方法主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍轟擊法。與其它許多雙子葉植物相比，甜菜的遺傳轉(zhuǎn)化相對較難，主要是轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生植株的頻率很低。盡管甜菜細(xì)胞對農(nóng)桿菌感染敏感，易于被農(nóng)桿菌所轉(zhuǎn)化，但轉(zhuǎn)化后植株再生率低，且受基因型限制，因而主要工作集中在轉(zhuǎn)化方法的改進(jìn)、抗病、抗除草劑]等方面。1991年，F(xiàn)ry等以甜菜子葉為外植體，利用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將抗除草劑基因轉(zhuǎn)入甜菜，以草甘膦為選擇劑進(jìn)行篩選，最終獲得抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因甜菜，但頻率很低。1992年，Halluin等以胚產(chǎn)生的愈傷組織為受體，將抗除草劑基因轉(zhuǎn)入甜菜，獲得了抗除草劑的轉(zhuǎn)基因植株。1997年，Marie等將epsps gos nptII導(dǎo)入甜菜，結(jié)果證實不同轉(zhuǎn)化株間對草甘膦抗性存在差異。2000年，Dewar等論述了抗除草劑轉(zhuǎn)基因甜菜的種植情況。他們將抗除草劑的轉(zhuǎn)基因甜菜植株栽入大田，開花后收集花粉與其它遺傳性狀好的株系回交幾代，得到了抗除草劑的遺傳性狀好的甜菜品系，并對其安全性進(jìn)行了試驗。
在已報道的甜菜轉(zhuǎn)基因工作中，多數(shù)是以愈傷組織為材料，但由于愈傷組織再生植株困難，獲得的轉(zhuǎn)基因植株無法滿足育種需要。本實驗室已發(fā)展起以離體培養(yǎng)的叢生芽芽尖為受體、采用農(nóng)桿菌中介法規(guī)模化獲得轉(zhuǎn)基因甜菜的技術(shù)體系。
在作物育種中，急待解決的難題之一是大幅度提高優(yōu)良育種材料的耐鹽耐旱性，從而選育出具有重大突破的品種。要達(dá)到此目標(biāo)，有賴于將多個目標(biāo)基因?qū)氲絻?yōu)良材料中，充分利用細(xì)胞抗御逆境的不同代謝活動及調(diào)節(jié)機(jī)制。這方面的研究在國內(nèi)外尚處在起步階段，尚未確定最佳的技術(shù)路線和方法。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種通過多基因轉(zhuǎn)化提高甜菜耐鹽耐旱性的方法。在本發(fā)明中，采用多基因轉(zhuǎn)化的策略，將3-4個具有重要農(nóng)藝價值的異源基因?qū)胩鸩思?xì)胞，培育出耐鹽耐旱性提高和抗除草劑綠黃隆特性的育種材料。本發(fā)明的通過多基因轉(zhuǎn)化提高甜菜耐鹽耐旱性和抗除草劑綠黃隆特性的方法是，將來自植物的液泡膜鈉氫反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NHX1和液泡膜焦磷酸酶基因PPase、來自大腸桿菌的膽堿脫氫酶基因betA和來自擬南芥的抗除草劑綠黃隆的突變的乙酰乳酸合成酶基因als分別重組到植物表達(dá)載體中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)入離體培養(yǎng)的甜菜叢生芽芽尖分生組織細(xì)胞并高效表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因植株；從轉(zhuǎn)基因植株及其后代中篩選耐鹽耐旱性明顯提高的轉(zhuǎn)基因植株；通過對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行二次轉(zhuǎn)化或使帶有不同轉(zhuǎn)基因的植株相互雜交獲得帶有3-4個目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因植株；或以含雙T-DNA區(qū)的植物表達(dá)載載體(含有3-4個目標(biāo)基因)直接轉(zhuǎn)化甜菜細(xì)胞，獲得帶有3-4個目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因植株；檢測多基因轉(zhuǎn)化植株后代的耐鹽性、除草劑抗性和農(nóng)藝性狀，選出耐鹽耐旱兼抗除草劑綠黃隆的新種質(zhì)。
其中，上述目標(biāo)基因NHX1和PPase基因可以融合基因形式串聯(lián)插在植物表達(dá)載體上，在甜菜細(xì)胞內(nèi)能高效表達(dá)；betA和als基因重組在另一植物表達(dá)載體上，由在植物細(xì)胞內(nèi)能啟動基因高效表達(dá)的啟動子驅(qū)動。
本發(fā)明中，可將含雙T-DNA區(qū)的植物表達(dá)載載體(含有3-4個目標(biāo)基因)直接轉(zhuǎn)化甜菜細(xì)胞，獲得帶有3-4個目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因植株；含雙T-DNA區(qū)的植物表達(dá)載載體的T-DNA區(qū)可有左邊界序列，也可無左邊界序列。
其中，上述NHX1和PPase基因可來自鹽生植物和非鹽生植物。
其中，上述甜菜是糖甜菜品種、飼用甜菜品種和兼用型品種以及特用型品種之一。
其中，上述對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行耐鹽耐旱性和抗除草劑綠黃隆特性檢測以篩選出優(yōu)異材料，獲得甜菜耐鹽耐旱兼抗除草劑綠黃隆的新種質(zhì)。
本發(fā)明的基本思路為，依據(jù)植物抗逆生理和植物抗逆基因工程研究的新進(jìn)展，利用植物細(xì)胞中與抗逆性相關(guān)的代謝途徑的調(diào)控知識，采用多基因轉(zhuǎn)化技術(shù)，將能夠顯著提高細(xì)胞中甘氨酸甜菜堿含量并明顯提高植物耐鹽耐旱性的betA基因、能夠大幅度增強(qiáng)細(xì)胞Na+區(qū)隔化的液泡膜上的鈉氫反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NHX1和能夠提高液泡膜質(zhì)子梯度增加Na+向液泡儲蓄從而增加細(xì)胞吸水能力的焦磷酸酶基因PPase基因?qū)胩鸩藚采垦考夥稚M織細(xì)胞中，實現(xiàn)這些基因的過表達(dá)，從而大幅度提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽耐旱性。由于在轉(zhuǎn)基因操作中選用了對人、畜安全的除草劑抗性基因als(來自于擬南芥，編碼乙酰乳酸合成酶，后者是分支氨基酸合成途徑中的關(guān)鍵酶)作為選擇標(biāo)記，因此，賦予轉(zhuǎn)基因植物抗除草劑特性。
本發(fā)明所用的目標(biāo)基因為來自大腸桿菌的膽堿脫氫酶基因betA，來自鹽芥和擬南芥的編碼液泡膜上的鈉氫反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NHX1、來自鹽芥的編碼液泡膜上焦磷酸酶基因PPase；所用的植物轉(zhuǎn)基因載體有pCAMBIA1300派生的載體和pROKII派生的載體。在這些派生的載體中分別重組進(jìn)betA基因、NHX1基因和PPase基因，或重組進(jìn)betA基因和NHX1基因、NHX1基因和PPase基因、betA基因和PPase基因。轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞選擇標(biāo)記基因為抗除草劑綠黃隆(有效成分Chlorsulfuron)的突變基因als。目標(biāo)基因和轉(zhuǎn)基因植物選擇標(biāo)記基因采用常規(guī)分子生物學(xué)方法通過多步驟重組插入到植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體中，并通過轉(zhuǎn)基因植物的檢測確定了這些基因能在植物中活躍表達(dá)，提高了轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性(耐鹽耐旱性、耐冷性和除草劑抗性等)。
轉(zhuǎn)基因甜菜采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法產(chǎn)生，轉(zhuǎn)基因植株用PCR檢測、Southern blotting驗證，外源基因表達(dá)研究采用Northern blotting。轉(zhuǎn)基因植株耐鹽耐旱性測定采用盆栽試驗-生理指標(biāo)測定、鹽堿地和干旱池栽培實驗和田間多點(diǎn)實驗法。轉(zhuǎn)基因遺傳穩(wěn)定性測定采用經(jīng)典的遺傳學(xué)方法。
在甜菜遺傳轉(zhuǎn)化中，以我國生產(chǎn)上常用的優(yōu)良糖用甜菜和以色列的飼用甜菜為材料，取大田植株的幼嫩花序離體培養(yǎng)產(chǎn)生的叢生芽為受體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)選擇基本保持原品種特性，一般通過二次轉(zhuǎn)化實現(xiàn)多基因轉(zhuǎn)化，也可將攜帶數(shù)個目的基因的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行人工套袋姊妹交，實現(xiàn)目的基因聚合，或以含雙T-DNA區(qū)的植物表達(dá)載載體(含有3-4個目標(biāo)基因)直接轉(zhuǎn)化甜菜細(xì)胞，獲得帶有3-4個目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明的具體步驟為1)將目的基因和植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞選擇標(biāo)記基因以不同組合(基本組合為1或2個目的基因加1個選擇標(biāo)記基因或以含有3-4個目標(biāo)基因的雙T-DNA區(qū))的方式重組到植物表達(dá)載體中，并導(dǎo)入到大腸桿菌或/和農(nóng)桿菌中。
2)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)入甜菜細(xì)胞中，獲得轉(zhuǎn)基因植株。通過分子檢測和植株抗逆性測定選出目的基因穩(wěn)定表達(dá)且植株抗性明顯提高的轉(zhuǎn)基因植株。
3)利用入選的轉(zhuǎn)基因植株或其自交結(jié)實的后代為材料，通過二次轉(zhuǎn)化法或姊妹交結(jié)實達(dá)到多基因轉(zhuǎn)化。對二次轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的植株和通過姊妹交獲得的植株進(jìn)行PCR檢測，選出多基因轉(zhuǎn)化的植株。在進(jìn)行二次轉(zhuǎn)化中，所用的植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體所帶的植物細(xì)胞選擇標(biāo)記基因必須與初次轉(zhuǎn)化所用的表達(dá)載體上的植物細(xì)胞選擇標(biāo)記基因不同，以利于選擇出二次轉(zhuǎn)化體。若植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體不帶有植物選擇標(biāo)記基因，雖通過PCR檢測可獲得轉(zhuǎn)基因植株，但效率十分低。
4)多基因轉(zhuǎn)化材料的耐鹽耐旱性和抗除草劑綠黃隆特性的鑒定和利用。對獲得的不同轉(zhuǎn)基因聚合材料，根據(jù)目的基因表達(dá)產(chǎn)物的生理作用，進(jìn)行相應(yīng)的生理生化指標(biāo)檢測，并通過盆栽試驗和大田耐鹽耐旱性測定實驗，篩選出耐鹽耐旱性和抗除草劑綠黃隆特性明顯提高的轉(zhuǎn)基因育種材料。


圖1多基因轉(zhuǎn)化材料中目標(biāo)基因的分子檢測圖片其中betA轉(zhuǎn)化植株P(guān)CR結(jié)果(左1)與PCR-Southem雜交結(jié)果(左2)；NHX1基因轉(zhuǎn)化植株P(guān)CR結(jié)果(右2)與Southern雜交結(jié)果(右1)。
左1圖1，9示Marker；2-6示轉(zhuǎn)基因植株；7示陽性質(zhì)粒；8示非轉(zhuǎn)基因植株。
左2圖1示非轉(zhuǎn)基因植株；2-6示轉(zhuǎn)基因植株；7示陽性質(zhì)粒；8示Marker。
右2圖1示Marker；2-5示轉(zhuǎn)基因植株；6示非轉(zhuǎn)基因植株；7示陽性質(zhì)粒。
右1圖1，3示非轉(zhuǎn)基因植株；2示陽性質(zhì)粒；4-6示轉(zhuǎn)基因植株；7示Marker。
具體實施例方式
以下敘述本發(fā)明的實施例。需說明的是，本發(fā)明的實施例只對本發(fā)明起說明作用而沒有限制作用。
實施例1通過多基因轉(zhuǎn)化創(chuàng)制耐鹽耐旱性和抗除草劑綠黃隆特性優(yōu)異的甜菜轉(zhuǎn)基因株系1.甜菜轉(zhuǎn)基因植株的獲得取大田花蕾期植株約1cm長的幼嫩花序頂端切段，經(jīng)70％酒精1min、0.1％HgCl25min消毒后，切成0.1-0.5cm小段，接種于MS附加1mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上，26±2℃下暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)叢生芽發(fā)生。叢生芽塊切開后繼代培養(yǎng)。剝?nèi)ビ兹~的叢生芽塊用于遺傳轉(zhuǎn)化。
將帶有雙元載體(Mini-Ti質(zhì)粒帶有除草劑抗性基因als和目的基因betA，或帶有除草劑抗性基因bar和目的基因NHX1和PPase基因)的根瘤農(nóng)桿菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的YEP培養(yǎng)基中28℃下分別震蕩培養(yǎng)，震蕩速率為110r/min，使細(xì)菌處于對數(shù)生長期。然后在4000r/min下離心10分鐘，棄上清液。菌體用1/2改良MS液體培養(yǎng)基洗滌，離心收集。再將菌體用添加100mg/L乙酰丁香酮的1/2MS改良液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋5-20倍用于轉(zhuǎn)化。
將繼代后7天的叢生芽塊剝成2-3mm大小的小芽，在農(nóng)桿菌(分別帶有betA、NHX1、PPase基因)菌液中浸泡0-20min，然后轉(zhuǎn)到叢生芽發(fā)生培養(yǎng)基上共培養(yǎng)1、3、5、7天，再轉(zhuǎn)到含有頭孢霉素(100mg/L)的培養(yǎng)基上抑菌培養(yǎng)，2周后轉(zhuǎn)移到加有綠磺隆(0.05mg/L)的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。每10天繼代培養(yǎng)一次，連續(xù)篩選三代，得到了不同比例的轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化芽尖增殖后，待小苗長至2-3cm高時剪成單芽，在附加1mg/LNAA的1/2MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。小苗生根率在50-80％之間。選取健壯的生根植株，移栽到下層壤土、上層蛭石的花盆中，每隔一天澆一次營養(yǎng)液，溫度15-23℃，相對濕度85％以上，日光照5000lx左右，成活率可達(dá)70-80％。
抗除草劑轉(zhuǎn)化植株生長到4-6葉時，取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測外源基因，對PCR陽性植株進(jìn)行Southern blotting檢測。約30％的植株為轉(zhuǎn)基因個體。
2.轉(zhuǎn)基因植株的管理和抗性檢測轉(zhuǎn)基因植株春化后套袋自交或姊妹交結(jié)實。種子播種在大田或溫室，植株長到4-6葉期時取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測是否帶有外源基因。取轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行耐鹽耐旱性和綠黃隆抗性測定。
對4-6葉期的PCR陽性植株噴施除草劑綠黃隆(濃度分別為0、0.1、0.3、0.5、1.0、2.0ppm)，15天后統(tǒng)計植株死亡率和受害程度以及雜草存活率，收獲時稱重甜菜生物量，計算塊根產(chǎn)量，得出耐受綠黃隆的最高濃度、適宜劑量綠黃隆使用后對甜菜產(chǎn)量的影響及經(jīng)濟(jì)效益。
對于轉(zhuǎn)betA基因的小苗在干旱或高鹽處理前后取葉片測定甘氨酸甜菜堿含量，篩選目的基因表達(dá)高的植株套袋自交結(jié)籽。同時，對同一株系的植株進(jìn)行耐鹽性測定和干旱脅迫處理，以及農(nóng)藝性狀的觀測，測定與植株耐鹽耐旱性相關(guān)的生理生化指標(biāo)，確定植株耐鹽耐旱的最高級別。綜合植株農(nóng)藝性狀、甘氨酸甜菜堿含量和其它生理生化測定指標(biāo)、盆栽干旱和鹽脅迫處理等的結(jié)果，選擇出耐鹽耐旱性優(yōu)良的材料用于多基因轉(zhuǎn)化。
對于轉(zhuǎn)NHX1和PPase基因的小苗用高鹽(NaCl)溶液進(jìn)行脅迫處理，在處理前后取葉片測細(xì)胞Na+、K+和Ca2+離子含量，并觀測不同NaCl濃度處理下植株的生長勢、存活率和受害情況，對苗期表現(xiàn)出優(yōu)良耐鹽性的植株取來自同一轉(zhuǎn)化體的后代種子播種在花盆或鹽堿地，進(jìn)行全生育期耐鹽耐旱性測定。綜合植株農(nóng)藝性狀、葉片細(xì)胞Na+、K+和Ca2+含量測定結(jié)果及葉片水勢變化和其它生理生化測定指標(biāo)、盆栽和鹽堿地實驗結(jié)果等，選擇出耐鹽耐旱性優(yōu)良的材料用于多基因轉(zhuǎn)化。
3.多基因轉(zhuǎn)化和耐鹽耐旱植株的利用多基因轉(zhuǎn)化可通過三條途徑進(jìn)行第一條途徑為，以轉(zhuǎn)betA基因和als基因(或NHX1和PPase基因)的植株花序離體培養(yǎng)獲得的叢生芽為材料，按照本實例“甜菜轉(zhuǎn)基因植株的獲得”部分所介紹的方法將NHX1和PPaae基因(或betA基因和als基因)轉(zhuǎn)入，經(jīng)自交和耐鹽耐旱性檢測、除草劑綠黃隆抗性檢測和農(nóng)藝性狀選擇，獲得綜合性狀好的耐鹽耐旱性狀優(yōu)異的株系。
第二條途徑為，以來自同一基因型的分別轉(zhuǎn)betA基因和NHX1及Ppase、als基因的植株進(jìn)行人工輔助授粉，產(chǎn)生具有3-4個目的基因的后代。
第三條途徑為，目標(biāo)基因NHX1和PPase基因以融合基因形式串聯(lián)插入在一個植物表達(dá)載體的一個T-DNA區(qū)，betA和als基因插入在同一個植物表達(dá)載體的另一個T-DNA區(qū)，按照本實例“甜菜轉(zhuǎn)基因植株的獲得”部分所介紹的方法，以含雙T-DNA區(qū)的植物表達(dá)載載體(含有3-4個目標(biāo)基因)直接轉(zhuǎn)化甜菜細(xì)胞，獲得帶有3-4個目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因植株及其后代。
對于轉(zhuǎn)多基因材料，一般通過和本實例“轉(zhuǎn)基因植株的管理和抗性檢測”部分闡述的方法和程序進(jìn)行耐旱耐鹽性測定及綜合性狀選擇，對獲得的優(yōu)異材料用于甜菜育種或生產(chǎn)實踐。
由于甜菜對鹽害的敏感期為苗后，在葉叢期后耐鹽性較強(qiáng)，為了獲得具有應(yīng)用參考價值的數(shù)據(jù)，同時又能使篩選出的耐鹽植株產(chǎn)生大量的種子以供鹽堿地種植實驗，將部分T0代植株產(chǎn)生的種子播在沙盆中，每天分別澆灌2.0％、2.5％或3.0％的NaCl溶液，部分株系的種子在播種后4-5天左右萌發(fā)，部分株系的種子延遲到播種后15-20天間萌發(fā)。小苗早期生長健壯，但隨著鹽脅迫處理的天數(shù)增加，部分小苗逐漸死亡。NaCl溶液澆灌30天后，存活的植株矮小粗壯，子葉和葉片肥厚。通過篩選獲得了來自不同基因型的分別耐受2.0％、2.5％或3.0％NaCl的轉(zhuǎn)多基因植株。在去除鹽脅迫后小苗迅速恢復(fù)正常生長，3-4天后長出新葉，原有葉片也迅速擴(kuò)展，葉片厚度降低，逐步回復(fù)到非鹽脅迫狀態(tài)下的形態(tài)特征，表現(xiàn)出比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ沾蠓忍岣叩哪望}特性。由于篩選所用的鹽濃度遠(yuǎn)高于中度鹽堿地的含鹽量，而甜菜通常只在含鹽量0.4％以下的土地中生長正常，故獲得的轉(zhuǎn)基因甜菜具有優(yōu)異的耐鹽性，可望獲得在中度鹽堿地種植的優(yōu)良品種。
實施例1中涉及的多基因轉(zhuǎn)化材料中目標(biāo)基因的分子檢測圖片見圖1。
實施例2采用轉(zhuǎn)不同目標(biāo)基因植株姊妹交獲得多基因轉(zhuǎn)化的耐鹽耐旱性優(yōu)異的抗除草劑綠黃隆的甜菜育種材料1.甜菜轉(zhuǎn)基因植株的獲得 同實施例1。
2.轉(zhuǎn)基因植株的管理和抗性檢測 同實施例1。
3.采用轉(zhuǎn)不同目標(biāo)基因植株姊妹進(jìn)行多基因聚合將來自同一受體基因型的轉(zhuǎn)不同目標(biāo)基因(選擇標(biāo)記基因也不同)的植株塊根種在同一隔離區(qū)中，開放授粉，產(chǎn)生種子。將收獲的種子用2種不同的選擇劑(如除草劑綠黃隆和除草劑草丁膦)進(jìn)行篩選。篩選一般在植株4葉期開始進(jìn)行，先用一種選擇劑(如除草劑綠黃隆，濃度是未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓耆克劳?水溶液處理植株，殺死對選擇劑敏感的個體。第一次選擇處理后一個月左右，用第二種選擇劑(如除草劑草丁膦，濃度是未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓耆克劳?處理，殺死對選擇劑敏感的個體。然后用PCR方法檢測存活且生長健壯的植株，確定轉(zhuǎn)基因聚合是否成功。對聚合成功的多基因轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行套袋自交，子代植株也同上代一樣經(jīng)歷2次選擇劑篩選和PCR檢測。獲得多基因轉(zhuǎn)化植株純合體后，采用生理學(xué)方法篩選耐鹽耐旱性明顯提高的轉(zhuǎn)基因株系。
4.多基因轉(zhuǎn)化的耐鹽耐旱抗除草劑植株的選擇及利用 同實施例1。
實施例3采用帶雙T-DNA區(qū)的植物表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化獲得多基因轉(zhuǎn)化的耐鹽耐旱性優(yōu)異的抗除草劑綠黃隆的甜菜育種材料
1.甜菜轉(zhuǎn)基因植株的獲得取大田花蕾期植株約1cm長的幼嫩花序頂端切段，經(jīng)70％酒精1min、0.1％HgCl25min消毒后，切成0.1-0.5cm小段，接種于MS附加1mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上，26±2℃下暗培養(yǎng)，誘導(dǎo)叢生芽發(fā)生。叢生芽塊切開后繼代培養(yǎng)。剝?nèi)ビ兹~的叢生芽塊用于遺傳轉(zhuǎn)化。
將帶有雙元載體(Mini-Ti質(zhì)粒帶有雙T-DNA區(qū)，目標(biāo)基因NHX1和PPase基因可以融合基因形式串聯(lián)插入其中一個T-DNA區(qū)，betA和als基因插入在另一個T-DNA區(qū)；含雙T-DNA區(qū)的植物表達(dá)載載體的T-DNA區(qū)可有左邊界序列，也可無左邊界序列)的根瘤農(nóng)桿菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的YEP培養(yǎng)基中28℃下分別震蕩培養(yǎng)，震蕩速率為110r/min，使細(xì)菌處于對數(shù)生長期。然后在4000r/min下離心10分鐘，棄上清液。菌體用1/2改良MS液體培養(yǎng)基洗滌，離心收集。再將菌體用添加100mg/L乙酰丁香酮的1/2MS改良液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋5-20倍用于轉(zhuǎn)化。
將繼代后7天的叢生芽塊剝成2-3mm大小的小芽，在農(nóng)桿菌(帶有植物表達(dá)載體及目標(biāo)基因)菌液中浸泡0-20min，然后轉(zhuǎn)到叢生芽發(fā)生培養(yǎng)基上共培養(yǎng)1、3、5、7天，再轉(zhuǎn)到含有頭孢霉素(100mg/L)的培養(yǎng)基上抑菌培養(yǎng)，2周后轉(zhuǎn)移到加有綠磺隆(0.05mg/L)的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。每10天繼代培養(yǎng)一次，連續(xù)篩選三代，得到了不同比例的轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化芽尖增殖后，待小苗長至2-3cm高時剪成單芽，在附加1mg/LNAA的1/2MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。小苗生根率在50-80％之間。選取健壯的生根植株，移栽到下層壤土、上層蛭石的花盆中，每隔一天澆一次營養(yǎng)液，溫度15-23℃，相對濕度85％以上，日光照5000lx左右，成活率可達(dá)70-80％。
抗除草劑綠黃隆轉(zhuǎn)化植株生長到4-6葉時，取葉片提取DNA，采用PCR技術(shù)檢測外源基因，對PCR陽性植株進(jìn)行Southern blotting檢測。約5-10％的植株為轉(zhuǎn)如雙T-DNA區(qū)的個體。
2.轉(zhuǎn)基因植株的管理和抗性檢測 同實施例1。
3.多基因轉(zhuǎn)化的耐鹽耐旱抗除草劑植株的選擇及利用 同實施例1。
權(quán)利要求
1.一種通過多基因轉(zhuǎn)化提高甜菜耐鹽耐旱性和抗除草劑綠黃隆特性的方法及應(yīng)用，其主要步驟包括將來自植物的液泡膜鈉氫反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NHX1和液泡膜焦磷酸酶基因PPase、來自大腸桿菌的膽堿脫氫酶基因betA和來自擬南芥的抗除草劑綠黃隆的突變的乙酰乳酸合成酶基因als分別重組到植物表達(dá)載體中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)入離體培養(yǎng)的甜菜叢生芽芽尖分生組織細(xì)胞并高效表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因植株；從轉(zhuǎn)基因植株及其后代中篩選耐鹽耐旱性明顯提高的轉(zhuǎn)基因株系；通過對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行二次轉(zhuǎn)化或使帶有不同轉(zhuǎn)基因的植株相互雜交獲得帶有3-4個目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因植株；或以含雙T-DNA區(qū)的植物表達(dá)載載體(含有3-4個目標(biāo)基因)直接轉(zhuǎn)化甜菜細(xì)胞，獲得帶有3-4個目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因植株；檢測多基因轉(zhuǎn)化植株后代的耐鹽性、除草劑抗性和農(nóng)藝性狀，選出耐鹽耐旱兼抗除草劑綠黃隆的新種質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的通過多基因轉(zhuǎn)化提高甜菜耐鹽耐旱性和抗除草劑綠黃隆特性的方法及應(yīng)用，其特征是，目標(biāo)基因NHX1和PPase基因可以融合基因形式串聯(lián)插入在植物表達(dá)載體上，在甜菜細(xì)胞內(nèi)能高效表達(dá)；betA和als基因重組在另一植物表達(dá)載體上，由在植物細(xì)胞內(nèi)能啟動基因高效表達(dá)的啟動子驅(qū)動。
3.如權(quán)利要求1所述的通過多基因轉(zhuǎn)化提高甜菜耐鹽耐旱性和抗除草劑綠黃隆特性的方法及應(yīng)用，其特征是，目標(biāo)基因NHX1和PPase基因可以融合基因形式串聯(lián)插入在一個植物表達(dá)載體的一個T-DNA區(qū)，betA和als基因插入在同一個植物表達(dá)載體的另一個T-DNA區(qū)。
4.如權(quán)利要求2所述的通過多基因轉(zhuǎn)化提高甜菜耐鹽耐旱性和抗除草劑綠黃隆特性的方法及應(yīng)用，其特征是，NHX1和PPase基因可來自鹽生植物和非鹽生植物。
5.如權(quán)利要求3所述的通過多基因轉(zhuǎn)化提高甜菜耐鹽耐旱性和抗除草劑綠黃隆特性的方法及應(yīng)用，其特征是，含雙T-DNA區(qū)的植物表達(dá)載載體的T-DNA區(qū)可有左邊界序列，也可無左邊界序列。
6.如權(quán)利要求1所述的通過多基因轉(zhuǎn)化提高甜菜耐鹽耐旱性和抗除草劑綠黃隆特性的方法及應(yīng)用，其特征是，所述的甜菜是糖甜菜品種、飼用甜菜品種和兼用型品種以及特用型品種之一。
7.如權(quán)利要求1所述的通過多基因轉(zhuǎn)化提高甜菜耐鹽耐旱性和抗除草劑綠黃隆特性的方法及應(yīng)用，其特征是，對轉(zhuǎn)基因植株及其后代進(jìn)行耐鹽耐旱性和抗除草劑綠黃隆特性的檢測，從中選擇優(yōu)異材料培育甜菜耐鹽耐旱和抗除草劑綠黃隆的新種質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開一種通過多基因轉(zhuǎn)化提高甜菜耐鹽耐旱性和抗除草劑綠黃隆特性的方法及應(yīng)用，是將來自植物的液泡膜鈉氫反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NHX1和液泡膜焦磷酸酶基因PPase、來自大腸桿菌的膽堿脫氫酶基因betA和來自擬南芥的抗除草劑綠黃隆的突變的乙酰乳酸合成酶基因als重組到植物表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)入甜菜細(xì)胞并高效表達(dá)，獲得轉(zhuǎn)基因植株；從轉(zhuǎn)基因植株及其后代中篩選出耐鹽耐旱性明顯提高兼有綠黃隆抗性的轉(zhuǎn)基因植株；通過對轉(zhuǎn)基因植株細(xì)胞進(jìn)行二次轉(zhuǎn)化或使帶有不同轉(zhuǎn)基因的植株相互交配獲得帶有3－4個目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因植株；從多基因轉(zhuǎn)化植株后代中選擇耐鹽耐旱性優(yōu)異兼抗除草劑綠黃隆的的個體，進(jìn)而創(chuàng)建出耐鹽耐旱兼抗除草劑綠黃隆的甜菜育種新材料。
文檔編號A01H1/02GK1768575SQ200510044790
公開日2006年5月10日 申請日期2005年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月22日
發(fā)明者楊愛芳, 張舉仁, 谷曉峰, 張可煒, 尹小燕 申請人:山東大學(xué)