專利名稱：鱗翅目害蟲核型多角體病毒的改造方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領域，涉及一種利用反義基因技術(shù)改造野生核型多角體病毒(NPV)，構(gòu)建鱗翅目害蟲新型NPV的方法。
背景技術(shù)：
鱗翅目昆蟲，如尺蠖、毛蟲等，是為害農(nóng)作物的重要害蟲種類之一。這些害蟲大量發(fā)生時，造成作物嚴重減產(chǎn)和品質(zhì)劣化。因此，尺蠖等鱗翅目昆蟲是農(nóng)作物生產(chǎn)上的重要防治對象之一。目前生產(chǎn)上應用的農(nóng)藥主要有兩類一類是化學合成農(nóng)藥，如菊酯類農(nóng)藥、有機磷農(nóng)藥和殺蟲脲等；另一類是生物農(nóng)藥，如核型多角體病毒(NPV)制劑、蘇云金桿菌(Bt)制劑以及一些捕食性昆蟲等。化學合成農(nóng)藥，防治速度快、效果好，但容易引起農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染以及害蟲的抗藥性問題。生物農(nóng)藥NPV屬于昆蟲桿狀病毒，其外被為多角體蛋白，其內(nèi)為雙鏈環(huán)狀DNA分子。游離NPV病毒粒子可通過昆蟲進食和體壁創(chuàng)傷感染；而具有包含體的NPV病毒只能由昆蟲進食感染，進入害蟲中腸的NPV粒子在消化液的作用下，多角體蛋白被破壞并釋放出游離病毒粒子，之后通過附著、融合、去殼等過程進入害蟲細胞，并在核中大量復制并利用宿主細胞核糖體合成多角體包裝成完整的NPV。受NPV侵染的害蟲逐漸出現(xiàn)拒食等癥狀，最終死亡。但是，野生型的NPV病毒株侵染后潛伏期長，殺蟲速度慢，防治效果不理想。因此，NPV生物農(nóng)藥在實際生產(chǎn)中推廣應用還比較有限。在大力倡導無公害、綠色和有機農(nóng)產(chǎn)品的今天，新型高毒力NPV的構(gòu)建和生產(chǎn)具有非常重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明技術(shù)基于以下兩個事實①幾丁質(zhì)是尺蠖等鱗翅目害蟲的卵膜、蛹殼、幼蟲表皮和中腸圍食膜以及成蟲體壁等組織的重要組分。而幾丁質(zhì)是由尿嘧啶二磷酸-N-乙酰-葡糖胺通過β-1，4方式連接形成的聚合物，該反應由幾丁質(zhì)合成酶(CS)催化完成。CS為大分子量的細胞膜結(jié)合蛋白，主要由位于細胞膜內(nèi)側(cè)的催化活性中心和多個親脂跨膜區(qū)域組成。而且該酶的催化活性中心和親脂跨膜區(qū)域相當保守。②反義基因技術(shù)是將一段與宿主細胞基因核苷酸組成互補且方向相反的序列，通過基因工程技術(shù)導入宿主細胞并表達。通過反義基因mRNA與靶基因mRNA互補配對而抑制目標蛋白的合成，從而導致基因轉(zhuǎn)錄后沉默。
本發(fā)明的思路是利用現(xiàn)代分子生物學手段，將鱗翅目害蟲CS反義基因(CSr)導入NPV，形成包含CSr序列的重組NPV(NPV-CSr)，利用NPV本身的侵染和表達系統(tǒng)，使CS反義基因在鱗翅目害蟲細胞中表達，抑制害蟲自身內(nèi)源CS基因的表達活性，從而使害蟲無法正常合成幾丁質(zhì)。缺乏幾丁質(zhì)合成的尺蠖等鱗翅目害蟲將無法形成正常的細胞壁，不能進行有效的細胞分裂和生長，而且害蟲重要的消化器官“中腸圍食膜”也因為缺乏幾丁質(zhì)而喪失正常消化功能。由于害蟲細胞無法形成正常的細胞壁，改造后的新型NPV具有更快的擴散和再侵染速度，同時具有更高毒力。
本發(fā)明的技術(shù)路線是在克隆尺蠖等鱗翅目害蟲幾丁質(zhì)合成酶(CS)基因保守序列的基礎上，根據(jù)反義基因技術(shù)的原理，構(gòu)建包含鱗翅目害蟲CS反義基因序列的轉(zhuǎn)移載體，并通過同源重組將CS反義基因成功導入NPV基因組，通過篩選、驗證獲得快速、高效殺滅鱗翅目害蟲的重組NPV。
本發(fā)明方案主要包括以下幾個步驟1、根據(jù)鱗翅目害蟲CS基因保守序列設計2-4對包含酶切位點的特異引物，提取害蟲mRNA，并進行RT-PCR，獲得CS基因保守序列，并進行序列分析驗證；2、將驗證后的CS基因RT-PCR產(chǎn)物純化后連入pUCm-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)過抗性篩選和PCR驗證，獲得包含CS保守序列的T載體(pUCm-T-CS)；3、以特異的內(nèi)切酶酶切pUCm-T-CS載體回收包含CS基因的特異片段，并反向?qū)胪瑯用盖泻蟮陌嘟求w基因(ph)的NPV轉(zhuǎn)移載體pFASTBacI-ph中，形成pFASTBacI-ph-CSr；4、將pFASTBacI-ph-CSr轉(zhuǎn)化包含NPV DNA和幫助質(zhì)粒的大腸桿菌感受態(tài)細胞DH10Bac，形成重組的包含CS序列的NPV DNA(NPV-CSr)；5、NPV-CSr侵染草地夜蛾細胞株sf9擴增，獲得完整的重組病毒；6、通過PCR方法對重組NPV進行驗證，以野生NPV病毒為對照，對重組NPV進行殺蟲能力評價和篩選，獲得高毒力的重組NPV病毒株。
上述步驟進一步敘述如下①.尺蠖等鱗翅目害蟲CS保守序列克隆根據(jù)鱗翅目害蟲CS基因保守序列設計2-4對包含酶切位點的特異引物，提取害蟲mRNA，并進行RT-PCR，獲得CS基因保守序列，并進行序列分析驗證。CS基因RT-PCR產(chǎn)物純化后連入pUCm-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)過抗性篩選和PCR驗證，獲得包含CS保守序列的T載體(pUCm-T-CS)。
②.鱗翅目害蟲反義CS基因轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建以特異的內(nèi)切酶酶切pUCm-T-CS載體回收包含CS基因的特異片段，并反向?qū)胪瑯用盖泻蟮陌嘟求w基因(ph)的NPV轉(zhuǎn)移載體pFASTBacI-ph中，形成pFASTBacI-ph-CSr。
③.重組NPV將pFASTBacI-ph-CSr轉(zhuǎn)化包含NPV DNA和幫助質(zhì)粒的大腸桿菌感受態(tài)細胞DH10Bac，形成重組的包含CS序列的NPV DNA(NPV-CSr)，并以NPV-CSr侵染草地夜蛾細胞株sf9，獲得完整的重組病毒。
④.新型重組NPV-CSr病毒分子生物學驗證和殺蟲能力評價通過PCR等方法對重組NPV進行驗證；以野生NPV病毒為對照，對重組NPV進行殺蟲能力評價和篩選，獲得高毒力的重組NPV病毒株。


圖1為本發(fā)明方法的流程框圖。
具體實施例方式
實施例 含茶尺蠖幾丁質(zhì)合成酶(CS)反義基因序列的NPV構(gòu)建方法1)取3齡茶尺蠖幼蟲1條約100mg，以Trizol(Invitrogen公司)試劑提取總RNA，電泳檢測RNA質(zhì)量，并以GENQUENT分析RNA濃度。具體操作參照試劑和儀器說明；2)以MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒合成茶尺蠖幼蟲cDNA第一鏈，具體操作參照試劑盒說明；3)以包含酶切位點的以下引物對進行RT-PCR，PCR條件如表1；L 5’AA

TTCGAATACGCCATCGGCCATTGG (劃線部分為Xba I酶切位點)R 5’AA

CCAACGATCCTCGCCCTGATCGTACTG(劃線部分為BamH I酶切位點)表1

4)上述PCR后獲208bp左右CS目標產(chǎn)物(含酶切位點序列)，經(jīng)純化后與pUCm-T于16℃條件下連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，經(jīng)藍白斑篩選，以菌落PCR方法進行連接結(jié)果驗證，同時進行序列分析(序列分析委托上海聯(lián)合基因公司進行)，具體序列如下
CS序列(包含酶切位點)AATCTAGATT CGAATACGCC ATCGGCCATT GGCTGCAAAA GGCCACGGAGCACATGATTGG CTGCGTGCTC TGTTCACCTG GATGCTTCTC CCTGTTCAGGGGCAAGGCCC TCATGGATGA CAATGTGATG AAGAAATACA CGACACGGTCGGATGAGGCT CGTCACTACG TGCAGTACGA TCAGGGCGAG GATCGTTGGGGATCCTT5)陽性菌落經(jīng)擴繁后，抽提質(zhì)粒。對質(zhì)粒進行Xba I、BamH I雙酶切并回收目標片段(該序列中BamH I酶切位點位于Xba I之后)；同時以Xba I、BamH I對包含多角體基因(ph)的NPV轉(zhuǎn)移載體pFASTBacI-ph(該載體中BamH I酶切位點位于Xba I之前)進行雙酶切，并回收目標片段；并將兩個目標進行反向連接，獲包含反義幾丁質(zhì)合成酶序列(CSr)的轉(zhuǎn)移載體(pFASTBacI-ph-CSr)。
6)將pFASTBacI-ph-CSr轉(zhuǎn)化包含NPV DNA和幫助質(zhì)粒的感受態(tài)大腸桿菌細胞DH10Bac(Invitrogen公司)，并篩選重組子，獲含反義CS的NPV DNA(NPV-CSr)。
7)將NPV-CSr侵染草地夜蛾細胞株sf9，獲得完整的重組病毒。
8)以不包含外源CS反義序列的野生NPV為對照，比較重組病毒(NPV-CSr)對尺蠖幼蟲的侵染和毒殺能力的差異。具體做法為將上述培養(yǎng)獲得的重組NPV以及野生NPV病毒配制成1×104PIB/ml溶液，直接注射3齡尺蠖幼蟲(每頭注射2μl，每個處理30頭尺蠖，重復3次)，定時進行觀察并統(tǒng)計尺蠖死亡情況。結(jié)果顯示，含CSr的重組病毒侵染尺蠖后，潛伏期縮短1天以上，茶尺蠖感染病毒后前期死亡率超過野生型對照30％以上。
上述結(jié)果顯示，利用本方法進行NPV改造，并獲得高毒力NPV的技術(shù)是成功的。
權(quán)利要求
1.鱗翅目害蟲核型多角體病毒的改造方法，其特征在于如下步驟(1)根據(jù)鱗翅目害蟲CS基因保守序列設計2-4對包含酶切位點的特異引物，提取害蟲mRNA，并進行RT-PCR，獲得CS基因保守序列，并進行序列分析驗證；(2)將驗證后的CS基因RT-PCR產(chǎn)物純化后連入pUCm-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)過抗性篩選和PCR驗證，獲得包含CS保守序列的T載體(pUCm-T-CS)；(3)以特異的內(nèi)切酶酶切pUCm-T-CS載體回收包含CS基因的特異片段，并反向?qū)胪瑯用盖泻蟮陌嘟求w基因(ph)的NPV轉(zhuǎn)移載體pFASTBacI-ph中，形成pFASTBacI-ph-CSr；(4)將pFASTBacI-ph-CSr轉(zhuǎn)化包含NPV DNA和幫助質(zhì)粒的大腸桿菌感受態(tài)細胞DH10Bac，形成重組的包含CS序列的NPV DNA(NPV-CSr)；(5)NPV-CSr侵染草地夜蛾細胞株sf9擴增，獲得完整的重組病毒；(6)通過PCR方法對重組NPV進行驗證，以野生NPV病毒為對照，對重組NPV進行殺蟲能力評價和篩選，獲得高毒力的重組NPV病毒株。
2.按權(quán)利要求1所述的鱗翅目害蟲核型多角體病毒的改造方法，其特征在于按照本方法獲得的重組NPV應用于鱗翅目害蟲的防治。
全文摘要
鱗翅目害蟲核型多角體病毒的改造方法屬于生物技術(shù)領域，涉及一種利用反義基因技術(shù)改造野生核型多角體病毒(NPV)，構(gòu)建新型鱗翅目害蟲NPV的方法。發(fā)明方案主要包括以下幾個步驟①尺蠖等鱗翅目害蟲幾丁質(zhì)合成酶(CS)保守序列克隆；②鱗翅目害蟲反義CS基因轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建；③重組NPV；④通過PCR等方法對重組NPV進行驗證；⑤以野生NPV病毒為對照，對重組NPV進行殺蟲能力評價和篩選，獲得高毒力的重組NPV病毒株。用本發(fā)明方法改造后的NPV具有更快的擴散和再侵染速度，并對鱗翅目害蟲具有更高毒力。
文檔編號A01N63/00GK1804031SQ20051006213
公開日2006年7月19日 申請日期2005年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月21日
發(fā)明者陸建良, 林晨, 梁月榮, 張廣輝, 杜穎穎, 葉儉惠 申請人:浙江大學