專利名稱：一種建立多年生黑麥草高效基因槍轉(zhuǎn)化體系的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬植物生物技術(shù)領(lǐng)域或作物育種領(lǐng)域。具體說，涉及多年生黑麥草組織培養(yǎng)技術(shù)，基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)和轉(zhuǎn)化植株的分子檢測(cè)技術(shù)，從而高效的獲得多年生黑麥草轉(zhuǎn)基因植株。
背景技術(shù)：
草坪業(yè)是我國(guó)發(fā)展很快的一門新興產(chǎn)業(yè)，具有十分廣闊的市場(chǎng)前景；但我國(guó)的草坪科研工作比起發(fā)達(dá)國(guó)家存在著一定的差距。多年生黑麥草分蘗多，產(chǎn)量高，質(zhì)地柔軟，綠期長(zhǎng)，根系發(fā)達(dá)，適生性強(qiáng)，耐踐踏；有一定的耐鹽堿潛力，能增加土壤有機(jī)質(zhì)，改善土壤結(jié)構(gòu)，防止水土流失，不僅是良好的綠色飼料，而且是很好的草坪草。由于多年生黑麥草高度自交不育，用傳統(tǒng)方法進(jìn)行育種研究進(jìn)展很慢。組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展為作物品種的改良開辟了更加廣闊的天地，使不同物種的基因交流和基因的定向轉(zhuǎn)移成為現(xiàn)實(shí)，也為多年生黑麥草新品種的培育提供了新的手段。
基因槍法是利用高速運(yùn)動(dòng)的金屬微粒將附著于表面的核酸分子引入到受體細(xì)胞中的一種遺傳物質(zhì)導(dǎo)入技術(shù)。其原理是利用火藥爆炸、高壓放電或高壓氣體作為驅(qū)動(dòng)力加速金屬粒子，并使其進(jìn)入帶壁的細(xì)胞。在此過程中，攜帶有目的基因的質(zhì)粒DNA首先粘附在微彈表面，結(jié)合有DNA分子的微彈經(jīng)加速而獲足夠的動(dòng)量，進(jìn)而穿透植物細(xì)胞壁進(jìn)入靶細(xì)胞。外源DNA分子也就隨之導(dǎo)入細(xì)胞，并隨機(jī)整合到寄主的基因組內(nèi)?；驑尫ǖ氖荏w可以是各種外植體、愈傷組織及胚性細(xì)胞或細(xì)胞器，突破了基因轉(zhuǎn)移的物種界限。實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單易行，具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用范圍，已成為研究植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化和培育轉(zhuǎn)基因植物的最有效的手段之一?；驑屴D(zhuǎn)化法是目前質(zhì)體基因工程中最常用和最有效的DNA導(dǎo)入技術(shù)，它避開了原生質(zhì)體再生培養(yǎng)的困難，克服了當(dāng)時(shí)所認(rèn)為的農(nóng)桿菌的宿主限制，受體材料來源廣泛，且不受基因型限制。且具有高效表達(dá)、原核基因無需修飾改造、便于遺傳操作、可實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合和易保持純系、后代不分離等優(yōu)點(diǎn)。
多年生黑麥草的基因槍法轉(zhuǎn)化方面，國(guó)內(nèi)暫無以胚性愈傷組織為受體的成功報(bào)道，而國(guó)外也只有少數(shù)幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室獲得了轉(zhuǎn)基因植株，但轉(zhuǎn)化頻率較低，很多實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)化后未得到轉(zhuǎn)基因植株。因此，培養(yǎng)出適合遺傳轉(zhuǎn)化用途的胚性愈傷組織，優(yōu)化基因槍轉(zhuǎn)化法的各項(xiàng)影響條件，找出適宜的組培篩選再生條件，對(duì)于多年生黑麥草細(xì)胞工程和基因工程的研究均有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以多年生黑麥草優(yōu)良品種的胚性愈傷組織為受體材料，采用基因槍法將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，經(jīng)選擇獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞及植株。在此基礎(chǔ)上，確立了抗生素的篩選壓；基因槍法遺傳轉(zhuǎn)化體系中，金粉包裹物質(zhì)、受體愈傷的直徑大小、金粉直徑、轟擊的高度、次數(shù)對(duì)基因槍法轉(zhuǎn)化的影響，從而建立起一個(gè)高效的多年生黑麥草轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。
本發(fā)明的主要步驟包括以多年生黑麥草成熟種子或成熟胚為外植體誘導(dǎo)胚性愈傷組織，作為轉(zhuǎn)基因操作的受體材料。經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后進(jìn)行轟擊和滲透培養(yǎng)，而后進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)和篩選培養(yǎng)，挑取存活愈傷進(jìn)行續(xù)篩選以及再生培養(yǎng)，并對(duì)抗性植株進(jìn)行鑒定和選擇。
附圖簡(jiǎn)要說明附


圖1轉(zhuǎn)入DREB1A的多年生黑麥草愛神特(Accent)轉(zhuǎn)基因植株；附圖2轉(zhuǎn)入DREB1A的多年生黑麥草尤文圖斯(Juventus)轉(zhuǎn)基因植株根系；附圖3轉(zhuǎn)入BADH-CMO雙基因的愛神特轉(zhuǎn)基因植株；附圖4轉(zhuǎn)入BADH-CMO雙基因的愛神特轉(zhuǎn)基因植株根系；附圖5gus基因在愈傷中的瞬時(shí)表達(dá)；附圖6gus基因在再生芽中的穩(wěn)定表達(dá)；附圖7表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖；附圖8轉(zhuǎn)DREB基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果(1-19為轉(zhuǎn)化植株，20為陰性對(duì)照，21為陽性對(duì)照，22為marker)；附圖9轉(zhuǎn)BADH基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果(1-10為轉(zhuǎn)化植株，11為陽性對(duì)照，12為陰性對(duì)照，13為marker)；附
圖10轉(zhuǎn)CMO基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果(1-11為轉(zhuǎn)化植株，12為陽性對(duì)照，13為BADH擴(kuò)增產(chǎn)物，14為陰性對(duì)照，15為marker)；附
圖11轉(zhuǎn)DREB基因Southern雜交結(jié)果(1為陰性對(duì)照，2為陽性對(duì)照，3為marker，4-9為轉(zhuǎn)化植株)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明一種建立多年生黑麥草高效基因槍轉(zhuǎn)化體系的方法及其應(yīng)用是基于成功建立多年生黑麥草高頻再生體系的基礎(chǔ)上，通過調(diào)控影響基因槍法轉(zhuǎn)化的各因子而建立起來的轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。
受體材料準(zhǔn)備以多年生黑麥草成熟種子或成熟胚為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，愈傷誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)基均為MS+4-6mg/L 2，4-D+0.2-0.3mg/L 6-BA+0.1g/L水解酪蛋白，25℃暗培養(yǎng)。挑取年齡2-3個(gè)月的胚性愈傷組織預(yù)培養(yǎng)3d后，用鑷子分成直徑約0.5-1mm的小塊，置于含有滲透劑的培養(yǎng)基中央，緊密排列出一個(gè)直徑2cm的圓。
篩選劑濃度和篩選時(shí)間的確定將胚性愈傷組織分別接入含有不同潮霉素篩選劑濃度的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中25℃暗培養(yǎng)，20d和30d時(shí)分別統(tǒng)計(jì)愈傷組織的存活率。另將胚性愈傷組織接入含有不同潮霉素篩選劑濃度的分化培養(yǎng)基中，25℃光照培養(yǎng)，20d和30d統(tǒng)計(jì)出芽率并觀察愈傷狀態(tài)。以愈傷組織接近全部死亡，分化影響適中的篩選劑濃度為轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇濃度和篩選時(shí)間。
包裹DNA微彈(1)稱取30mg直徑1μm的金粉，置于1.5ml離心管中，加入1ml70％乙醇，渦旋3-5min，靜置15min，瞬時(shí)離心1-5s，棄上清。(2)重復(fù)以下步驟三次加入1ml無菌水洗滌金粉，渦旋1min，靜置1min，瞬時(shí)離心，棄上清。(3)加500μl 50％無菌甘油，金粉濃度約為60mg/ml，室溫下可保持兩周。(4)渦旋保存在甘油中的金粉5min。(5)吸取50μl(3mg)于1.5ml離心管中，吸取過程保持渦旋，冰上操作；(6)依次加入5μl攜帶有目的基因的質(zhì)粒DNA(1μg/μl)，Ca(NO3)2和PEG4000(現(xiàn)配現(xiàn)用)，持續(xù)渦旋2-3min，靜置1min，瞬時(shí)離心2s；(7)棄上清，加入140μl 70％乙醇；(8)棄上清，加入140μl無水乙醇；(9)棄上清，加入48μl無水乙醇，輕輕敲擊離心管數(shù)次懸浮金粉，低速渦旋2-3s。置于冰上備用。
轟擊處理所用基因槍為Biorad公司PDS1000/He型，將其放置于一個(gè)較大型的超凈工作臺(tái)上，以利于操作。工作臺(tái)、真空室、微彈載體和阻擋網(wǎng)等均需用70％遺傳消毒，然后吹干。將微彈載體裝入載體架上，取6μl包被質(zhì)粒DNA的金粉懸浮液，均勻涂抹于微彈咱體中心，干燥10min。將載有包被質(zhì)粒DNA的金粉顆粒的微彈載體及阻擋網(wǎng)裝入微彈發(fā)射裝置中，將盛有欲轉(zhuǎn)化愈傷組織的培養(yǎng)皿置于基因槍樣品室內(nèi)，可裂圓片與載體的距離為2.5cm，載體與阻擋網(wǎng)的距離為0.8cm，氦氣壓力為1100psi，真空度28inchHg，微彈飛行距離在6cm轟擊2次。
過渡培養(yǎng)和篩選培養(yǎng)將轟擊后的愈傷組織在含有滲透劑的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中過夜，次日進(jìn)行g(shù)us基因化學(xué)組織染色，按照J(rèn)efferson的方法進(jìn)行。將愈傷組織轉(zhuǎn)入愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)10d，再轉(zhuǎn)入加有50mg/L潮霉素的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)30d，25℃暗培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)愈傷存活率。
植株再生培養(yǎng)挑取存活愈傷轉(zhuǎn)入含有50mg/L潮霉素的分化培養(yǎng)基(分化培養(yǎng)基是指MS+0.1-0.2mg/L6-BA+0.4-0.6mg/L NAA+0.3-0.5mg/L ZT+6.4mg/L Cu2+)中續(xù)篩選30d，25℃光照16h培養(yǎng)。挑取部分愈傷組織進(jìn)行g(shù)usA化學(xué)組織染色。將長(zhǎng)出的小芽轉(zhuǎn)入到不含篩選劑的分化培養(yǎng)基中待小苗長(zhǎng)到3-4片葉時(shí)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(生根培養(yǎng)基是指MS+0.4mg/L NAA+0.1mg/L ZT)中，壯苗生根。
抗性植株的移栽將根葉完全的壯苗室溫下煉苗3d后，清洗掉基部的培養(yǎng)基，直接栽入到花盆(基質(zhì)為沙∶土∶草炭＝1∶1∶1)中，自然光下生長(zhǎng)。
實(shí)施例實(shí)施例1基因槍法將DREB1A基因轉(zhuǎn)入多年生黑麥草中獲得抗旱、耐鹽、耐低溫的轉(zhuǎn)基因植株植物基因的表達(dá)受干旱高鹽及低溫脅迫的誘導(dǎo)，根據(jù)基因產(chǎn)物的作用，主要有兩大類，第一類包括直接保護(hù)細(xì)胞免受水分脅迫傷害的功能蛋白、滲透調(diào)節(jié)因子的合成酶、以及毒性降解酶；第二類包括傳遞信號(hào)和調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子、感應(yīng)和轉(zhuǎn)導(dǎo)脅迫信號(hào)的蛋白激酶以及在信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用的蛋白酶?？刂铺鸩藟A合成的膽堿單氧化物酶(CMO)和甜菜堿醛脫氫酶(BADH)都屬于滲透調(diào)節(jié)因子的合成酶，CMO-BADH是二者整合到同一個(gè)表達(dá)載體中構(gòu)建的雙基因表達(dá)載體。轉(zhuǎn)錄因子DREB1A屬于第二類，通常認(rèn)為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控多個(gè)與同類性狀有關(guān)的基因的表達(dá)，在提高作物對(duì)環(huán)境脅迫抗性的分子育種中，與導(dǎo)入或改良個(gè)別功能基因來提高某種抗性的傳統(tǒng)方法相比，從改良或增強(qiáng)一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控能力著手，是提高作物抗性的更為有效的方法和途徑。
受體材料的獲得植物材料為多年生黑麥草三個(gè)品種種子，愛神特(Accent)、特拉華(Delaware)和尤文圖斯(Juventus)。將其種子經(jīng)次氯酸鈉攪拌消毒40min后，無菌水清洗6次，4℃浸泡10h，再次清洗后用尖頭鑷子剝?nèi)∑渑呓臃N到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)，溫度25℃。期間拔芽三次，25d后繼代，2-3代后挑取胚性愈傷組織預(yù)培養(yǎng)3d。用鑷子將胚性愈傷組織分成直徑約小于0.5mm、0.5-1.0mm、大于1.0mm的愈傷組織塊(表1)，置于含有滲透劑的培養(yǎng)基中央，緊密排列出一個(gè)直徑2cm的圓。愈傷組織塊過小轟擊受損后難以恢復(fù)，多數(shù)褐化死亡；愈傷塊過大使培養(yǎng)基表面不能夠平整，單塊愈傷的轟擊點(diǎn)范圍變小，且，因此0.5-1mm為最適宜的轟擊愈傷直徑。
表1愈傷組織塊的大小對(duì)轟擊后愈傷存活率的影響

篩選劑濃度和時(shí)間的確定將愛神特胚性愈傷組織分別接入含有不同潮霉素篩選劑濃度的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，25℃暗培養(yǎng)，20d和30d時(shí)分別統(tǒng)計(jì)愈傷組織的褐化率。另將胚性愈傷組織接入含有不同潮霉素篩選劑濃度的分化培養(yǎng)基中，25℃光照培養(yǎng)，20d和30d統(tǒng)計(jì)出芽率并觀察愈傷狀態(tài)。以愈傷組織大部分死亡，分化影響適中的篩選劑濃度為轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇濃度和篩選時(shí)間。(表2&表3)確定潮霉素濃度為50mg/L，篩選時(shí)間為30d。
表2潮霉素濃度和篩選時(shí)間對(duì)愈傷褐化情況的影響

表3在抗生素中篩選30d后轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)基中再生狀況

包被DNA從含有DREB1A植物表達(dá)載體的大腸桿菌DH10B中提取質(zhì)粒并純化，稀釋為1μg/μl，-20℃保存。稱取30mg直徑0.6或1μm的金粉，置于1.5ml離心管中，加入lml70％乙醇，渦旋3-5min；靜置15min，瞬時(shí)離心1-5s，棄上清。重復(fù)一下步驟三次加入1ml無菌水，渦旋1min，靜置1min，瞬時(shí)離心，棄上清。三次洗完后，加500μl 50％無菌甘油，金粉濃度約為60mg/ml，室溫下可保持兩周。包被DNA的步驟如下(1)渦旋保存在甘油中的金粉5min。(2)吸取50μl(3mg)于1.5ml離心管中，吸取過程保持渦旋；(3)依次加入5μl DNA CaCl2+sperm或Ca(NO3)2+PEG4000(表5)；(4)持續(xù)渦旋2-3min，靜置1min，瞬時(shí)離心2s；(5)棄上清，加入140μl 70％乙醇；(6)棄上清，加入140μl無水乙醇；(7)棄上清，加入48μl無水乙醇，輕輕敲擊離心管數(shù)次懸浮金粉，低速渦旋2-3s。置于冰上備用。1μm直徑的金粉在瞬時(shí)表達(dá)時(shí)明顯優(yōu)于0.6μm直徑的金粉(表4)。Ca(NO3)2+PEG4000的組合明顯優(yōu)于CaCl2+sperm(表5)，因此金粉的包裹物質(zhì)選擇Ca(NO3)2+PEG4000。
表4金粉直徑對(duì)轟擊后愈傷組織gus基因瞬時(shí)表達(dá)的影響

表5金粉的不同處理對(duì)轟擊后愈傷組織存活率影響

基因槍轟擊采用美國(guó)Biorad公司PDS-1000/He型基因槍，工作臺(tái)、真空室、微彈載體和阻擋網(wǎng)等均需用70％遺傳消毒，然后吹干。將微彈載體裝入載體架上，取6μl包被質(zhì)粒DNA的金粉懸浮液，均勻涂抹于微彈咱體中心，干燥10min。將載有包被質(zhì)粒DNA的金粉顆粒的微彈載體及阻擋網(wǎng)裝入微彈發(fā)射裝置中，將盛有欲轉(zhuǎn)化愈傷組織的培養(yǎng)皿置于基因槍樣品室內(nèi)，可裂圓片與載體的距離為2.5cm，載體與阻擋網(wǎng)的距離為0.8cm，氦氣壓力為1100psi，真空度28inchHg，微彈飛行距離在6或9cm轟擊1-2次。愈傷組織的存活率轟擊2次和轟擊高度選擇6cm較轟擊1次轟擊高度9cm均更高(表6、表7)。
表6轟擊次數(shù)對(duì)愈傷組織存活率的影響

表7轟擊高度對(duì)轟擊后愈傷組織gus瞬時(shí)顯色的影響

轉(zhuǎn)化后愈傷的培養(yǎng)、植株再生和移栽轟擊后在含有滲透劑(0.2M山梨醇和甘露醇)的培養(yǎng)基上過夜。次日通過gus組織化學(xué)染色觀察基因的瞬時(shí)表達(dá)狀況，并將愈傷組織轉(zhuǎn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中黑暗條件下恢復(fù)培養(yǎng)10d，使轉(zhuǎn)入的基因能夠充分的表達(dá)。而后將其轉(zhuǎn)入含有篩選劑(潮霉素50mg/L)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)30d，選擇存活材料轉(zhuǎn)入含有篩選劑的再生培養(yǎng)基中，30d后將再生出小苗的愈傷轉(zhuǎn)入不含篩選劑的再生培養(yǎng)基中，同時(shí)通過gus化學(xué)組織染色觀察基因的穩(wěn)定表達(dá)。將長(zhǎng)到3-4片葉的小苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根，根系發(fā)達(dá)后的植株去除封口膜，室溫下煉苗3d后移入花盆中。
轉(zhuǎn)化植株的分子檢測(cè)提取抗性植株DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，DREB1A引物序列為引物F5’＞AAA GGA TCC TTA CCC GGG TTC TGA TCA ATG AAC TCA TTT TCT G＜3’，引物R5’＞AAA GGT ACC AAT CCC GGG GTT TTA ATA ACT CCA TAA CGA TAC G＜3’取PCR陽性植株的DNA進(jìn)行Southern印跡雜交鑒定，以目的基因的PCR產(chǎn)物做探針。共檢測(cè)愛神特抗性植株109株，其中陽性植株24株，轉(zhuǎn)化效率22％；特拉華抗性植株3株，全部為陽性植株；尤文圖斯抗性植株12株，其中陽性植株10株，轉(zhuǎn)化效率83％。
實(shí)施例2基因槍法將CMO-BADH雙基因轉(zhuǎn)入多年生黑麥草中獲得抗旱耐鹽的轉(zhuǎn)基因植株受體材料的獲得、篩選劑濃度和時(shí)間的確定、DNA的包被以及基因槍的轟擊同實(shí)施例1，轉(zhuǎn)化受體為多年生黑麥草愛神特愈傷組織。PCR擴(kuò)增時(shí)，CMO引物序列為引物FATG ATG GCA GCA AGC GCA AGC GCA AC引物RTTA CTT CAA AGT TTG TTG CAA CCA GCA GTG GBADH引物序列為引物Faac GGA TCC ATG GCG TTC CCA ATT CCT GC引物Racc GAG CTC TCA AGG AGA CTT GTA CCA TCC CC取PCR陽性植株的DNA進(jìn)行Southern印跡雜交鑒定，以目的基因的PCR產(chǎn)物做探針。共檢測(cè)抗性植株50株，其中陽性植株7株，轉(zhuǎn)化效率13％。
權(quán)利要求
1.一種建立多年生黑麥草高效基因槍轉(zhuǎn)化體系的方法及其應(yīng)用，其技術(shù)體系包括(1)通過高頻再生體系獲得受體材料；(2)篩選劑篩選壓和篩選時(shí)間的確定；(3)基因槍法導(dǎo)入外源DNA；(4)轉(zhuǎn)化后愈傷的篩選與再生；(5)抗性植株的分子檢測(cè)。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，它是一種應(yīng)用于多年生黑麥草的高效基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以胚性愈傷組織為受體，通過調(diào)節(jié)基因槍轟擊過程中的各項(xiàng)影響因素，獲得適合多年生黑麥草最佳轉(zhuǎn)化體系。待轟擊愈傷組織塊直徑在0.5-1mm，采用Ca(NO3)2+PEG4000包被質(zhì)粒DNA，使用1μm金粉作為質(zhì)粒DNA的載體，轟擊的高度選擇6cm，轟擊次數(shù)為2次。
4.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，轟擊后愈傷組織在含有滲透劑(0.2M山梨醇和甘露醇)的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上過夜，次日轉(zhuǎn)入愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)10d。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)的愈傷組織，在篩選壓為50mg/L潮霉素的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中篩選培養(yǎng)30d，而后轉(zhuǎn)入相同篩選壓的再生培養(yǎng)基中續(xù)篩選的同時(shí)再生植株。
6.一種多年生黑麥草高效基因槍轉(zhuǎn)化體系在建立轉(zhuǎn)基因抗旱、耐鹽、耐低溫多年生黑麥草中的用途。
7.轉(zhuǎn)基因抗旱、耐鹽、耐低溫多年生黑麥草，其是通過應(yīng)用權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)的方法而得到的。
全文摘要
本發(fā)明一種建立多年生黑麥草高效基因槍轉(zhuǎn)化體系的方法及其應(yīng)用，通過調(diào)控基因槍轟擊過程中的各影響因子，包括轟擊愈傷組織塊大小、金粉包被物、金粉直徑、轟擊高度、轟擊次數(shù)等，以及篩選劑的篩選壓和篩選時(shí)間，成功建立起多年生黑麥草的遺傳轉(zhuǎn)化體系。應(yīng)用該轉(zhuǎn)化體系在建立轉(zhuǎn)基因多年生黑麥草中的用途和應(yīng)用該轉(zhuǎn)化體系得到的轉(zhuǎn)基因抗旱、耐鹽、耐低溫多年生黑麥草植株。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1715417SQ20051008547
公開日2006年1月4日 申請(qǐng)日期2005年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月21日
發(fā)明者韓烈保, 李雪, 劉君, 曾會(huì)明, 信金娜 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué), 韓烈保, 李雪