專利名稱：建立草地早熟禾高頻再生體系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一種建立草地早熟禾高頻再生體系的方法，屬于細胞工程中的植物組織培養(yǎng)，建立了3個草地早熟禾品種的高頻再生體系，可用于農(nóng)桿菌和基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。
背景技術(shù)：
草地早熟禾(Poa pratensis L.)是禾本科早熟禾屬的一種優(yōu)質(zhì)冷季型草坪草，采用基因工程對草地早熟禾進行品種改良、新品種選育已經(jīng)成為當(dāng)前草地早熟禾生物技術(shù)領(lǐng)域研究的重點。草地早熟禾基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)主要來源于組織培養(yǎng)途徑，作為基因轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)，要求具有很強的再生能力、較高的遺傳穩(wěn)定性、穩(wěn)定的外植體來源、對選擇性抗生素敏感、對農(nóng)桿菌侵染要有敏感性等。因此，建立高效的再生體系一直是草地早熟禾育種學(xué)家追尋的目標(biāo)。草地早熟禾組織培養(yǎng)開始于80年代，之后，不同的草地早熟禾組培再生體系相繼建立起來，但是還存在再生頻率較低、維持愈傷胚性困難等不足。本專利從不同外植體來源、激素水平、基因型、繼代時間等因素上研究了草地早熟禾再生體系，建立3個草地早熟禾品種的相對穩(wěn)定的高頻再生體系，為下一步遺傳轉(zhuǎn)化工作提供基礎(chǔ)材料。而且，在這些再生體系的基礎(chǔ)了，進行了遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了轉(zhuǎn)3種外源基因的草地早熟禾轉(zhuǎn)基因植株，證明了這3個再生體系的實用性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明建立了三個草地早熟禾品種的高頻再生體系，能夠應(yīng)用于懸浮培養(yǎng)、農(nóng)桿菌與基因槍轉(zhuǎn)化等過程中。主要包括1)對比成熟種子與胚軸作為外植體進行愈傷組織誘導(dǎo)，兩者獲得的胚性愈傷結(jié)構(gòu)均較好、且增殖較快，考慮到操作的簡便性，采取成熟種子作為外植體。
2)對草地早熟禾進行消毒處理方式比較，證明采用磁力攪拌器攪拌消毒40-60分鐘，蒸餾水洗凈后直接接種效果最佳。
3)選擇干燥、易碎、顆粒狀的愈傷組織進行繼代培養(yǎng)，能夠保持愈傷的胚性，其再生頻率不會下降。
4)采用正交設(shè)計與單因素方差分析對愈傷組織誘導(dǎo)與再生使用的培養(yǎng)基進行研究。得到合適于Baron品種的最適愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2，4-D(1mg/L)+6-BA(0.1mg/L)+CuSO4(3mg/L)+酸水解酪蛋白CH(1g/L)，胚性愈傷誘導(dǎo)率為23.75％，最適再生培養(yǎng)基為AK2MS+KT(0.2mg/L)+6-BA(1mg/L)，分化頻率為53.33％；適合于Midnight品種最適愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2，4-D(2mg/L)+6-BA(0mg/L)+CuSO4(3mg/L)+CH(1g/L)，胚性愈傷誘導(dǎo)率為10％，最適分化培養(yǎng)基為AL2MS++6-BA(1mg/L)+LH(0.5g/L)，分化頻率為56.67％；適合于Mardona品種的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為2mg/L 2，4-D+0.2mg/L 6-BA+3mg/L CuSO4+1g/L CH為愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基，胚性愈傷誘導(dǎo)率為31.67％，最適分化培養(yǎng)基為KBNMS+KT(0.2mg/L)+6-BA(1mg/L)+NAA(0.5mg/L)，分化頻率為40％以上。同時，建議把胚性愈傷誘導(dǎo)率作為愈傷組織誘導(dǎo)效率的評價指標(biāo)。
5)獲得的再生植株在有很強的分蘗能力，再生2個月是適合移栽的時期，移栽到花盆中的再生苗能夠100％成活，在田間能夠正常擴繁生長。
四

圖1干燥、易碎的第一類愈傷組織(被稱為胚性愈傷組織)；圖2柔軟、水質(zhì)的第二類愈傷組織；圖3草地早熟禾再生植株；圖4草地早熟禾生根；圖5移栽到花盆的再生苗；圖6再生苗移栽以2個月移栽效果最好(左圖為再生2個月，右圖為再生一個月)；圖7再生苗移栽到田間生長旺盛(均Mardona品種為例)
五具體實施例方式
1.材料與方法1.1試驗材料草地早熟禾‘Mardona’品種，來自丹麥丹農(nóng)種子公司，‘Midnight’品種，來自美國Turf-seed Inc公司，‘Baron’品種，來自荷蘭百綠集團。
1.2外植體的獲得采用成熟種子與胚軸作為外植體，胚軸來源于剛萌發(fā)的種子。成熟種子浸入70％酒精30秒，無菌水沖洗2-3次，25％次氯酸鈉溶液消毒40分鐘-1小時(依消毒狀態(tài)而定)，無菌水清洗5-6次。
1.3培養(yǎng)基培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基，附加不同量的植物激素、30g/L蔗糖、8g/L瓊脂，pH值5.8。愈傷組織誘導(dǎo)與繼代使用相同的培養(yǎng)基。愈傷組織分化和生根使用相同的培養(yǎng)基。
1.4培養(yǎng)方法無菌種子接種入誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基中，28℃無菌黑暗條件誘導(dǎo)愈傷，約9天對種子進行拔芽處理，促進愈傷組織形成，記錄發(fā)芽率，20天后繼代到新鮮的相同培養(yǎng)基中。繼代2次后，統(tǒng)計出愈率和胚性愈傷誘導(dǎo)率，進行結(jié)果分析。愈傷組織分化與生根條件為16h光照，8h黑暗，光照度2000Lx，溫度均為25±1℃。
2.結(jié)果與分析2.1不同外植體誘導(dǎo)愈傷的影響采用成熟種子與長1cm的胚軸愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷，結(jié)果見表1。
表1 胚軸誘導(dǎo)愈傷與種子誘導(dǎo)比較

由表1可見，成熟種子作為外植體誘導(dǎo)愈傷的出愈率與胚性愈傷誘導(dǎo)率均較胚軸高，兩者獲得的胚性愈傷結(jié)構(gòu)均很好、且增殖較快，考慮到操作的簡便性，采取成熟種子作為外植體。
2.2外植體消毒方式對誘導(dǎo)愈傷影響種子消毒后，采用兩種不同的處理方式1直接接種；2滅菌蒸餾水中4攝氏度浸泡3天后接種，結(jié)果見表2。在種子消毒過程中采用磁力攪拌器攪拌消毒與手動消毒2種方式，結(jié)果見表3。
表2 不同接種方式對愈傷誘導(dǎo)影響

浸泡種子按種后，種子4天便可發(fā)芽，而直接接種，種子則5天才可發(fā)芽。雖然浸泡可以使種子提前發(fā)育，但是并沒有使出愈率增加，反而使出愈率降低了4.7個百分點。所以采用直接接種的方法較好。
表3 種子消毒方式對愈傷誘導(dǎo)影響

由表3可以看出，采用磁力攪拌消毒么能大大提高愈傷組織出愈率，所以，采用磁力攪拌消毒處理種子。
2.3愈傷質(zhì)量與年齡對植株再生影響由成熟種子誘導(dǎo)的愈傷組織在顯微鏡下觀察可見典型的兩種類型(附圖1，2)，第一種類型中的愈傷生長迅速，呈顆粒狀結(jié)構(gòu)，形狀有球形、心形，有些呈現(xiàn)體細胞胚發(fā)育的早期形態(tài)，而第二種愈傷組織為水狀、生長緩慢，顏色暗淡，分化只能形成毛狀根，不能形成植株。選擇第一種愈傷組織進行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)不同時間長短的愈傷組織進行分化再生實驗，結(jié)果見表4。
表4 不同年齡愈傷分化情況比較

從總體(表4)上看，在8個月內(nèi)，草地早熟禾愈傷沒有因為繼代次數(shù)增多而胚性下降，對于草地早熟禾而言，采用誘導(dǎo)出的胚性愈傷或者繼代產(chǎn)生的胚性愈傷繼代，能夠保持胚性。
2.4三種草地早熟禾品種再生體系建立2.4.1愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基確定愈傷組織誘導(dǎo)在MS基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，考慮4個因素，每個因素設(shè)4個水平，采用L16(45)正交表進行，具體因素與水平見表5，愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果見表6。
表5 正交試驗表頭設(shè)計

表6 愈傷誘導(dǎo)情況統(tǒng)計

對所得百分率的結(jié)果進行反正弦轉(zhuǎn)換，并進行數(shù)據(jù)處理與分析，獲得了三個品種的最適愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基(表7)。只有胚性愈傷才能正常再生，對再生體系建立作用較大，所以，用胚性愈傷誘導(dǎo)率作為評價指標(biāo)較為合理。最終以胚性愈傷誘導(dǎo)率確定為最適合的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
表7 三個品種草地早熟禾愈傷組織誘導(dǎo)正交設(shè)計結(jié)果

各因素影響程度為 各因素影響程度為A＞B＞D＝C，最適合的 A＞D＞C＞B，最適合的Midnight(Md)組合為A3B3C2D4組合為A3B1C2D4。
對Baron、Midnight品種進行正交設(shè)計結(jié)果的驗證，驗證用的培養(yǎng)基見表8，驗證結(jié)果見表9。
表8 驗證用的培養(yǎng)基成分

表9 不同培養(yǎng)基的誘導(dǎo)情況

注不同字母表示差異顯著(P＜O.05)由表9可以看出，適合Baron品種的最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為P2，胚性愈傷誘導(dǎo)率為23.75％，適合Midnight品種的最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為P5，胚性愈傷誘導(dǎo)率為10％。
2.4.2最適愈傷組織分化培養(yǎng)基確定對于Mardona品種，愈傷組織分化培養(yǎng)基在MS基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，考慮4個因素、每個因素3個水平，采用L9(34)正交表進行，具體因素與水平見表10，結(jié)果見表11。對于Baron、Midnight品種，采用單因素實驗設(shè)計，具體的方法與結(jié)果見表12。
表10 愈傷組織分化正交試驗表頭設(shè)計

表11 愈傷組織分化正交設(shè)計實施結(jié)果因素與水平處理均值

對所得百分率的結(jié)果進行反正弦轉(zhuǎn)換，并進行數(shù)據(jù)處理與分析，得到最適合于Mardona品種分化培養(yǎng)基為MS+KT(0.2mg/L)+6-BA(1mg/L)+LH(0g/L)+NAA(0.5mg/L)。
表12 Baron、Midnight品種單因素再生實驗結(jié)果

由表12可以看出，Baron品種的最適再生培養(yǎng)基為AK2MS+KT(0.2mg/L)+6-BA(1mg/L)，Midnight的最適分化培養(yǎng)基為AL2MS++6-BA(1mg/L)+LH(0.5g/L)。
2.5再生植株的移栽愈傷組織在再生培養(yǎng)基中分化1個月后(附圖3)，轉(zhuǎn)入相同的培養(yǎng)基生根和壯苗(附圖4)，轉(zhuǎn)入花盆中(附圖5)，一般再生2個月后移栽效果最佳(附圖6)。這些移栽苗，轉(zhuǎn)入田間能保持旺盛生長(附圖7)。
3.該再生體系應(yīng)用實例采用基因槍轉(zhuǎn)化法，轟擊由此再生體系培養(yǎng)出的胚性愈傷組織，經(jīng)過繼代與分化培養(yǎng)，獲得了Baron品種轉(zhuǎn)DREB1A、BADH-CMO、CMO三種外源基因的轉(zhuǎn)基因植株(表13)。其轉(zhuǎn)化頻率依次為3.59％、3.92％與1.94％。是一次成功的運用實例。
表13 Baron品種轉(zhuǎn)基因數(shù)目

權(quán)利要求
1建立草地早熟禾高頻再生體系的方法，其技術(shù)體系包括1)外植體的選擇以及消毒；2)胚性愈傷誘導(dǎo)與鑒定方法；3)不同時間長短的愈傷再生能力比較；4)正交設(shè)計和單因素設(shè)計在再生體系中的應(yīng)用；5)組培苗移栽合適時期的選擇與田間移栽
2.按照權(quán)利要求1所述，建立草地早熟禾高頻再生體系的方法，其特征在于，選擇成熟種子作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，消毒時運用磁力攪拌消毒，蒸餾水洗凈后直接接種為宜。
3.按照權(quán)利要求1所述，建立草地早熟禾高頻再生體系的方法，其特征在于，選擇易碎、干燥的胚性愈傷進行繼代培養(yǎng)，在8個月內(nèi)能夠保持其再生能力。
4.按照權(quán)利要求1所述，建立草地早熟禾高頻再生體系的方法，其特征在于，正交設(shè)計與單因素實驗設(shè)計，是草地早熟禾組織培養(yǎng)過程中可靠的研究方法。運用這2種實驗設(shè)計的方法，建立了三種草地早熟禾品種的高頻再生體系。
5.按照權(quán)利要求1所述，建立草地早熟禾高頻再生體系的方法，其特征在于，再生2個月的組培苗，移栽到花盆中能夠100％成活，在田間生長健壯。
6.按照權(quán)利要求1所述，建立草地早熟禾高頻再生體系的方法，其特征在于，運用Baron品種高頻再生體系進行了基因槍介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了轉(zhuǎn)DREB1A、BADH-CMO、CMO基因的轉(zhuǎn)化植株。其轉(zhuǎn)化頻率依次為3.59％、3.92％與1.94％。
全文摘要
本專利對草地早熟禾Baron、Mardona、Midnight品種進行了組織培養(yǎng)研究，表明選擇成熟種子作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，消毒時運用磁力攪拌消毒，蒸餾水洗凈后直接接種為宜；選擇易碎、干燥的胚性愈傷進行繼代培養(yǎng)，在8個月內(nèi)能夠保持其再生能力；再生2個月的組培苗，移栽到花盆中能夠100％成活，在田間生長健壯；運用正交設(shè)計與單因素實驗設(shè)計的方法，建立了三種草地早熟禾品種的高頻再生體系，胚性愈傷誘導(dǎo)率高達31.67％，愈傷組織分化率高達56.67％。運用其中Baron品種的再生體系進行基因槍轉(zhuǎn)化，獲得了轉(zhuǎn)DREB1A、BADH－CMO、CMO基因的轉(zhuǎn)化植株。
文檔編號A01H4/00GK1698423SQ20051008547
公開日2005年11月23日 申請日期2005年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月21日
發(fā)明者韓烈保, 信金娜, 曾會明, 劉君, 李雪 申請人:北京林業(yè)大學(xué), 韓烈保, 信金娜