專利名稱：一種鑒定茄科作物青枯病抗性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物對病害抗性的鑒定方法，特別涉及一種鑒定茄科作物青枯病抗性的方法。
背景技術(shù)：
中國是世界上馬鈴薯生產(chǎn)量最大的國家，全國常年種植面積達(dá)470多萬公頃，總產(chǎn)7000多萬噸，約占世界的19％，亞洲的70％。但生產(chǎn)水平偏低，全國平均水平僅14噸/公頃，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于發(fā)達(dá)國家20-40噸/公頃的生產(chǎn)水平。影響馬鈴薯產(chǎn)量的因素很多，如品種、品種質(zhì)量、生產(chǎn)投入、耕作制度等。其中，細(xì)菌和真菌病害是影響馬鈴薯產(chǎn)量的重要因素。多年來，國內(nèi)外科學(xué)家投入大量的人力物力致力于馬鈴薯品種的改良及其病蟲害防治，并取得了一定的成效。
馬鈴薯青枯病是由青枯病菌(Ralstonia solanacearum)引起的，是僅次于馬鈴薯晚疫病的一種細(xì)菌性病害，可侵害馬鈴薯、番茄等數(shù)百種植物。青枯病是一種維管束病害，典型癥狀是葉片、分枝或植株出現(xiàn)急性萎蔫，枝葉未等發(fā)黃，青枝綠葉即萎蔫枯死。其致病機(jī)理主要是通過胞外多糖等大分子阻礙植物導(dǎo)管內(nèi)水分的運(yùn)輸，從而引起萎蔫癥狀；一些胞外酶，如果膠酶類、纖維素酶類等在致病過程中也起到一定的作用。該病害可通過土壤、灌溉、植株、種薯等進(jìn)行傳播，寄主范圍廣，并隨著氣候變化、土壤類型、地理位置和耕作方式的不同而變化，造成不同程度的減產(chǎn)，嚴(yán)重時可使馬鈴薯減產(chǎn)80％，甚至絕產(chǎn)(He liyuan.Characterization of Pseudomonassolanacearum from China.Pl.Dis.，1987，671357-1362)。該病害在我國長江流域及其以南的西南單雙季混作區(qū)、南方和中原二季作地區(qū)馬鈴薯生產(chǎn)為害很大，并且由于青枯病菌的寄主不斷增加，且防治技術(shù)有限，導(dǎo)致該病已成為目前危害許多栽培植物的最嚴(yán)重病害之一。
提高馬鈴薯抗性，培育抗病品種是防治馬鈴薯青枯病的重要方法，目前國內(nèi)外研究已取得一定的進(jìn)展。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)馬鈴薯二倍體野生種、原始栽培種、四倍體野生種及四倍體栽培種等很多材料具有對青枯病不同程度的抗性和耐性。屈冬玉等利用產(chǎn)生2n配子的材料進(jìn)行4x-2x有性多倍化，篩選出了既能高頻率產(chǎn)生2n配子又具有青枯病抗性的二倍體種質(zhì)，并利用2n配子將Solanum phureja的抗青枯病基因轉(zhuǎn)移到四倍體栽培種中，獲得了MS42.3×CD1045，AVRDC1287×ED1022，B927017×CD1045，W2×D-2-1等一批高抗青枯病的四倍體組合及后代材料(Qu Dongyu.Use of unreduced gametesof potato for TPS production through 4x-2x crosses〔dissertation〕.WageningenWageningen Agricultural University，1996.38-46)；何禮遠(yuǎn)等利用Mira與自國際馬鈴薯中心(CIP)引進(jìn)材料中的377852.2和800928組配雜交組合，從中篩選出了895010和898006兩個抗病高產(chǎn)的優(yōu)良品系；南方馬鈴薯研究中心也從中篩選出了800935、385233-3、388193-21等14份抗病材料。但如何評價、特別是先期評價所培育出的馬鈴薯品系(種)的抗病性強(qiáng)弱仍是進(jìn)行馬鈴薯抗病育種的重要環(huán)節(jié)。
目前進(jìn)行馬鈴薯抗青枯病種質(zhì)資源的鑒定方法主要分為室內(nèi)鑒定和田間鑒定。室內(nèi)鑒定可為田間鑒定提供參考，具有一定的優(yōu)越性可人工控制生長環(huán)境條件，進(jìn)行工廠化作業(yè)和管理，保持條件的一致性，不易受外界因素干擾；可對育種研究初期獲得的雜交后代，或無性系的試管苗等進(jìn)行早期大量鑒定和篩選；也可對育成的優(yōu)良材料在標(biāo)準(zhǔn)化條件下，采用多個菌系(小種或致病型)和不同菌量接種，進(jìn)行抗病性鑒定和評價。目前進(jìn)行馬鈴薯抗青枯病鑒定所采用的接種方法主要有灌根法(傷根灌注法、不傷根灌注法)和莖部毛細(xì)管菌液滴注法(即莖部刺傷微吸管滴注接種法)，另外還有水培法等(李乃堅，黃愛興，袁四清，王得元.茄科作物抗青枯病水培法鑒定研究II.液體培養(yǎng)青枯菌的致病力.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000年第3期，38-40)。這些方法各有優(yōu)、缺點(diǎn)。研究表明接種方法對抗性有顯著的影響，如傷根接種跟不傷根接種相比，對于抗性主要表現(xiàn)為抗侵入的植株，傷根法則難以真實(shí)反映材料的自然抗性(Perera K D A，Hartman G L，Poulos J M.Introduction procedures and theevaluation of peppers for resistance to P.solanacearum.Bacterial Wilt.TheAustralian Center for International Agricultural Research，1992，193-198.)；而對于誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性的植株二者則沒有明顯差別。此外灌根法周期長、操作繁瑣、費(fèi)時費(fèi)力，同時傷根灌注也存在因傷根程度不同帶來的人為誤差。莖部毛細(xì)管菌液滴注法同樣也存在因作物莖桿粗細(xì)不同導(dǎo)致接種時傷害程度不同的問題，且操作不便。水培法則需要專用設(shè)備和一定濃度的營養(yǎng)液進(jìn)行作物與菌液的共培養(yǎng)，成本較高，但該方法卻能保持所鑒定植株的生理年齡的基本一致性。鑒于上述方法的不足，迫切需要一種更為經(jīng)濟(jì)有效、快速簡便的茄科作物(特別是馬鈴薯)抗病鑒定新方法，以更好的進(jìn)行抗病種質(zhì)資源評價及進(jìn)行快速準(zhǔn)確的篩選和鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種方便實(shí)用的鑒定茄科作物對青枯病菌抗性的方法。
本發(fā)明所提供的鑒定茄科作物對青枯病菌抗性的方法，是將生理年齡一致的植株的莖或/和枝接種于青枯病菌菌液中，在可控條件下培養(yǎng)，定期觀察其發(fā)病情況并調(diào)查相關(guān)指標(biāo)，作出抗性評價。
在上述鑒定方法中，青枯菌菌液濃度的選擇是較寬的，如可以是1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108cfu/mL等，可根據(jù)待測植株品種及實(shí)際需要進(jìn)行選擇。如當(dāng)待測植株為馬鈴薯時，菌液濃度優(yōu)選為1×106cfu/mL；當(dāng)待測植株為番茄時，菌液濃度優(yōu)選為1×104cfu/mL。
可控培養(yǎng)條件為待測植株品種或品系對青枯菌的最適發(fā)病條件。如鑒定馬鈴薯對青枯病菌小種3號P041的抗性時，可控培養(yǎng)條件優(yōu)選為在26-28℃可控溫室內(nèi)，空氣相對濕度大于70％下培養(yǎng)；當(dāng)鑒定番茄對青枯病菌小種1號TM60的抗性時，可控培養(yǎng)條件優(yōu)選為在28-32℃可控溫室內(nèi)，空氣相對濕度大于70％下培養(yǎng)。
所述植株可為任一易于水培的馬鈴薯，番茄，茄子，煙草等茄科作物，優(yōu)選為馬鈴薯。所述植株可為大田生長的植株，組培幼苗或小氣候環(huán)境下的植株(開放環(huán)境下的盆栽植株和溫室內(nèi)盆栽植株)。
所述莖或/和枝可來自于同一個植株，還可來自于遺傳背景相同的不同植株，莖為主莖，枝為側(cè)枝、主枝或次生枝。
將莖或/和枝接種于菌液中的方法為從生長正常、旺盛、整齊、無病蟲害的待測植株上切取莖、枝，首先存放于自來水或無菌水(優(yōu)選)中保濕，待取完全部所需的莖、枝后，同時插入青枯菌菌液中浸泡培養(yǎng)。
可按下述方法對青枯菌進(jìn)行培養(yǎng)并對菌液的濃度進(jìn)行調(diào)整挑取致病力強(qiáng)的單菌落畫線，于28℃斜面培養(yǎng)24～48小時后，轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)平板中，在相同溫度下繼續(xù)培養(yǎng)12～24小時，待長至菌臺后，用無菌蒸餾水將其洗下，通過測定菌液OD600的吸光值，用無菌水調(diào)整菌液的濃度，如1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108cfu/mL等。
培養(yǎng)過程中定期觀察植株的發(fā)病情況，逐個材料或逐株(枝)詳細(xì)記載發(fā)病期和嚴(yán)重度，以發(fā)病高峰期且最能反映抗(感)病性差異的調(diào)查記載數(shù)據(jù)為依據(jù)作出抗病性評價。
可參照下述方法對植株的青枯病抗病性進(jìn)行評價1)供試材料接種后，從第二天開始持續(xù)觀察發(fā)病情況，以發(fā)病高峰期且最能反應(yīng)抗、感病差異的調(diào)查記載數(shù)據(jù)，參照傳統(tǒng)方法(孫惠生.馬鈴薯育種學(xué).中國農(nóng)業(yè)出版社.2003，238.)，將植株的發(fā)病嚴(yán)重度分為以下5級1級無癥狀，健康；2級1-2個葉片萎蔫；
3級3-4個葉片萎蔫；4級全部葉片萎蔫；5級莖枝死亡。
根據(jù)抗病級別對植株材料作出抗病性評價，這也是利用該方法進(jìn)行植株抗病鑒定的主要依據(jù)。
2)測定接種后第10天浸泡有植株莖枝的青枯菌菌液的OD600吸光值，然后根據(jù)該值對植株的青枯病抗病性進(jìn)行初步判斷，OD600吸光值的高低與植株的抗病呈負(fù)相關(guān)，吸光值越高植株越感病。
3)觀察浸泡部位的瘤狀乳突數(shù)量，抗性越強(qiáng)，所形成的瘤狀乳突數(shù)量越多。
浸泡菌液的OD600吸光值大小及浸泡部位所形成的瘤狀乳突數(shù)量的多少均作為參考依據(jù)，可對植株抗病性作出初步評價。在實(shí)際操作中，可綜合上述三種方法對植株的抗病性作出綜合評價。
本發(fā)明提供了一種茄科作物對青枯病抗性鑒定的新方法，取名為“莖枝菌液浸泡法”。該方法是在綜合傳統(tǒng)作物抗病鑒定方法，并結(jié)合作物無土栽培的水培法的基礎(chǔ)上，發(fā)明的一種茄科作物對青枯病抗性鑒定新方法。該方法較傳統(tǒng)的灌根法、莖部毛細(xì)管菌液滴注法等具有以下優(yōu)點(diǎn)①簡單易行只需將生理年齡一致的不同植株的莖、枝或同一植株的主莖和側(cè)枝剪下浸泡在含有一定濃度的菌液中即可，不需將所有植株進(jìn)行傷根浸染，保證了實(shí)驗(yàn)試材生理年齡的一致性，也增加了鑒定的準(zhǔn)確性。②可操作性更強(qiáng)，更加經(jīng)濟(jì)可通過去掉植株頂芽使其產(chǎn)生大量側(cè)枝的方法獲得足夠數(shù)量的莖、枝，無需培養(yǎng)大量植株，降低了工作量，同時也保證了所取莖枝生理年齡的一致性；同一個容器內(nèi)可浸泡多個植株的莖枝，節(jié)省了空間，有利于控制發(fā)病條件，更加便于管理，也有利于對大量不同的材料進(jìn)行鑒定；可通過改變浸泡菌液的濃度人為控制發(fā)病的速度，節(jié)省時間，降低能耗。③鑒定結(jié)果的一致性更強(qiáng)、重復(fù)性更高由于對每一個莖、枝在菌液浸泡前均經(jīng)過同樣的鋒利刀片的垂直切割，所受到的傷害基本一致，避免了傷根灌注法因傷根程度不同和毛細(xì)管滴注法對不同粗細(xì)的植株莖所造成的傷害程度不同的弊端及由此引起的植株抗感表現(xiàn)的差異，同時浸泡所用菌液均勻一致，減少其他條件的干擾，保證了鑒定結(jié)果的一致性和可重復(fù)性；并且同一植株的多個莖枝可同時進(jìn)行鑒定，增加了單株鑒定的準(zhǔn)確性，這對于無性繁殖的作物具有重要意義。④適用對象更廣大田生長的植株，組培幼苗，小氣候環(huán)境下的植株(開放環(huán)境下的盆栽植株和溫室內(nèi)盆栽植株)，植株的主枝和次生枝等，同時對所要鑒定的群體大小沒有嚴(yán)格的限制，只要每個基因型的植株莖枝能夠滿足5個以上即可。⑤適用范圍更寬能夠進(jìn)行水培的植物均可使用該方法進(jìn)行(快速)抗病性鑒定。⑥可人為控制發(fā)病時間的早晚增加所使用菌液的濃度，可進(jìn)行植株抗病性的快速鑒定；降低浸泡菌液的濃度，則可推遲發(fā)病時間，按照傳統(tǒng)的調(diào)查方法進(jìn)行調(diào)查后，確定植株的抗病級別。⑦鑒定后的植株可直接利用由于用于鑒定的是植株的莖枝，所剩余的植株沒有接觸病菌，因此可直接進(jìn)行利用，而用灌根法和毛細(xì)管法鑒定后的植株因直接接觸了菌液則不能直接利用，因此，莖枝菌液浸泡法對于珍貴稀有的植株材料的鑒定、保存和繁殖具有重要意義。本發(fā)明不僅適用于茄科作物對青枯病的抗性鑒定和篩選，還將在茄科作物的細(xì)菌性病害的抗性篩選和鑒定，種質(zhì)資源評價，特別是病菌誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性的抗(感)病植株的快速鑒定及其幼苗的先期快速篩選等方面發(fā)揮巨大作用。


圖1為莖、枝菌液浸泡法流程示意2A-圖2C為不同抗病性的馬鈴薯植株莖、枝經(jīng)青枯菌菌液浸泡后形成的瘤狀突起圖3為不同接種方法接種馬鈴薯的結(jié)果對比圖4接種于不同菌液濃度下的抗病番茄393浸泡培養(yǎng)10天后的生根表現(xiàn)圖5為抗病番茄在不同接菌濃度下浸泡培養(yǎng)14天后的抗病表現(xiàn)圖6抗病性不同的番茄接菌后14天的抗病表現(xiàn)具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、馬鈴薯對青枯病菌小種3號(P041)的抗性鑒定供試青枯病菌株青枯病菌小種3號P041，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所植保室提供。
供試植物材料馬鈴薯抗病植株和感病植株，來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所馬鈴薯組，其遺傳背景參見文獻(xiàn)(Qu Dongyu.Use of unreduced gametes of potato for TPSproduction through 4x-2x crosses(dissertation).WageningenWageningenAgricultural University，1996.38-46)，抗病對照植株(MS42.3)源自國際馬鈴薯中心(CIP)。
參照圖1進(jìn)行馬鈴薯對青枯病菌小種3號(P041)的抗性鑒定，具體方法如下一、青枯病菌的培養(yǎng)及菌液濃度的調(diào)整挑取致病力強(qiáng)的青枯病菌單菌落進(jìn)行畫線培養(yǎng)，待長至菌臺后，用無菌蒸餾水將其洗下，分光光度計測定其OD600的光吸收值，并調(diào)整菌液濃度分別為1×105、1×106、1×107、1×108cfu/mL備用。
二、用本發(fā)明的方法進(jìn)行抗性鑒定采用“莖枝菌液浸泡法”進(jìn)行接種，具體方法為取生長正常、旺盛、整齊、無病蟲害的塊莖繁殖的不同基因型(見表1)的馬鈴薯植株，待其長至7-8片展葉時，去除主莖頂芽，促使側(cè)芽繼續(xù)生長至5-6片展葉時，用手術(shù)刀片切取帶有4-5片展葉的主莖或側(cè)枝，首先存放于自來水中保濕，待取完全部所需的主莖或側(cè)枝后，同時插入盛有不同濃度(1×105、1×106、1×107、1×108cfu/mL)的青枯病菌小種3號菌液(該菌液為菌的水溶液，水為無菌水。)的容器內(nèi)進(jìn)行浸泡，做好詳細(xì)標(biāo)記，并于浸泡后第3、5、7、10、14天調(diào)查發(fā)病情況，同時測定第10天浸泡菌液的OD600光密度值。同時，采用灌根法和毛細(xì)管菌液滴注法進(jìn)行接菌作為對照，所使用的菌液濃度為1×108cfu/mL，灌根法所使用的器具、土壤等均進(jìn)行相應(yīng)的消毒滅菌處理，其菌液接種量為30mL，毛細(xì)管菌液滴注法接種量為30μL。接種后的馬鈴薯植株培養(yǎng)在26-28℃可控溫室內(nèi)，空氣相對濕度為70％以上，灌根法的土壤濕度約為土壤最大持水量的60％。
采用本發(fā)明的方法接菌后植株的發(fā)病情況如表1所示，以菌液濃度為1×106cfu/mL為例，接菌后第3天，感病植株的莖枝開始出現(xiàn)萎蔫，第4天萎蔫程度明顯加重，個別高感植株的莖枝已大部分萎蔫，第5天高感植株的莖枝已全部萎蔫，高抗植株的莖枝也出現(xiàn)萎蔫癥狀，第7天抗病植株的莖枝萎蔫程度明顯加重，高抗植株的莖枝萎蔫程度基本不變；第10天高抗植株莖枝萎蔫癥狀減輕，有的已基本恢復(fù)健康，而感病植株的莖枝則腐爛死亡；第14天高抗植株的莖枝已恢復(fù)健康，個別的已開始生根?？垢兄仓昵o、枝的發(fā)病程度與浸泡菌液的濃度和浸泡時間呈高度相關(guān)，浸泡時間越長、菌液濃度越高，發(fā)病越快，這對于研究者要求植株盡早發(fā)病，確定準(zhǔn)確的取材時期至關(guān)重要，但試驗(yàn)中不同濃度的浸泡菌液浸泡植株莖枝所得的抗、感結(jié)果一致，因此該方法對于種質(zhì)資源的抗病篩選、資源評價和抗病鍛煉具有重要的指導(dǎo)意義。同時在試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)抗病植株主枝浸泡菌液后，在其受菌液浸泡部位形成了一些瘤狀乳突結(jié)構(gòu)，抗性級別越高的植株莖、枝所形成的瘤狀乳突結(jié)構(gòu)越多，如圖2A-圖2C所示，且浸泡菌液變得澄清；而在感病植株的莖枝上未發(fā)現(xiàn)有瘤狀乳突結(jié)構(gòu)的形成，且其浸泡菌液的末端發(fā)生褐變，浸泡菌液變得混濁。測定菌液OD600光密度值，結(jié)果表明隨著植株感病程度的增加，浸泡其莖、枝的菌液OD600吸光值也逐步升高，這可能是由于抗病植株所產(chǎn)生的瘤狀乳突或莖枝本身能夠釋放一種抑菌物質(zhì)所致，Yuan等(Yuan F H，He L Y.An anti-Ralstonia solanacearum protein form and its immunogoldlocalization in vivo.Bacterial wilt Disease.Germany Springer Press.1998，209~217.)從馬鈴薯近緣栽培種Solanum phureja的雜交后代中分離純化了抗青枯病菌蛋白AP1，該AP1蛋白對5種源自馬鈴薯和其它作物的青枯菌系及源自馬鈴薯的2種真菌病原均具有較好的抑菌活性，同時該基因的原核表達(dá)產(chǎn)物具有與源自馬鈴薯的AP1蛋白同樣的抑菌活性(馮潔，何禮遠(yuǎn)，袁鳳華.馬鈴薯32kD抗菌蛋白的cDNA分子克隆研究.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，1999，7(1)37-40.；Feng J，Yuan F，Gao Y，LiangC，Xu J，Zhang C，He L.A novel antimicrobial protein isolated from potato(Solanum tuberosum)shares homology with an acid phosphatase.Biochem J.2003，376(2)481-487)，并且轉(zhuǎn)AP1蛋白編碼基因的馬鈴薯和煙草植株對青枯病菌具有不同程度的抗性(梁成罡，何禮遠(yuǎn).抗菌蛋白AP1編碼基因?qū)︸R鈴薯的轉(zhuǎn)化及其介導(dǎo)的青枯病抗性研究.植物保護(hù)學(xué)報，2002，29(1)51～56.)。因此根據(jù)植株莖枝經(jīng)菌液浸泡后所形成的瘤狀乳突結(jié)構(gòu)的有無、多少及浸泡菌液OD600光密度值的大小可以對相應(yīng)植株的抗病性進(jìn)行初步判定。
表1 不同接菌濃度下3次鑒定馬鈴薯莖枝的綜合發(fā)病情況(部分結(jié)果)

1健康 21-2個葉片萎蔫 33-4個葉片萎蔫 4全部葉片萎蔫 5莖枝死亡a莖枝恢復(fù)健康，但有少數(shù)老葉死亡b莖枝恢復(fù)健康，但有部分老葉死亡三、莖枝菌液浸泡法與灌根法、毛細(xì)管菌液滴注法鑒定結(jié)果的比較多年實(shí)踐證明，灌根法及毛細(xì)管菌液滴注法對于馬鈴薯抗病性的篩選和評價是有效的，但這些方法所需時間較長，特別是灌根法需要3周時間，無疑會加大資源評價的成本，從三種方法的比較中發(fā)現(xiàn)莖枝菌液浸泡法同灌根法及毛細(xì)管菌液滴注法的評價結(jié)果是一致的，如圖3所示(圖中A-D為莖枝菌液浸泡法接種；E-H為莖部毛細(xì)管菌液滴注法接種；I-L為傷根灌注法接種；豎排為相應(yīng)基因型不同接種方法的抗病表現(xiàn))。同時試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)莖枝菌液浸泡法接種后，植株莖枝抗病表現(xiàn)的變異范圍小于傷根灌注法和毛細(xì)管滴注法(表2)，這可能是由于莖枝菌液浸泡接種法接種時莖枝所受傷害基本一致，避免了傷根灌注法傷根程度不同和毛細(xì)管滴注法對不同粗細(xì)的植株莖枝所造成的傷害程度不同等引起的植株抗感表現(xiàn)的差異所致。采用莖枝菌液浸泡法時，不同的浸泡菌液濃度之間存在莖枝發(fā)病早晚的差異，菌液濃度與發(fā)病早晚存在高度相關(guān)，菌液濃度越高，莖枝發(fā)病越早。這對于要求待評價植株快速發(fā)病，研究植株抗病基因表達(dá)及植病互作具有重要意義。對于馬鈴薯而言，浸泡菌液的濃度以1×106cfu/mL為宜，以第4或第5天調(diào)查結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價。若提高浸泡菌液的濃度，則適當(dāng)提前調(diào)查時間。
表2 三種接種方法接菌后馬鈴薯(莖枝)的發(fā)病情況(部分結(jié)果)

實(shí)施例2、番茄對青枯病菌小種1號TM60的抗性篩選與鑒定供試青枯病菌株青枯病菌小種1號TM60，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所植保室提供。
供試植物材料番茄抗病植株和感病植株，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所番茄組提供。
參照圖1進(jìn)行番茄對青枯病菌小種1號TM60的抗性鑒定，具體方法如下一、青枯病菌的培養(yǎng)及菌液濃度的調(diào)整挑取致病力強(qiáng)的青枯病菌單菌落進(jìn)行畫線培養(yǎng)，待長至菌臺后，用無菌水將其洗下，用分光光度計測定其OD600的吸光值，調(diào)整菌液濃度分別為1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108cfu/mL，備用。
二、用本發(fā)明的方法進(jìn)行抗性鑒定采用“莖枝菌液浸泡法”進(jìn)行接種，具體步驟與實(shí)施例1相同，同時采用灌根法接菌作為對照，所使用的菌液濃度為1×108cfu/mL，灌根法所使用的器具、土壤等均進(jìn)行相應(yīng)的消毒滅菌處理，其菌液接種量為30mL。接種后的番茄植株培養(yǎng)在28-32℃可控溫室內(nèi)，空氣相對濕度為70％以上，灌根法的土壤濕度約為土壤最大持水量的60％。
采用本發(fā)明的方法接菌后番茄植株的發(fā)病情況如表3所示，以菌液濃度為1×104cfu/mL為例，接菌后第3天，高感植株的莖枝萎蔫程度已達(dá)3級，抗病植株的莖枝則剛開始有癥狀；第5天時，高感植株的莖枝已經(jīng)全部萎蔫，抗病植株的莖枝萎蔫程度加重；第7天時抗病植株的莖枝的萎蔫癥狀有所緩解，而感病植株的莖枝已部分死亡。第10天時高抗植株的莖枝已經(jīng)開始恢復(fù)健康，仍然存活的感病植株莖枝的萎蔫癥狀也有所緩解；到第14天時，高抗植株的莖枝已恢復(fù)健康，仍然存活的感病植株的莖枝也基本恢復(fù)正常。其中，抗病番茄品種393莖、枝浸泡于1×103、1×104、1×105cfu/mL菌液后10天抗病表現(xiàn)如圖4所示，抗病番茄品種393莖、枝浸泡于0、1×105、1×106、1×107、1×108cfu/mL菌液后14天抗病表現(xiàn)如圖5所示，抗病性不同番茄植株莖、枝浸泡于1×105cfu/mL菌液后14天抗病表現(xiàn)如圖6所示(D3、D14、D5為感病植株，393、395、419為抗病植株)，表明當(dāng)植株受病菌浸染后，感病植株因不含有抗病因子，無法抵御病菌的浸染而發(fā)病，甚至死亡；而抗病植株由于含有抗病因子，病菌的浸染刺激，激活了其體內(nèi)抗病基因的表達(dá)，抗病基因的表達(dá)產(chǎn)物對病菌在植株體內(nèi)的存活和擴(kuò)散具有一定的抑制作用，二者經(jīng)過一段時間的互作，雖然高抗植株最初也表現(xiàn)出感病，但最終仍能恢復(fù)健康，這與前人的分析是一致的(Vasse J et al.Microscopic studies of intercellular infection and protoxylem invasion oftomato rests by Pseudomonas solanacearum.MPMI.1995，8241-251.)。如果接菌濃度太高，抗病基因的表達(dá)不足以抑制病菌在植株體內(nèi)的存活和擴(kuò)散，抗病植株仍然會像感病植株那樣感病后無法恢復(fù)而最終死亡。
表3 不同菌液濃度、不同基因型番茄莖枝的發(fā)病程度(部分結(jié)果)


三、莖、枝菌液浸泡法與灌根法鑒定結(jié)果的的比較莖、枝菌液浸泡法同灌根法對于番茄的評價結(jié)果是一致的；采用莖枝菌液浸泡法時，不同的浸泡菌液濃度之間也存在莖枝發(fā)病早晚的差異，菌液濃度與發(fā)病早晚同樣存在高度相關(guān)，菌液濃度越高，莖枝發(fā)病越早。對于番茄而言，浸泡菌液的濃度以1×104cfu/mL為宜，以第5-7天調(diào)查結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評價，若要獲得高抗植株，則可適當(dāng)提高菌液濃度(如1×105cfu/mL)，根據(jù)接菌后14天植株的莖枝是否可以恢復(fù)正常進(jìn)行篩選。
權(quán)利要求
1.一種鑒定茄科作物對青枯病抗性的方法，是將生理年齡一致的植株的莖或/和枝接種于青枯菌菌液中，在可控條件下培養(yǎng)，定期觀察其發(fā)病情況并調(diào)查相關(guān)指標(biāo)，作出抗性評價。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述青枯菌菌液的濃度為1×102-1×108cfu/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述植株為馬鈴薯時，菌液濃度為1×106cfu/mL；植株為番茄時，菌液濃度為1×104cfu/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述可控培養(yǎng)條件為待測植株品種或品系對青枯菌的最適發(fā)病條件。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述鑒定馬鈴薯對青枯病菌小種3號P041的抗性時，可控培養(yǎng)條件為在26-28℃可控溫室內(nèi)，空氣相對濕度大于70％下培養(yǎng)；鑒定番茄對青枯病菌小種1號TM60抗性時，可控培養(yǎng)條件為在28-32℃可控溫室內(nèi)，空氣相對濕度大于70％下培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗性鑒定方法，其特征在于所述植株品種為馬鈴薯，番茄，茄子，煙草；所述植株為大田生長的植株，組培幼苗或小氣候環(huán)境下的植株。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗性鑒定方法，其特征在于所述莖或/和枝來自于同一個植株或來自于遺傳背景相同的不同植株。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗性鑒定方法，其特征在于所述莖為主莖，枝為側(cè)枝、主枝或次生枝。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗性鑒定方法，其特征在于所述將莖或/和枝接種于菌液中的方法為從生長正常、旺盛、整齊、無病蟲害的待測植株上切取莖或/和枝，首先存放于水中保濕，待取完全部所需的莖或/和枝后，同時插入青枯菌菌液中浸泡培養(yǎng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗性鑒定方法，其特征在于所述抗性評價是采用傳統(tǒng)方法，測定培養(yǎng)液OD600吸光值，和/或浸泡部位的瘤狀乳突數(shù)量的方法進(jìn)行的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒定茄科作物對青枯病抗性的方法。該抗性鑒定方法是將生理年齡一致的植株的莖或/和枝接種于青枯菌菌液中，在可控條件下培養(yǎng)，定期觀察其發(fā)病情況并調(diào)查相關(guān)指標(biāo)，作出抗性評價。所述植株為任一適于水培的茄科作物，如馬鈴薯，番茄，茄子，煙草等。莖或/和枝可來自于同一個植株，還可來自于遺傳背景相同的不同植株，莖為主莖，枝為側(cè)枝、主枝或次生枝。本發(fā)明不僅適用于茄科作物對青枯病的抗性鑒定和篩選，還將在茄科作物的細(xì)菌性病害的抗性篩選和鑒定，種質(zhì)資源評價，特別是病菌誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性的抗(感)病植株的快速鑒定及其幼苗的先期快速篩選等方面發(fā)揮巨大作用。
文檔編號A01G7/00GK1709030SQ200510087140
公開日2005年12月21日 申請日期2005年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月27日
發(fā)明者屈冬玉, 李廣存, 金黎平, 馮蘭香, 謝開云, 龐萬福, 卞春松, 段紹光 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所