專利名稱：水稻胚乳直鏈淀粉含量控制基因du1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及水稻胚乳直鏈淀粉含量控制基因DU1，該基因編碼的蛋白質(zhì)及其功能類似物，編碼其的核苷酸序列，含有該核苷酸的載體和含有該載體的宿主細胞；另外，本發(fā)明還涉及控制植物胚乳直鏈淀粉含量的方法和改良植物胚乳直鏈淀粉含量育種的方法。
背景技術(shù)：
水稻胚乳淀粉通常由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，含量高達90％左右[1]。直鏈淀粉是指葡萄糖單元之間以α-1，4糖苷鍵連接形成的、長約1000個葡萄糖殘基的線性長鏈分子，而支鏈淀粉則是在此基礎(chǔ)上以α-1，6糖苷鍵衍生出小的鏈狀分子，支鏈平均長度約20個葡萄糖殘基[2]。直鏈淀粉和支鏈淀粉的比例和特性決定淀粉的屬性，也決定稻米食味品質(zhì)和加工品質(zhì)的最重要因素。
Wx是影響稻米品質(zhì)的重要基因，水稻W(wǎng)x基因首先由Okagaki克隆[3]，隨后Wang等克隆了Wx基因的DNA全序列[4]。研究表明，水稻W(wǎng)x基因的轉(zhuǎn)錄能力與GBSS蛋白含量及直鏈淀粉含量關(guān)系密切。顆粒結(jié)合淀粉合酶(GBSS)緊密地結(jié)合在淀粉粒上，催化水稻胚乳直鏈淀粉的合成，其大小約為60kD[3，4]。
1981年，Satoh等[5]發(fā)現(xiàn)一突變體，種子在完全干燥后才表現(xiàn)云霧狀特征，稱為暗胚乳(dull endosperm，簡稱du)，其胚乳直鏈淀粉含量普遍下降。研究表明，該性狀受一隱性基因控制，突變材料胚乳直鏈淀粉含量通常在6％左右，米飯外觀油潤而富有光澤，食味獨特，冷不回生，尤其適合開發(fā)各種方便米飯等，也是改良稻米直鏈淀粉含量和食味品質(zhì)的優(yōu)良材料[6，7]。
Isshiki等[8]通過對du突變體的研究認(rèn)為DU基因編碼的蛋白可能通過對調(diào)節(jié)Wx從而影響水稻胚乳淀粉的生物合成。但至今未見克隆該基因的報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述研究背景，本發(fā)明的一個目的是提供一種控制水稻胚乳直鏈淀粉含量的基因。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種由本發(fā)明的控制水稻胚乳直鏈淀粉含量的基因所編碼的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種含有本發(fā)明的控制水稻胚乳直鏈淀粉含量的基因的植物表達載體。
本發(fā)明的又一個目的是提供一種培育植物的方法，該方法可使植物淀粉的主要儲藏器官的淀粉構(gòu)成發(fā)生變化。
本發(fā)明提供了一種控制水稻胚乳直鏈淀粉含量的基因，該基因的核苷酸序列選自(1)編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(2)與(1)中的核苷酸序列能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并同時編碼具有控制水稻胚乳直鏈淀粉含量的功能的核苷酸序列。
嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是指，將雜交膜置于預(yù)雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH 7.2，7％SDS)中，65℃預(yù)雜交30min；棄預(yù)雜交液，加入雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH 7.2，7％SDS，同位素標(biāo)記的核苷酸片段)，65℃雜交12小時；棄雜交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH 7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH 7.2，1％SDS)，65℃洗膜30min。
本發(fā)明的控制水稻胚乳直鏈淀粉含量的基因優(yōu)選具有如圖7和SEQID NO1所示的DNA序列。
本發(fā)明還提供了一種由上述核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)優(yōu)選具有如圖8和SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本發(fā)明中的SEQ ID NO2和圖8所示的蛋白質(zhì)屬于PRP蛋白家族，與人類的Prp1/Zer1蛋白和Prp6蛋白的同源性為51％，參與mRNA前體的剪接而調(diào)控支鏈淀粉的生物合成。
本發(fā)明還提供了一種含有本發(fā)明的控制水稻胚乳直鏈淀粉含量的基因的植物表達載體。這種表達載體可以是如圖5所示的pCAMDU1，該載體可以表達由上述核酸序列編碼的多肽。
本發(fā)明還提供了一種培育植物的方法，該方法可使植物淀粉的主要儲藏器官的淀粉構(gòu)成發(fā)生變化，包括用本發(fā)明的表達載體轉(zhuǎn)化植物細胞；和將轉(zhuǎn)化的植物細胞培育成植株的步驟。


下面結(jié)合附圖對理解本發(fā)明作進一步的詳細描述，但并非對本發(fā)明作限定。
附圖1.水稻F2代植株所結(jié)種子的表型鑒定(A，普通水稻籽粒表現(xiàn)為陽性；B低直鏈淀粉水稻胚乳表現(xiàn)為陰性)附圖2.DU1在水稻第10條染色體上的初步定位圖附圖3.DU1基因的精細定位及物理定位附圖4.DU1基因轉(zhuǎn)化du1突變體恢復(fù)正常表型(A.du1突變體胚乳表現(xiàn)低直鏈淀粉特征；B.轉(zhuǎn)DU1基因后表型恢復(fù)正常)附圖5.載體pCAMDU1質(zhì)粒圖譜附圖6.載體pCAMDU1質(zhì)粒表達的包含DU1的8.3kb基因組片段附圖7.DU1的核苷酸序列附圖8.DU1所編碼的氨基酸序列具體實施方式
下面結(jié)合附圖對理解本發(fā)明作進一步的詳細描述，但并非對本發(fā)明作限定。
實施例1 水稻胚乳直鏈淀粉含量控制基因DU1的克隆1.水稻材料水稻(Oryza sativa ssp.)胚乳低直鏈淀粉突變體du1(中國水稻研究所使用EMS(甲基磺酸乙酯)誘變獲得)[6，7]和常規(guī)水稻品種明恢63(購自中國水稻研究所)。
2.分析和定位群體純合的秈稻品種明恢63和粳稻突變體du1進行雜交，F(xiàn)1代自交，共得到7,150個F2個體，并從中選出1,618個個體作為定位群體。在苗期每株取2克左右的嫩葉，用來提取DNA。
3、通過SSR(Simple Sequence Repeat)，STS(Sequence-tagged Sites)，和CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence)標(biāo)記定位DU1基因采用改進的CTAB(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide)方法[9]從水稻葉片中提取用于基因定位的基因組DNA。取大約100mg水稻葉片，經(jīng)液氮冷凍，在直徑5cm的小研缽中磨成粉狀，轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管里提取DNA，獲得的DNA沉淀溶解于100μl超純水中。每一個SSR、STS或CAPS反應(yīng)用1μl DNA樣品。
根據(jù)水稻經(jīng)典遺傳學(xué)的研究，DU1基因被定位于第10染色體的長臂上。我們選取了兩對SSR引物(序列見表1)。我們發(fā)現(xiàn)DU1基因與這兩個標(biāo)記連鎖并位于二者之間。在此基礎(chǔ)上，我們設(shè)計的PCR引物分別以兩個親本的基因組DNA為模板進行PCR擴增(94℃預(yù)變性5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，35個循環(huán)，72℃延伸10mins)，將DU1基因初步定位在SSR標(biāo)記M2和M3之間。
為了將DU1定位在一個PAC克隆上，我們用已公布的水稻品種Nipponbare的PAC文庫(http//rgp.dna.affrc.go.jp)序列構(gòu)建了DU1位點附近的重疊群，設(shè)計的PCR引物分別以兩個親本(秈稻品種明恢63和du1突變體)的基因組DNA為模板進行PCR擴增(94℃預(yù)變性5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min，35個循環(huán)，72℃延伸10mins)。以此發(fā)展了STS和SSR標(biāo)記(序列見表1)，并用于群體精細定位，最終將其定位在一個PAC克隆AC068923上。
4.DU1基因的精細定位根據(jù)公布的PAC克隆AC068923的序列(http//rgp.dna.affrc.go.jp)，2個新標(biāo)記(序列見表1)，最后通過連鎖分析將DU1定位在66kb的范圍之內(nèi)。
表1 克隆DU1基因所用引物序列

5.DU1部分cDNA基因的獲得與功能的預(yù)測首先對66kb的全長基因組序列用GENSCAN軟件(http//genes.mit.edu/GENSCAN.html)預(yù)測可能的編碼區(qū)(ORF)，發(fā)現(xiàn)這個區(qū)間共有12個ORF。其中一個ORF具有典型的PRP蛋白的開放閱讀框；擴大序列范圍預(yù)測，并將基因產(chǎn)物用blastX軟件預(yù)測(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。用DNAStar軟件(Lasergene)MegAlign程序中的ClustalW方法進行蛋白質(zhì)序列比較和進化樹分析。同時又設(shè)計一對引物DUF(5’tgtgaagctgtggttgcagg 3’)和DUR(5’ttcatccagaccctctcagtgc 3’)以秈稻明恢63總RNA為模板進行RT-PCR反應(yīng)(70℃10mins，42℃60mins，99℃5mins，4℃5mins)并用ABI3730DNAanalyzers型測序儀測序，得到了DU1基因的cDNA序列。在上述研究的基礎(chǔ)上推測該基因可能編碼一種剪接因子，與人類的Prp1/Zer1蛋白和Prp6蛋白極其相似。
6.不同品種間DU1基因序列的比較通過水稻不同品種間，包括野生型秀水11、親本明恢63等多個品種(由中國水稻研究所提供)的DU1基因所在位點的DNA序列的比較，并與表型結(jié)果相對應(yīng)，發(fā)現(xiàn)了引起表型差異的基因改變位置，表明堿基替換是造成水稻胚乳直鏈含量改變的遺傳基礎(chǔ)。
實施例2 水稻胚乳直鏈淀粉含量控制基因SU1的功能互補及轉(zhuǎn)基因研究根據(jù)秈稻明恢63 DU1基因的序列設(shè)計引物，用引物DU1F，DU1R，DU2F，DU2R，DU3F和DU3R(序列見表1)分3段高保真PCR(序列見表1，94℃預(yù)變性5min，94℃1min，60℃1min，72℃1min，35個循環(huán)，72℃延伸10mins并用ABI3730 DNA analyzers型測序儀測序(ABI公司，美國)，挑選序列完全正確的克隆利用共有的Sal I和Xba I位點將它們連接成一個8.3kb片段，包含起始密碼子ATG上游的3,055個堿基和終止密碼子TAG后的2,115個堿基的全長序列，克隆到雙元載體pCAMBIA1300(購自CAMIA公司，澳大利亞)中，獲得了用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒pCAMBIDU1(圖5)。質(zhì)粒通過電擊的方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(AgroBacterium tumefaciens)株系EHA105(購自CAMIA公司，澳大利亞)中轉(zhuǎn)化水稻。將du1突變體的幼胚脫殼滅菌，接種到誘導(dǎo)愈傷組織的MS培養(yǎng)基[10]中。在28℃的培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)3周，從盾片處生長出愈傷組織，挑選生長旺盛，顏色淺黃，比較松散的胚性愈傷組織，用作轉(zhuǎn)化的受體。用含有雙元質(zhì)粒載體的農(nóng)桿菌EHA105菌株侵染水稻愈傷組織，在黑暗處25℃培養(yǎng)3天后，在含有50mg/L潮霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷組織和轉(zhuǎn)基因植株。將潮霉素抗性植株在陰涼處煉苗，幾天后移栽到水田，結(jié)實后收種進行表型鑒定。共收獲8個株系的T0代種子，其中胚乳直鏈淀粉含量表現(xiàn)為陽性的有5個株系，證明DU1基因已經(jīng)整合進受體基因組內(nèi)并能夠正確表達(見附圖4)。
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權(quán)利要求
1.一種控制水稻胚乳直鏈淀粉含量的基因，該基因的核苷酸序列選自(1)編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(2)與(1)中的核苷酸序列能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并同時編碼具有控制植物器官淀粉組成和水稻胚乳直鏈淀粉含量功能的核苷酸序列。
2.按照權(quán)利要求1所述的基因，它具有SEQ ID NO1所示的DNA序列。
3.一種由權(quán)利要求1或2所述的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)。
4.按照權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)，它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
5.一種含有權(quán)利要求1或2所述的控制水稻胚乳直鏈淀粉含量的基因的植物表達載體。
6.按照權(quán)利要求5所述的表達載體，該表達載體是pCAMDU1。
7.一種培育植物方法，該方法可使植物淀粉的主要儲藏器官的淀粉構(gòu)成發(fā)生變化，包括用權(quán)利要求5或6所述的表達載體轉(zhuǎn)化植物細胞；和將轉(zhuǎn)化的植物細胞培育成植株的步驟。
全文摘要
本發(fā)明是從水稻粳稻品種秀水11中克隆并鑒定了控制水稻胚乳直鏈淀粉含量的基因DU1，該基因的核苷酸序列選自(1)編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；(2)與(1)中的核苷酸序列能夠在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，并同時編碼具有控制植物器官淀粉組成和水稻胚乳直鏈淀粉含量功能的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種控制水稻胚乳直鏈淀粉含量的蛋白質(zhì)、含有本發(fā)明的基因的植物表達載體和一種培育植物的方法，該方法可使植物淀粉的主要儲藏器官的淀粉構(gòu)成發(fā)生變化，包括用含有本發(fā)明的基因的表達載體轉(zhuǎn)化植物細胞；和將轉(zhuǎn)化的植物細胞培育成植株的步驟。
文檔編號A01H4/00GK1908171SQ200510088978
公開日2007年2月7日 申請日期2005年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月4日
發(fā)明者李家洋, 錢前, 曾大力, 田志喜, 周奕華 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所