專利名稱：通過體胚發(fā)生途徑建立野牛草再生體系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及野牛草離體培養(yǎng)再生體系建立的方法。具體講涉及以野牛草種子成熟胚為外植體，通過體細胞胚胎發(fā)生途徑建立其再生體系的方法。屬于植物細胞工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
野牛草[Buchloe dactyloides(Nutt.)]為禾本科野牛草屬，又名水牛草。原產(chǎn)北美中部溫帶和亞熱帶半干旱地區(qū)。是一種生長緩慢，耐寒、耐熱、抗旱性強的暖季型多年生低矮草坪草。
草坪作為人類干預(yù)下的人工植被，是城市綠化的基礎(chǔ)和重要組成部分，在人類生活中起保護、改善和美化環(huán)境的作用，是衡量一個國家文明程度和城市現(xiàn)代化的重要標(biāo)志之一。上世紀(jì)90年代以來，隨著社會經(jīng)濟的迅速發(fā)展，我國草坪業(yè)進入了一個新的發(fā)展高潮，草坪業(yè)已經(jīng)成為現(xiàn)代園林建設(shè)中極其重要的組成部分。各種不同功能用途的草坪，如公園綠地、住宅小區(qū)綠地、公路兩側(cè)及護坡綠地、各種運動場綠地等，在我國各城市不斷興建。大面積的草坪建植促進了我國草坪業(yè)的迅猛發(fā)展，從而導(dǎo)致對草坪草種的需求量急劇增加，草坪的作用在我國越來越受到人們的重視，其價值、地位和作用也發(fā)生了根本性的變化，它已從單一的經(jīng)濟職能轉(zhuǎn)變?yōu)榧?jīng)濟、生態(tài)和社會效益于一體的產(chǎn)業(yè)。但我國除亞熱帶地區(qū)和西藏以外，各地建植草坪選用的草種95％以上均為進口冷季型草種，如早熟禾、黑麥草、高羊茅等。冷季型草要求土壤肥沃，需水量相對較大，在夏季高溫高濕季節(jié)進入半休眠，容易發(fā)生病蟲害，而大量施用農(nóng)藥和化肥又造成環(huán)境污染，加之春秋季生長旺盛，修剪頻率高，草坪的管理費用居高不下。若管理不當(dāng)，5年左右，草坪就會發(fā)生退化，在我國一些缺水和經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)造成“種得起、養(yǎng)不起”的局面。冷季型草坪草大多不耐踐踏，人們只能觀賞而不能進入。因此，建植的面積越大，可休閑的空間就越小。并且為了發(fā)揮其園林景觀效果，就要頻繁的大水澆灌草坪綠地，而近年來，我國水資源短缺的狀況日益嚴(yán)重，這無疑加劇了我國水資源緊張的矛盾。為了解決這些矛盾，近幾年，國外逐漸引進旱景園林的理念，暖季型草坪草以其較強的抗逆性和低耗水等特點，在園林景觀建設(shè)中開始受到人們的重視。
20世紀(jì)40年代，野牛草作為水土保持植物引入我國，首先在甘肅地區(qū)試種，后在我國華北、西北和東北等地作為草坪草都有大面積成功引種。野牛草最突出的特征之一是極具抗旱性，能在低等護養(yǎng)水平下保持優(yōu)良品質(zhì)。它在極端干旱時進入休眠狀態(tài)，一旦條件適宜又迅速恢復(fù)生長。野牛草匍匐莖發(fā)達，有時也有根莖發(fā)生。其匍匐莖的侵占性、生長習(xí)性及草皮的致密特性使其具有較強的水土保持能力。研究證實，在野牛草適應(yīng)區(qū)域內(nèi)，其日蒸散量只有6mm，比冷季型或其他的暖季型草坪草都低。國內(nèi)學(xué)者近年來在野牛草需水特性方面做了大量的研究工作。趙炳祥等(北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，11，25(6)39～44)研究表明，野牛草在充足澆水條件下的年蒸散量為758.66mm，而在限量供水條件下的年蒸散量為624.28mm。野牛草在北京地區(qū)的年需水范圍是424mm至527mm。野牛草在干旱脅迫下可迅速進入休眠狀態(tài)，一旦條件適宜又可很快恢復(fù)生長。這很大程度上是由于其強大的須根系、具侵占性的匍匐生長能力及干旱脅迫下葉片能夠卷曲的特性。在北京地區(qū)天然降水條件下，野牛草可正常生長，無需灌溉，因而有人稱其為“雨養(yǎng)型”草坪草。近年來，越來越多地應(yīng)用于高速公路旁、機場跑道、高爾夫球道及一些運動場等低養(yǎng)護的地方，是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ呐拘筒萜翰?。但野牛草作為草坪草也存在一些不足，如一年只有一個生長季，綠期較短，且葉片顏色淡，這在一定程度上影響了其觀賞和實用價值。盡管通過刈割和水肥管理等措施，可以適當(dāng)延長綠期，但也不能達到理想效果。因此通過育種手段培育綠期長的野牛草新我國是地錦屬植物分布的中心，在全球的15種中我國就有10種，據(jù)中國植物志我國幾乎各省都有地錦的分布，品種是最根本的解決途徑。
國外對野牛草新品種的選育工作最早始于1936年，其育種方向主要是培育耐低修剪、綠期長、葉色深、抗病蟲害等坪用價值高的新品種。至今，國外利用常規(guī)育種方法如倍性育種及雜交育種等手段已培育出許多適用于高爾夫球場、公路護坡綠化等不同功用的野牛草新品種。二十世紀(jì)80年代，美國高爾夫球協(xié)會聯(lián)合加利福尼亞大學(xué)及內(nèi)布拉斯加大學(xué)重點培育了一些適用于高爾夫球場及其它觀賞性草坪建植的新品種，1995年，內(nèi)布拉斯加大學(xué)選育出第一個種子繁殖的野牛草新品種，使得以種子直播方式建植野牛草成為可能。
長期以來，培育綠期長的新品種是人們的育種重點之一，但遺憾的是，到目前為止，綠期明顯延長的野牛草新品種仍未培育成功。究其原因，是由于傳統(tǒng)育種方法對這一性狀的改良存在局限性。因此，利用現(xiàn)代生物技術(shù)對這一性狀進行改良勢在必行。而建立高頻、穩(wěn)定的植株再生體系是利用現(xiàn)代生物技術(shù)進行品種改良的前提。以野牛草為代表的暖季型草坪草，其再生體系建立相當(dāng)困難。因此，野牛草再生體系的建立成為生物技術(shù)育種的關(guān)鍵。
野牛草離體培養(yǎng)與植株再生研究僅有個別報道。Hughes等(AgronAbs，Amer.soc.Agron.Madison，WI，1991，177)和Moore等(Hort.Sci.Abs，1991，26，150)從野牛草的種子和幼嫩的莖葉組織誘導(dǎo)出了愈傷組織，但未能獲得再生植株。鈕友民等(杭州植物園通訊，1996，13(2)，45～46)利用野牛草“華美一號”莖段也誘導(dǎo)出愈傷組織，但最終未得到再生植株。僅Fei S等(Plant Cell Org.andCult.，2000，，60，197～203；Plant Cell.Org.Cult.，2001，70，275～279，InternationalTurfgrass Society Research，1997，8，283～289)用野牛草未成熟花序為外植體，在含9uM(2mg/L)2，4-D、5～15mg/L AgNO3及5～15g/LCH的穆拉布格和斯庫格培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，成分見表1)中誘導(dǎo)出愈傷組織，繼代培養(yǎng)30d后，在含2.25～9μM2，4-D、0.44～1.32μM 6-BA中誘導(dǎo)出叢生芽，在含4.5～9μM2，4-D的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出胚性愈傷組織，并獲得了再生植株。雖然通過這一方法建立了野牛草的再生體系，但由于未成熟花序取材受季節(jié)限制大，因此在實際應(yīng)用中受到了極大的限制。在野牛草離體培養(yǎng)的各種外植體中，其種子比其他外植體具有易收集、耐貯藏，取材不受季節(jié)限制等優(yōu)勢，且種子中成熟胚內(nèi)源激素含量高，細胞具有潛在旺盛的分裂能力，是用于離體培養(yǎng)的良好材料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是以野牛草成熟胚為培養(yǎng)材料建立野牛草的再生體系。
本發(fā)明是以野牛草Texoka成熟胚為外植體進行培養(yǎng)，以此建立野牛草再生體系的方法。
本發(fā)明通過離體培養(yǎng)野牛草成熟胚建立了再生體系，所獲得的再生植株性狀均一、穩(wěn)定，易于遺傳工程操作。
本發(fā)明的培養(yǎng)方法包括四個培養(yǎng)階段(1)外植體直接培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織(2)愈傷組織繼代培養(yǎng)(3)愈傷組織誘導(dǎo)體細胞胚(4)體細胞胚再生植株，其中(1)(2)為黑暗培養(yǎng)，(3)為200～600勒克斯的弱光培養(yǎng)，(4)為1500～3000勒克斯的光培養(yǎng)，整個培養(yǎng)過程，培養(yǎng)溫度為20℃～30℃，每培養(yǎng)20天換新鮮培養(yǎng)基。
本發(fā)明通過上述四個階段的培養(yǎng)從野牛草成熟胚外植體誘導(dǎo)出愈傷組織，并從愈傷組織進一步誘導(dǎo)出體細胞胚，通過體細胞胚再生途徑得到了再生植株。
本發(fā)明四個階段的基本培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基或DPD培養(yǎng)基其中之一，培養(yǎng)基中碳源是蔗糖、葡萄糖其中之一或兩者以任意重量比組合的混合物，所用激素為從2，4-D、6-BA、TDZ和ZT的組合中選擇出的任何一種、兩種或三種，在第(1)階段培養(yǎng)基中還添加乙烯合成抑制劑STS、AgNO3、CoCl2其中之一，或抗氧化劑PVP、Vc、Ac(活性碳)其中之一作為防治愈傷組織褐化的添加物質(zhì)，在第(2)培養(yǎng)基中還添加CH(水解酪蛋白)或LH(乳蛋白)。
優(yōu)選為四個階段的基本培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基、培養(yǎng)基中碳源為添加蔗糖和葡萄糖各15g/L。在第(1)階段的培養(yǎng)基中所用激素為0.1～5mg/L2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)，0.1～3mg/L6-BA(6-芐基氨基腺嘌呤)。在(2)階段的培養(yǎng)基中所用激素為0.1～5mg/L2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)，0.1～3mg/L6-BA(6-芐基氨基腺嘌呤)。在第(3)階段的培養(yǎng)基中所用激素為0.05～5mg/L2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)，0.01～3mg/L6-BA(6-芐基氨基腺嘌呤)。在第(4)階段的培養(yǎng)基為不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基。
在第(1)階段的培養(yǎng)基還添加1～20mg/L的STS(硫代硫酸銀)；在第(2)階段的培養(yǎng)基還添加500～2000mg/L水解酪蛋白。
在第(3)階段愈傷組織誘導(dǎo)胚狀體前對愈傷組織在無菌環(huán)境中進行12～96小時，溫度為20℃～50℃的干燥處理。
本發(fā)明特別優(yōu)選的方法包括以下步驟(1)外植體接種于添加1.50-2.50mg/L2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)，0.05～0.20mg/L6-BA(6-芐基氨基腺嘌呤)，5.00～10.00mg/L的STS(硫代硫酸銀)的培養(yǎng)基(2)誘導(dǎo)得到的愈傷組織接種于添加2.00～3.00mg/L2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)，0.10～0.30mg/L 6-BA(6-芐基氨基腺嘌呤)，800～1200mg/L水解酪蛋白的培養(yǎng)基(3)繼代的愈傷組織在無菌環(huán)境中進行36～60小時，溫度為20℃～0℃的干燥處理(4)干燥處理過的愈傷組織接種于添加0.10-1.00mg/L2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)，0.05～0.30mg/L mg/L6-BA(6-芐基氨基腺嘌呤)的培養(yǎng)基(5)誘導(dǎo)得到的體細胞胚接種于不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基除激素外其他成分與MS(表1)培養(yǎng)基相同，碳源為添加蔗糖和葡萄糖各15.00g/L。其中(1)(2)為黑暗培養(yǎng)，(3)為200～600勒克斯的弱光培養(yǎng)，(5)為1500～3000勒克斯的光培養(yǎng)，整個培養(yǎng)過程，培養(yǎng)溫度為20℃～30℃，每培養(yǎng)20天換一次新鮮培養(yǎng)基。
本發(fā)明將野牛草成熟種子(Buchloe dactyloides(Nutt.)Texoka)，作解除休眠處理，對種子直接滅菌后，接種于第(1)階段的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3天后，無菌操作取出萌芽的成熟胚，垂直于胚軸切割數(shù)段后繼續(xù)置于原培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在上述第(1)階段的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)20天，愈傷組織誘導(dǎo)率達到86.67％，轉(zhuǎn)入第(2)階段的培養(yǎng)基，每20天繼代一次生長量體積約增長1.3-2.0倍，選取其中結(jié)構(gòu)較致密的白色或淡黃色愈傷組織，經(jīng)干燥處理轉(zhuǎn)入第(3)階段的培養(yǎng)基培養(yǎng)20天，體細胞胚誘導(dǎo)率為16.83％，干燥處理使胚狀體誘導(dǎo)率較處理前提高9.97％。將體胚轉(zhuǎn)入第(4)階段的培養(yǎng)基，植株再生率為36.2％，移栽成活率達到95％。
本發(fā)明從野牛草成熟胚易于誘導(dǎo)出愈傷組織，并保持了愈傷組織良好的質(zhì)量，所誘導(dǎo)的體細胞胚，能夠產(chǎn)生高數(shù)量、穩(wěn)定、均一的再生植株，因此此體系可用于基因工程或細胞工程育種。
本發(fā)明在起始培養(yǎng)時，由于野牛草種子內(nèi)生真菌的存在，使得到成熟胚無菌培養(yǎng)物相當(dāng)困難，本發(fā)明人通過大量反復(fù)實驗，得到適宜的滅菌方法(錢永強，草業(yè)科學(xué)，2005，22(2)，101-105)。將種子用70％酒精處理60s后，用70％NaClO原溶液(有效氯為7～10％)浸泡25～30分鐘，去污染率達到95％以上。其原理可能是由于其與細菌的滲透壓相近，在細菌表面蛋白未變性前逐漸不斷地向菌體內(nèi)部滲入，使菌體蛋白脫水、凝固變性而達到滅菌目的。次氯酸鈉的滅菌效果優(yōu)于升汞，次氯酸鈉中次氯酸的氧化作用是其最主要的殺菌機理。在水中形成次氯酸，與細胞壁發(fā)生作用后，且因分子小，不帶電荷，故可侵入細胞內(nèi)與蛋白質(zhì)發(fā)生氧化作用或破壞其磷酸脫氫酶，使糖代謝失調(diào)而致細胞死亡。本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)，野牛草所帶菌種對NaClO具有高度敏感性。
具體實施例方式
在下面的實施例中進一步說明了本發(fā)明，這并不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1野牛草成熟種子(Buchloe dactyloides(Nutt.)Texoka)，購于中國農(nóng)科院，種子作解除休眠處理，試驗測定發(fā)芽率為90％；用洗滌液充分洗滌后，流動的自來水中浸泡24h～48h，將種子從其苞穎取出，，用70％酒精對種子處理60s后，用70％NaClO原溶液(有效氯為7～10％)浸泡30min，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，添加1.7mg/L 2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)，0.09mg/L6-BA(6-芐基氨基腺嘌呤)，9mg/L的STS(硫代硫酸銀)。其中，培養(yǎng)基的制備是將激素直接添加于Ms培養(yǎng)基的其他成分中，然后高壓滅菌而制得的。黑暗培養(yǎng)3天后，無菌操作取出，將萌芽的成熟胚，垂直于胚軸切割數(shù)段后繼續(xù)置于原培養(yǎng)基中培養(yǎng)。繼續(xù)黑暗培養(yǎng)。
所用儀器設(shè)備是植物組織培養(yǎng)所公知的超凈工作機、自動高壓滅菌鍋等設(shè)備。在整個再生體系培養(yǎng)全過程中，培養(yǎng)基pH值均為5.8，溫度均為25±1℃。
將誘導(dǎo)得到的愈傷組織在MS培養(yǎng)基，添加2.2mg/L 2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)，0.28mg/L 6-BA(6-芐基氨基腺嘌呤)，1200mg/L水解酪蛋白。黑暗培養(yǎng)。
繼代培養(yǎng)的愈傷組織中選取其中結(jié)構(gòu)較致密的白色或淡黃色愈傷組織，在超凈工作臺上，無菌操作置于鋪有干燥濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，溫度為25℃，放置時間為40小時，立即轉(zhuǎn)入含0.5mg/L 2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)，0.27mg/L 6-BA(6-芐基氨基腺嘌呤)的MS培養(yǎng)基中，弱光培養(yǎng)(光強為500～1000勒克司)、將誘導(dǎo)的體細胞胚轉(zhuǎn)入不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上，使其長成完整植株。在光強為1500～3000勒克司的光照培養(yǎng)。光照時間在10～14h/d，體細胞胚經(jīng)過20天的培養(yǎng)，長成根莖葉完整的植株，移栽于蛭石中煉苗15天，可移入室外大田中。
上述方法所建立的再生體系，愈傷組織誘導(dǎo)率達到86.67％，胚狀體誘導(dǎo)率達到16.83％，其中干燥處理使胚狀體誘導(dǎo)率較處理前提高9.97％。再生率達到36.2％，移栽成活率達到95％。
實施例2培養(yǎng)程序均按實施例1進行，所不同之處在于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加2，4-D為2.0mg/L，6-BA為0.13mg/L，STS為10mg/L，愈傷組織繼代培養(yǎng)基中添加激素為2，4-D為2.5mg/L，6-BA為0.13mg/L，水解酪蛋白為1100mg/L，干燥處理時間為48小時，體細胞培誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加激素為2，4-D為0.13mg/L，6-BA為0.09mg/L。
實施例3培養(yǎng)程序均按實施例1進行，所不同之處在于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加2，4-D為2.0mg/L，6-BA為0.07mg/L，STS為8mg/L，愈傷組織繼代培養(yǎng)基中添加激素為2，4-D為3.0mg/L，6-BA為0.3mg/L，水解酪蛋白為800mg/L，干燥處理時間為60小時，體細胞培誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加激素為2，4-D為0.8mg/L，6-BA為1.0mg/L。
實施例4培養(yǎng)程序均按實施例1進行，所不同之處在于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加2，4-D為2.5mg/L，6-BA為0.18mg/L，STS為5mg/L，愈傷組織繼代培養(yǎng)基中添加激素為2，4-D為2.0mg/L，6-BA為0.2mg/L，水解酪蛋白為1000mg/L，干燥處理時間為36小時，體細胞培誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加激素為2，4-D為0.8mg/L，6-BA為0.15mg/L。
實施例5培養(yǎng)程序均按實施例1進行，所不同之處在于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加2，4-D為1.5mg/L，6-BA為0.05mg/L，STS為7mg/L，愈傷組織繼代培養(yǎng)基中添加激素為2，4-D為3.0mg/L，6-BA為0.3mg/L，水解酪蛋白為950mg/L，干燥處理時間為36小時，體細胞培誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加激素為2，4-D為1.0mg/L，6-BA為0.3mg/L。
實施例6培養(yǎng)程序均按實施例1進行，所不同之處在于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加2，4-D為1.8mg/L，6-BA為0.11mg/L STS為7mg/L，愈傷組織繼代培養(yǎng)基中添加激素為2，4-D為2.3mg/L，6-BA為0.1mg/L，水解酪蛋白為1000mg/L，干燥處理時間為60小時，體細胞培誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加激素為2，4-D為1.0mg/L，6-BA為0.1mg/L。
實施例7培養(yǎng)程序均按實施例1進行，所不同之處在于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加2，4-D為2.0mg/L，6-BA為0.2mg/L，STS為7mg/L，愈傷組織繼代培養(yǎng)基中添加激素為2，4-D為2.5mg/L，6-BA為0.10mg/L，水解酪蛋白為900mg/L，干燥處理時間為45小時，體細胞培誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加激素為2，4-D為0.10mg/L，6-BA為0.2mg/L。
表一MS基本培養(yǎng)基(Murashige & Skoog，1962)成分

表二B5基本培養(yǎng)基(Gamborg等，1968)成分

表三N6基本培養(yǎng)基(朱至清，1974)

表四DPD基本培養(yǎng)基成分(Durand等，1973)

權(quán)利要求
1.一種建立野牛草再生體系的方法，其特征在于以野牛草Texoka成熟胚為外植體，進行培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述方法包括四個培養(yǎng)階段(1)外植體直接培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織(2)愈傷組織繼代培養(yǎng)(3)愈傷組織誘導(dǎo)體細胞胚(4)體細胞胚再生植株，其中(1)(2)為黑暗培養(yǎng)，(3)為200～600勒克斯的弱光培養(yǎng)，(4)為1500～3000勒克斯的光培養(yǎng)，整個培養(yǎng)過程，培養(yǎng)溫度為20℃～30℃，每培養(yǎng)20天換新鮮培養(yǎng)基。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于四個階段的基本培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基或DPD培養(yǎng)基其中之一，培養(yǎng)基中碳源是蔗糖、葡萄糖其中之一或兩者以任意重量比組合的混合物，所用激素為從2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、6-芐基氨基腺嘌呤6-BA、噻苯隆TDZ和玉米素ZT的組合中選擇出的任何一種、兩種或三種，在第(1)階段培養(yǎng)基中還添加乙烯合成抑制劑硫代硫酸銀STS、硝酸銀AgNO3、氯化鈷CoCl2其中之一，或抗氧化劑PVP、維生素cVc、活性碳Ac其中之一作為防治愈傷組織褐化的添加物質(zhì)，在第(2)培養(yǎng)基中還添加水解酪蛋白CH或乳蛋白LH。
4.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于四個階段的基本培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基、碳源為添加蔗糖和葡萄糖各15g/L，在第(1)階段的培養(yǎng)基中所用激素為0.1～5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.1～3mg/L 6-芐基氨基腺嘌呤6-BA，在第(2)階段的培養(yǎng)基中所用激素為0.1～5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.1～3mg/L 6-芐基氨基腺嘌呤6-BA。在第(3)階段的培養(yǎng)基中所用激素為0.05～5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.01～3mg/L 6-芐基氨基腺嘌呤6-BA，在第(4)階段的培養(yǎng)基為不使用激素的MS培養(yǎng)基。
5.按照權(quán)利要求3所述的方法，第(1)階段的培養(yǎng)基還添加1～20mg/L的硫代硫酸銀STS。
6.按照權(quán)利要求3所述的方法，第(2)階段的培養(yǎng)基還添加500～2000mg/L水解酪蛋白。
7.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于第(3)階段愈傷組織誘導(dǎo)胚狀體前對愈傷組織在無菌環(huán)境中進行12～96小時，溫度為20℃～50℃的干燥處理。
8.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)外植體接種于添加1.5-2.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、0.05～0.2mg/L 6-芐基氨基腺嘌呤6-BA和5～10mg/L的硫代硫酸銀STS的培養(yǎng)基；(2)誘導(dǎo)得到的愈傷組織接種于添加2.0～3.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.1～0.3mg/L 6-芐基氨基腺嘌呤6-BA，800～1200mg/L水解酪蛋白的培養(yǎng)基；(3)繼代的愈傷組織在無菌環(huán)境中進行36～60小時、溫度為20℃～30℃的干燥處理；(4)干燥處理過的愈傷組織接種于添加0.1-1mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.05～0.3mg/L mg/L 6-芐基氨基腺嘌呤6-BA的培養(yǎng)基；(5)誘導(dǎo)得到的體細胞胚接種于不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基，上述培養(yǎng)基除激素外其他成分與MS培養(yǎng)基相同，碳源為添加蔗糖和葡萄糖各15g/L，其中(1)(2)為黑暗培養(yǎng)，(3)為200～600勒克斯的弱光培養(yǎng)，(5)為1500～3000勒克斯的光培養(yǎng)，整個培養(yǎng)過程，培養(yǎng)溫度為20℃～30℃，每培養(yǎng)20天換一次新鮮培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及以野牛草成熟胚為材料建立其再生體系的方法，包括四個培養(yǎng)階段(1)外植體直接培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織；(2)愈傷組織繼代培養(yǎng)；(3)愈傷組織誘導(dǎo)體細胞胚；(4)體細胞胚再生植株。培養(yǎng)過程中前三階段所使用的培養(yǎng)基是在含有2，4－D和6－BA不同配比的Ms并培養(yǎng)基上進行，第四階段體細胞胚在不含激素的Ms培養(yǎng)基上發(fā)育成完整植株。在胚狀體誘導(dǎo)前對愈傷組織進行一段時間的干燥處理，顯著的提高了體細胞胚的誘導(dǎo)率。
文檔編號A01H4/00GK1737126SQ20051008987
公開日2006年2月22日 申請日期2005年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月10日
發(fā)明者孫振元, 錢永強, 韓蕾, 巨關(guān)升 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所