專利名稱：通過胚狀體發(fā)生途徑建立多年生黑麥草遺傳轉化受體系統(tǒng)的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種通過胚狀體發(fā)生途徑建立多年生黑麥草遺傳轉化受體系統(tǒng)的方法，屬于生物技術和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術領域。
背景技術：
多年生黑麥草屬禾本科黑麥草屬多年生草本植物。原產(chǎn)于南歐、北歐及亞洲西南。是世界溫帶降雨量多的地區(qū)廣泛栽培的重要禾本科牧草。因其須根系發(fā)達，葉片質地細、柔軟、葉色綠，建植速度快，分蘗能力及耐磨性強等特性，常作為水土保持混播種中的先鋒植物，是一種重要的優(yōu)良草坪草。
但多年生黑麥草根系入土不深，抗寒性差，在北京及以北地區(qū)越冬成活率較低，其耐熱性及耐旱性也較差，當氣溫在35℃以上時，生長受阻，在干旱半干旱地區(qū)生長也不理想，因而嚴重限制了該種的廣泛應用。許多研究者針對多年生黑麥草作為草坪草存在的缺點已開始了對其進行性狀改良的研究。而多年生黑麥草為異花授粉植物，利用常規(guī)育種技術進行品種改良難度大，周期長。利用現(xiàn)代生物技術，特別是轉基因技術對植物進行遺傳改良具有高效、快捷等特點，在許多植物育種中已成功應用。為多年生黑麥草利用現(xiàn)代生物技術育種提供了重要的借鑒。多年生黑麥草的離體培養(yǎng)和轉基因技術越來越受到重視。
建立多年生黑麥草高效穩(wěn)定的遺傳轉化受體系統(tǒng)是利用轉基因技術對其進行遺傳改良的重要前提，但目前已報道的多年生黑麥草組織培養(yǎng)及植株再生體系均不完善，再生率偏低，不能滿足轉基因的需要。Dale(1977)通過根尖培養(yǎng)獲得多年生黑麥草再生植株。Kran(1980，1981)；White(1987，1988)利用成熟胚為外植體進行組織培養(yǎng)獲得再生植株。Creemers-Molenaar et al，(1988)Wang et al，(1993)，Dalton(1988)研究了不同培養(yǎng)方式對多年生黑麥草再生體系建立的影響，并初步建立了多年生黑麥草的固體培養(yǎng)、液體懸浮培養(yǎng)及原生質體懸浮培養(yǎng)再生體系。Creemers-Molenaar et al，(1988)以未成熟幼穗為外植體，研究了外源激素及培養(yǎng)環(huán)境對其植株再生影響，并獲得了再生植株。1994年，陳文品以多年生幼穗為外植體，直接從幼穗誘導出再生不定芽。并形成完全植株。
上述研究報道均是以器官發(fā)芽途徑獲得的再生植株，且再生率都較低。胚狀體是指脫分化的細胞團即愈傷組織在合適的培養(yǎng)條件下，部分細胞進一步發(fā)育，細胞內(nèi)出現(xiàn)兩極化，并經(jīng)魚雷胚、球形胚、心形胚等幾個發(fā)育階段形成與經(jīng)有性繁殖形成的種子胚具有相似特性的體細胞。條件適宜，胚狀體那可象種子一樣萌芽，因此通過誘導體細胞形成的胚狀體是利用轉基因技術對多年生黑麥草進行遺傳轉化最理想的受體材料。成熟種子取材不受季節(jié)限制，且易于保存。因此，目前多集中以其成熟種子為外植體，研究進一步完善多年生黑麥草再生體系的方法與技術。遺憾的是，迄今為止，以成熟胚為外植體建立高頻穩(wěn)定的再生體系仍不理想。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述技術的不足及胚狀體發(fā)生途徑建立遺傳轉化受體的優(yōu)點，本發(fā)明以多年生黑麥草成熟種子為外植體，高頻誘導愈傷組織，獲得的愈傷組織經(jīng)繼代培養(yǎng)及胚狀體誘導培養(yǎng)后轉入植株再生培養(yǎng)基誘導獲得高頻再生植株。從而建立起多年生黑麥草高效穩(wěn)定的遺傳轉化受體系統(tǒng)，為進一步利用基因工程對其進行遺傳改良奠定了技術平臺。
本發(fā)明中所述的外植體是指無菌條件下，離體培養(yǎng)于人工培養(yǎng)基上的，用于達到培養(yǎng)目的的原始材料，本發(fā)明中使用的外植體是多年生黑麥草成熟種子。
本發(fā)明中所述的遺傳轉化受體系統(tǒng)是指為使載有目的基因的載體能順利融合到宿主植物體并能使轉化后的植物體形成完整而探索出的一個能使其離體材料在合適的培養(yǎng)條件下高頻穩(wěn)定的誘導再生植株的技術體系。本發(fā)明中的受體即為以多年生黑麥草為外植體建立的再生體系。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法包括四個培養(yǎng)階段(1)外植體培養(yǎng)誘導愈傷組織(2)愈傷組織繼代培養(yǎng)(3)愈傷組織誘導胚狀體(4)胚狀體再生植株，其中(1)(2)為黑暗培養(yǎng)，(3)為200～500勒克斯的弱光培養(yǎng)，光照時間為12h/d，(4)為1500～3000勒克斯的光培養(yǎng)，光照時間為12h/d，整個培養(yǎng)過程，培養(yǎng)溫度為20℃～30℃，每培養(yǎng)20～30天換新鮮培養(yǎng)基。
本發(fā)明通過上述四個階段的培養(yǎng)從野牛草成熟胚外植體誘導出愈傷組織，并從愈傷組織進一步誘導出胚狀體，通過胚狀體再生途徑得到了再生植株。
本發(fā)明中四個階段的基本培養(yǎng)基均為是N6培養(yǎng)基(附表)。四個階段所用激素為2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、萘乙酸NAA、6-芐基氨基腺嘌呤6-BA和激動素KT的組合中選擇出的任何一種、兩種或三種，在第(1)階段，培養(yǎng)基中還添加水解酪蛋白CH，第(4)階段采用的基本培養(yǎng)基為大量元素用量減半的N6培養(yǎng)基，蔗糖為30g/L。
本發(fā)明所述的方法選優(yōu)為第(1)階段的培養(yǎng)基中所用外源激素及其濃度為2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 4～15mg/L，6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 0.1～2.0mg/L，萘乙酸NAA0.1～3.0mg/L，還添加了水解酪蛋白CH200～1000mg/L，在第(2)階段的培養(yǎng)基中所用外源激素及其濃度為2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D2.0～10.0mg/L，激動素KT0.5～2mg/L。在第(3)階段的培養(yǎng)基中所用外源激素及其濃度為2，4-二苯氧乙酸2，4-D 0.1～3.0mg/L，激動素KT0.1～2.0mg/L，在第(4)階段的培養(yǎng)基添加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 0.5～2mg/L和激動素KT0.1～1mg/L的N6培養(yǎng)基，其中大量元素減半，蔗糖用量減至30g/L。
本發(fā)明特別優(yōu)選的方法包括以下步驟(1)多年生黑麥草經(jīng)滅菌后，接種于添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 1～15mg/L、6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 0.1～2.0mg/L，萘乙酸NAA0.1～3.0mg/L及水解酪蛋白CH200～1000mg/L的培養(yǎng)基；(2)誘導得到的愈傷組織接種于添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D2.0～10.0mg/L，激動素KT0.5～2mg/L的培養(yǎng)基，進行兩次繼代培養(yǎng)，繼代周期20～30天；(3)選擇胚性愈傷組織接種于添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 0.1～3.0mg/L，激動素KT0.1～2.0mg/L的培養(yǎng)基誘導胚狀體，培養(yǎng)條件為弱光培養(yǎng)，光照強度為200～500勒克斯，(5)誘導得到的胚狀體接種于添加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 0.5～2mg/L和激動素KT0.1～1mg/L的培養(yǎng)基，見光培養(yǎng)，光照強度為1500～3000勒克斯。
本發(fā)明將多年生黑麥草(Lolium perenne L.)成熟種子，用自來水浸泡0.5小時；洗滌劑與水以1∶50比例混合浸泡1小時，流動的自來水沖洗12小時后，70％的酒精浸泡30s，無菌水沖洗5次；再用0.1％的升汞浸泡15min，以無菌水沖洗5～10次。無菌條件下用解剖刀將種子橫切后接種至誘導第(1)階段的培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)30天后在種子的切口處形成白色透明的愈傷組織。在上述第(1)階段的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)30天，愈傷組織誘導率達到85％以上，轉入第(2)階段的培養(yǎng)基，每25天繼代一次，生長量體積約增長2.0-3.0倍，愈傷組織的質量有顯著提高，出現(xiàn)結構緊密，淡黃色或乳白色的愈傷組織及質地松脆、淡黃色或乳白色、表面有乳狀突起的愈傷組織。選取其中結構較致密的白色或淡黃色愈傷組織，轉入第(3)階段的培養(yǎng)基培養(yǎng)50天，胚狀體(體細胞胚)誘導率達75％以上，將胚狀體轉入第(4)階段的培養(yǎng)基，在光強為1500～3000勒克斯的光照條件下培養(yǎng)30天，植株再生率達86％以上。將再生植株在溫度為25℃、濕度75％左右的玻璃溫室中揭開封口膜煉苗3～4d。之后取出再生植株，洗凈根部附著培養(yǎng)基，移栽到基質(珍珠巖∶草炭∶有機肥＝4∶2∶1)中，用塑料膜覆蓋保濕。10d后，揭開塑料膜，成活率達95％。
本發(fā)明從多年生黑麥草成熟種子誘導出愈傷組織，并保持了愈傷組織良好的質量，所誘導出的胚狀體(即體細胞胚)，能夠產(chǎn)生高數(shù)量、穩(wěn)定、均一的再生植株，因此此體系可用于基因工程或細胞工程育種。


圖1誘導出的愈傷組織圖2胚性愈傷組織的誘導圖3愈傷組織的分化圖4再生植株誘導圖5移栽成活苗
具體實施例方式在下面的實施例中進一步說明了本發(fā)明，這并不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1多年生黑麥草(Lolium perenne L.)成熟種子，用自來水浸泡0.5小時；洗滌劑與水以1∶50比例混合浸泡1小時，流動的自來水沖洗12小時后，70％的酒精浸泡30s，無菌水沖洗5次；再用0.1％的升汞浸泡15min，以無菌水沖洗5～10次。無菌條件下用解剖刀將種子橫切后接種至誘導愈傷組織的培養(yǎng)基，添加5.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 0.5mg/L，萘乙酸NAA0.5mg/L及水解酪蛋白CH 500mg/L的培養(yǎng)基，黑暗培養(yǎng)30天。其中，培養(yǎng)基的制備是將激素直接添加于N6培養(yǎng)基的其他成分中，然后高壓滅菌而制得的。
所用儀器設備是植物組織培養(yǎng)所公知的超凈工作機、自動高壓滅菌鍋等設備。在整個再生體系培養(yǎng)全過程中，培養(yǎng)基pH值均為5.8，溫度均為25±1℃。
將誘導得到的愈傷組織轉移至添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D5.0mg/L，激動素KT0.5mg/L的N6培養(yǎng)基，黑暗培養(yǎng)50天，其中每25天更換新鮮培養(yǎng)基。
選擇結構較致密的白色或淡黃色的愈傷組織接種于添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 1.0mg/L，激動素KT 1.0mg/L的培養(yǎng)基誘導胚狀體，培養(yǎng)條件為弱光培養(yǎng)，光照強度為200～500勒克斯將誘導的胚狀體(體細胞胚)轉入添加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 0.5mg/L和激動素KT0.5mg/L的N6培養(yǎng)基上，在光強為1500～3000勒克斯的光照條件下誘導培養(yǎng)，使其長成完整植株。光照時間在12h/d，胚狀體經(jīng)過30天的培養(yǎng)，長成根莖葉完整的植株，再生植株在溫度為25℃、濕度75％左右的玻璃溫室中揭開封口膜煉苗3～4d。之后取出再生植株，洗凈根部殘留的培養(yǎng)基，移栽到基質(珍珠巖∶草炭∶有機肥＝4∶2∶1)中，用塑料膜覆蓋保濕。10d后，揭開塑料膜，即可進行大田移載。
上述方法所建立的再生體系，愈傷組織誘導率達到85.47％，胚狀體誘導率達到76.83％，再生率達到86.2％，移栽成活率達到100％。
實施例2培養(yǎng)程序均按實施例1進行，所不同之處在于愈傷組織誘導培養(yǎng)基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D為8.0mg/L，6-芐基氨基腺嘌呤6-BA為0.6mg/L，萘乙酸NAA為0.6mg/L，愈傷組織繼代培養(yǎng)基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D為8.0mg/L，激動素KT為0.6mg/L，胚狀體誘導培養(yǎng)基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D為0.7mg/L，激動素KT為1.0mg/L，在胚狀體再生植株培養(yǎng)基中添加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA為0.4mg/L和激動素KT0.4mg/L。
上述方法所建立的再生體系，愈傷組織誘導率達到85.25％，胚狀體誘導率達到75.04％，再生率達到85.72％，移栽成活率達到97.5％。
實施例3培養(yǎng)程序均按實施例1進行，所不同之處在于愈傷組織誘導培養(yǎng)基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D為6.0mg/L，6-芐基氨基腺嘌呤6-BA為0.8mg/L，萘乙酸NAA為0.3mg/L，愈傷組織繼代培養(yǎng)基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D為6.0mg/L，激動素KT為0.8mg/L，胚狀體誘導培養(yǎng)基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D為0.5mg/L，激動素KT為1.5mg/L，在胚狀體再生植株培養(yǎng)基中添加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA為0.8mg/L和激動素KT0.4mg/L。
上述方法所建立的再生體系，愈傷組織誘導率達到86.06％，胚狀體誘導率達到75.33％，再生率達到85.2％，移栽成活率達到98％。
實施例4培養(yǎng)程序均按實施例1進行，所不同之處在于愈傷組織誘導培養(yǎng)基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D為10.0mg/L，6-芐基氨基腺嘌呤6-BA為1.0mg/L，萘乙酸NAA為0.4mg/L，愈傷組織繼代培養(yǎng)基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D為10.0mg/L，激動素KT為0.7mg/L，胚狀體誘導培養(yǎng)基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D為0.8mg/L，激動素KT為1.0mg/L，在胚狀體再生植株培養(yǎng)基中添加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA為0.6mg/L和激動素KT0.6mg/L。
上述方法所建立的再生體系，愈傷組織誘導率達到86.06％，胚狀體誘導率達到77.23％，再生率達到87.12％，移栽成活率達到96％。
實施例5培養(yǎng)程序均按實施例1進行，所不同之處在于愈傷組織誘導培養(yǎng)基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D為9.0mg/L，6-芐基氨基腺嘌呤6-BA為0.8mg/L，萘乙酸NAA為0.4mg/L，愈傷組織繼代培養(yǎng)基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D為5.0mg/L，激動素KT為0.8mg/L，胚狀體誘導培養(yǎng)基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D為0.5mg/L，激動素KT為1.5mg/L，在胚狀體再生植株培養(yǎng)基中添加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA為0.6mg/L和激動素KT0.6mg/L。
上述方法所建立的再生體系，愈傷組織誘導率達到86.06％，胚狀體誘導率達到78.67％，再生率達到88.32％，移栽成活率達到98％。
實施例6培養(yǎng)程序均按實施例1進行，所不同之處在于愈傷組織誘導培養(yǎng)基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D為7.0mg/L，6-芐基氨基腺嘌呤6-BA為0.4mg/L，萘乙酸NAA為0.6mg/L，愈傷組織繼代培養(yǎng)基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D為4.0mg/L，激動素KT為0.8mg/L，胚狀體誘導培養(yǎng)基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D為1.2mg/L，激動素KT為1.0mg/L，在胚狀體再生植株培養(yǎng)基中添加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA為0.4mg/L和激動素KT0.5mg/L。
上述方法所建立的再生體系，愈傷組織誘導率達到86.76％，胚狀體誘導率達到77.12％，再生率達到85.06％，移栽成活率達到100％。
附表N6基本培養(yǎng)基(朱至清，1974)

權利要求
1.通過胚狀體發(fā)生途徑建立多年生黑麥草遺傳轉化受體系統(tǒng)的方法，其特征在于以多年生黑麥草成熟種子為外植體，進行培養(yǎng)。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其特征在于所述方法包括四個培養(yǎng)階段(1)外植體培養(yǎng)誘導愈傷組織(2)愈傷組織繼代培養(yǎng)(3)愈傷組織誘導胚狀體(4)胚狀體再生植株，其中(1)(2)為黑暗培養(yǎng)，(3)為200～500勒克斯的弱光培養(yǎng)，光照時間為12h/d，(4)為1500～3000勒克斯的光培養(yǎng)，光照時間為12h/d，整個培養(yǎng)過程，培養(yǎng)溫度為20℃～30℃，每培養(yǎng)20～30天換新鮮培養(yǎng)基。
3.按照權利要求2所述的方法，其特征在于四個階段的基本培養(yǎng)基均為是N6培養(yǎng)基。四個階段所用激素為2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、萘乙酸NAA、6-芐基氨基腺嘌呤6-BA和激動素KT的組合中選擇出的任何一種、兩種或三種，在第(1)階段，培養(yǎng)基中還添加水解酪蛋白CH，第(4)階段采用的基本培養(yǎng)基為大量元素用量減半的N6培養(yǎng)基，蔗糖為30g/L。
4.按照權利要求3所述的方法，其特征在于在第(1)階段的培養(yǎng)基中所用外源激素及其濃度為2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 1～15mg/L，6-芐基氨基腺嘌呤6-BA0.1～2.0mg/L，萘乙酸NAA0.1～3.0mg/L，還添加了水解酪蛋白CH200～1000mg/L，在第(2)階段的培養(yǎng)基中所用外源激素及其濃度為2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D2.0～10.0mg/L，激動素KT0.5～2mg/L。在第(3)階段的培養(yǎng)基中所用外源激素及其濃度為2，4-二苯氧乙酸2，4-D 0.1～3.0mg/L，激動素KT0.1～2.0mg/L，在第(4)階段的培養(yǎng)基添加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 0.5～2mg/L和激動素KT0.1～1mg/L的N6培養(yǎng)基，其中大量元素減半，蔗糖用量減至30g/L。5.按照權利要求1所述的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)多年生黑麥草經(jīng)滅菌后，接種于添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 1～15mg/L、6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 0.1～2.0mg/L，萘乙酸NAA0.1～3.0mg/L及水解酪蛋白CH200～1000mg/L的培養(yǎng)基；(2)誘導得到的愈傷組織接種于添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D2.0～10.0mg/L，激動素KT0.5～2mg/L的培養(yǎng)基，進行兩次繼代培養(yǎng)，繼代周期20～30天；(3)選擇胚性愈傷組織接種于添加2，4-二苯氧乙酸2，4-D0.1～3.0mg/L，激動素KT0.1～2.0mg/L的培養(yǎng)基誘導胚狀體，培養(yǎng)條件為弱光培養(yǎng)，光照強度為200～500勒克斯，(5)誘導得到的胚狀體接種于添加6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 0.5～2mg/L和激動素KT0.1～1mg/L的培養(yǎng)基，見光培養(yǎng)，光照強度為1500～3000勒克斯。
全文摘要
本發(fā)明公開一種通過胚狀體發(fā)生途徑建立多年生黑麥草遺傳轉化受體系統(tǒng)的方法，主要步驟包括以多年生黑麥草成熟種子為材料，在誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得愈傷組織，經(jīng)繼代培養(yǎng)后，在胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)基及再生培養(yǎng)基中高頻誘導胚狀體及再生植株。在誘導愈傷組織培養(yǎng)基通過添加一定配比的2，4－D、6－BA、NAA以及水解酪蛋白CH可有效地提高了愈傷組織的誘導率。在繼代培養(yǎng)到再生培養(yǎng)過程，通過改變植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比，胚狀體誘導率達75％以上，植株再生率達85％以上。
文檔編號A01H4/00GK1737127SQ20051009007
公開日2006年2月22日 申請日期2005年8月12日 優(yōu)先權日2005年8月12日
發(fā)明者孫振元, 馮霞, 彭鎮(zhèn)華, 韓蕾, 錢永強 申請人:中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所