專利名稱：吡喃酮抗生素及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及吡喃酮抗生素及其制備方法與應用，屬于生物技術領域。
背景技術：
木霉菌(Trichoderma spp.)在產生抗生素方面具有優(yōu)勢，就其種類而言，僅抗真菌的代謝產物在70種左右，多數(shù)種類產生的抗生素不止一種，如哈茨木霉可產生12種，康氏木霉可產生9種，綠色木霉可產生10種，鉤狀木霉可產生7種，長枝木霉可產生3種，多孢木霉可產生2種。
丹尼斯，韋伯斯特，木霉菌產生的非揮發(fā)性抗生素，菌物學，1971年57期(DENNIS C，WEBSTER J.Antagonistic properties of species-groups of Trichoderma production ofnon-volatile antibiotics[J].Trans Br Mycelia Soc，1971，5725-39.)認為抗菌物質包括烷基吡喃酮、丁烯羥酸內酯、環(huán)硫氧化哌、嗪、吡啶類、萜類和肽類化合物。賀瑞斯，理查德，梵尼斯等，哈茲木霉產生的6-戊烷基吡喃酮植物生長抑制劑和殺菌劑，農業(yè)生物化學，1986年50期(HORACE G C，RICHARD H C，F(xiàn)ANIST G，et al.6-Pentyl-Q-pyrone fromTrichoderma harzianumIts plant growth inhibitory and antimicrobial properties[J].Agric Biol Chem，1986，50(11)2943-2945.)報道，哈茨木霉菌防治立枯絲核菌的主要機制之一就是產生了揮發(fā)性抗生素，經過鑒定為6-戊烷基吡喃酮。朱天輝，邱德勛，哈茨木霉對立枯絲核菌的抗生現(xiàn)象[J]，四川農業(yè)大學學報，1994，12(1)11-15，研究哈茨木霉菌對立枯絲核菌的抗生作用，發(fā)現(xiàn)F060菌株的代謝物質能抑制立枯絲核菌的菌落擴散，降低其菌絲干量，而且非揮發(fā)性代謝物具熱穩(wěn)定性。貝斯特，木霉屬下定義長枝木霉，澳洲羊毛制品，1984年62期(Bissett J.A revision of the genus Trichoderma.I.Sectionlongibrachiatum sect.nov.[J].Canad.J.Bet.，1984，62924-931.)從長枝木霉菌中分離提純出特殊的抗菌肽，命名為trichobrachin，并測定了其氨基酸序列。
我國的農作物病害每年造成大量損失，現(xiàn)在的防治手段除了一部分抗病品種外，主要依賴于噴灑大量的化學殺菌劑，造成農產品的有毒化學物質的殘留，病原菌的抗藥性上升，生態(tài)環(huán)境惡化。發(fā)展生物農藥，是保證農業(yè)生產不受病蟲草害危害，而又不污染農產品的重要途徑。木霉菌是重要的植物病害生物防治菌，能夠產生多種抗生素，其中吡喃酮類化合物已被證實有強烈的抗菌活性，但現(xiàn)在還沒有具體的制備方法及農用制劑。

發(fā)明內容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種吡喃酮抗生素及其制備方法與應用1、本發(fā)明的抗生素吡喃酮(2H-Pyran-2-one，5，6-dihydro-6-pentyl-)，分子式C10H16O2，分子量168，分子結構為
2、本發(fā)明的吡喃酮抗生素的制備方法，步驟如下，均為重量比(1)用固體培養(yǎng)基，麩皮∶玉米粉＝7∶3，含水量為70％，硫酸亞鐵為100μg/mL，pH6.0，培養(yǎng)綠色木霉(Trichoderma viride)LTR-2，獲得孢子粉。所述的綠色木霉LTR-2，保藏號為CGMCC NO.1498。
(2)用二氯甲烷5-10℃浸泡孢子粉2天，浸泡液依次經5％活性炭吸附，3％碳酸鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉脫水，最后將處理液減壓濃縮至粘稠狀，得到含抗生素吡喃酮的濃縮物。
對于上述產物進行分離純化和活性測定，繼續(xù)以下步驟(3)采用硅膠柱分離純化上述濃縮物。用流動相(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1、10∶2、10∶4、10∶6、10∶8，體積比)梯度洗脫，離心管收集流分。
(4)用硅膠板將各管收集樣展開(石油醚∶乙酸乙酯＝12∶1，體積比)，經波長λ＝302nm的紫外燈檢測后，合并相同的流分，減壓濃縮，以立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)為指示菌，采用PDA平板擴散法測定各流分的抑菌活性。
(5)保留有抗性的流分，在硅膠板上展開。合并Rf值(比移值)相同的樣品，用二氯甲烷復溶，采用PDA平板擴散法測定其抑菌活性。如此重復展開及收集檢測，至活性樣品薄層展開后僅為一純斑點。
樣品測定采用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(Agilent 6890N-5973N GC-MSD)離子源為EI，電子能量為70eV，離子源溫度為230℃，接口溫度為280℃，質量掃描范圍為29-500amu，色譜柱為HP-5MS(30m×0.25mm×0.25um)，起始柱溫50℃，恒溫5min后以5℃/min升溫到300℃，汽化室溫度為300℃，載氣為氦氣，分流比為10∶1，進樣方式為GC。結果抗性成分為吡喃酮(2H-Pyran-2-one，5，6-dihydro-6-pentyl-)。
上述步驟(2)中按孢子粉50g/1L的量加入二氯甲烷。
上述步驟(2)所述的活性炭吸附是除去二氯甲烷浸泡液中的色素，洗滌是用3％碳酸鈉溶液洗滌1-2次，除去二氯甲烷浸泡液中的酸性成分。
上述步驟(3)采用的硅膠柱為40cm×3cm，用10mL離心管收集流分。
上述步驟(4)所用硅膠板為GF254，10cm×20cm×0.25mm。
上述步驟(1)的綠色木霉LTR-2是按如下方法獲得的樣品的采集采集樣品為蔬菜田土，地點為濟南，用鐵鏟撥開表層泥土，直至見到有植物根系存在的土層，將土壤連同植物的根一起鏟出，用聚乙烯袋裝好，帶回實驗室。
分離方法將根系連同土壤稍風干，輕拍根系，使粘附土壤脫落，然后以滅菌水充分漂洗根上殘留的土壤，保留漂洗液，用無菌生理鹽水作梯度稀釋，并分別取0.1mL滴入TSM培養(yǎng)基平板上，用滅菌的L形玻璃棒涂勻，置28℃恒溫箱中培養(yǎng)2-4天。挑取菌落形態(tài)近似木霉菌的單菌落，轉接PDA平板純化培養(yǎng)，經鏡檢初步鑒定為木霉菌，編號保存于PDA斜面上。
上述PDA培養(yǎng)基取土豆200g，洗凈切成小塊，用水煮沸30min，用紗布過濾，保留濾液，加入10g葡萄糖，15g瓊脂，定容至1000mL，121℃滅菌20min備用(無菌操作加入氯霉素使培養(yǎng)基氯霉素含量達到100μg/mL)。
上述TSM培養(yǎng)基(木霉菌半選擇培養(yǎng)基)MgSO4·7H2O 0.2g，K2HPO40.9g，KCl 0.15g，NH4NO31.0g，葡萄糖3.0g，玫瑰紅0.15g，60％敵克松可濕性粉劑0.3g，PCNB 0.2g，瓊脂15g，水1000mL。121℃滅菌20min備用(無菌操作加入氯霉素使培養(yǎng)基氯霉素含量達到100μg/mL)。
3、吡喃酮抗生素的應用本發(fā)明吡喃酮抗生素在農業(yè)上的應用，以吡喃酮為有效成分配制成農用制劑，一種可濕性粉劑，組分如下，均為重量份硅藻土 68-84份含吡喃酮的濃縮物(上述步驟(2)的產物)10-20份十二烷基苯磺酸鈉 5-10份吐溫80 1-2份。
將上述組分用超微粉碎機進行粉碎，過325目篩。
上述組分中硅藻土為載體，十二烷基苯磺酸鈉為助劑，非離子表面活性劑吐溫80為消泡劑。
上述農用制劑的應用效果如下(1)抗菌譜測定(表1)將上述吡喃酮抗生素可濕性粉劑稀釋，與冷卻至45℃的PDA培養(yǎng)基混合傾倒平板，使混合后粉劑的濃度為200μg/mL。將事先培養(yǎng)好的植物病原真菌平板用無菌打孔器打取直徑為5mm的菌片，分別接入上述配制好的含藥平板中央，相同的處理設3個重復，以不加藥的PDA平板作空白對照，25℃培養(yǎng)2-5天記錄病原真菌的菌落擴展直徑，計算抑制率。
抑制率％＝(對照菌落擴展面積-藥劑處理菌落擴展面積)×100％/對照菌落擴展面積。
表1 本發(fā)明農用制劑的抗菌譜測定

(注“CK”表示病原真菌在無藥PDA平板上的擴展直徑，“處理”表示病原真菌在含本制劑濃度200μg/mL的PDA平板上的擴展直徑。)(2)溫室生物活性測定(表2)供試病原真菌為棉花立枯病菌(R.solani)，用小米培養(yǎng)基培養(yǎng)病原真菌(取新鮮小米，自來水浸泡24h，用紗布濾去多余水分，將小米裝入三角瓶中，121℃、30min滅菌，取出30℃培養(yǎng)12h，第二天121℃、45min二次滅菌。冷卻后，用無菌接種環(huán)從平皿上挑取預培養(yǎng)的菌絲塊接入瓶中，置25℃恒溫箱中培養(yǎng)，中間不斷振搖，至病原菌布滿小米粒即可)。
供試作物為棉花(新陸早1號)，用本發(fā)明的吡喃酮抗生素可濕性粉劑拌種(干種子量的0.5％)，以多菌靈1％拌種為藥劑對照，以清水浸種作空白對照。每盆內分別接入上述不同處理的種子20粒，布滿病原菌的小米5粒，每處理設3個重復，隨機區(qū)組排列。溫室培養(yǎng)，溫度為25-35℃，濕度為40-70％，定期定量澆水。試驗期為42天。
棉花立枯病病情調查與防治效果計算0無??；1莖基部有小病斑，占莖圍的1/4以下；2莖基部病斑較大，約占莖圍的1/4-1/2；3莖基部病斑占莖圍的1/2以上，但尚未破壞整個莖圍；4莖基部病斑占據(jù)全部莖圍，植株死亡。
病株率％＝每個處理的病株數(shù)×100％/每個處理的總株數(shù)病情指數(shù)％＝∑(各病級×各級株數(shù))×100％/(最高病級×總調查株數(shù))防治效果％＝(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))×100％/對照病情指數(shù)表2 本發(fā)明農用制劑對棉花立枯病的防治效果

(注數(shù)據(jù)采用LSR法統(tǒng)計，不同大寫字母表示在0.01水平上差異顯著。)上述試驗結果表明本發(fā)明的吡喃酮抗生素有強烈的抗菌活性，可廣泛用于農業(yè)抗菌制劑的制備。


圖1是實施例2步驟(4)的產物吡喃酮對立枯絲核菌的PDA平板抑制作用。1為對照，2為吡喃酮。
圖2是本發(fā)明吡喃酮的分子結構和質譜圖。縱坐標(Abundance)峰度，橫坐標m/z質核比，圖中Scan 4125掃描數(shù)，YHT9.D(-)文件名。
具體實施例方式
實施例1綠色木霉LTR-2的固體發(fā)酵培養(yǎng)，以下均為重量比或重量百分比。
綠色木霉LTR-2，保藏號為CGMCC NO.1498，是從土壤中分離、篩選得到的，經室內平板拮抗實驗和大田生物防治試驗發(fā)現(xiàn)，該菌株抑菌譜廣，防治效果好，易培養(yǎng)，無污染。
綠色木霉LTR-2的固體發(fā)酵培養(yǎng)，按以下步驟進行(1)斜面菌種采用固體PDA培養(yǎng)基，將該綠色木霉LTR-2接種在試管培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2-3天。
(2)茄瓶菌種采用液體PDA培養(yǎng)基，將試管菌種接種在液體茄瓶中，置于搖床上28℃振蕩培養(yǎng)3-4天。
(3)液體菌種采用種子培養(yǎng)基，玉米粉2％，葡萄糖0.5％，豆餅粉1％，磷酸氫二鉀0.2％，磷酸二氫鉀0.3％，碳酸鈣1％，pH6.0，121℃滅菌40分鐘，將1-2個茄瓶的種子用無菌水洗下，接種于150立升的種子罐內，30℃培養(yǎng)，通氣量1∶0.6-0.8，攪拌速度為200r/min，培養(yǎng)時間為36-48小時。
(4)固體菌種采用固體培養(yǎng)基，麩皮∶稻殼∶玉米粉＝7∶1∶2，含水量為70％(其中包括接種的液體菌種的水分)，pH6.0，121℃滅菌40分鐘后以循環(huán)水冷卻，在混合接種器內將液體菌種與固體培養(yǎng)基混合均勻，接種量為5-10％，接種完畢轉移到固體培養(yǎng)室內培養(yǎng)。
(5)培養(yǎng)培養(yǎng)基厚度為5cm，料溫控制在30±2℃，室溫控制在25-30℃±2℃，空氣的相對含水量控制在95-100％，培養(yǎng)時間為5-7天。
培養(yǎng)完畢，將固體培養(yǎng)物自然風干，成品含水量控制在5-10％，得綠色木霉LTR-2固體培養(yǎng)物。過100目篩收集孢子粉。
實施例2吡喃酮抗生素的制備，以下均為重量百分比。
(1)孢子制備將綠色木霉菌LTR-2固體培養(yǎng)物(實施例1產物)用100目篩過篩，收集孢子粉。
(2)孢子中吡喃酮抗生素的提取將孢子粉按50g/1L的量加入二氯甲烷5℃浸泡2天，浸泡液用5％活性炭吸附2h，經濾紙過濾除去活性炭及孢子殘渣，上清液加入等體積的3％碳酸鈉溶液洗滌，重復一次，將碳酸鈉溶液合并后，用少許二氯甲烷洗滌，并入二氯甲烷浸泡液，然后加無水硫酸鈉脫水，將二氯甲烷浸泡液在35℃下減壓濃縮至粘稠狀液體，得到含吡喃酮抗生素的濃縮物。
(3)吡喃酮抗生素的分離純化采用硅膠柱(40cm×3cm)分離純化上述濃縮物。取100g硅膠G(60-100目)，置120℃活化1h，與500mL石油醚混勻后小心裝入硅膠柱內，平衡1h，放出石油醚至接近硅膠上表面1cm左右。
濃縮物與少量硅膠及石油醚混勻，小心倒入柱中，平衡30min。
加入流動相(石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1、10∶2、10∶4、10∶6、10∶8，體積比)梯度洗脫，用10mL離心管收集流分。
硅膠板(GF254，10cm×20cm×0.25mm)置115℃烘箱中活化1h，在距底邊1.5cm處點樣，將收集流分在硅膠薄板上(石油醚∶乙酸乙酯＝12∶1)展開，待溶劑前沿上升至距板上邊緣2cm處即可結束層析。取出硅膠板用吹風機吹干，置λ＝302nm的紫外燈下檢測。合并相同流分，減壓濃縮，以立枯絲核菌為指示菌采用PDA平板擴散法測定各流分的抑菌活性。
(4)保留有抗性的流分，在硅膠板上展開，合并Rf值相同的樣品，用二氯甲烷復溶，同(3)法測定抑菌活性。如此重復展開及收集檢測，至活性樣品薄層展開后僅為一純斑點。
上述步驟(4)的產物吡喃酮對立枯絲核菌的PDA平板抑制作用(見圖1)，1為對照，2為吡喃酮。在PDA平板垂直交叉線上距中央35mm處打取4個直徑5mm的孔洞，2個洞內滴入50uL的濃度為200μg/mL的吡喃酮(溶劑為二氯甲烷)，另2個洞內滴入同體積的對照溶劑二氯甲烷，平板中央接入直徑5mm的立枯絲核菌菌片，25℃培養(yǎng)2-3天觀察吡喃酮的抑菌效果。結果吡喃酮對立枯絲核菌有強烈的抑制作用，抑菌帶大小為6.5mm(孔洞內邊緣與病原菌菌落外邊緣間的最小值)，而對照孔洞已長滿病原菌。
(5)用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(Agilent 6890N-5973N GC-MSD)分析色譜柱為HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)，柱溫從50℃升到300℃。結果抗性成分為吡喃酮(2H-Pyran-2-one，5，6-dihydro-6-pentyl-)。檢測結果如圖2所示。
實施例3抗生素吡喃酮的農用制劑，均為重量份硅藻土84份含吡喃酮的濃縮物 10份十二烷基苯磺酸鈉 5份吐溫80 1份。
上述含吡喃酮的濃縮物為實施例2中步驟(2)的產品。
實施例4抗生素吡喃酮的農用制劑，均為重量份硅藻土 74.5份含吡喃酮的濃縮物 16份十二烷基苯磺酸鈉 8份吐溫80 1.5份。
上述含吡喃酮的濃縮物為實施例2中步驟(2)的產品。
其中，生物材料綠色木霉LTR-2樣品已保藏，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址北京市海淀區(qū)中關村北一條13號；保藏日期2005年10月20日；保藏編號CGMCC No.1498；分類命名綠色木霉(Trichoderma viride)。
權利要求
1.抗生素吡喃酮，分子式C10H16O2，分子量168，分子結構為
2.權利要求1所述的吡喃酮抗生素的制備方法，步驟如下(1)用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)綠色木霉LTR-2，獲得孢子粉，所述的綠色木霉LTR-2，保藏號為CGMCC NO.1498；(2)用二氯甲烷5-10℃浸泡孢子粉2天，浸泡液依次經5％活性炭吸附，3％碳酸鈉溶液洗滌，無水硫酸鈉脫水，最后將處理液減壓濃縮至粘稠狀，得到含抗生素吡喃酮的濃縮物；對于上述產物進行分離純化和活性測定，繼續(xù)以下步驟(3)采用硅膠柱分離純化上述濃縮物，用流動相，石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1、10∶2、10∶4、10∶6、10∶8，梯度洗脫，離心管收集流分；(4)用硅膠板將各管收集樣展開，石油醚∶乙酸乙酯＝12∶1，經λ＝302nm的紫外燈檢測后，合并相同的流分，減壓濃縮，以立枯絲核菌為指示菌，采用PDA平板擴散法測定各流分的抑菌活性；(5)保留有抗性的流分，在硅膠板上展開，合并Rf值相同的樣品，用二氯甲烷復溶，采用PDA平板擴散法測定其抑菌活性；如此重復展開及收集檢測，至活性樣品薄層展開后僅為一純斑點，采用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀測定，結果抗性成分為吡喃酮。
3.如權利要求2所述的吡喃酮抗生素的制備方法，其特征在于，步驟(2)中按孢子粉50g/1L的量加入二氯甲烷。
4.如權利要求2所述的吡喃酮抗生素的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述的活性炭吸附是除去二氯甲烷浸泡液中的色素，洗滌是用3％碳酸鈉溶液洗滌1-2次，除去二氯甲烷浸泡液中的酸性成分。
5.如權利要求2所述的吡喃酮抗生素的制備方法，其特征在于，步驟(3)采用的硅膠柱為40cm×3cm，用10mL離心管收集流分。
6.如權利要求2所述的吡喃酮抗生素的制備方法，其特征在于，步驟(4)所用硅膠板為GF254，10cm×20cm×0.25mm。
7.吡喃酮抗生素在農業(yè)上的應用，以吡喃酮為有效成分配制成農用制劑，一種可濕性粉劑，組分如下，均為重量份硅藻土 68-84份含吡喃酮的濃縮物10-20份十二烷基苯磺酸鈉5-10份吐溫80 1-2份；將上述組分用超微粉碎機進行粉碎，過325目篩。
全文摘要
吡喃酮抗生素及其制備方法與應用，屬于生物技術領域。抗生素吡喃酮，分子式C
文檔編號A01N43/02GK1785989SQ20051010438
公開日2006年6月14日 申請日期2005年10月31日 優(yōu)先權日2005年10月31日
發(fā)明者楊合同, 陳凱, 王加寧, 李紀順, 扈進冬, 張廣志 申請人:山東省科學院中日友好生物技術研究中心