專利名稱：發(fā)菜細(xì)胞的固態(tài)培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，特別涉及一種發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，具體為可直接接種于沙?；蚧哪寥雷匀簧惩帘韺拥陌l(fā)菜細(xì)胞固態(tài)培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
發(fā)菜(Nostoc flagelliforme)，是一種原核生物，隸屬于原核生物界(Procaryotae)，藍(lán)藻門(Cyanophyta)，藍(lán)藻綱(Cyanophyceae)，段殖體目(Hormogonales)、念珠(Nostocaceae)、念珠藻屬(Nostoc)。其營(yíng)養(yǎng)豐富，并具有一定的藥用價(jià)值，極具經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)價(jià)值和潛力，并因發(fā)音與“發(fā)財(cái)”相似長(zhǎng)期受到人們的青睞。發(fā)菜在我國(guó)主要分布于西北和華北部分省區(qū)的荒漠半荒漠地帶，發(fā)菜既能進(jìn)行光合作用，又能固氮，是一種在特殊生態(tài)條件下生活的陸生藍(lán)藻，對(duì)干旱、高溫、紫外輻射、貧瘠等惡劣環(huán)境具有很強(qiáng)的適應(yīng)性。是荒漠生態(tài)環(huán)境中主要的固氮資源，具有重要的生態(tài)恢復(fù)作用。由于在野外發(fā)菜生長(zhǎng)極其緩慢，加之大規(guī)模無(wú)節(jié)制的毀滅性采收不僅使其資源量銳減，而且嚴(yán)重破壞了草原生態(tài)系統(tǒng)。為了保護(hù)發(fā)菜資源和生態(tài)環(huán)境，長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直試圖采用人工培養(yǎng)的方法，增加其生物量和資源量，以滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求，并開(kāi)展了大量的生理生態(tài)學(xué)研究，例如，申請(qǐng)?zhí)枮?213882808和03119101.0的中國(guó)專利申請(qǐng)，進(jìn)行了發(fā)菜細(xì)胞液體懸浮培養(yǎng)工作，取得了一些進(jìn)展。但是，完全人工培養(yǎng)一直沒(méi)有實(shí)現(xiàn)。目前的培養(yǎng)工作基本以野外采集的發(fā)菜藻體為材料，倘無(wú)利用發(fā)菜細(xì)胞進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是針對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行的研究，其目的是提供一種方法簡(jiǎn)單易行，操作方便，有利于發(fā)菜這一瀕危物種的保護(hù)和人工生產(chǎn)，以期在目前發(fā)菜藻體人工培養(yǎng)進(jìn)展緩慢的情況下，實(shí)現(xiàn)完全人工培養(yǎng)，并能在接近自然的條件下或直接接種于沙?；蚧哪寥雷匀簧惩帘韺訑U(kuò)大生產(chǎn)，使其能相對(duì)快速地生長(zhǎng)的發(fā)菜細(xì)胞的固態(tài)培養(yǎng)方法。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明解決所述發(fā)菜細(xì)胞的固態(tài)培養(yǎng)方法技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案是，采取了以下技術(shù)措施1、培養(yǎng)液配方為NaNO30.5-1.5g/L，MgSO4·7H2O 75mg/L，CaCl2·2H2O 30-40mg/L，NaSiO3·9H2O 55-65mg/L，K2HPO435-40mg/L，pH7.5-8.0。培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)鹽使用化學(xué)純，溶解于自來(lái)水中即可。配制時(shí)，盡量避免沉淀生成，微有沉淀析出亦可，培養(yǎng)液無(wú)需進(jìn)行高溫滅菌。
2、發(fā)菜細(xì)胞液的制備將液體培養(yǎng)的發(fā)菜細(xì)胞液4000rpm離心或過(guò)濾，棄去上清液，添加新鮮培養(yǎng)液，使之重新懸浮，或者將干燥發(fā)菜細(xì)胞用培養(yǎng)液浸泡，使其恢復(fù)活性，作為固態(tài)培養(yǎng)用種。
3、沙粒預(yù)處理40目篩網(wǎng)將沙粒過(guò)篩，用水洗凈，100℃烘干，平鋪于淺盤中，厚約0.5-1.5cm。
4.發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)將發(fā)菜細(xì)胞液按400ml/m2的接種量接種于沙粒表層，按1-1.5L/m2的總用量分3次每天在光照期間噴施培養(yǎng)液或水分，沙盤上覆蓋透明塑料薄膜保持沙粒表層濕潤(rùn)。在無(wú)光照時(shí)揭去薄膜，使沙粒表層干燥，進(jìn)行干濕節(jié)律培養(yǎng)。野外培養(yǎng)時(shí)，白天地表溫度低于40℃時(shí)噴施培養(yǎng)液或水，保持土層表層濕潤(rùn)，夜晚或地表溫度高于40℃時(shí)則保持干燥狀態(tài)。
5、培養(yǎng)條件溫度24-26℃，光照60-180μmol·m-2s-1，光暗周期12h12h；或是野外自然條件培養(yǎng)。
6、收獲當(dāng)沙盤上發(fā)菜細(xì)胞生長(zhǎng)成團(tuán)或野外培養(yǎng)到達(dá)收獲季節(jié)時(shí)去沙采收。
7、干燥于45℃以下曬干、風(fēng)干或烘干。
8、保藏室溫干燥保存。
9、繼續(xù)培養(yǎng)干燥發(fā)菜細(xì)胞于新的培養(yǎng)液中復(fù)水，可進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是由于采用細(xì)胞固體培養(yǎng)法，改變了傳統(tǒng)的藻體培養(yǎng)方式，方法簡(jiǎn)單易行，操作方便；培養(yǎng)液無(wú)需進(jìn)行高溫滅菌，與傳統(tǒng)發(fā)菜藻體培養(yǎng)相比，發(fā)菜的增殖速度更快，有利于發(fā)菜這一瀕危物種的保護(hù)和人工生產(chǎn)。由于進(jìn)行了干濕節(jié)律培養(yǎng)，因此，本發(fā)明培養(yǎng)獲得的發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)物，具有與野生發(fā)菜相類似的較強(qiáng)的耐干旱能力，并可在干燥條件下長(zhǎng)期保藏，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)可直接用于生產(chǎn)，接種于沙?；蚧哪寥雷匀簧惩帘韺?；應(yīng)用該技術(shù)培養(yǎng)發(fā)菜細(xì)胞，可以吸收空氣中的二氧化碳并可固氮，向大氣中釋放氧氣，有凈化空氣的作用，并且不同于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)要用到農(nóng)藥和除草劑，生產(chǎn)中無(wú)需任何農(nóng)藥和除草劑，其培養(yǎng)過(guò)程中不會(huì)產(chǎn)生任何毒害物質(zhì)；該技術(shù)突破了傳統(tǒng)的發(fā)菜藻體培養(yǎng)方式，其擴(kuò)大培養(yǎng)有利于維持干旱半干旱地區(qū)的生態(tài)平衡和荒漠化土壤的改良，對(duì)草原生態(tài)系統(tǒng)的平衡具有一定的現(xiàn)實(shí)意義，并且具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和環(huán)保價(jià)值。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1發(fā)菜細(xì)胞沙盤固態(tài)培養(yǎng)，其具體方法為A.配制培養(yǎng)液NaNO30.5g/L，MgSO4·7H2O 75mg/L，CaCl2·2H2O 30mg/L，NaSiO3·9H2O55mg/L，K2HPO435mg/L，pH7.5，混勻備用。
B.制備發(fā)菜細(xì)胞液發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)液離心或過(guò)濾，收集發(fā)菜細(xì)胞。按10g(濕重)發(fā)菜細(xì)胞加1L培養(yǎng)液的比例，使之重新懸浮，或者采用干發(fā)菜細(xì)胞，按2.5g細(xì)胞粉加1L培養(yǎng)液的比例浸泡24h，使之恢復(fù)活性，作為固態(tài)培養(yǎng)用種。
C.沙粒預(yù)處理40目篩網(wǎng)將沙粒過(guò)篩，用水洗凈，100℃烘干至恒重。平鋪于玻璃、塑料、金屬或木制淺盤上，厚度0.5cm。
D.細(xì)胞培養(yǎng)將發(fā)菜細(xì)胞液按400ml/m2的接種量接種于沙粒表層，按1L/m2的總用量分3次每天在光照期間噴施培養(yǎng)液或水分，沙盤上覆蓋透明塑料薄膜保持沙粒表層濕潤(rùn)。在無(wú)光照時(shí)揭去薄膜，使沙粒表層干燥，進(jìn)行干濕節(jié)律培養(yǎng)。
E.培養(yǎng)條件溫度24℃，光照60μmol·m-2s-1，光暗周期12h12h。
F.收獲當(dāng)發(fā)菜細(xì)胞生長(zhǎng)成團(tuán)或長(zhǎng)滿沙盤表層時(shí)去沙采收。
G.干燥于45℃以下曬干、風(fēng)干或烘干。
H.保藏將收集的發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)物于室溫干燥通風(fēng)環(huán)境下保存。
I.繼續(xù)培養(yǎng)將干燥的發(fā)菜細(xì)胞于新的培養(yǎng)液中復(fù)水，可進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)。
實(shí)施例2A.配制培養(yǎng)液NaNO31.0g/L，MgSO4·7H2O 75mg/L，CaCl2·2H2O 35mg/L，NaSiO3·9H2O60mg/L，K2HPO437.5mg/L，pH7.25(pH7.8)，混勻備用。
C.沙粒預(yù)處理40目篩網(wǎng)將沙粒過(guò)篩，用水洗凈，100℃烘干至恒重。平鋪于玻璃、塑料、金屬或木制淺盤上，厚度1.0cm。
D.細(xì)胞培養(yǎng)將發(fā)菜細(xì)胞液按600ml/m2的接種量接種于沙粒表層，按1.2L/m2的總用量分3次每天在光照期間噴施培養(yǎng)液或水分，沙盤上覆蓋透明塑料薄膜保持沙粒表層濕潤(rùn)。
E.培養(yǎng)條件溫度25℃，光照120μmol·m-2s-1，光暗周期12h12h。
其余同實(shí)施例1。
實(shí)施例3A.配制培養(yǎng)液NaNO31.5g/L，MgSO4·7H2O 75mg/L，CaCl2·2H2O 40mg/L，NaSiO3·9H2O65mg/L，K2HPO4 40mg/L，pH8.0，混勻備用。
C.沙粒預(yù)處理40目篩網(wǎng)將沙粒過(guò)篩，用水洗凈，100℃烘干至恒重。平鋪于玻璃、塑料、金屬或木制淺盤上，厚度1.5cm。
D.細(xì)胞培養(yǎng)將發(fā)菜細(xì)胞液按800ml/m2的接種量接種于沙粒表層，按1.5L/m2的總用量分3次每天在光照期間噴施培養(yǎng)液或水分，沙盤上覆蓋透明塑料薄膜保持沙粒表層濕潤(rùn)。
E.培養(yǎng)條件溫度26℃，光照180μmol·m-2s-1，光暗周期12h12h；其余同實(shí)施例1。
實(shí)施例4發(fā)菜細(xì)胞野外培養(yǎng)，其具體方法為發(fā)菜細(xì)胞液按500ml/m2的接種量噴灑于荒漠-半荒漠草原或丘陵裸地的沙土表層，自然條件下培養(yǎng)。每年4月底或5月初播種，11月底采收。夏季高溫季節(jié)培養(yǎng)地上覆蓋遮陽(yáng)網(wǎng)，以遮蔽過(guò)于強(qiáng)烈的光照并降低地表溫度。白天地表溫度低于40℃時(shí)噴施培養(yǎng)液或水，保持土層表層濕潤(rùn)，夜晚或地表溫度高于40℃時(shí)則保持干燥狀態(tài)。其余同實(shí)施例1(不包括人工控制的培養(yǎng)條件、沙粒預(yù)處理等內(nèi)容)。
實(shí)施例5發(fā)菜細(xì)胞野外培養(yǎng)，其具體方法為發(fā)菜細(xì)胞液按750ml/m2的接種量噴灑于荒漠-半荒漠草原或丘陵裸地的沙土表層，其余同實(shí)施例4。
實(shí)施例6發(fā)菜細(xì)胞野外培養(yǎng)，其具體方法為發(fā)菜細(xì)胞液按1000ml/m2的接種量噴灑于荒漠-半荒漠草原或丘陵裸地的沙土表層，其余同實(shí)施例4。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)菜細(xì)胞的固態(tài)培養(yǎng)方法，其特征在于將液體懸浮培養(yǎng)獲得的發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)物接種于固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)表層，在人工控制或自然條件下培養(yǎng)發(fā)菜細(xì)胞，包括以下步驟A.培養(yǎng)液配制NaNO30.5-1.5g/L，MgSO4·7H2O 75mg/L，CaCl2·2H2O 30-40mg/L，NaSiO3·9H2O55-65mg/L，K2HPO435-40mg/L，pH7.5-8.0，混勻備用；B.發(fā)菜細(xì)胞液制備發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)液離心或過(guò)濾，收集發(fā)菜細(xì)胞，添加新鮮培養(yǎng)液，使之重新懸浮，或者將干燥發(fā)菜細(xì)胞用培養(yǎng)液浸泡，使其恢復(fù)活性，作為固態(tài)培養(yǎng)用種；C.沙粒預(yù)處理40目篩網(wǎng)將沙粒過(guò)篩，用水洗凈，100℃烘干至恒重，平鋪于玻璃、塑料、金屬或木制淺盤上，厚度0.5-1.5cm；D.發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)將發(fā)菜細(xì)胞液接種于固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)表層；室內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，每天光照階段按1-1.5L/m2總用量分3次噴施培養(yǎng)液或水，沙盤表層覆蓋薄膜使基質(zhì)表層保持濕潤(rùn)，無(wú)光照時(shí)則去除薄膜，使基質(zhì)表層干燥，進(jìn)行干濕節(jié)律培養(yǎng)；野外培養(yǎng)時(shí)，白天地表溫度低于40℃時(shí)噴施培養(yǎng)液或水，保持土層表層濕潤(rùn)，夜晚或地表溫度高于40℃時(shí)則保持干燥狀態(tài)；E.培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度24-26℃，光照60-180μmol·m-2s-1，光暗周期12h12h；或野外自然條件培養(yǎng)；F.收獲當(dāng)沙盤上發(fā)菜細(xì)胞生長(zhǎng)成團(tuán)或野外培養(yǎng)到達(dá)收獲季節(jié)時(shí)去沙采收；G.干燥于45℃以下曬干、風(fēng)干或烘干；H.保藏將收集的發(fā)菜細(xì)胞室溫干燥通風(fēng)環(huán)境下保存；I.繼續(xù)培養(yǎng)將干燥發(fā)菜細(xì)胞于新的培養(yǎng)液中復(fù)水，可進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)菜細(xì)胞的固態(tài)培養(yǎng)方法，其特征在于將液體懸浮培養(yǎng)獲得的發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)物接種于人工預(yù)處理的沙粒表層，在人工控制條件下培養(yǎng)發(fā)菜細(xì)胞。
3根據(jù)權(quán)利要求1所述的發(fā)菜細(xì)胞的固態(tài)培養(yǎng)方法，其特征在于將液體懸浮培養(yǎng)獲得的發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)物接種于自然沙土表層，且在自然條件下培養(yǎng)發(fā)菜細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種發(fā)菜細(xì)胞的固態(tài)培養(yǎng)方法。解決了發(fā)菜在人工控制或自然條件下相對(duì)快速生長(zhǎng)的問(wèn)題。其技術(shù)方案是將活化的發(fā)菜細(xì)胞懸液，接種于固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)表層，噴灑一定量事先配制好的培養(yǎng)液，在人工控制或自然條件下培養(yǎng)發(fā)菜細(xì)胞，并進(jìn)行干濕節(jié)律培養(yǎng)，控制適宜的培養(yǎng)條件，實(shí)現(xiàn)完全人工培養(yǎng)或野外擴(kuò)大培養(yǎng)。該技術(shù)突破了傳統(tǒng)培養(yǎng)方式，加快了增殖速度。本發(fā)明獲得的發(fā)菜細(xì)胞培養(yǎng)物具有較強(qiáng)的耐干旱能力，可長(zhǎng)期保藏；生長(zhǎng)中吸收空氣中的二氧化碳并可固氮，向大氣中釋放氧氣，有凈化空氣的作用；無(wú)需農(nóng)藥，不產(chǎn)生毒害物質(zhì)；其擴(kuò)大培養(yǎng)有利于維持干旱半干旱地區(qū)的生態(tài)平衡和荒漠化土壤的改良，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和環(huán)保價(jià)值。
文檔編號(hào)A01G33/00GK1793314SQ200510122059
公開(kāi)日2006年6月28日 申請(qǐng)日期2005年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月1日
發(fā)明者賈士儒, 蘇建宇, 何茜, 陳雪峰, 于海峰 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)