專利名稱：海帶絲狀體包埋脫水保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種大型經(jīng)濟(jì)藻類—海帶種質(zhì)的超低溫保存技術(shù)。
背景技術(shù)：
海帶(Laminaria japonica Aresch)是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)藻類，海帶生活史分兩個(gè)明顯的世代階段孢子體世代和配子體世代，配子體世代是海帶的單倍體階段，在該階段將雌配子體和雄配子體單個(gè)分離培養(yǎng)，可形成無性繁殖系。傳統(tǒng)的種質(zhì)保存技術(shù)就是將無性系繼代培養(yǎng)保存，傳統(tǒng)保存技術(shù)具有明顯的不足(1)液體培養(yǎng)是唯一的保存途徑，手段單一，限制了保存的規(guī)模和效率；(2)液體培養(yǎng)保存一般需要在半月內(nèi)更新一次培養(yǎng)液，工作量大，操作繁瑣，頻繁操作也增加了種質(zhì)污染及混雜的機(jī)會(huì)；(3)采孢子前無法對(duì)種海帶進(jìn)行無菌處理，整個(gè)保存過程都在有菌條件下，不能徹底杜絕微生物尤其雜藻的污染；(4)培養(yǎng)中細(xì)胞形態(tài)異常、單性生殖等現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，培養(yǎng)因子有待進(jìn)一步優(yōu)化。因此，目前的保種技術(shù)是一種傳統(tǒng)的繼代培養(yǎng)保存的方法，無法完全排除混雜、污染、變異的可能性。
超低溫冷凍是唯一可靠的可長(zhǎng)期穩(wěn)定保存種質(zhì)的技術(shù)。藻類種質(zhì)超低溫保存的研究開始于20世紀(jì)60年代，80年代以后發(fā)展速度較快，從淡水藻類到海水藻類，從微藻類到大型藻類，從非經(jīng)濟(jì)藻類到經(jīng)濟(jì)藻類都給予了較多的關(guān)注。藻類超低溫冷凍保存的方法主要是兩步冰凍法(two-step freezing)，該方法首先在保存材料中加入抗凍保護(hù)劑，進(jìn)行預(yù)凍，再將預(yù)凍過的材料投入液氮中快速冷凍，目前已成為藻類種質(zhì)冰凍保存的常規(guī)方法。該方法的主要局限在于抗凍保護(hù)劑有一定毒性，除了在復(fù)蘇后去處保護(hù)劑環(huán)節(jié)繁瑣外，對(duì)種質(zhì)的遺傳特性是否有影響也受到一定質(zhì)疑，另外，兩步法凍存通常需要比較昂貴的程序降溫儀，也限制了該技術(shù)的推廣應(yīng)用。
包埋脫水法(encapsulation-dehydration)是近幾年發(fā)展起來的一種新的超低溫保存方法，即生物材料用褐藻膠包埋后，脫水到一定程度投入液氮保存，該方法通常不使用抗凍保護(hù)劑和昂貴的程序降溫儀，無疑是對(duì)超低溫保存技術(shù)的改進(jìn)。在海帶目中只有掌狀海帶(L.digitata)和裙帶菜(Undaria pinnatifida)兩個(gè)種類采用過包埋脫水法保存。未見采用包埋脫水法保存中國(guó)海帶(L.japonica)的研究報(bào)道。在超低溫冷凍保存中，有效的凍存程序以種類的不同而有較大差異，凍存程序的建立主要是依靠經(jīng)驗(yàn)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，沒有一種程序適合其他種類或多數(shù)種類，這也是超低溫保存技術(shù)的主要難點(diǎn)之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于改進(jìn)已有的絲狀體繼代培養(yǎng)保存以及兩步法超低溫保存技術(shù)的不足而提供一種用于最有經(jīng)濟(jì)價(jià)值海帶種類(L.japonica)的、可靠的、簡(jiǎn)單有效的種質(zhì)保存方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，海帶絲狀體包埋脫水保存方法，是以海帶絲狀體為凍存材料的超低溫保存方法，其特點(diǎn)是包括以下步驟材料包埋、蔗糖溶液中預(yù)培養(yǎng)、干燥脫水、預(yù)凍、入液氮保存、復(fù)蘇、脫固定。
材料包埋是將絲狀體用組織破碎儀切割成100-200um的小段，在光強(qiáng)1500±200Lux，光時(shí)L∶D 24∶0，水溫10～15℃，營(yíng)養(yǎng)鹽NO3-N6-10g/m3，PO4-P 1-2g/m3的條件下培養(yǎng)兩周后，將實(shí)驗(yàn)材料與3％褐藻酸鈉溶液混勻，移入注射器中，將藻液滴入含0.1M CaCI2的30‰NaCI溶液中，輕輕搖動(dòng)，膠球變硬，即完成固定化包埋過程，制成直徑為3.5±0.2mm的含有絲狀體的褐藻酸鈣膠球。
蔗糖溶液中預(yù)培養(yǎng)是將膠球置于0.4M的蔗糖溶液中培養(yǎng)6-15h。
干燥脫水是預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將膠球置于溫度10-15℃、相對(duì)濕度50-80％的環(huán)境中陰干3-6h.去除保護(hù)劑是將混合液經(jīng)500目篩絹過濾，濾出的無性系移入培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
預(yù)凍是將干燥后的膠球置于-20--40℃的冰箱中停留30-60min。
入液氮保存是將預(yù)凍后的膠球直接投入液氮保存。
復(fù)蘇是從液氮中取出膠球直接放入40℃恒溫水浴，快速震蕩直至膠球表面由白色變?yōu)樗疇?，移入常?guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)。
脫固定是復(fù)蘇培養(yǎng)一周后按每5-7粒膠球放入20ml含0.05M檸檬酸鈉的30‰NaCI溶液中，使膠球完全溶解，用500目篩絹濾出絲狀體，濾出的絲狀體移入常規(guī)培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
本發(fā)明與已有技術(shù)相比具有以下顯著特點(diǎn)和積極效果(1)本發(fā)明采用超低溫冷凍保存海帶絲狀體，使絲狀體細(xì)胞在-196℃狀態(tài)下代謝完全停止，生命以靜止的形式在這種狀態(tài)下長(zhǎng)期保存，解凍后又可恢復(fù)其原有的生物活性和遺傳特性，有效地解決了海帶種質(zhì)保存中污染、混雜、變異的問題；(2)本發(fā)明方法與常規(guī)的兩步法超低溫保存技術(shù)相比，一是不使用抗凍保護(hù)劑，避免了抗凍保護(hù)劑對(duì)種質(zhì)材料的毒性影響，也簡(jiǎn)化了復(fù)蘇后去處保護(hù)劑的繁瑣；二是不采用比較昂貴的程序降溫儀，利于該技術(shù)普及應(yīng)用；(3)本發(fā)明方法將包埋脫水法與兩步冰凍法結(jié)合，通過蔗糖溶液培養(yǎng)、低溫高濕壞境干燥和預(yù)凍三環(huán)節(jié)充分脫水，既解決了海帶(L.japonica)對(duì)干燥脫水較敏感的問題，也阻止了入液氮和復(fù)蘇過程中冰晶的形成，提高了存活率。
四、具體實(shí)施方案下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
實(shí)施例，海帶絲狀體包埋脫水保存法，是以海帶絲狀體為凍存材料的超低溫保存方法，包括材料包埋、蔗糖溶液中預(yù)培養(yǎng)、干燥脫水、預(yù)凍、入液氮保存、復(fù)蘇、脫固定七個(gè)步驟；首先將絲狀體用組織破碎儀切割成100-200um的小段，在光強(qiáng)1500±200Lux，光時(shí)L∶D 24∶0，水溫10～15℃，營(yíng)養(yǎng)鹽NO3-N 6-10g/m3，PO4-P 1-2g/m3的條件下培養(yǎng)兩周，與3％褐藻酸鈉溶液混勻，移入注射器中，將藻液滴入含0.1M CaCI2的30‰ NaCI溶液中，輕輕搖動(dòng)，15-30min后膠球變硬，制成直徑為3.5±0.2mm的含有絲狀體的褐藻酸鈣膠球；將膠球置于海水配置的0.4M蔗糖溶液中培養(yǎng)6h；預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將膠球置于溫度10℃、相對(duì)濕度70％的環(huán)境中陰干6h；將干燥后的膠球置于-40℃的冰箱中停留30mm；預(yù)凍后的膠球直接投入液氮保存，保存時(shí)間依據(jù)具體情況，可幾個(gè)月，也可幾年，或更長(zhǎng)；復(fù)蘇時(shí)，從液氮中取出膠球直接放入40℃恒溫水浴，快速震蕩直至膠球表面由白色變?yōu)樗疇?，移入常?guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)；復(fù)蘇后培養(yǎng)7天，按每7粒膠球放入20ml含0.05M檸檬酸鈉的30‰ NaCI溶液中，使膠球完全溶解，用500目篩絹濾出絲狀體，濾出的細(xì)胞系移入常規(guī)培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
采用本發(fā)明方法保存的絲狀體，再培養(yǎng)法測(cè)定存活率達(dá)43％。
權(quán)利要求
1.海帶絲狀體包埋脫水保存方法，是以海帶絲狀體為凍存材料的超低溫保存方法，其特征是包括以下步驟材料包埋、蔗糖溶液中預(yù)培養(yǎng)、干燥脫水、預(yù)凍、入液氮保存、復(fù)蘇、脫固定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海帶絲狀體包埋脫水保存方法，其特征材料包埋是將海帶無性系用組織破碎儀切割成100-200um的小段，在光強(qiáng)1500±200Lux，光時(shí)LD 240，水溫10～15℃，營(yíng)養(yǎng)鹽NO3-N 6-10g/m3，PO4-P 1-2g/m3的條件下培養(yǎng)兩周后，與3％褐藻酸鈉溶液混勻，移入注射器中，將藻液滴入含0.1MCaCI2的30‰ NaCI溶液中，輕輕搖動(dòng)，膠球變硬即完成固定化包埋過程，得到直徑為3.5±0.2mm的含有絲狀體的褐藻酸鈣膠球。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海帶絲狀體包埋脫水保存方法，其特征蔗糖溶液中預(yù)培養(yǎng)是將含有絲狀體的褐藻酸鈣膠球置于海水配置的0.4M蔗糖溶液中培養(yǎng)6-15小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海帶絲狀體包埋脫水保存方法，其特征干燥脫水是蔗糖溶液中預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后，將含有絲狀體的褐藻酸鈣膠球置于溫度10-15℃、相對(duì)濕度50-80％的環(huán)境中陰干3-6小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海帶絲狀體包埋脫水保存方法，其特征預(yù)凍是將干燥脫水后的含有絲狀體的褐藻酸鈣膠球置于溫度在-20℃--40℃的冰箱中停留30-60min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海帶絲狀體包埋脫水保存方法，其特征入液氮保存是將預(yù)凍后的含有絲狀體的褐藻酸鈣膠球直接投入液氮保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海帶絲狀體包埋脫水保存方法，其特征復(fù)蘇是從液氮中取出含有絲狀體的褐藻酸鈣膠球直接放入40℃恒溫水浴，快速震蕩直至膠球表面由白色變?yōu)樗疇?，移入常?guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海帶絲狀體包埋脫水保存方法，其特征脫固定是在復(fù)蘇培養(yǎng)一周后按每5-7粒膠球放入20ml含0.05M檸檬酸鈉的30％o NaCI溶液中，使膠球完全溶解，用500目篩絹濾出絲狀體，濾出的絲狀體移入常規(guī)培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了海帶絲狀體包埋脫水保存方法，是以海帶絲狀體為凍存材料的超低溫保存方法，包括以下步驟材料包埋、蔗糖溶液中預(yù)培養(yǎng)、干燥脫水、預(yù)凍、入液氮保存、復(fù)蘇、脫固定，本發(fā)明改進(jìn)已有的絲狀體繼代培養(yǎng)保存以及兩步法超低溫保存技術(shù)的不足，提供一種用于最有經(jīng)濟(jì)價(jià)值海帶種類(L.japonica)的、可靠的、簡(jiǎn)單有效的種質(zhì)保存方法，有效地解決了海帶種質(zhì)保存中污染、混雜、變異的問題，不使用抗凍保護(hù)劑，避免了抗凍保護(hù)劑對(duì)種質(zhì)材料的毒性影響，也簡(jiǎn)化了復(fù)蘇后去處保護(hù)劑的繁瑣，設(shè)備簡(jiǎn)單，利于該技術(shù)普及應(yīng)用，提高了存活率。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1762198SQ20051012327
公開日2006年4月26日 申請(qǐng)日期2005年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月17日
發(fā)明者張全勝, 王國(guó)文, 戴宏亮, 解建祖, 錢瑞, 鄭龍華 申請(qǐng)人:山東東方海洋科技股份有限公司, 煙臺(tái)大學(xué)