專利名稱：包括用于細(xì)胞裂解的電解裝置的微流體器件及利用它電化學(xué)裂解細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種包括用于細(xì)胞裂解(cell lysis)的電解裝置的微流體器件(microfluidic device)及利用它裂解細(xì)胞(lysing cell)的方法。
背景技術(shù)：
微流體器件是指其中入口、出口、反應(yīng)器等通過微通道連接的器件。該器件在本領(lǐng)域是公知的，并廣泛用于微量分析儀器如芯片實驗室(LOC)中。在微流體器件中，不但形成微通道，而且包括輸送并混合流體的微泵，微混合器，及過濾輸送中的流體的微過濾器。用作生物測定器件如LOC的微流體器件，通常應(yīng)該包括在裂解細(xì)胞或病毒的過程中所需的裝置或者利用外部裂解的細(xì)胞溶液或已經(jīng)提純的材料。堿性法等常用作細(xì)胞裂解方法。然而，當(dāng)利用這些方法時，必須加入化學(xué)藥品如NaOH且必須包括用于在裂解混有化學(xué)藥品的細(xì)胞之后除去所加入的化學(xué)藥品的裝置。例如，必須包括用于完成上述過程的閥、泵、過濾器等。
因而，包括用于細(xì)胞裂解的電解裝置的微流體器件仍然不是公知的。
另外，各種細(xì)胞裂解方法是公知的。例如，煮沸法、堿性法、利用酶的細(xì)胞裂解方法等都是公知的。堿性法是通過將細(xì)胞或病毒暴露于具有高pH的物質(zhì)如NaOH來裂解細(xì)胞的方法。然而，常規(guī)的細(xì)胞或病毒裂解方法如堿性法用于微流體器件如LOC中，有許多缺點。例如，當(dāng)通過利用堿性溶液如NaOH裂解細(xì)胞得到的堿性細(xì)胞裂解液(lysate)用中和溶液來中和時，需要用于細(xì)胞裂解的堿性溶液的注入步驟并且因此需要裝置并且樣品溶液由于堿性溶液和中和溶液的加入而被稀釋。該溶液注入步驟和裝置在處理微體積的微流體器件中可能帶來嚴(yán)重的問題，并且當(dāng)?shù)玫交驍U增所需的樣品時，稀釋也可能帶來問題。而且，必須除去或中和堿性溶液如NaOH以用于隨后的生物分析方法如PCR中。
因而，、當(dāng)通過電解在原位產(chǎn)生裂解細(xì)胞的物質(zhì)如氫氧化物來裂解細(xì)胞時能夠提供具有適于隨后生物分析的pH和條件的細(xì)胞裂解液的細(xì)胞裂解方法，仍然不是公知的。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)電解是利用含有包含標(biāo)準(zhǔn)氧化電位比水低或高的離子的電解液的陽極室及含有包含標(biāo)準(zhǔn)還原電位比水低的離子和細(xì)胞的電解液的陰極室進行時，能夠制備具有適于隨后生物分析的pH和條件的細(xì)胞裂解液，從而導(dǎo)致本發(fā)明的完成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種包括用于細(xì)胞裂解的電解裝置的微流體器件。
本發(fā)明還提供一種利用電解裂解細(xì)胞的方法。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種包括用于細(xì)胞裂解的電解裝置的微流體器件，該電解裝置包括陽極室、陰極室和隔板，其中該隔板安裝在陽極室和陰極室之間，陽極室包括陽極室溶液的入口和出口及電極，陰極室包括陰極室溶液的入口和出口及電極。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種利用包括用于細(xì)胞裂解的電解裝置的微流體器件裂解細(xì)胞或病毒的方法，該電解裝置包括陽極室、陰極室和隔板，其中該隔板安裝在陽極室和陰極室之間，陽極室包括陽極室溶液的入口和出口及電極，陰極室包括陰極室溶液的入口和出口及電極，所述方法包括經(jīng)過陽極室的入口，將包含標(biāo)準(zhǔn)氧化電位比水低或高的化合物的陽極室溶液引入到陽極室中；經(jīng)過陰極室的入口，將包含細(xì)胞或病毒和標(biāo)準(zhǔn)還原電位比水低的化合物的陰極室溶液引入到陰極室中；及通過向包括在陽極室和陰極室中的電極施加電流，在陽極室和陰極室中引起電解而裂解細(xì)胞。


通過參考附圖詳述其示例性實施方案，本發(fā)明的上述和其它特點和優(yōu)點將變得更加顯而易見，其中圖1A為包括陰極室、陽極室和安裝在陰極室與陽極室之間的隔板的電解裝置圖；圖1B為包括陰極室和陽極室的、用作本發(fā)明實施例1中的對照電解裝置的電解裝置圖；圖1C為包括陰極室和陽極室的、置于載物玻片上用于顯微觀察的、用作本發(fā)明實施例1的對照電解裝置的電解裝置圖；圖1D為根據(jù)本發(fā)明實施方案包括電解裝置的微流體器件圖；圖1E和1F為根據(jù)本發(fā)明另外的實施方案，其中分別安裝了兩個泵和一個泵的包括電解裝置的微流體器件圖；圖2圖示在37℃下培養(yǎng)用通過電解得到的溶液處理過的細(xì)胞16小時后的瓊脂平板；圖3圖示利用通過用電解的溶液處理細(xì)胞得到的溶液作為模板，進行實時PCR得到的實時PCR曲線；圖4為在利用通過用電解的溶液處理細(xì)胞得到的溶液作為模板，進行實時PCR得到的PCR產(chǎn)物的電泳后，用Agilent 2100 Bioanalyzer分析結(jié)果圖；圖5為將圖4的結(jié)果圖解為PCR產(chǎn)物的濃度圖；圖6圖示利用通過在所使用的鹽濃度、電流和時間條件下，直接電解細(xì)胞溶液得到的細(xì)胞裂解液作為模板，進行實時PCR擴增的結(jié)果；圖7圖示通過利用在各種條件下直接電解細(xì)胞溶液得到的細(xì)胞裂解液作為模板，進行PCR得到的最終PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果；圖8圖示在電泳后，利用Agilent 2100 Bioanalyzer，分析利用圖6中通過電解得到的細(xì)胞裂解液作為模板，進行實時PCR得到的PCR產(chǎn)物；圖9圖示用連在顯微鏡上的數(shù)字照相機，在施加5V的DC電壓和1mA的電流后，連續(xù)觀察載片上的加樣孔(well)中的CHO細(xì)胞的結(jié)果；圖10圖示在向陽極室和陰極室中均加入10ml 100mM NaCl水溶液(初始pH＝6.0)，并施加5V的DC電壓后，觀察pH隨時間變化的結(jié)果；圖11圖示在分別向陽極室和陰極室中加入200ml 100mM MgSO4水溶液(初始pH＝5.75)和200ml 100mM NaCl水溶液(初始pH＝5.75)，并施加10V的DC電壓后，觀察pH隨時間變化的結(jié)果；圖12圖示在分別向陽極室和陰極室中加入200ml 100mM Na2SO4水溶液(初始pH＝5.82)和200ml 100mM NaCl水溶液(初始pH＝5.82)，并施加10V的DC電壓后，觀察pH隨時間變化的結(jié)果；及圖13圖示利用陽極室中不同的電解質(zhì)進行電解后，陽極電解的溶液和陰極電解的溶液混合物的實時PCR的結(jié)果。
具體實施例方式
本發(fā)明提供一種包括用于細(xì)胞裂解的電解裝置的微流體器件，該電解裝置包括陽極室、陰極室和隔板，其中該隔板安裝在陽極室和陰極室之間，陽極室包括陽極室溶液的入口和出口及電極，陰極室包括陰極室溶液的入口和出口及電極。
本實施方案的微流體器件包括用于細(xì)胞裂解的電解裝置，該電解裝置包括陽極室、陰極室和隔板。在用于細(xì)胞裂解的電解裝置中，隔板安裝在陽極室和陰極室之間，陽極室包括陽極室溶液的入口和出口及電極，陰極室包括陰極室溶液的入口和出口及電極。入口和出口不需要分離，一個口也可以既充當(dāng)入口又充當(dāng)出口。
當(dāng)含有細(xì)胞或病毒的溶液被引入到陰極室中并且適當(dāng)?shù)碾娊赓|(zhì)包括在陽極室中時，包括在本實施方案的微流體器件中的用于細(xì)胞裂解的電解裝置，可以通過向包括在各室中的電極施加電流用于裂解細(xì)胞。推測細(xì)胞裂解是由于在陰極室中通過施加電流產(chǎn)生的氫氧離子而完成的，但本發(fā)明不限于具體的機理。
用于細(xì)胞裂解的電解裝置構(gòu)成微流體器件的一部分。例如，陽極室和陰極室的各個入口和出口構(gòu)成微流體器件的微通道，并且陽極室和陰極室以微通道的形式構(gòu)成反應(yīng)器。在本實施方案的微流體器件中，陽極室和陰極室的各個入口由單獨的微通道組成。另外，陽極室和陰極室的各個出口可以是單獨的微通道或可以彼此連接/結(jié)合。陽極室和陰極室的各個出口優(yōu)選被連接/結(jié)合，以便在一個微通道中混合并中和陽極室溶液和陰極室溶液。當(dāng)形成一個連接的微通道時，陰極室的細(xì)胞裂解液可以被中和，而不加入單獨的中和溶液。
在本發(fā)明的實施方案中，陽極室溶液可以包含標(biāo)準(zhǔn)氧化電位比水低的化合物。該化合物的實例包括陰離子如NO3-、F-、SO42-、PO43-和CO32-，但不限于此。當(dāng)陽極室溶液為具有標(biāo)準(zhǔn)氧化電位比水低的化合物時，當(dāng)電解是利用本實施方案的微流體器件進行時，陽極室中的水被電解產(chǎn)生氧氣和H+離子。
然而，當(dāng)陽極室溶液和陰極室溶液混合并且僅需要細(xì)胞裂解而不需要中和時，陽極室溶液可以包含化合物，即標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位比水低或高的電解質(zhì)。該化合物的實例包括陰離子如Cl-、NO3-、F-、SO42-、PO43-和CO32-，但不限于此。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，陰極室溶液可以包含標(biāo)準(zhǔn)還原電位比水低的化合物。該化合物的實例包括陽離子如Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Al3+，但不限于此。因而，當(dāng)電解是利用本實施方案的微流體器件進行時，陰極室中的水被電解產(chǎn)生氫氣和OH-離子。
在本實施方案中，隔板優(yōu)選允許電流穿過，但是不允許由包含在陽極室和陰極室中的電解質(zhì)電解產(chǎn)生的離子和/或氣體穿過。隔板更優(yōu)選允許電穿過，但是不允許氫離子和氫氧離子和/或氣體穿過。隔板的實例包括NafionTM(Dupont)、DowexTM(Aldrich)和DiaionTM(Aldrich)，但不限于此。
包括在陽極室和陰極室中的電極可以選自Pt，Au，Cu，及Pd。當(dāng)Pt電極用于陽極室中時，可以防止蛋白質(zhì)和DNA的吸收。當(dāng)使用Cu電極時，它在陽極室與氯化物如NaCl反應(yīng)形成CuCl2，從而減少有毒的氯氣的產(chǎn)生。當(dāng)使用Pd電極時，它吸收在陰極室中產(chǎn)生的氫氣，并因而不需要除氣過程。
本實施方案的微流體器件還可以包括向陽極室引入或從陽極室排出溶液的泵，及向陰極室引入或從陰極室排出溶液的泵?；蛘撸⒘黧w器件還可以包括向陽極室和陰極室引入或從陽極室和陰極室排出溶液的泵。在此情況下，陽極室和陰極室的溶液利用一個泵注入并混合。
在本發(fā)明的實施方案中，微流體器件可以包括具有上述用于細(xì)胞裂解的電解裝置的細(xì)胞裂解室(compartment)、核酸分離室、核酸擴增室和檢測室。本實施方案的微流體器件可以充當(dāng)LOC。可用于核酸分離室、核酸擴增室和檢測室的元件可以是任何本領(lǐng)域公知的裝置。
本發(fā)明還提供一種裂解細(xì)胞或病毒的方法，該方法通過利用包括用于細(xì)胞裂解的電解裝置的微流體器件的電解完成，該電解裝置包括陽極室、陰極室和隔板，其中該隔板安裝在陽極室和陰極室之間，陽極室包括陽極室溶液的入口和出口及電極，陰極室包括陰極室溶液的入口和出口及電極，該方法包括經(jīng)過陽極室的入口，將包含標(biāo)準(zhǔn)氧化電位比水低或高的化合物的陽極室溶液引入到陽極室中；經(jīng)過陰極室的入口，將包含細(xì)胞或病毒和標(biāo)準(zhǔn)還原電位比水低的化合物的陰極室溶液引入到陰極室中；及通過向包括在陽極室和陰極室中的電極施加電流，在陽極室和陰極室中引起電解而裂解細(xì)胞。
本實施方案的細(xì)胞或病毒裂解方法包括經(jīng)過陽極室的入口，將包含標(biāo)準(zhǔn)氧化電位比水低或高的化合物的陽極室溶液引入到陽極室中；及經(jīng)過陰極室的入口，將包含細(xì)胞或病毒和標(biāo)準(zhǔn)還原電位比水低的化合物的陰極室溶液引入到陰極室中。
在本發(fā)明的實施方案中，所述標(biāo)準(zhǔn)氧化電位比水低的化合物可以包括下列NO3-、F-、SO42-、PO43-和CO32-中的至少一種陰離子，并且所述標(biāo)準(zhǔn)氧化電位比水高的化合物可以包括Cl-離子，但不限于此。標(biāo)準(zhǔn)還原電位比水低的化合物可以包括下列Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Al3+中的至少一種陽離子，但不限于此。該兩個步驟可以同時或連續(xù)進行。
當(dāng)電解是在將包含最常包含在生物樣品溶液中的NaCl的樣品溶液，引入到陽極室和陰極室中之后完成的時，陽極室中的氯化物而不是水被電解產(chǎn)生氯氣，因而產(chǎn)生了比陰極室中產(chǎn)生的氫氧離子的量少的氫離子。氫離子是由于氯氣和水之間的反應(yīng)而產(chǎn)生的并且它的量隨著溶解氯氣的條件變化，這使得pH控制困難。為了解決該問題，在本發(fā)明的實施方案中，標(biāo)準(zhǔn)氧化電位比水低的化合物和標(biāo)準(zhǔn)還原電位比水低的化合物分別用于陽極室和陰極室中。
本實施方案的細(xì)胞或病毒裂解方法包括通過向包括在陽極室和陰極室中的電極施加電流，在陽極室和陰極室中引起電解而裂解細(xì)胞。在本實施方案的方法中，因為陰極室含有包含標(biāo)準(zhǔn)還原電位比水低的化合物的陰極室溶液，所以水被電解產(chǎn)生氫氣和OH-離子。因而，陰極室中的細(xì)胞或病毒能夠被氫氧離子裂解。另外，在本發(fā)明的實施方案中，因為陽極室含有包含標(biāo)準(zhǔn)氧化電位比水低的化合物的陽極室溶液，所以水被電解產(chǎn)生氧氣和氫離子。因此，陰極室溶液變?yōu)閴A性，而陽極室溶液變?yōu)樗嵝浴?br> 通常，細(xì)胞裂解液經(jīng)歷各種附加的生物分析過程，如PCR、核酸分離或蛋白質(zhì)分離。因為生物分子如核酸或蛋白質(zhì)在中性狀態(tài)下一般是穩(wěn)定的，該生物分析過程在中性狀態(tài)下進行。具體地，細(xì)胞裂解、核酸分離、核酸擴增、蛋白質(zhì)分離和檢測可以接連進行。在此情況下，在相對早期進行的細(xì)胞裂解不應(yīng)該包括能夠影響隨后步驟中經(jīng)歷的反應(yīng)的物質(zhì)。例如，當(dāng)核酸在細(xì)胞裂解后利用PCR擴增時，能夠抑制PCR的物質(zhì)不應(yīng)被包括。
因而，本實施方案的方法還包括，在電解后，經(jīng)過出口從陽極室中排出酸性溶液；經(jīng)過出口從陰極室中排出堿性細(xì)胞或病毒裂解液；及混合所述酸性溶液和堿性細(xì)胞或病毒裂解液以便中和細(xì)胞或病毒裂解液。
而且，在本發(fā)明的實施方案中，從陽極室中排出的酸性溶液和從陰極室中排出的堿性細(xì)胞或病毒裂解液通過按照1∶1體積比混合而被中和。在本實施方案的方法中，因為在陰極室溶液和陽極室溶液中分別產(chǎn)生相同當(dāng)量比的氫氧離子和氫離子，所以即使當(dāng)細(xì)胞裂解后陰極室溶液和陽極室溶液按照1∶1的比例混合時，也能得到中性pH或近似中性pH。
用于本實施方案的方法的微流體器件，還可以包括向陽極室引入或從陽極室排出溶液的泵，及向陰極室引入或從陰極室排出溶液的泵。或者，所述微流體器件還可以包括向陽極室和陰極室引入或從陽極室和陰極室排出溶液的泵。在此情況下，陽極室和陰極室的溶液利用一個泵注入并混合。
另外，包括在用于本實施方案方法的微流體器件的用于細(xì)胞裂解的電解裝置中的隔板，優(yōu)選允許電流穿過，但是不允許由包含在陽極室和陰極室中電解質(zhì)電解產(chǎn)生的離子和/或氣體穿過。隔板更優(yōu)選允許電穿過，但是不允許氫離子和氫氧離子和/或氣體穿過。隔板的實例包括NationTM(Dupont)、DowexTM(Aldrich)和DiaionTM(Aldrich)，但不限于此。
包括在用于細(xì)胞裂解的電解裝置的陽極室和陰極室中的電極，可以選自Pt、Au、Cu和Pd。當(dāng)Pt電極用于陽極室時，能夠防止蛋白質(zhì)和DNA的吸收。當(dāng)使用Cu電極時，它在陽極室中與氯化物如NaCl發(fā)生反應(yīng)形成CuCl2，從而減少有毒的氯氣的產(chǎn)生。當(dāng)使用Pd電極時，它吸收在陰極室中產(chǎn)生的氫氣，因而不需要除氣過程。
用于本實施方案的方法的微流體器件可以包括具有上述用于細(xì)胞裂解的電解裝置的細(xì)胞裂解室、核酸分離室、核酸擴增室和檢測室。該微流體器件可以充當(dāng)LOC?？捎糜诤怂岱蛛x室、核酸擴增室和檢測室的元件可以是任何本領(lǐng)域公知的裝置。
圖1A為用于根據(jù)本發(fā)明實施方案的微流體器件的電解裝置示意圖。參考圖1A，陰極室10和陽極室30被隔板20分隔。電極40和電極50安裝在各室中，因而可以通過向各電極施加電壓在各室中引起電解。在圖1A中，室溶液的入口和出口合并為一體，并且可以通過打開和關(guān)閉上蓋來實施。
圖1D為根據(jù)本發(fā)明實施方案包括電解裝置的微流體器件的示意圖。參考圖1D，陰極室10和陽極室30被隔板20分隔。電極40和電極50安裝在各室中，因而可以通過向各電極施加電壓在各室中引起電解。入口和出口形成在各室中并且出口被連接起來以便混合在陽極室和陰極室中電解的溶液。
圖1E和1F為根據(jù)本發(fā)明實施方案另一種包括電解裝置的微流體器件的示意圖。圖1E和1F所示的微流體器件與圖1D所示的微流體器件相同，除了它們還分別包括兩個微泵和一個微泵。在如圖1F圖解的具有微泵的微流體器件中，陽極室和陰極室的電解的溶液按照相同的量注入以混合，因而只有當(dāng)通過電解在陽極室中產(chǎn)生的氫離子的當(dāng)量與在陰極室中產(chǎn)生的氫氧離子的當(dāng)量彼此相似時，本實施方案才是可能的。
現(xiàn)在將參考下面的實施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。下面的實施例僅僅是為了說明性目的，而不意味著限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1通過陰極室和陽極室的電解的溶液的細(xì)胞裂解在本實施例中，細(xì)胞裂解是利用采用電解裝置進行電解之后得到的陰極室溶液和陽極室溶液引起的，該電解裝置包括陰極室，陽極室，及安裝在陰極室和陽極室之間的隔板，并且觀察了結(jié)果。
用于本實施例的電解裝置示于圖1A中。參考圖1A，該電解裝置包括陰極室，陽極室，及安裝在陰極室和陽極室之間的隔板。Au電極和Pt電極分別包括在陰極室和陽極室中，并且陰極室和陽極室被NafionTM膜(Dupont，USA)分隔。
(1)電解的溶液的制備在室溫下，通過向陰極室和陽極室中加入300ml 100mM NaCl水溶液，并施加10V的DC電壓，引起電解5分鐘。因此，從陽極室中得到電解的酸性溶液(EAS)，從陰極室中得到電解的堿性溶液(EBS)，并且通過以等體積混合EAS和EBS得到電解的總?cè)芤?ETS)。這些溶液用于進行細(xì)胞裂解。利用pH傳感器(AR15，F(xiàn)isher scientific，USA)測量各溶液的pH。
(2)利用電解的溶液的細(xì)胞裂解在燒瓶里的100ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌(E.coli)(ATCC#45020)，同時在37℃和250rpm下攪拌6～8小時。在4℃和6000g下，利用Eppendorf5810R離心機收集細(xì)胞10分鐘。該大腸桿菌被懸浮在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，大腸桿菌細(xì)胞的濃度達(dá)到相應(yīng)于OD600值為0.8。在室溫下，細(xì)胞懸浮液分別用電解的溶液即EAS、EBS和ETS處理5分鐘。反應(yīng)后，在4℃和10000g下，利用Eppendorf 5810R離心機(Eppendorf AG，Germany)使樣品稍離心(spin down)10分鐘。結(jié)果，將所得到樣品的上清液和下清液用于分析。
(3)通過實時PCR鑒定細(xì)胞裂解為了鑒定細(xì)胞裂解的發(fā)生，利用樣品的上清液和下清液作為模板，進行實時PCR。細(xì)胞裂解的發(fā)生從結(jié)果間接地推測。PCR目標(biāo)序列是重組到大腸桿菌基因組的HBV基因組的一部分核心區(qū)(core domain)。
利用上清液和下清液作為模板，及SEQ ID No1和SEQ ID No2的寡核苷酸作為引物，并利用反應(yīng)體積為20μl的LightCycler儀器(RocheDiagnosticsm，Germany)，進行PCR。對于LightCycler PCR反應(yīng)來說，按照所示的最終濃度制得下面的反應(yīng)組分的反應(yīng)通用試劑(mastermix)2μlLightCycler master(Fast start DNA master SYBR Green I；Roche Diagnostics)，3.2μl MgCl2(5mM)，1.0μl正向-反向引物混合物(1.0mM)，4.0μl UNG(Uracil-N-Glycosylase，0.2單位)，及4.8μl PCR-等級的水。向該混合液中加入5μl被測的樣品。使用兩種不同的Taq DNA聚合酶(Roche Hot-start TaqDNA聚合酶和Solgent Taq DNA聚合酶)來制備該LightCycler master。
然后，將20μl的反應(yīng)混合物分配在lightCycler毛細(xì)管中。該毛細(xì)管被關(guān)閉且定位于lightCycler轉(zhuǎn)子上。下面的兩種LightCycler方案用于兩種不同的酶(1)對于Hot-start Taq DNA聚合酶(Roche Diagnostics)，UNG效果步驟(在50℃，10分鐘)，初始變性(在95℃，10分鐘)，35個擴增和定量循環(huán)(在95℃，5秒；在62℃，15秒，及一次熒光檢測)，解鏈曲線步驟(連續(xù)的熒光檢測，在62-95℃的變溫速度(ramping rate)為1℃/秒)，及最終冷卻到40℃；及(2)對于Taq DNA聚合酶(Solgent)，UNG效果步驟(在50℃，10分鐘)，初始變性(在95℃，1分鐘)，35個擴增和定量循環(huán)(在95℃，5秒；在62℃，15秒，以及一次熒光檢測)，解鏈曲線步驟(連續(xù)的熒光檢測，在62～95℃的變溫速度為1℃/秒)，及最終冷卻到40℃。
(4)擴增產(chǎn)物的分析具體地，用Agilent 2100 Bioanalyzer系統(tǒng)測定1μl擴增的產(chǎn)物。使用DNA 500實驗室芯片(Agilent Technologies，USA)檢測PCR產(chǎn)物和二聚體的百分率。簡要地說，將9μl的凝膠-染料混合物吸取到適當(dāng)?shù)募訕涌?well)中，然后該加樣孔通過1ml注射器加壓1分鐘，以用混合物填充微通道。然后，用5μl DNA大小標(biāo)記混合物+1μl分子大小梯帶(ladder)或樣品加載梯帶加樣孔和樣品加樣孔。通過渦流混合之后，立即將芯片插入到生物分析系統(tǒng)中并根據(jù)生產(chǎn)商的指導(dǎo)進行處理。PCR產(chǎn)物的量由二聚體和野生型(wild)DNA片段的兩個峰的相對面積比來確定。
(5)結(jié)果研究了電解的溶液對于大腸桿菌細(xì)胞裂解的效果。作為對照組，使用煮沸的樣品和未經(jīng)處理的樣品。煮沸處理在95℃下進行5分鐘，未經(jīng)處理的樣品懸浮在PBS(pH 7)中。細(xì)胞懸浮液用上面制得的三種類型電解的溶液處理。收集所處理的細(xì)胞并在LB瓊脂平板上培養(yǎng)過夜。接著，觀察到細(xì)胞裂解的發(fā)生。
圖2圖示了在37℃下培養(yǎng)細(xì)胞16小時后的瓊脂平板。參考圖2，盡管分別在培養(yǎng)皿(a)、(b)、(c)和(d)中的EAS、EBS、ETS和煮沸的樣品沒有生長，但是在培養(yǎng)皿(e)中的未經(jīng)處理的樣品(對照)卻生長了。在電解的溶液和煮沸的細(xì)胞中沒有觀察到菌落，表明大腸桿菌由于所有電解的溶液和煮沸而失去活性。然而，不確定是否所有細(xì)胞都被分裂，其通過下面的實時PCR來鑒定。
為了鑒定細(xì)胞是否被分裂，進行實時PCR。如果細(xì)胞膜被裂解，那么源于細(xì)胞的基因可以被實時PCR分析。為了保證實時PCR的準(zhǔn)確性和再現(xiàn)，分析偏差由在LightCycler development內(nèi)的三次重復(fù)來確定。實時PCR曲線用于量化源于分裂的細(xì)胞的基因。圖3為當(dāng)其中用電解的溶液處理細(xì)胞所得到的溶液用作模板進行實時PCR時，所得到的實時PCR曲線。通過測量擴增的DNA的量，這些曲線圖示了標(biāo)繪在縱軸的初始模板拷貝數(shù)和標(biāo)繪在橫軸的交點中的循環(huán)數(shù)。如圖3所示，DNA的量相對于循環(huán)數(shù)具有對數(shù)(log)形式。閾循環(huán)數(shù)Ct為對數(shù)線相交于橫向閾線的點。所有樣品中目標(biāo)的量在交叉點的Ct是相等的。即，如果其中目標(biāo)量達(dá)到某水平的循環(huán)數(shù)小，那么表明初始DNA的量大，并且如果循環(huán)數(shù)大，那么表明初始DNA的量小。對數(shù)期(log phase)的擴增過程由下面的方程式表示Ct＝-(1/logE)logT0+(logK/logE)。
在該方程式中，T0為目標(biāo)的初始量，K為交叉點，E為擴增的效率。Ct為測量值，T0為由實驗者確定的標(biāo)準(zhǔn)初始濃度。發(fā)明人用Ct值推測源于分裂的細(xì)胞的核酸濃度。比較五種細(xì)胞裂解方法的結(jié)果，觀察到顯著性差異?；贑t曲線，核酸的量按照下面的順序增加EBS處理的細(xì)胞＞煮沸的細(xì)胞＞ETS處理的細(xì)胞＞對照＞EAS處理的細(xì)胞(見表1)。
表1在PBS中未稀釋的樣品和1/10稀釋的懸浮液的Ct值

在表1中，“-”表示沒有Ct值并且對照表示未經(jīng)處理的樣品。
如表1所示，用EBS處理的未稀釋樣品的核酸初始濃度比煮沸的樣品高。這些數(shù)據(jù)表明在所試驗的方法中，EBS處理是最有效的細(xì)胞裂解方法。
而且，實驗室芯片證明了擴增的PCR產(chǎn)物的特異性。另外，EBS處理的樣品的PCR產(chǎn)物濃度高于其它樣品，這也表明EBS處理比常用的煮沸處理更有效。
圖4圖示了在電泳后利用Agilent 2100 Bioanalyzer，分析通過進行實時PCR得到的PCR產(chǎn)物的結(jié)果，該PCR中用電解的溶液處理細(xì)胞得到的溶液用作模板。在圖4中，煮沸處理在95℃進行5分鐘。參考圖4，從EAS處理的細(xì)胞的PCR產(chǎn)物均為二聚體，表明PCR沒有很好地進行。盡管在所有EAS處理的樣品中都沒有觀察到PCR產(chǎn)物，但是在作為對照樣品的未稀釋的樣品和1/10稀釋的樣品中觀察到PCR產(chǎn)物。假定因為EAS包括PCR抑制劑，所以在EAS處理的樣品中沒有觀察到PCR產(chǎn)物。因而，用含有EAS的ETS處理的樣品的PCR產(chǎn)物的濃度低于EBS處理的樣品(見圖5)。圖5為將圖4的結(jié)果圖解為PCR產(chǎn)物的濃度圖。
從上述結(jié)果中可以確定，對于生物分析如PCR，用陰極室中產(chǎn)生的EBS處理對裂解細(xì)胞是最有效率的，并且能夠有效地完成生物分析如PCR。
實施例2在電解室中直接細(xì)胞裂解在本實施例中，細(xì)胞被注入到電解室中，并在原位產(chǎn)生電解的溶液，隨后確定細(xì)胞裂解效率。
(1)電解裝置使用圖1A、1B和1C所示的電解裝置。圖1A的電解裝置如實施例1所述。為了生產(chǎn)用于細(xì)胞裂解的氫氧離子，在室溫下用5V的DC電壓電解包含大腸桿菌的12ml的10mM或100mM NaCl溶液1或3分鐘。
圖1B的電解裝置與圖1A的電解裝置相同，除了沒有包括分隔陽極室和陰極室的隔板。電極間距為2cm。圖1C的電解裝置與圖1B的電解裝置相同，除了它被放置于載物玻片(Corning，USA)上，以便可能通過固定于顯微鏡的數(shù)字照相機觀察。電極安裝在壁的邊緣，電極間距為4cm。利用這些裝置，通過施加5V的DC電壓電解包含100mM NaCl的500μl CHO細(xì)胞懸浮液30秒。
(2)分析方法如實施例1中所述，通過實時PCR和擴增產(chǎn)物的分析，觀察在電解后馬上收集到的細(xì)胞裂解液。顯微分析利用裝有數(shù)字照相機(Photometrics Inc.，USA)的Nikon Eclipse TE 300熒光顯微鏡(Nikon，Japan)攝取圖像。
(3)結(jié)果圖6圖示了利用通過在所使用的鹽濃度、電流和時間條件下電解得到的細(xì)胞裂解液作為模板，進行的實時PCR擴增的結(jié)果。在圖6中，[1]～[4]為利用具有NationTM膜的電解裝置得到的結(jié)果，[5]～[8]為利用沒有膜的電解裝置得到的結(jié)果。[1]為100mM NaCl溶液電解1分鐘，[2]為100mM NaCl溶液電解3分鐘，[3]為10mM NaCl溶液電解1分鐘，[4]為10mM NaCl溶液電解3分鐘，[5]為100mM NaCl溶液電解1分鐘，[6]為100mM NaCl溶液電解3分鐘，[7]為10mM NaCl溶液電解1分鐘，[8]為10mM NaCl溶液電解3分鐘，[9]為對照。
表2表示源于利用通過在所使用的鹽濃度、電流和時間條件下電解得到的細(xì)胞裂解液作為模板，得到的實時PCR擴增曲線的Ct值。
表2在各種條件下的Ct值


如表2所示，[4](含有膜，10mM NaCl，施加電流3分鐘)表示最強的信號和最低的Ct值，表明細(xì)胞在[4]的條件下被最有效地裂解。該結(jié)果表明，在中心具有膜的裝置內(nèi)，EBS中的細(xì)胞裂解比EBS和EAS的混合物中的細(xì)胞裂解更有效。因為NafionTM膜防止從陽極和陰極電解的溶液混合，EAS和EBS在電解裝置中是分隔的。
圖7圖示了通過電泳分析最終PCR產(chǎn)物的結(jié)果，該PCR產(chǎn)物是利用通過在各種條件下電解得到的細(xì)胞裂解液作為模板，進行PCR得到的。如圖7所示，僅得到擴增產(chǎn)物，而沒有得到引物二聚體。圖8為在電泳后利用Agilent2100 Bioanalyzer，分析PCR產(chǎn)物圖，該PCR產(chǎn)物是利用圖6中通過電解得到的細(xì)胞裂解液作為模板，進行實時PCR得到的。
圖9圖示了利用固定于顯微鏡上的數(shù)字照相機，通過施加5V的DC電壓和1mA的電流，連續(xù)觀察載物玻片的加樣孔上的CHO細(xì)胞的結(jié)果。如圖9所示，細(xì)胞在非常短的時間內(nèi)變形并最后分裂。圖9的結(jié)果證明，用電化學(xué)方法產(chǎn)生的氫氧離子快速地裂解細(xì)胞。細(xì)胞裂解發(fā)生在產(chǎn)生氫氧離子的陰極附近。
實施例3通過電解得到的細(xì)胞裂解液的中和在本實施例中，使用了如圖1A所示具有陽極室、陰極室和安裝在陽極室和陰極室之間的隔板的電解裝置，并在陽極室和陰極室中電解各種溶液，然后觀察所得到的溶液的pH變化。
圖10圖示了當(dāng)向陽極室和陰極室分別加入10ml的100mM NaCl水溶液(初始pH＝6.0)，并施加5V的DC電壓時，觀察pH隨時間變化的結(jié)果。在60秒后，陽極室溶液和陰極室溶液的1∶1混合物的pH為9.49。因而，可以看出，當(dāng)陽極室溶液和陰極室溶液按照1∶1的比例混合時，該混合物沒有中和到初始pH，而是變?yōu)閴A性。
圖11圖示了當(dāng)向陽極室和陰極室分別加入200ml的100mM MgSO4水溶液(初始pH＝5.75)和200ml 100mM NaCl水溶液(初始pH＝5.75)，并施加10V的DC電壓時，觀察pH隨時間變化的結(jié)果。在300秒后，陽極室溶液和陰極室溶液的1∶1混合物pH為5.75，其與初始pH相同。
圖12圖示了當(dāng)向陽極室和陰極室分別加入200ml的100mM Na2SO4水溶液(初始pH＝5.82)和200ml的100mM NaCl水溶液(初始pH＝5.82)，并施加10V的DC電壓時，觀察pH隨時間變化的結(jié)果。在300秒后，陽極室溶液和陰極室溶液的1∶1混合物pH為5.82，其與初始pH相同。
圖10的結(jié)果可以由如下所述的反應(yīng)原理解釋，但是本發(fā)明不束縛于具體的原理。
如下面的反應(yīng)圖解所示，在電解含有NaCl的溶液過程中，陽極室中的水被還原產(chǎn)生氯，陰極室中的水被還原產(chǎn)生氫氣和氫氧離子。
陽極反應(yīng)(l)
陰極反應(yīng)(2)
陽極室中產(chǎn)生的氯適當(dāng)?shù)厝芙庠谒?，并與水發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生HOCl和HCl。陽極室中產(chǎn)生的HOCl消毒，而陰極室中產(chǎn)生的氫氧離子象堿性細(xì)胞裂解中的氫氧化鈉一樣有效地使細(xì)胞分裂。即，HOCl沒有使細(xì)菌分裂而是殺死它們，而氫氧化物使細(xì)胞分裂。
另外，如上面的反應(yīng)圖解所示，陽極室中產(chǎn)生的H+離子由于溶解在水中的Cl2氣而產(chǎn)生，而氫氧化物由于水的還原而產(chǎn)生。因此，產(chǎn)生了比H+離子多的氫氧離子。因而，當(dāng)通過電解得到的陽極室溶液和陰極室溶液按照1∶1的比例混合時，該混合物變得比初始溶液具有更強的堿性。
同時，如圖11和圖12所示，當(dāng)陽極室包含標(biāo)準(zhǔn)氧化電位比水低的離子如MgSO4或Na2SO4時，則在其中產(chǎn)生氧氣和2H+離子。并且，當(dāng)包含標(biāo)準(zhǔn)還原電位比水低的離子如Na+離子的溶液用于陰極室時，則水被電解產(chǎn)生氫氣和2OH-離子。因而，陽極室和陰極室中產(chǎn)生相同當(dāng)量的2H+離子和2OH-離子，通過按照1∶1的比例混合各室的電解的溶液，可以得到中性溶液。
因為許多生物分析過程在中性pH下具有高效率，所以具體優(yōu)選包含標(biāo)準(zhǔn)氧化電位比水低的離子的溶液用于陽極室，包含標(biāo)準(zhǔn)還原電位比水低的離子的溶液用于陰極室。在此情況下，從上述實施例中顯而易見，能夠減少可能潛在地抑制生物過程如PCR的物質(zhì)如HOCl或Cl-的產(chǎn)生。而且，雖然為了通過分別控制陰極室溶液和陽極室溶液的流速得到中性溶液，在電解裝置中常需要兩個泵，但是在本發(fā)明中可以僅使用一個流速控制泵，因為僅僅通過混合陰極室中電解的溶液和陽極室中電解的溶液，就可以獲得中性溶液(見圖1F)。
實施例4包括在陽極室中的電解質(zhì)對于細(xì)胞裂解和/或PCR的影響在本實施例中，在圖1A所示的電解裝置中，將在100mM NaCl溶液中含有108細(xì)胞/ml的大腸桿菌細(xì)胞的溶液放入到陰極室中，并將各10ml 100mM NaCl溶液和100mM Na2SO4溶液放入到陽極室中，然后通過施加5V的DC電壓進行電解3分鐘。在電解后，從陽極室和陰極室中取出等量的樣品并混合。利用該混合物作為模板進行PCR。根據(jù)實施例1的(3)中所述的方法進行PCR，并且使用Hot-start Taq DNA聚合酶(Roche Diagnostics)作為聚合酶。
圖13圖示了在陽極室中利用各種電解質(zhì)引起電解，及混合陽極電解的溶液和陰極電解的溶液之后，進行實時PCR的結(jié)果。如圖13所示，當(dāng)陽極室包含Na2SO4溶液時，與當(dāng)陽極室包含NaCl時相比，核酸的初始濃度和最終擴增的核酸的濃度更高。結(jié)果表明，當(dāng)陽極室包含標(biāo)準(zhǔn)氧化電位比水低的物質(zhì)時，在隨后的生物分析和電解的溶液的中和過程中，它更有利。
根據(jù)本發(fā)明的微流體器件，可以通過施加電流，同時將細(xì)胞遷移到微通道中進行電解，從而容易裂解細(xì)胞，而不利用單獨的細(xì)胞裂解溶液。因而，當(dāng)使用微流體器件時，因為不需要引入細(xì)胞溶液的裝置，所以它結(jié)構(gòu)簡單并且在裝置小型化中是有利的。而且，微流體器件可以用于容易地裂解細(xì)胞。
根據(jù)裂解細(xì)胞或病毒的方法，本發(fā)明的細(xì)胞或病毒可以被容易并有效地裂解，并且可以制得具有適于隨后的生物分析的pH和電解質(zhì)的細(xì)胞裂解液。
盡管己經(jīng)參考其示例性的實施方案具體地說明和描述了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解可以進行不背離如權(quán)利要求所界定的本發(fā)明的實質(zhì)和范圍的各種形式和細(xì)節(jié)上的變化。
序列表<110>三星電子株式會社(Samsung Electronics Co.Ltd.)<120>包括用于細(xì)胞裂解的電解裝置的微流體器件及利用它電化學(xué)裂解細(xì)胞的方法<130>PN057612<160>2<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>正向引物<400>1agtgtggatt cggcactcct20<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反向引物<400>2gagttcttcttctaggggac ctg 2權(quán)利要求
1.一種包括用于細(xì)胞裂解的電解裝置的微流體器件，該電解裝置包括陽極室、陰極室和隔板，其中該隔板安裝在陽極室和陰極室之間，陽極室包括陽極室溶液的入口和出口及電極，并且陰極室包括陰極室溶液的入口和出口及電極。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的微流體器件，其中所述陽極室的出口和陰極室的出口接在一個通道上。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的微流體器件，其中所述陽極室溶液包含標(biāo)準(zhǔn)氧化電位比水低的化合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的微流體器件，其中所述化合物包括至少一種選自NO3-、F-、SO42-、PO43-和CO32-的離子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的微流體器件，其中所述陽極室的出口和陰極室的出口是分隔的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的微流體器件，其中所述陽極室溶液包含標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電位比水低或高的化合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的微流體器件，其中所述陽極室溶液包括至少一種選自Cl-、NO3-、F-、SO42-、PO43-和CO32-的離子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的微流體器件，其中所述陰極室溶液包含細(xì)胞或病毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的微流體器件，其中所述陰極室溶液包含標(biāo)準(zhǔn)還原電位比水低的化合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的微流體器件，其中所述溶液包括至少一種選自Na+、K+、Ca2+、Mg2+和Al3+的離子。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的微流體器件，其中所述隔板允許電流穿過并隔離由于電解在各室中產(chǎn)生的離子和氣體。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的微流體器件，其中所述電極選自Pt、Au、Cu和Pd。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的微流體器件，還包括向所述陽極室引入和從陽極室排出溶液的泵，及向陰極室引入和從陰極室排出溶液的泵。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的微流體器件，還包括向所述陽極室和陰極室引入及從陽極室和陰極室排出溶液的泵。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的微流體器件，包括包含所述電解裝置的細(xì)胞裂解室、核酸分離室、核酸擴增室和檢測室。
16.一種利用包括用于細(xì)胞裂解的電解裝置的微流體器件裂解細(xì)胞或病毒的方法，該電解裝置包括陽極室、陰極室和隔板，其中該隔板安裝在陽極室和陰極室之間，陽極室包括陽極室溶液的入口和出口及電極，陰極室包括陰極室溶液的入口和出口及電極，所述方法包括經(jīng)過陽極室的入口，將包含標(biāo)準(zhǔn)氧化電位比水低或高的化合物的陽極室溶液引入到陽極室中；經(jīng)過陰極室的入口，將包含細(xì)胞或病毒和標(biāo)準(zhǔn)還原電位比水低的化合物的陰極室溶液引入到陰極室中；及通過向包括在陽極室和陰極室中的電極施加電流，在陽極室和陰極室中引起電解而裂解細(xì)胞。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述標(biāo)準(zhǔn)氧化電位比水低的化合物包括選自下列中的至少一種選自NO3-、F-、SO42-、PO43-和CO32-的離子。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述標(biāo)準(zhǔn)氧化電位比水高的化合物包含Cl-。
19.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述標(biāo)準(zhǔn)還原電位比水低的化合物包括至少一種選自Na+、K+、Ca2+、Mg2+和A13+的離子。
20.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述隔板允許電流穿過并分隔由于電解在各室中產(chǎn)生的離子。
21.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述電極選自Pt、Au、Cu和Pd。
22.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，還包括，在所述電解之后，經(jīng)過出口從陽極室中排出酸性溶液；經(jīng)過出口從陰極室中排出堿性細(xì)胞或病毒裂解液；及通過混合酸性溶液和堿性細(xì)胞或病毒裂解液中和細(xì)胞或病毒裂解液。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中從所述陽極室排出的酸性溶液和從陰極室排出的堿性細(xì)胞或病毒裂解液按照1∶1體積比混合。
24.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述微流體器件還包括向陽極室引入和從陽極室排出溶液的泵，及向陰極室引入和從陰極室排出溶液的泵。
25.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述微流體器件還包括向陽極室和陰極室引入及從陽極室和陰極室排出溶液的泵。
26.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述微流體器件包括含有電解裝置的細(xì)胞裂解室、核酸分離室、核酸擴增室和檢測室。
全文摘要
本發(fā)明提供一種包括用于細(xì)胞裂解的電解裝置的微流體器件，及利用它電化學(xué)裂解細(xì)胞的方法，所述電解裝置包括陽極室、陰極室和隔板，其中該隔板安裝在陽極室和陰極室之間，陽極室包括陽極室溶液的入口和出口及電極，陰極室包括陰極室溶液的入口和出口及電極。
文檔編號B02C19/00GK1818051SQ200510131609
公開日2006年8月16日 申請日期2005年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月17日
發(fā)明者李憲周, 金俊鎬, 劉昌恩, 林熹均, 黃奎淵, 馬秀旻, 閔畯泓 申請人:三星電子株式會社