專利名稱：新的香瓜植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的植物，具體地涉及能夠產(chǎn)生具有令人愉悅的新味道的果實的香瓜植物。特別地，本發(fā)明的香瓜植物的果實具有與目前商業(yè)甜香瓜的果實相比改變的有機酸含量和較低的pH，并具有高糖含量。
背景技術(shù)：
香瓜(melon，Cucumis melo L.)是一種全球種植的商業(yè)作物。香瓜(Cucumis melo)是葫蘆科(Cucurbitaceae)的成員。葫蘆科包括大約90個屬和700至760個種，大多數(shù)為熱帶植物。該科包括西葫蘆(pumpkin)、南瓜(squash)、葫蘆(gourd)、西瓜(watermelon)、絲瓜(loofah)及幾種雜草。香瓜包括種類十分繁多的栽培品種，這些品種產(chǎn)生具有不同形狀、外觀和果肉顏色的果實。商業(yè)香瓜一般產(chǎn)生甜的果實，例如稱作Charentais、羅馬甜瓜(cantaloupe)、蜜瓜(honeydew)、amarello、哈密瓜(Piel de sapo)、Kirkagak、Hamy、Ananas、Galia、Oriental，它們通常作為甜點水果食用。香瓜也包括在中東至遠(yuǎn)東于沙拉、烹調(diào)、腌漬中食用的、不甜的商業(yè)栽培品種，例如，Alficoz、Faqqous、Chito、Conomon(Pitrat等(2000)Eucarpiameeting Proceedings29-36)。香瓜果實的味道和香氣由多種因素確定，這些因素包括糖類、香氣揮發(fā)物、游離氨基酸、有機酸、pH和可溶性礦物質(zhì)(Wang等，(1996)J.Agric.Food Chem.44210-216)。四種主要味道(甜、酸、苦、咸)中，甜味被認(rèn)為是良好口味的香瓜果實的一個非常重要的成分。在商業(yè)香瓜果實中，甜味主要由高水平的蔗糖產(chǎn)生(Burger等(2002)J.Amer.Soc.Hort.Sci.127(6)938-943)。蔗糖在果實發(fā)育結(jié)束時于成熟過程中積累(Shaffer等(1987)Phytochemistry 261883-1887)。香瓜果實最初也積累己糖，主要是果糖和葡萄糖，這些糖是主要的還原糖(Stepanski等(1999)Genetic Resources and Crop Evolution 4653-62)。香瓜果實中的一個重要味道成分是甜味，其主要是糖類積累的結(jié)果。甜味不僅與總的糖含量有關(guān)，還與糖的類型有關(guān)。例如，1克葡萄糖的甜味等于0.7克蔗糖的甜味；1克果糖的甜味等于1.7克蔗糖的甜味；1克轉(zhuǎn)化糖，即，自1克蔗糖產(chǎn)生的葡萄糖加果糖，的甜味等于1.3克蔗糖的甜味(J.A.BABOR等，J.IBARZ(1935)Quimica General Moderna)。
甜的香瓜果實的果肉具有通常高于6.0的pH，但是也已知存在具有低得多的pH，低至5.0以下的香瓜種質(zhì)(accession)。這種低pH遍布于許多不同的香瓜類型中，例如Faqqous、Chito、Conomon、Momordica、Agrestis(Stepanski等)。在這些情況中的大多數(shù)情況下，這些類型的香瓜結(jié)合了低pH和低糖含量，例如蔗糖含量(Stepanski等)。這些果實在未經(jīng)適當(dāng)處理或烹調(diào)的情況下通常不能生吃，并且一些情況下它們甚至是苦的。在這些具有低pH的香瓜種質(zhì)中，大多數(shù)香瓜種質(zhì)的中果皮，果實的可食用部分，占果實全部的一小部分，而種子腔和胎座占據(jù)了果實總鮮重的大部分。這與作為甜點的甜香瓜不同，在甜香瓜中中果皮占果實的主要部分。此外，在許多情況下，具有低pH的香瓜的果實體積或重量低于商業(yè)可接受的范圍。
一些香瓜的果肉具有酸味(Kubicki(1962)Genetica Polonica 3265-274)。導(dǎo)致這種酸味的原因仍然不清楚，但其已經(jīng)與果肉中的低pH關(guān)聯(lián)(US 5,476,998和Danin-Poleg等(2002)Euphytica 125373-384)。也已經(jīng)報道了負(fù)責(zé)酸味(So)和pH的單基因，但是不清楚它們的遺傳相關(guān)性(Danin-Poleg等)。
已經(jīng)嘗試過生產(chǎn)結(jié)合了酸味和甜味的香瓜果實。例如，已經(jīng)報道了基于阿拉伯野生品種的Najd香瓜(Ibrahim和Alzeir(1992)Hortscience 27276-277)。US 5,476,998也描述了具有酸味的香瓜，其具有4.8的平均pH值和大約11的總可溶性內(nèi)容物。US 5,476,998中的香瓜來源于MR-1，MR-1也稱作PI124111(Thomas，Eucarpia’92pp142)，是C.melo Var.Momordica(Roxburg)。這種香瓜的果實表現(xiàn)出低pH(Danin-Poleg等)。這種香瓜變種也包括差的果實性狀，例如成熟時薄皮漲裂、非常粉質(zhì)的、不香不甜的果肉以及非常大的呼吸躍變行為。這些不期望的性狀難于通過育種除去，因此可以預(yù)期到，從該品種開發(fā)商業(yè)產(chǎn)品將是漫長而艱難的。因此，對于產(chǎn)生具有可替代的或改良的口味的果實的香瓜，仍存在需要。尤其是，仍需要具有新的器官感覺特征和香氣的組合的香瓜果實。
發(fā)明概述本發(fā)明解決了對具有可替代的或改良的口味的香瓜果實的需要。因此，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生具有新的有機酸含量和組成、pH及糖含量和組成的組合的果實的香瓜植物。本發(fā)明還公開本發(fā)明植物及其果實的制備和使用方法。
本申請的發(fā)明人已經(jīng)鑒定出在香瓜果實中有機酸的含量和組成有很大的變異性。尤其是，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)鑒定出，香瓜植物可以產(chǎn)生具有變化的檸檬酸含量及變化的檸檬酸和蘋果酸比率的果實。因此，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)將適當(dāng)含量的有機酸、低pH和期望的糖含量組合在香瓜果實中以獲得極為令人愉悅的新味道。
因此，一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生果實的香瓜植物，所述果實具有低pH及期望的檸檬酸與蘋果酸含量的組合，同時保持了或增加了目前在甜香瓜中觀察到的糖水平。一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生果實的香瓜植物，所述果實具有低pH和期望的檸檬酸和蘋果酸含量的組合并具有期望的蔗糖和己糖含量的組合。一個實施方案中，本發(fā)明提供能夠產(chǎn)生果實的香瓜植物，所述果實與目前的商業(yè)香瓜相比具有升高的檸檬酸含量和較低的pH。一個實施方案中，通過將低pH性狀引入不含所述性狀的香瓜植物中而獲得本發(fā)明香瓜植物。一個實施方案中，通過將低pH基因引入不含所述基因的香瓜植物中而獲得本發(fā)明香瓜植物。一個實施方案中，所述低pH基因可以從以NCIMB41202保藏號保藏在NCIMB的IND-35系獲得。因此，本發(fā)明公開包含低pH性狀并產(chǎn)生包含期望的有機酸含量和組成、pH及糖含量和組成的果實的香瓜植物。一個實施方案中，在保持果實中低水平的蘋果酸的同時，增加檸檬酸的含量。一個實施方案中，本發(fā)明香瓜植物的果實具有高的檸檬酸和蘋果酸比率。
一個實施方案中，本發(fā)明香瓜植物能夠產(chǎn)生具有等于或大于每100g鮮重(fwt)大約400mg的檸檬酸含量的果實。一個實施方案中，本發(fā)明香瓜植物能夠產(chǎn)生具有大約4.2至大約5.6的pH的果實。一個實施方案中，本發(fā)明香瓜植物能夠產(chǎn)生具有等于或大于每100g fwt大約5.0g的糖含量的果實。一個實施方案中，本發(fā)明香瓜植物能夠產(chǎn)生具有等于或大于每100g fwt大約7.0g的糖含量的果實。
一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生如下果實的香瓜植物，所述果實具有等于或大于每100g fwt大約400mg的檸檬酸含量、大約4.2至大約5.6的pH、以及等于或大于每100g fwt大約5.0g的糖含量。
一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生如下果實的香瓜植物，所述果實在成熟時包含a)每100g fwt大約400mg至大約1,200mg檸檬酸；b)大約4.2至大約5.6的pH；和c)每100g fwt大約5.0g至大約15.0g糖。
一個實施方案中，本發(fā)明植物的果實的檸檬酸含量是每100g fwt大約400mg至大約1,000mg檸檬酸。一個實施方案中，本發(fā)明香瓜植物產(chǎn)生可食用果實，該果實優(yōu)選為圓形或卵形，優(yōu)選重450克以上。本發(fā)明香瓜的果肉優(yōu)選是綠色、黃色、白色或橙色。
一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生具有尖酸提神的(tart-refreshing)酸味的、非常甜的多汁果實的香瓜植物，在本文中稱作“Citric+”植物或果實。這些果實包含高含量的檸檬酸和低pH、增加了酸味并提供了尖酸感覺，這可以覆蓋果實成熟早期的過于平淡和不良的味道。
一個實施方案中，本發(fā)明Citric+植物的果實在成熟時包含
a)每100g fwt大約600至大約1,200mg檸檬酸；b)大約4.2至大約5.1的pH；和c)每100g fwt大約5.0g至大約15.0g糖。
一個實施方案中，本發(fā)明植物的果實的檸檬酸含量是每100g fwt大約600mg至大約1,000mg檸檬酸。
一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生具有溫和果酸味的甜香果實的香瓜植物，在此稱作“Citric-”香瓜植物或果實。該果實包含相對高含量的檸檬酸和輕微低的pH。這種輕微低的pH造成果酸感覺，這種果酸感覺可以覆蓋果實成熟早期的其它仍然過于平淡和不良的味道。
一個實施方案中，本發(fā)明Citric-植物的果實在成熟時包含a)每100g fwt大約400至大約650mg檸檬酸；b)大約4.6至大約5.6的pH；和c)每100g fwt大約5.0g至大約15.0g糖。
一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生具有低pH和深橙色果肉的果實的香瓜植物。一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生具有大約4.5至大約5.6的pH的果實的香瓜植物，其中所述果實具有評定為4級或更高級的橙色果肉。
一個實施方案中，在生長于露天田間或塑料大棚(plastichouses)中并于成熟時收獲的香瓜植物果實上，測量本文描述的香瓜果實的特征。一個實施方案中，從成熟早期至成熟晚期(如本文描述的，第2-4階段)收獲果實。一個實施方案中，本發(fā)明果實在其蔗糖含量等于或大于每100g fwt 2g蔗糖時成熟。
一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生如下果實的香瓜植物，所述果實包含大約1.6至大約3.8的酸味和大約4.3至大約5.8的甜味(sugar savor)。一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生如下果實的香瓜植物，所述果實包含大約2.5至大約3.8的酸味和大約4.3至大約5.6的甜味。一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生如下果實的香瓜植物，所述果實包含大約1.6至大約3.0的酸味和大約5.2至大約5.8的甜味。一個實施方案中，由專家組，例如按本文實施例12中所述，測定所述酸味和甜味。一個實施方案中，所述果實包含本文所述的pH和檸檬酸含量。一個實施方案中，所述果實包含本文所述的pH、有機酸含量及組成和糖含量及組成。
一個實施方案中，本發(fā)明公開包含與低pH性狀共分離的DNA序列的香瓜植物。一個實施方案中，所述DNA序列是使用本文所述引物擴增本文所述DNA片段的模板。一個實施方案中，本發(fā)明公開該引物和使用這些引物擴增的DNA片段。一個實施方案中，本文所述DNA片段從所述植物的DNA使用本文所述的引物而擴增。該DNA片段用作低pH性狀的分子標(biāo)記。一個實施方案中，當(dāng)使用能夠鑒定CMAT141標(biāo)記的引物時，從所述植物的DNA擴增出大約168bp至大約178bp的DNA片段。一個實施方案中，當(dāng)使用能夠鑒定CMAT141標(biāo)記的引物時，擴增出168bp、173bp、169bp、172bp或178bp的DNA片段。一個實施方案中，當(dāng)使用能夠鑒定CMAT141標(biāo)記的引物時，擴增小于176bp的DNA片段。一個實施方案中，當(dāng)使用能夠鑒定CMAT141標(biāo)記的引物時，擴增小于175bp的DNA片段。一個實施方案中，當(dāng)使用能夠鑒定NE0585標(biāo)記的引物時，擴增大約218bp至大約253bp的DNA片段。一個實施方案中，當(dāng)使用能夠鑒定NE0585標(biāo)記的引物時，擴增230bp、232bp、218bp、229bp、234bp或239bp的DNA片段。一個實施方案中，當(dāng)使用能夠鑒定NE1746標(biāo)記的引物時，擴增大約121bp至大約145bp的DNA片段。一個實施方案中，當(dāng)使用能夠鑒定NE1746標(biāo)記的引物時，擴增124bp、127bp、133bp、142bp或145bp的DNA片段。
一個實施方案中，本發(fā)明公開包含如下DNA序列的香瓜植物，所述DNA序列是擴增指示所述植物中存在(酸性片段)或不存在(堿性片段)低pH性狀的DNA片段的模板。一個實施方案中，本發(fā)明公開包含如下DNA序列的香瓜植物，所述DNA序列是擴增與低pH性狀連鎖的堿性片段的模板，其中所述DNA序列與所述低pH性狀連鎖。一個實施方案中，所述香瓜植物包含位于低pH基因一側(cè)的這樣的DNA序列。一個實施方案中，所述香瓜植物包含位于低pH基因兩側(cè)的這樣的DNA序列。一個實施方案中，該植物的果實包含位于本文公開的范圍內(nèi)的pH。一個實施方案中，該植物的果實包含本文所述的糖含量和組成。一個實施方案中，該植物的果實包含本文所述的有機酸含量和組成。一個實施方案中，該植物的果實包含本文所述的pH、糖含量及組成和有機酸含量及組成。
一個實施方案中，本文所述的本發(fā)明果實的特征在果實達(dá)到成熟后保持穩(wěn)定。一個實施方案中，在果實達(dá)到成熟后，當(dāng)果實保留在植物上時，這些特征保持穩(wěn)定。一個實施方案中，當(dāng)果實被收獲并于收獲后被貯存時，這些特征保持穩(wěn)定。這使得可以減少收獲頻率以及可以貯存或運輸本發(fā)明的果實而不損失本發(fā)明果實的器官感覺特征和香氣。一個實施方案中，本發(fā)明果實的pH在果實達(dá)到成熟后保持穩(wěn)定。一個實施方案中，本發(fā)明果實的檸檬酸含量在果實達(dá)到成熟后保持穩(wěn)定。一個實施方案中，本發(fā)明果實的蘋果酸含量在果實達(dá)到成熟后保持穩(wěn)定。一個實施方案中，本發(fā)明果實的檸檬酸和蘋果酸比率在果實達(dá)到成熟后保持穩(wěn)定。一個實施方案中，本發(fā)明果實的pH和有機酸含量及組成在果實達(dá)到成熟后保持穩(wěn)定。一個實施方案中，這些特征在果實達(dá)到成熟后保持在本文所述的范圍內(nèi)。一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生果實的植物，所述果實的特征在果實保留于植物上時持續(xù)至少2天保持穩(wěn)定，一個實施方案中當(dāng)果實保留于植物上時所述特征持續(xù)至少3天保持穩(wěn)定，在一個實施方案中，當(dāng)果實保留于植物上時所述特征持續(xù)至少4天保持穩(wěn)定。一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生果實的植物，其中當(dāng)所述果實于20℃貯存時其特征持續(xù)至少5天保持穩(wěn)定，在一個實施方案中當(dāng)所述果實于20℃貯存時其特征持續(xù)至少7天保持穩(wěn)定，在一個實施方案中，當(dāng)所述果實于20℃貯存時其特征持續(xù)至少9天保持穩(wěn)定。在一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生果實的植物，其中當(dāng)所述果實在8-12℃貯存至少7天并之后于20℃貯存至少2天時其特征保持穩(wěn)定，在一個實施方案中，當(dāng)所述果實在8-12℃貯存至少12天并之后于20℃貯存至少2天時其特征保持穩(wěn)定，在一個實施方案中，當(dāng)所述果實在8-12℃貯存至少26天并之后于20℃貯存至少2天時其特征保持穩(wěn)定。一個實施方案中，本發(fā)明植物能夠產(chǎn)生長保存期限的果實(LSL)或中等保存期限的果實(MSL)。一個實施方案中，本發(fā)明植物能夠產(chǎn)生不轉(zhuǎn)色的(non-turning)或低轉(zhuǎn)色的(low turning)果實。一個實施方案中，本發(fā)明植物能夠產(chǎn)生無呼吸躍變(non-climacteric)的果實或低呼吸躍變的果實。
本發(fā)明還公開本發(fā)明香瓜植物的種子和其后代的種子，其中所述后代種子能夠產(chǎn)生本發(fā)明的植物。本發(fā)明還公開本發(fā)明香瓜植物的部分，例如，胚珠或花粉，以及本發(fā)明香瓜植物的果實。本發(fā)明還公開本發(fā)明香瓜植物的果實的果肉。本發(fā)明還公開本發(fā)明香瓜植物的果實的汁液。
本發(fā)明還公開本發(fā)明果實的果肉在鮮切產(chǎn)品(fresh cut product)中的應(yīng)用。本發(fā)明還公開本發(fā)明果實的汁液在軟飲料中的應(yīng)用。
本發(fā)明還公開增加植物的檸檬酸含量的方法，包括獲得第一香瓜植物；使所述第一香瓜植物與包含低pH性狀的第二香瓜植物雜交；獲得后代香瓜植物，確定所述后代植物的果實的pH和檸檬酸含量，選擇與所述第一香瓜植物的果實相比具有增加的檸檬酸含量的所述后代香瓜植物的果實。一個實施方案中，所述后代香瓜植物與所述第一香瓜植物的果實相比具有較低的pH。在一個實施方案中，該方法包括使用本文所述引物檢測本文所述的DNA片段。本發(fā)明還公開包含低pH性狀的香瓜植物在獲得本發(fā)明香瓜植物中的用途。一個實施方案中，包含低pH性狀的香瓜植物還具有積累相應(yīng)水平的糖，例如蔗糖的能力。一個實施方案中，包含低pH的香瓜植物積累高水平的檸檬酸。一個實施方案中，包含低pH的香瓜植物積累低水平的蘋果酸。一個實施方案中，包含低pH性狀的香瓜植物還具有積累相應(yīng)水平的糖例如蔗糖以及積累高水平的檸檬酸及積累低水平的蘋果酸的能力。一個實施方案中，包含低pH的香瓜植物是IND-35系的植物或其后代。
本發(fā)明還公開產(chǎn)生本發(fā)明植物的種子的方法，包括獲得本發(fā)明的植物、使所述植物自花授粉或使所述植物與另一香瓜植物雜交、和收獲后代種子。本發(fā)明還公開營養(yǎng)繁殖本發(fā)明的香瓜植物的方法。本發(fā)明還公開生產(chǎn)果實的方法，包括種植本發(fā)明的植物、使所述植物生長和收獲果實，其中所述果實包含本文所述的特征。該方法還包括貯存所述果實，例如按本文所述的進行貯存。該方法還包括運輸所述果實。一個實施方案中，本文所描述的所述果實的特征在所述果實的貯存期間保持穩(wěn)定。一個實施方案中，本文所描述的所述果實的特征在所述果實的貯存期間保持穩(wěn)定。一個實施方案中，本發(fā)明植物是自交系、雜種、雙單倍體或營養(yǎng)繁殖的克隆。
本發(fā)明因此提供香瓜果實，所述果實提供令人愉悅的酸成分但避免了澀味。這將香瓜的味道增加或補充至其最大的可能性。這些有機酸含量及低pH與高糖的組合為果肉食用或鮮切或鮮果汁工業(yè)提供了新的吸引人的味道種類和類型。果肉中的低pH還防止鮮切工業(yè)和果汁工業(yè)加工中的細(xì)菌污染。
定義性狀特征或表型。例如，在本發(fā)明上下文中，低pH性狀使香瓜果實的果肉具有低pH，例如大約4.2至大約5.6的pH。性狀可以以顯性或隱性方式，或以部分的或不完全的顯性方式遺傳。性狀可以是單基因的或多基因的，或者也可以由一個或多個基因與環(huán)境的相互作用而導(dǎo)致。
單基因的由單個基因座決定的。
多基因的由多于一個基因座決定的。
顯性在雜合或純合狀態(tài)下導(dǎo)致完全的表型顯現(xiàn)。
隱性僅在以純合狀態(tài)存在時才表現(xiàn)出自己。
部分或不完全顯性當(dāng)以雜合狀態(tài)存在時確定了純合狀態(tài)時或該性狀不存在時的表型的中間表型。
回交回交是雜種后代重復(fù)地與親本之一雜交的過程。
基因座染色體上包含對性狀產(chǎn)生貢獻(xiàn)的基因的區(qū)域。
遺傳連鎖由于基因在同一染色體上位置緊鄰而導(dǎo)致特征在遺傳上相聯(lián)。通過基因座之間的重組百分?jǐn)?shù)測定(厘摩，cM)。
數(shù)量性狀基因座(QTL)數(shù)量性狀基因座(QTL)指控制在一定程度上可以用數(shù)字來表示的性狀的遺傳座位，其中所述性狀通常是連續(xù)分布的。
等基因的除了可能因存在或不存在基因、賦予性狀的基因座或異源DNA序列而不同外，在遺傳上相同的植物。
標(biāo)記輔助的選擇指通過從植物檢測一個或多個核酸，在一個或多個植物中選擇一個或多個期望性狀的過程，其中所述核酸與所述期望性狀相關(guān)。
雙單倍體單倍體(單染色體)狀況的基因組的加倍(例如通過花藥培養(yǎng)或小孢子培養(yǎng))，產(chǎn)生完全純合的植物。
“測交”植物用于以遺傳方式表征待測植物的性狀的植物。典型地，待測植物與“測交”植物雜交，評定雜交后代中所述性狀的分離比率。
基因遺傳單位?；蛭挥谌旧w上的固定基因座，并且可以存在一系列的稱作等位基因的可變形式。
等位基因由于位于同源染色體的相同基因座而可在遺傳上相互替代的一對或一系列基因形式中的一種形式。
純合在同源染色體上的一個或多個相應(yīng)基因座上具有相象的等位基因。
雜合在同源染色體上的一個或多個相應(yīng)基因座上具有不相象的等位基因。
低pH基因當(dāng)在植物基因組中存在時導(dǎo)致所述植物的果實的果肉與不含所述基因的植物相比具有較低pH的基因。
低pH香瓜植物包含低pH性狀的香瓜植物。一個實施方案中，低pH香瓜植物的果實的pH是大約4.2至大約5.6。
香瓜(Cucumis melo L)也稱作C.melo或melon。
腔指含有種子和母本組織的香瓜果實的中心。
可溶性固體指果實組織中發(fā)現(xiàn)的固體物質(zhì)的百分?jǐn)?shù)，其中絕大多數(shù)是糖。
呼吸躍變/無呼吸躍變見例如Watkins(2002)“乙烯合成、作用模式、結(jié)果和控制”，Michael Knee(編)，《Fruit Quality and itsBiological Basis》，Sheffield Academic Press，Sheffield，UK.第8章，pp.180-224，尤其是第181頁，第8.2.1節(jié)，頭2段中的定義。
轉(zhuǎn)色香瓜轉(zhuǎn)色(turning)指香瓜果實在達(dá)到成熟時果皮顏色的明顯改變，例如在Galia型香瓜中由綠變黃，或者在Charentais型香瓜中由灰變奶黃色果皮，而不轉(zhuǎn)色的和低轉(zhuǎn)色的香瓜的果實的果皮顏色在成熟后不發(fā)生鮮明的變化，例如在Piel de Sapo型香瓜中黃色成分增加。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供能夠產(chǎn)生具有新的味道的果實的香瓜植物。具體地，本發(fā)明提供能夠產(chǎn)生如下果實的香瓜植物，所述果實具有新的有機酸含量、pH和糖含量的組合。本申請的發(fā)明人已經(jīng)鑒定出香瓜果實含有不同水平的有機酸，例如檸檬酸。本申請發(fā)明人還鑒定出香瓜果實含有不同的相對檸檬酸和蘋果酸含量。此外，本申請發(fā)明人還確定了，通過在甜香瓜背景中引入低pH性狀，可以在果實中獲得pH的降低和檸檬酸含量的增加，從而進一步擴展了操作香瓜果實味道的能力。在一個實施方案中，本發(fā)明香瓜果實具有低含量的蘋果酸。因此，本發(fā)明公開香瓜植物，所述植物產(chǎn)生如本文所述的具有升高的檸檬酸含量和較低的pH的果實。一個實施方案中，在本發(fā)明植物的果實中觀察到的糖水平保持在目前可獲得的甜香瓜中存在的水平上或者有增加。因此，本發(fā)明植物能夠產(chǎn)生具有新的令人愉悅的味道的果實。本文所述的pH、檸檬酸和蘋果酸含量、及糖含量的測定按照實施例1至5所示進行。本文中表1A和1B公開本發(fā)明的代表性香瓜植物及其果實。
一個實施方案中，本發(fā)明香瓜植物能夠產(chǎn)生具有等于或大于每100g鮮重(fwt)大約400mg檸檬酸含量的果實。一個實施方案中，本發(fā)明香瓜植物能夠產(chǎn)生具有大約4.2至大約5.6的pH的果實。一個實施方案中，本發(fā)明香瓜植物能夠產(chǎn)生具有等于或大于每100g fwt大約5.0g糖含量的果實。一個實施方案中，本發(fā)明公開能產(chǎn)生如下果實的香瓜植物，所述果實具有等于或大于每100g鮮重(fwt)大約400mg的檸檬酸含量、大約4.2至大約5.6的pH、及等于或大于每100g fwt大約5.0g的糖含量。
一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生如下果實的香瓜植物，所述果實在成熟時包含a)每100g fwt大約400mg至大約1,200mg的檸檬酸；b)大約4.2至大約5.6的pH；和c)每100g fwt大約5.0g至大約15.0g的糖。
在一個實施方案中，所述果實包含每100g fwt大約400mg至大約1,000mg檸檬酸。一個實施方案中，所述果實包含每100g fwt大約450mg至大約950mg檸檬酸，一個實施方案中，包含每100g fwt大約475mg至大約900mg檸檬酸。一個實施方案中，所述果實具有大約4.3至大約5.4的pH，一個實施方案中，具有大約4.4至大約5.1的pH。一個實施方案中，所述果實包含每100g fwt大約5.5g至大約13.0g糖。一個實施方案中，所述果實包含每100g fwt大約7.0g至大約15.0g糖。
一個實施方案中，在所述植物的果實中檸檬酸與蘋果酸的比大于4.4，一個實施方案中，大于5，一個實施方案中，大于10。一個實施方案中，在所述植物的果實中檸檬酸與蘋果酸的比小于450，一個實施方案中，小于200，一個實施方案中，小于150。一個實施方案中，所述植物的果實包含每100g fwt小于大約85mg的蘋果酸，一個實施方案中每100g fwt小于大約75mg的蘋果酸。
一個實施方案中，所述植物的果實中蔗糖與己糖的比為大約1∶1，一個實施方案中為大約1∶1至大約1∶2，一個實施方案中為大約1∶1至大約2∶1。
一個實施方案中，所述植物的果實的果肉為橙色、白色、綠色或黃色。一個實施方案中，所述果實可以新鮮食用。一個實施方案中，所述植物的果實的中果皮占鮮果總重的50％以上。
一個實施方案中，所述香瓜植物包含低pH性狀。一個實施方案中，所述低pH性狀可以從IND-35系植物或所述IND-35系的后代獲得，其中該IND-35系植物的代表性種子以保藏號NCIMB41202保藏。一個實施方案中，所述低pH性狀在所述植物中是純合的或是雜合的。
本發(fā)明一個實施方案中，公開稱作“Citric+”植物的香瓜植物。該植物能夠產(chǎn)生具有尖酸提神的酸味的、非常甜的多汁果實。該果實含有高含量的檸檬酸和低pH，增加了酸味并提供了尖酸感覺。這通過高糖含量彌補，在一個實施方案中，通過升高水平的還原糖(葡萄糖和果糖)彌補。高還原糖含量在成熟早期階段尤其顯著。這種不可能由目前現(xiàn)有的甜香瓜獲得的、尖酸味和甜味的組合得到消費者的喜愛。該尖酸提神的酸甜香瓜組合滿足了此需要。這種果味的尖酸感覺也覆蓋了成熟早期果實的仍過于平淡和不良的口味。一個實施方案中，Citric+植物一般通過將低pH性狀例如來自IND-35系的低pH性狀引入Oriental香瓜背景中而獲得。在一個實施方案中，根據(jù)一個或多個以下標(biāo)準(zhǔn)來選擇所述Oriental香瓜背景高檸檬酸含量、低蘋果酸含量、高檸檬酸與蘋果酸含量比、高糖含量、高己糖含量、高己糖與蔗糖比率、高汁液。引入低pH性狀的過程中，保持對以上特征的仔細(xì)選擇直到獲得期望的后代。
例如，實施例9、10和11描述該植物的構(gòu)建。也可以根據(jù)期望特征篩選可替代的香瓜植物，并用作本文所述的起始材料。
一個實施方案中，本發(fā)明Citric+植物的果實在成熟時包含a)每100g fwt大約600至大約1,200mg檸檬酸；b)大約4.2至大約5.1的pH；和c)每100g fwt大約5.0g至大約15.0g糖。
一個實施方案中，果實包含每100g fwt大約600至大約1,000mg檸檬酸。一個實施方案中，果實包含每100g fwt大約650至大約950mg檸檬酸。
一個實施方案中，果實的pH是大約4.4至大約5.0。
一個實施方案中，所述果實包含每100g fwt大約7.0g至大約13.0g糖。一個實施方案中，所述植物的果實中檸檬酸和蘋果酸的比大于6，一個實施方案中大于7，一個實施方案中大于10。一個實施方案中，所述植物的果實中檸檬酸和蘋果酸的比小于450，一個實施方案中小于200。一個實施方案中，所述植物的果實包含每100g fwt小于大約85mg的蘋果酸，一個實施方案中每100g fwt小于大約75mg的蘋果酸，一個實施方案中每100g fwt小于大約60mg的蘋果酸。
一個實施方案中，本發(fā)明植物的果實具有綠色或白色果肉并且在成熟時包含a)每100g fwt大約600至大約1,200mg檸檬酸；b)大約4.2至大約5.1的pH；和c)每100g fwt大約5.0g至大約15.0g糖。
一個實施方案中，所述果實包含每100g fwt大約600至大約1,000mg檸檬酸。一個實施方案中，具有綠色或白色果肉的所述果實在成熟時包含每100g fwt大約8.0g至大約12.0g糖。一個實施方案中，具有綠色或白色果肉的所述果實在成熟時具有大約25至200的檸檬酸和蘋果酸比率。一個實施方案中，所述果實的蘋果酸含量為每100g fwt小于大約50mg蘋果酸，一個實施方案中，每100g fwt小于大約30mg蘋果酸。一個實施方案中，在所述植物的果實中蔗糖和己糖的比率為大約1∶1，一個實施方案中為大約1∶1至大約2∶1。
一個實施方案中，本發(fā)明植物的果實具有橙色果肉并且在成熟時包含a)每100g fwt大約600mg至大約750mg檸檬酸；b)大約4.5至大約5.1的pH；和c)每100g fwt大約6.0至大約13.0g糖。
一個實施方案中，在所述果實中檸檬酸與蘋果酸的比率為大約4.4至30。一個實施方案中，所述果實包含每100g fwt大約7.0g至大約13.0g糖。
一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生具有輕微果酸味的甜香果實的香瓜植物，在本文中稱作“Citric-”香瓜植物或者果實。該果實包含相對高含量的檸檬酸和輕微低的pH。該輕微低的pH造成果味酸感覺，這可以覆蓋成熟早期果實的其它仍過于平淡和不良的味道，而且不影響進一步完全成熟的果實的果肉風(fēng)味和顏色的完全表達(dá)。進一步地在成熟過程中(成熟早期至晚期)，與來自低檸檬酸含量的弱緩沖潛力相符，果實隨后出現(xiàn)相應(yīng)的pH增加和酸性降低。這可以提供完全表達(dá)的非常甜香的香瓜風(fēng)味中具有非常輕微的酸韻調(diào)(note)的完全成熟的果實。香瓜風(fēng)味主要基于通常在果實成熟的真正晚期階段得到完全表達(dá)的甜味和香味。成熟早期的香瓜由于糖和香味低于預(yù)期值并且不存在任何其它味道成分，故常常被描述為令人不愉快的乏味。在其它果實，例如草莓、桃或橙中，酸味在此成熟早期階段成為一個非常令人認(rèn)可的補充。該輕微果酸和甜的香瓜組合可以避免或限制成熟早期香瓜乏味的危險。
一個實施方案中，通過將低pH性狀(例如來自IND-35系的)引入Charentais香瓜背景中，獲得Citric-植物。一個實施方案中，基于一個或多個如下標(biāo)準(zhǔn)選擇Charentais香瓜背景低檸檬酸含量、低蘋果酸含量、相對高的檸檬酸和蘋果酸含量比、高糖含量、高蔗糖含量。在引入低pH性狀過程中，保持對上述特征的仔細(xì)選擇直到獲得期望后代。
例如，實施例11描述了此類植物的制備。也可以基于期望的特征選擇可替代的香瓜植物，并且可以將其用作本文所述的起始材料。
一個實施方案中，本發(fā)明Citric-植物的果實在成熟時包含a)每100g fwt大約400至大約650mg檸檬酸；b)大約4.6至大約5.6的pH；和c)每100g fwt大約5.0g至大約13.0g糖。
一個實施方案中，所述果實包含每100g fwt大約450至大約600mg檸檬酸。一個實施方案中，所述果實包含大約4.8至大約5.4的pH，一個實施方案中包含大約5.2的pH。一個實施方案中，所述果實包含每100g fwt大約5.0g至大約13.0g糖，一個實施方案中每100g fwt大約6.0g至大約12.0g糖。一個實施方案中，所述果實包含每100g fwt大約7.0g至大約13.0g糖。
一個實施方案中，本發(fā)明植物的果實具有橙色果肉并且在成熟時包含a)每100g fwt大約400mg至大約550mg檸檬酸；b)大約4.8至大約5.6的pH；和c)每100g fwt大約5.0g至大約11.0g糖。
一個實施方案中，在所述果實中檸檬酸和蘋果酸的比率為大約4.4至10。一個實施方案中，所述果實包含每100g fwt大約7.0g至大約11.0g糖。
表1A品系數(shù)據(jù)的總結(jié)表1A公開本發(fā)明的代表性品系。表1A中顯示的數(shù)據(jù)是基于各單個試驗的測量值得到的平均值。所述各單個試驗的數(shù)據(jù)公開在以下實施例中表9-13中。

表1B雜種數(shù)據(jù)總結(jié)表1B公開本發(fā)明的代表性雜種。表1B中顯示的數(shù)據(jù)是基于各單個試驗的測量值得到的平均值。所述各單個試驗的數(shù)據(jù)公開在以下實施例中表9-13中。Mehari指雜種MEHARI的雌性親本。

本發(fā)明證明，操作果實中的酸度可以產(chǎn)生有價值的味道變化。酸味是幾種參數(shù)相互作用的結(jié)果，其中pH是最重要的參數(shù)之一，有機酸的含量及組成也是。pH極大地影響味道中所涉及的酸類化合物的解離程度。每一種酸都有不同的解離常數(shù)(pKa)，解離常數(shù)指造成所述酸的50％解離成其相應(yīng)的離子和H+時的pH。較低的pH導(dǎo)致較多的非解離形式的酸。酸味感覺主要來自于未解離形式的酸。這就說明了為什么在較高的pH水平下具有較高pKa的較弱的酸例如有機酸被感覺到比較強的酸有更大的酸味。
溶液的pH與酸的濃度和pKa有關(guān)。等摩爾的較強酸的溶液與較弱酸的溶液相比味道更酸，因為它們具有低得多的pH。酸的濃度(可滴定的酸度)越高，從該酸將感覺到越大的酸味。酸味也與酸化劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)、該分子的羧基數(shù)量、分子量和極性有關(guān)(見例如PURAC Biochem，Gorinchen，The Netherlands，“Flavor Special”，www.Purac.com)。
除了酸味，每種食物酸就持續(xù)時間、風(fēng)味強度和對其它非酸味的風(fēng)味韻調(diào)例如澀味、苦味和甜味的貢獻(xiàn)而言都有其自身的風(fēng)味特征。
香瓜果實中的主要有機酸是琥珀酸、蘋果酸和檸檬酸(Wang等(1996)J.Agric.Food Chem.44210-216)。蘋果酸傾向于與極不成熟相有關(guān)或者與過成熟的果實的衰老和變質(zhì)相有關(guān)，并且一般不優(yōu)選其在味道中占主導(dǎo)地位。在該果實的果肉中，從靠近種子腔的位置到靠近果皮的位置觀察到遞增梯度的蘋果酸含量。檸檬酸比蘋果酸具有較低的pKa。檸檬酸具有更為尖酸的純凈效果，這常常壓制住其它味道或者香味韻調(diào)。與蘋果酸不同，從靠近種子腔的更成熟區(qū)域到靠近果皮的區(qū)域，觀察到果肉中遞減梯度的檸檬酸含量。對于糖，也觀察到此梯度。
因此，在本發(fā)明的香瓜果實中，較高的糖含量和高檸檬酸含量傾向于在果肉中結(jié)合以在該果實的大多數(shù)有味道的區(qū)域提供高含量的兩者，從而導(dǎo)致非常令人愉悅的新味道。
此外，在本發(fā)明的香瓜果實中，當(dāng)pH低而且檸檬酸含量高時，酸味感覺更大。
一個實施方案中，由經(jīng)過訓(xùn)練的品味員組成的專家組對本發(fā)明的果實進行了測試。按0至9的評估級別(scale of quotation)，測定果實的感觀特征。此外，還測定了果實的pH、有機酸含量和糖含量。實施例12、表14和15描述了專家組的結(jié)果。感觀分析顯示，本發(fā)明果實中的酸味是果實中pH和檸檬酸含量的函數(shù)?；趶某墒斓暮臀闯墒斓墓麑嵅杉臄?shù)據(jù)，專家組對于果實中的酸味和pH及檸檬酸含量之間關(guān)系確定了如下公式酸味＝13.12-(2.97×pH)+(0.00587×檸檬酸含量(mg/100g fwt))，其中r2＝0.70。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生如下果實的香瓜植物，所述果實按照專家組的確定包含大于大約0.5的酸味。一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生如下果實的香瓜植物，所述果實包含等于或大于大約1.6的酸味。一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生如下果實的香瓜植物，所述果實包含大于大約0.5的酸味和等于或大于4.3的甜味。一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生如下果實的香瓜植物，所述果實包含大約1.6至大約3.8的酸味和大約4.3至大約5.8的甜味。
一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生如下果實的香瓜植物，所述果實包含大約2.5至大約3.8的酸味和大約4.3至大約5.6的甜味。雜種YUSOL X SOLAZ和Mehari X L53 AZ B是此類植物的代表性例子。
一個實施方案中，該果實包含本文所述的pH和檸檬酸含量。一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生如下果實的香瓜植物，所述果實包含大約1.6至大約3.0的酸味和大約5.2至大約5.8的甜味。雜種YUSAZ X YUSOL、Mehari X L53 AZ A和TD X L53 AZ A是此類植物的代表性例子。
一個實施方案中，該果實包含本文所述的pH和檸檬酸含量。一個實施方案中，該果實包含本文所述的pH、有機酸含量及組成和糖含量及組成。
可以理解，隨著果實的pH、檸檬酸含量和糖含量的變化，專家組的值可以不同。
本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)基于檸檬酸和糖的含量及組成篩選了多條(etnryies)和多份(accessions)香瓜種質(zhì)，并且測定到香瓜類型中的變化(見表2)。例如，發(fā)現(xiàn)一些Charentais型香瓜具有低的檸檬酸含量(例如表2中的Lunastar)。還發(fā)現(xiàn)一些Charentais型果實具有相對低的檸檬酸和蘋果酸比率以及高的蔗糖和己糖比率。另一方面，發(fā)現(xiàn)Oriental型香瓜例如日本Rocky型香瓜具有較高的檸檬酸含量(例如，表2中YUCA)。YUCA的一個代表，YUC-15，已經(jīng)于2003年12月17日保藏在NCIMB，Aberdeen，AB24 3RY，蘇格蘭，保藏號NCIMB41203。這些香瓜還被發(fā)現(xiàn)具有高的檸檬酸和蘋果酸比率和高的己糖和蔗糖比率。還發(fā)現(xiàn)一些Galia型香瓜，例如MG755，具有高檸檬酸含量。令人驚奇的是，根據(jù)本發(fā)明，在日本型香瓜和Charentais型香瓜的雜交(表2中Prince PF)中，日本型香瓜的高檸檬酸含量可以與高己糖和蔗糖比率分離并與Charentais型香瓜的高蔗糖和己糖比率組合。本發(fā)明還認(rèn)識到，檸檬酸含量的變化也存在于不甜的種質(zhì)例如Faqqous和IND-35中(與IND-35相比Faqqous中具有低檸檬酸含量，表2)。
此外，盡管本領(lǐng)域一般認(rèn)為在同一香瓜果實中低pH和高糖積累并不常見或者甚至是不相容的(Stepanski等(1999))，但本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)能夠?qū)⑸鲜鰌H和有機酸特征與期望的糖含量組合在所述果實中(見例如表3)。
表2在各種香瓜類型和品種中檸檬酸含量的變化(果實分析數(shù)據(jù)試驗Sarrians，1997年8月)

RiBrix，折射率(refractometer index)，測量可溶性固體表3糖積累相對于pH在IND-35和YUCA或0GEL雜交的F2群體(Agadir’98)中統(tǒng)計學(xué)分析相對于pH的糖的積累(brix)。該分析顯示brix值和pH之間不存在負(fù)相關(guān)性。

本發(fā)明還公開在甜香瓜背景中摻入低pH性狀。在甜香瓜背景中存在該低pH性狀使得果肉中pH降低并且有機酸濃度增加，并且使得可以將期望的pH和檸檬酸含量與適當(dāng)?shù)奶菨舛群秃拷M合在一起，而導(dǎo)致令人愉悅的新味道。
一個實施方案中，低pH性狀由低pH基因決定。一個實施方案中，從野生的香瓜種質(zhì)或栽培品種獲得低pH基因。一個實施方案中，用作所述低pH基因的供體的野生香瓜種質(zhì)或栽培品種包含利于構(gòu)建如下商業(yè)香瓜的性狀，所述商業(yè)香瓜具有可接受的農(nóng)藝特征并產(chǎn)生具有期望味道的果實。一個實施方案中，該供體能夠積累相應(yīng)水平的糖，例如蔗糖。一個實施方案中，該野生香瓜種質(zhì)或栽培品種具有至少一種以下特征無呼吸躍變行為、相對更大的果實體積和中果皮成分、脆果肉。
一個實施方案中，低pH性狀從IND-35系獲得，IND-35系的代表性種子已經(jīng)于2003年12月17日保藏在NCIMB，Aberdeen，AB24 3RY，蘇格蘭，保藏號NCIMB 41202。這是來自印度的香瓜種質(zhì)，該種質(zhì)可以分類到植物學(xué)變種Var.chito中，但是由于其較大的體積分類為Var.acidulous(Naudin，Pitrate等)可能更好。
檸檬酸是IND-35系的果實中主要的有機酸(每100g fwt多達(dá)911mg檸檬酸)，而蘋果酸含量低于每100g fwt 50mg。令人驚奇地，IND-35的果實也能夠積累相應(yīng)水平的蔗糖(在長果實周期后，即，結(jié)果后50或53天晚收后，多達(dá)每100g fwt 1.7g蔗糖以及每100g fwt5.6g總糖)。表2也報道了對IND-35果實的分析，顯示出大約4.9的pH、大約340mg/100g鮮重(fwt)的檸檬酸含量和大約4.0g/100g fwt的糖含量。
一個實施方案中，低pH性狀和分子標(biāo)記共分離。一個實施方案中，分子標(biāo)記是通過PCR擴增的DNA片段，例如SSR標(biāo)記或RAPDS標(biāo)記。一個實施方案中，擴增的DNA片段的存在或缺乏指示著所述性狀本身的存在與缺乏或者所述性狀的特定等位基因的存在或缺乏。一個實施方案中，擴增的DNA片段的長度差異指示著性狀的特定等位基因的存在，并由此使得可以區(qū)分性狀的不同等位基因。一個實施方案中，本發(fā)明公開可以區(qū)分低pH性狀的不同來源以及植物中是否存在低pH性狀的標(biāo)記。例如，該標(biāo)記是Danin-Poleg等(2001)Theor.Appl.Genet.10261-72和Danin-Poleg等(2002)Euphytica 125373-384中描述的CMAT141。分子標(biāo)記的其它例子是本文中公開的NE0585和NE1746(見實施例13)。這些標(biāo)記與該pH基因的基因座緊密連鎖。標(biāo)記CMAT141和NE0585位于該低pH基因的一側(cè)，而標(biāo)記NE1746位于該低pH基因的另一側(cè)。
一個實施方案中，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)確定，當(dāng)使用針對這些標(biāo)記的引物時，低pH性狀的不同來源擴增出不同長度的DNA片段(酸性片段，見實施例14，表16)。例如，在Faggous植物中，針對CMAT141，擴增出大約176bp的片段。在種質(zhì)PI414723、PI414724、PI161375和PI124112的植物中，擴增出大約175bp的片段。相反，在本文描述的IND-35植物中，擴增出獨特的大約168bp和大約173bp的片段。使用標(biāo)記NE0585，對于IND-35，擴增出大約230bp和大約232bp的獨特片段。使用標(biāo)記NE1746，對于IND-35，擴增出大約127bp的獨特片段。對于IND-35，還擴增出大約124bp的另一片段，該片段在例如Faggous中是不存在的。
一個實施方案中，還使用本文公開的引物分析了不含該低pH性狀的植物。確定了與低pH性狀的缺乏相關(guān)的多個DNA片段(堿性片段)。例如，使用CMAT141的引物，在不含低pH性狀的植物中檢測到長大約169bp、大約172bp和大約178bp的片段。使用NE0585的引物，檢測到長大約218bp、大約229bp、大約234bp和大約239bp的片段。使用NE1746的引物，檢測到大約133bp、大約142bp和大約145bp的片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了如何分析不含低pH性狀的其它植物并確定與該低pH性狀的缺乏相關(guān)的其它DNA片段。所述長度(單位bp)不是絕對的而是相對于使用相同引物對所檢測到的其它大小的產(chǎn)物而言的。擴增片段的真實(確切)大小(例如，通過測序確定)可能與此處所述的大小稍有差異(+/-1bp)。
因此，一個實施方案中，本發(fā)明公開包含如下DNA序列的香瓜植物，所述DNA序列是使用本文所述的引物擴增本文所述DNA片段的模板。一個實施方案中，當(dāng)使用能夠鑒定標(biāo)記CMAT141的引物時，從所述植物的該DNA擴增大約168bp至大約178bp的DNA片段。一個實施方案中，當(dāng)使用能夠鑒定CMAT141標(biāo)記的引物時，擴增168bp、173bp、169bp、172bp或178bp的DNA片段。一個實施方案中，當(dāng)使用能夠鑒定CMAT141標(biāo)記的引物時，擴增小于176bp的DNA片段。一個實施方案中，當(dāng)使用能夠鑒定CMAT141標(biāo)記的引物時，擴增小于175bp的DNA片段。一個實施方案中，當(dāng)使用能夠鑒定NE 0585標(biāo)記的引物時，擴增大約218bp至大約253bp的DNA片段。在一個實施方案中，當(dāng)使用能夠鑒定NE0585標(biāo)記的引物時，擴增230bp、232bp、218bp、229bp、234bp或239bp的DNA片段。一個實施方案中，當(dāng)使用能夠鑒定NE1746標(biāo)記的引物時，擴增大約121bp至大約145bp的DNA片段。一個實施方案中，當(dāng)使用能夠鑒定NE1746標(biāo)記的引物時，擴增124bp、127bp、133bp、142bp或145bp的DNA片段。
一個實施方案中，本發(fā)明發(fā)明人解開了指示低pH性狀的DNA片段與低pH基因之間的連鎖。在此情況下，作為擴增堿性片段的模板的DNA序列與低pH性狀連鎖。因此，一個實施方案中，本發(fā)明公開包含與指示堿性等位基因的標(biāo)記(尤其是當(dāng)使用本文所公開的標(biāo)記時)共分離的低pH性狀的植物。一個實施方案中，位于該pH基因一側(cè)的標(biāo)記是堿性的。一個實施方案中，位于該pH基因兩側(cè)的標(biāo)記是堿性的。一個實施方案中，該植物的果實包含位于本文所公開的范圍內(nèi)的pH。一個實施方案中，該植物的果實包含本文所述的糖含量及組成。一個實施方案中，該植物的果實包含本文所述的有機酸含量及組成。一個實施方案中，該植物的果實包含本文所述的pH、糖含量及組成和有機酸含量及組成。
因此，一個實施方案中，本發(fā)明公開包含如下DNA序列的香瓜植物，所述DNA序列是用于擴增堿性DNA片段的模板，與低pH基因連鎖。一個實施方案中，本發(fā)明公開包含含有如下DNA序列的染色體片段的香瓜植物，所述DNA序列是用于擴增堿性DNA片段和低pH基因的模板。一個實施方案中，該染色體片段在所述植物中是純合的或雜合的。本文所述的SOLAZ/2系是此類香瓜植物的代表性實例。在SOLAZ/2中，使用標(biāo)記CMAT141、NE0585和NE1746的引物，分別擴增出大約172bp、大約229bp和大約124bp的片段。
一個實施方案中，本發(fā)明公開香瓜植物，所述香瓜植物包含位于低pH基因一側(cè)的用作擴增堿性DNA片段的模板的DNA序列、低pH基因和位于該低pH基因另一側(cè)的用作擴增堿性DNA片段的模板的DNA序列，其中兩個DNA序列在所述植物中與該pH基因連鎖。一個實施方案中，本發(fā)明公開包含如下染色體片段的香瓜植物，所述染色體片段包含位于低pH基因一側(cè)的用作擴增堿性DNA片段的模板的DNA序列、所述低pH基因和位于該低pH基因另一側(cè)的用作擴增堿性DNA片段的模板的DNA序列。一個實施方案中，該染色體片段在所述植物中是純合的或雜合的。本文描述的SOLAZ/1系是此類香瓜植物的代表性實例。在SOLAZ/1中，使用標(biāo)記CMAT141、NE0585和NE1746的引物，分別擴增出大約172bp、大約239bp和大約142bp的片段。本文所述YUSOL/3系是此類香瓜植物的另一代表性實例。在YUSOL/3中，使用標(biāo)記CMAT141、NE0585和NE1746的引物，分別擴增出大約172bp、大約239bp和大約145bp的片段。
因此，本發(fā)明公開包含低pH性狀的香瓜植物在獲取本發(fā)明香瓜植物中的用途。一個實施方案中，含有低pH性狀的香瓜植物還能夠積累相應(yīng)水平的糖，例如蔗糖。一個實施方案中，包含低pH的香瓜植物積累高水平的檸檬酸。一個實施方案中，包含低pH的香瓜植物積累低水平的蘋果酸。一個實施方案中，包含低pH的香瓜植物是IND-35系植物或其后代。
一個實施方案中，所述低pH性狀從所述IND-35系的后代獲得。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到，還可以從其它來源獲得低pH性狀。一個實施方案中，在該其它來源中的低pH性狀與IND-35中的低pH性狀是等位的。一個實施方案中，進行測試以確定待檢測低pH基因的品系是否包含IND-35的低pH基因的等位基因。IND-35系可以用作與待測品系雜交的測交系，在所獲后代中確定低pH表型的分離比率。
一個實施方案中，IND-35系植物與香瓜繁殖系(優(yōu)選地具有高檸檬酸含量和高水平的糖)雜交。每次雜交后，選擇產(chǎn)生具有低pH的果實的植物。也基于增加的檸檬酸含量和高糖含量，進行選擇。實施例7-11公開了將低pH性狀引入原種品系(elite line)中的例子。
一個實施方案中，使用以上公開的分子標(biāo)記將所述pH性狀轉(zhuǎn)移至期望的背景中，尤其是在本文所述增加香瓜植物果實的檸檬酸含量的方法中進行。一個實施方案中，選擇可擴增出相應(yīng)于低pH性狀的片段的植物，并進一步使用。
一個實施方案中，在低pH性狀引入甜香瓜植物中后，與不含該低pH性狀的香瓜的果實相比，例如與不含該低pH性狀的等基因或近等基因品系相比，獲得大約1至大約2.5pH單位的降低，在一個實施方案中獲得大約1.5至大約2.0pH單位的降低。一個實施方案中，在低pH性狀引入香瓜植物中后，與不含該低pH性狀的香瓜的果實相比，例如與不含該低pH性狀的等基因或近等基因品系比較時，所述香瓜植物的果肉中檸檬酸含量增加大約1.5至大約3倍。比較各種植物的成熟果實。例如，表1A和1B顯示了含有低pH性狀的香瓜與不含低pH性狀的香瓜之間的比較，例如YUSAZ X YUSOL和MILENIUM-DENEV F1、SOLAZ X YUSOL和SOLAR F1、Mehari/L53-L53 AZ A-L53 AZ B之間的比較。
因此，本發(fā)明香瓜果實與可比的不含低pH性狀的現(xiàn)有香瓜相比具有更高濃度的有機酸(可滴定的酸度)。在本發(fā)明的香瓜果實中，有機酸的組成(優(yōu)勢酸的pKa)比有機酸的總濃度與pH的變化更為相關(guān)。一般在成熟晚期觀察到pH的增加，并且此pH的增加與蔗糖的積累同時發(fā)生。pH的這種增加被有機酸含量緩沖。低有機酸含量導(dǎo)致高的pH增加和酸味感覺的減少。例如，在具有低檸檬酸含量的香瓜，例如一些現(xiàn)有的Charentais型香瓜，例如呼吸躍變的轉(zhuǎn)色型Charentais香瓜中，pH的這種增加可以超過1.0pH單位(從pH6.0至7.0)。相反，正如在例如較少呼吸躍變的較少轉(zhuǎn)色的香瓜中所見的那樣，在成熟過程中較高的有機酸含量導(dǎo)致降低的pH增加量，并由此阻止或降低酸味感覺的下降。
因此，一個實施方案中，本發(fā)明公開基于穩(wěn)定的低pH和高檸檬酸含量而具有更穩(wěn)定的尖酸味的香瓜果實。一個實施方案中，本發(fā)明公開在成熟后或收獲后具有改善的味道穩(wěn)定性的香瓜果實。本發(fā)明還公開在香瓜植物的果實中延遲或減少pH的增加的方法，包括增加所述果實中有機酸的含量和在香瓜植物中引入低pH性狀。一個實施方案中，該方法包括在具有低呼吸躍變或無呼吸躍變行為的植物中引入低pH性狀。一個實施方案中，該方法包括在能夠產(chǎn)生低轉(zhuǎn)色或不轉(zhuǎn)色的果實的植物中引入低pH性狀。
一個實施方案中，本發(fā)明還公開香瓜果實，所述果實基于pH的適度增加(不超過0.5pH單位)和檸檬酸含量的適度升高，從最初的成熟早期的微酸味成熟為果味的風(fēng)味豐滿的味道。
根據(jù)本發(fā)明，將低pH性狀引入產(chǎn)生具有不同糖含量及組成的果實的香瓜植物中。一個實施方案中，來自日本Oriental型香瓜，例如YUCA的植物用作糖的來源。一般的觀察是，糖尤其是蔗糖的積累是以授粉后的天數(shù)理解的果實周期時間(從結(jié)果到果實成熟)的問題。一個實施方案中，在本發(fā)明中使用產(chǎn)生具有早期的并且實質(zhì)性的糖積累的果實的香瓜植物。例如，使用Galia型植物，例如栽培品種OGEL，作為糖來源。一個實施方案中，在本發(fā)明中使用產(chǎn)生具有獨立于最初的己糖水平高而快地積累蔗糖的潛力的果實的香瓜植物。例如，使用Charentais型植物，例如L53作為該蔗糖積累潛力的來源。
以下實施例公開了低pH性狀向原種品系轉(zhuǎn)移的實例。下表8還公開了在向原種品系轉(zhuǎn)移的過程中獲得的香瓜植物。然而，在本發(fā)明中也可以使用其它類型的香瓜或以上提及的香瓜類型的其它香瓜栽培品種或變種來構(gòu)建根據(jù)本發(fā)明的香瓜植物。
一個實施方案中，包含低pH性狀的香瓜植物與Oriental型或Galia型香瓜植物雜交。例如，包含低pH基因的香瓜植物是IND-35系。例如，Oriental型香瓜植物是YUCA，而Galia型香瓜植物是OGEL，見以下實施例7中的描述。所得后代可以例如進一步與Oriental型或Galia型香瓜植物雜交以獲得期望的pH和有機酸及糖的含量及組成?？梢酝ㄟ^按本文所公開的方式測量pH、有機酸和糖，輔助該方法的實施。也可以基于期望的特征選擇可替代的Oriental型或Galia型香瓜植物，并用作起始材料以獲得本文所述的香瓜植物。
一個實施方案中，包含低pH性狀的香瓜植物與Charentais型香瓜植物例如實施例11中所述的L53雜交。也可以基于期望特征選擇可替代的Charentais型香瓜植物，并用作起始材料以獲得本文所述的香瓜植物。
也可以使其它類型的香瓜植物與包含低pH性狀的香瓜植物雜交以獲得本文所述的香瓜植物。
一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生如下果實的植物，所述果實的特征在果實達(dá)到成熟并保留于植物上時或者在果實被收獲并貯存時保持穩(wěn)定。一個實施方案中，本文所述果實的特征在果實的商業(yè)收獲后壽命期保持穩(wěn)定。這使得可以對本發(fā)明的果實進行長期的貯存或運輸而不損失其器官感覺特征和香味。
一個實施方案中，本發(fā)明果實的pH在果實達(dá)到成熟后保持穩(wěn)定。一個實施方案中，本發(fā)明果實的pH在果實成熟后保持在大約4.2至大約5.6的范圍內(nèi)。一個實施方案中，本發(fā)明果實的檸檬酸含量在果實達(dá)到成熟后保持穩(wěn)定。一個實施方案中，本發(fā)明果實的檸檬酸含量在果實達(dá)到成熟后保持在等于或大于每100g fwt 400mg的水平。一個實施方案中，本發(fā)明果實的蘋果酸含量在果實達(dá)到成熟后保持穩(wěn)定。一個實施方案中，本發(fā)明果實的檸檬酸和蘋果酸比率在果實達(dá)到成熟后保持穩(wěn)定。一個實施方案中，所述檸檬酸和蘋果酸比率在果實達(dá)到成熟后保持大于4.4。一個實施方案中，這些特征在果實達(dá)到成熟后保持在本文所述范圍內(nèi)。一個實施方案中，這些特征保持在果實達(dá)到成熟時測量這些特征得到的值的大約70％至大約130％的范圍內(nèi)，一個實施方案中，保持在果實達(dá)到成熟時測量這些特征得到的值的大約80％至大約120％的范圍內(nèi)，一個實施方案中，保持在果實達(dá)到成熟時測量這些特征得到的值的大約90％至大約110％的范圍內(nèi)。一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生如下果實的植物，所述果實的特征在果實達(dá)到成熟后保留于植物上時、或在收獲并貯存時保持穩(wěn)定。一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生如下果實的植物，所述果實的特征在果實保留于植物上時持續(xù)至少2天保持穩(wěn)定，一個實施方案中當(dāng)果實保留于植物上時持續(xù)至少3天保持穩(wěn)定，一個實施方案中當(dāng)果實保留于植物上時持續(xù)至少4天保持穩(wěn)定。一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生果實的植物，所述果實的特征在果實于20℃貯存時持續(xù)至少5天保持穩(wěn)定，一個實施方案中在果實于20℃貯存時持續(xù)至少7天保持穩(wěn)定，一個實施方案中在果實于20℃貯存時持續(xù)至少9天保持穩(wěn)定。一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生果實的植物，所述果實的特征在果實于8-12℃貯存時持續(xù)至少7天并之后在20℃貯存至少2天保持穩(wěn)定，一個實施方案中在果實于8-12℃貯存時持續(xù)至少12天并之后在20℃貯存至少2天保持穩(wěn)定，一個實施方案中在果實于8-12℃貯存時持續(xù)至少26天并之后在20℃貯存至少2天保持穩(wěn)定。典型地，果實收獲后，在將果實在本文所述的條件下貯存前，果實可以持續(xù)幾小時保持在大田條件下。
實施例15，表17中顯示了本發(fā)明植物的果實的特征在果實保留于植物上時的演變實例。實施例16，表18和19顯示了本發(fā)明植物果實的特征在于收獲之后的貯存后的演變實例。
一個實施方案中，可以將香瓜描述為短保存期限(SLS)、中等保存期限(MSL)或長保存期限(LSL)。LSL香瓜的實例是Milenium，Piel deSapo，Italo和不轉(zhuǎn)色的Charentais LSL。MSL香瓜的實例是Galia和轉(zhuǎn)色的Charentais MSL。短保存期限(SSL)香瓜的實例是經(jīng)典的Charentais。
典型地，SSL香瓜的果實在植物上的壽命是大約1天至大約2天。這意味著果實必須大約每1至2天收獲一次以避免損失。典型地，MSL香瓜的果實在植物上的壽命是大約3至大約4天。這意味著大約每3至4天收獲果實一次以避免損失。典型地，LSL香瓜的果實在植物上的壽命是大約5天以上。典型地，SSL香瓜可以在8至12℃貯存大約4天至大約7天并之后再在20℃貯存2天，或者可以在20℃貯存大約3至4天。典型地，MSL香瓜可以在8至12℃貯存大約7至大約12天并之后再在20℃貯存2天，或者可以在20℃貯存大約5至10天。典型地，LSL香瓜可以在8至12℃貯存大約12天以上并之后再在20℃貯存2天，或者可以在20℃貯存大約10天以上。
一個實施方案中，本發(fā)明植物能夠產(chǎn)生長保存期限的果實(LSL)或者中等保存期限的果實(MSL)。
本發(fā)明發(fā)明人確定了，低pH性狀和高檸檬酸可以在果實達(dá)到成熟后加速香瓜果實(尤其是轉(zhuǎn)色的呼吸躍變型香瓜)中呼吸躍變。這導(dǎo)致果實變質(zhì)，這可以由例如pH和蘋果酸含量的快速增加及檸檬酸含量的降低來顯現(xiàn)。這也可以通過粉狀的質(zhì)地和醇分解的出現(xiàn)而顯現(xiàn)。在轉(zhuǎn)色的呼吸躍變型香瓜中，果實的保存期限被減少，而該現(xiàn)象在不轉(zhuǎn)色的或/和無呼吸躍變的香瓜中較少被覺察到。因此，一個實施方案中，本發(fā)明植物具有不轉(zhuǎn)色的或低轉(zhuǎn)色的香瓜基因型。一個實施方案中，本發(fā)明植物能夠產(chǎn)生無呼吸躍變的或低呼吸躍變的果實。
因此，一個實施方案中，本發(fā)明公開具有低呼吸躍變行為或無呼吸躍變行為的、包含低pH基因的香瓜植物。一個實施方案中，該香瓜植物的果實還包含本文所述的糖含量及組成的特征。在一個實施方案中，該香瓜植物的果實還包含本文所述的有機酸含量及組成的特征。一個實施方案中，該香瓜植物的果實包含本文所述的檸檬酸和蘋果酸比率。一個實施方案中，該植物的果實還包含本文所述的pH。
一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生低轉(zhuǎn)色或不轉(zhuǎn)色的果實的香瓜植物，其中所述植物包含低pH基因。一個實施方案中，該香瓜植物的果實還包含本文所述的糖含量及組成的特征。在一個實施方案中，該香瓜植物的果實還包含本文所述的有機酸含量及組成的特征。一個實施方案中，該香瓜植物的果實包含本文所述的檸檬酸和蘋果酸比率。一個實施方案中，該植物的果實還包含本文所述的pH。
一個實施方案中，本發(fā)明發(fā)明人已經(jīng)鑒定到，香瓜果實果肉中的低pH與具有橙色果肉的果實的非常差的果肉顏色強度相關(guān)。尤其是，對于產(chǎn)生具有橙色果肉的果實的香瓜植物，觀察到了輕微的橙色或者淡橙色(見例如表4)。令人驚奇的是，本發(fā)明發(fā)明人已經(jīng)能夠?qū)⒌蚿H和深橙色結(jié)合在香瓜植物的果實中。
表4顯示L53系(Syngenta雜種MEHARI的親本)的果實的顏色強度為深的至非常深的橙色(平均5.17)。起源于為在L53中引入低pH性狀而進行的回交程序但不含該低pH性狀的植物(L53*高pH)，顯示出顏色強度和pH的輕微降低(4.71和6.46)。起源于所述回交程序并含有該低pH性狀的植物顯示出顏色強度和pH的進一步降低。具有純合狀態(tài)的低pH性狀的植物(L53*低pH)具有最低等級的橙色果肉顏色4.04。具有雜合狀態(tài)的低pH性狀的植物(L53*酸)具有中等等級的橙色果肉顏色4.36。這說明低pH和淡橙色果肉顏色之間的連鎖或表型效應(yīng)。因此，基于在低pH性狀存在下濃郁的橙色果肉顏色(一個實施方案中在以下級別中評定為4級或更高級別，一個實施方案中，5級和更高級別，一個實施方案中6級)，選擇植物。
一個實施方案中，本發(fā)明公開能夠產(chǎn)生具有大約4.5至大約5.6pH的果實的香瓜植物，其中所述果實具有評定為4級或更高級別的橙色果肉。一個實施方案中，所述果實的橙色被評定為5級或更高級別，一個實施方案中為6級。一個實施方案中，所述果實的pH是大約4.5至大約5.4，一個實施方案中為大約4.8至大約5.2。一個實施方案中，所述果實包含每100g fwt大約400mg至大約900mg檸檬酸。一個實施方案中，所述果實包含每100g fwt大約450mg至大約750mg檸檬酸。一個實施方案中，所述果實包含每100g fwt等于或大于大約5g的糖含量，一個實施方案中包含每100g fwt大約5.0g至大約13.0g糖。一個實施方案中，該果實包含每100g fwt大約6.0g至大約12.0g糖。一個實施方案中，所述果實中檸檬酸和蘋果酸的比率為大約4至30，一個實施方案中為大約5至大約15。一個實施方案中，所述植物的果實中蔗糖和己糖比率為大約1∶1和大約1∶2。
對于顏色評定，使用如下級別1白色；2微橙色；3淡橙色；4橙色；5深橙色；6非常深的橙色(見表4)。一個實施方案中，使用分光光度計，例如Minolta CM-2500d分光光度計，評價果實的顏色。
表4
一個實施方案中，本發(fā)明香瓜果實的特征在成熟時收獲的果實上，即在成熟的或熟了的果實上進行測量。香瓜果實的具體組成以及由此其味道受到其收獲時的成熟階段的影響。糖和有機酸在香瓜果實中的積累是動態(tài)過程。隨著果實接近成熟，它們開始積累。隨著成熟過程的推進，這些化合物均遵循時間特異性的積累或降解模式，該模式也受到環(huán)境和生長條件的影響。本領(lǐng)域技術(shù)人員明了如何識別成熟的香瓜果實和理解定義香瓜果實成熟的標(biāo)準(zhǔn)。
一個實施方案中，使用一種以下的外在成熟標(biāo)記鑒定甜香瓜的成熟-側(cè)果葉(side fruit leaf)(該香瓜果實結(jié)在位于一片稱作側(cè)果葉(side leaf fruit)的葉的花梗著生處腋下的花中)衰老。該側(cè)果葉壞死。
-果皮顏色改變(在Galia型中由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，在Charentais型中由灰色轉(zhuǎn)變?yōu)槟厅S色，或者在Piel de Sapo型中黃色成分增加)。
-花梗開裂(尤其是對于Shipper香瓜而言，而對于Charentais而言較少，對于Galia而言較少)。
-果殼堅硬度下降，尤其是在果頂(blossom end)區(qū)域中。
一個實施方案中，“成熟”(maturity)包括介于鑒定為“2”的“成熟早期-部分成熟”的階段至鑒定為“4”的“成熟晚期-完全成熟”的階段之間的成熟的生理學(xué)過程。一個實施方案中，成熟早期-部分成熟階段在香瓜中以等于或大于每100g fwt 2g蔗糖的最初蔗糖含量積累來鑒定。一個實施方案中，這與檸檬酸和還原糖(葡萄糖加果糖)含量的劇烈增加以及典型的成熟果實果肉顏色和質(zhì)地相聯(lián)系。一個實施方案中，成熟晚期-完全成熟階段在香瓜中以蔗糖糖含量的劇烈增加的結(jié)束來定義。其也被定義為降解過程開始之前，例如果肉堅度的喪失、葡萄糖、檸檬酸含量的快速下降或者蘋果酸含量的增加之前。因此，一個實施方案中，當(dāng)果實中的蔗糖含量達(dá)到每100g fwt 2g時，果實開始成熟。一個實施方案中成熟持續(xù)到不再觀察到蔗糖含量的增加。
本文公開的測量值通常是取自多個果實的測量結(jié)果或數(shù)據(jù)的平均值?？梢岳斫猓捎诜N植香瓜植物時通常觀察的變異，在任何樣品中，植物的單個果實或來自單個植物的果實不在所述范圍內(nèi)。一個實施方案中，本文所述香瓜果實的特征使用在本文所述條件下或在相似條件下生長的果實來測定(例如，以下實施例6，表5-7)。一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的特征的數(shù)字是取自大棚木樁撐扶的植物(stakedplant)生長的果實的平均值(在木樁撐扶的植物中每植物一個果實)。
一個實施方案中，本發(fā)明植物是自交系、雙單倍體或雜種。一個實施方案中，自交系包含低pH性狀和本文所述的有機酸、pH和糖的特征。在此情況下，該自交系與另一香瓜植物，優(yōu)選地另一自交系雜交，以獲得根據(jù)本發(fā)明的雜種植物。一個實施方案中，所述雜交中的另一自交系也能夠產(chǎn)生具有高檸檬酸含量和/或高糖含量的果實。根據(jù)本發(fā)明的代表性自交系公開在表1A中。
一個實施方案中，本發(fā)明植物是雜種植物。在此情況下，低pH、高檸檬酸含量和高糖含量特征中的一些由其中一個親本貢獻(xiàn)，而剩余的特征由另一親本貢獻(xiàn)。一個實施方案中，雜交中的一個親本產(chǎn)生具有高檸檬酸含量、高糖含量但具有高pH(例如大約pH6.5)的果實，而雜交中的另一親本產(chǎn)生具有低pH的果實。一個實施方案中，所述另一親本的果實也具有高檸檬酸含量。根據(jù)本發(fā)明的代表性雜種公開在表1B中。在本文中，術(shù)語“植物”包括植物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體、可以再生香瓜植物的植物組織培養(yǎng)物細(xì)胞、植物愈傷組織、植物塊、以及植物中完好的植物細(xì)胞或植物部分例如花粉、花、葉、莖等。一個實施方案中，本發(fā)明植物能夠產(chǎn)生可食用的香瓜果實。中果皮為香瓜果實(果肉)的可食用部分。中果皮包圍種子腔，而中果皮本身被果皮(或殼)包圍。本發(fā)明果實的中果皮優(yōu)選具有2cm以上的厚度，并且優(yōu)選占果實果肉總重量的50％以上。一個實施方案中，本發(fā)明香瓜植物果實的果肉具有綠色、白色、黃色或橙色果肉。
一個實施方案中，本發(fā)明提供用于本發(fā)明植物的組織培養(yǎng)物中的可再生細(xì)胞。該組織培養(yǎng)物能夠再生出具有本發(fā)明植物的特征的植物。優(yōu)選地，在此組織培養(yǎng)物中所述可再生細(xì)胞是未成熟的胚、原生質(zhì)體、分生組織細(xì)胞、愈傷組織、花粉、葉、花藥、根、根尖或花。再有，本發(fā)明提供從本發(fā)明組織培養(yǎng)物再生的香瓜植物。再生的操作方案的例子公開在US 6,420,631中。本發(fā)明還提供無性繁殖本發(fā)明植物的方法，包括收集本發(fā)明植物的組織，培養(yǎng)所述組織以獲得增殖芽(proliferated shoot)，使增殖芽生根以獲得生根的小植物。本發(fā)明還公開產(chǎn)生本發(fā)明植物的種子的方法，包括獲得本發(fā)明植物，使所述植物自花授粉或使所述植物與另一香瓜植物雜交，和收獲后代種子。本發(fā)明還公開產(chǎn)生果實的方法，包括種植本發(fā)明的植物，使所述植物生長和收獲果實，其中所述果實包含本文所述的特征。該方法還包括貯存所述果實，例如按本文所述進行。該方法還包括運輸所述果實。一個實施方案中，本文所述的所述果實的特征在所述果實的貯存期間保持穩(wěn)定。一個實施方案中，本文所述的所述果實的特征在所述果實的貯存期間保持穩(wěn)定。
以下描述多種香瓜類型和品系的一些特征。對于這些不同的香瓜類型和品系，這些特征是例子，不意味著對這些香瓜類型和品系構(gòu)成限制，而是對這些香瓜類型和品系的舉例說明?？赡艹霈F(xiàn)自這些特征的變異。
Charentais型香瓜果實圓形至高圓(hight round)形；大小為600至1200grs；果皮白灰色帶有綠灰色縫(suture)，光滑外皮(光滑的或稍帶網(wǎng)紋的外皮)。橙色、易化的(melty)、非常芳香的甜果肉、呼吸躍變型。一些Charentais變種具有降低的呼吸躍變相和不轉(zhuǎn)色的果皮顏色。
Var LUNASTARLunastar是來自Nunhems的Charentais型雌雄同株雜種。
日本型香瓜果實圓至高圓形；大小為700至1500grs；果皮白灰色網(wǎng)紋外皮(例外情況，有縫)。綠黃色(例外情況為橙色)、脆的至易化的、很少香氣的、非常甜的果肉，僅僅在有些情況下。長周期，無呼吸躍變。
Var YUCA日本型綠色果肉的雄全同株雜種。
Var PRINCE日本型橙色果肉的雄全同株雜種。
Galia型香瓜果實圓至高圓形狀；大小為600至1500grs；果皮綠色轉(zhuǎn)色為黃色的網(wǎng)紋外皮。綠白色、易化的、芳香甜果肉。短周期，中等保存期限，呼吸躍變型。
Var MG.755Galia型雄全同株雜種。非常短的果實周期，具有高brix。
Piel de Sapo香瓜型果實卵形至橢圓狀長圓形(oblong-eliptic)的形狀；大小2至5Kgrs；果皮金綠色、帶斑點，具有很少的縱向網(wǎng)紋的外皮。白色、脆的、多汁的芳香甜果肉。中等果實周期、長保存期間，無呼吸躍變。
Var SanchoPiel de Sapo型雄全同株雜種。金色的果皮具有高brix。
Fagous型香瓜果實中短圓柱形；大小300至1000grs；果皮綠色外皮。白色、脆的、不甜果肉。對于食用，在沙拉中綠色蔬菜。雌雄同株的。
IND35果實卵狀長梨形(long pear-ovoid)；大小300至1000grs；果皮淺綠色帶斑點的外皮，成熟時黃色。白色、脆的、不甜果肉。對于食用，沙拉中綠色蔬菜。雌雄同株的。Syngenta Seeds品系，無呼吸躍變。
YUSOL圓形至高圓形；大小600至1300grs；果皮黃色、很少的網(wǎng)紋、具有淺綠色縫的外皮。綠白色、易化的、很少香氣的、甜的、不酸的果肉。短周期，中等保存期限，不轉(zhuǎn)色的低呼吸躍變型。雄全同株的Syngenta Seeds品系。
YUSAZ A圓形至高圓形；大小600至1300grs；果皮白灰色、很少的網(wǎng)紋、具有綠灰縫的外皮。綠色、特別脆的、很少香氣的、甜酸果肉。短周期，中長保存期限，不轉(zhuǎn)色的，低至中等的呼吸躍變。雄全同株的Syngenta Seeds品系。
YUSAZ B圓形至高圓形；大小600至1300grs；果皮黃色、帶網(wǎng)紋的、具有綠-灰縫的外皮。綠色、特別脆的、很少香氣的、甜酸果肉。長周期，長保存期限，不轉(zhuǎn)色的，低呼吸躍變型。雄全同株的Syngenta Seeds品系。
MILENIUN-DENEV圓形至高圓形；大小600至1500grs；果皮黃色、帶網(wǎng)紋的、不帶縫的外皮。綠-白色、脆的、無呼吸躍變的、不酸的、甜果肉。長周期、不轉(zhuǎn)色、長保存期限、無呼吸躍變。雄全同株的Syngenta Seeds雜種。
SOLAZ/1圓形至高圓形；大小700至1400grs；果皮黃色、很少網(wǎng)紋的、具有淺綠色縫的外皮。白色、脆的、很少香氣的、甜酸果肉。短周期、長保存期限、不轉(zhuǎn)色的、非常低的呼吸躍變。雄全同株的Syngenta Seeds品系。
SOLAZ/2圓形至高圓形；大小600至1300grs；果皮黃色、很少的網(wǎng)紋、具有淺綠色縫的外皮。白色、脆的、很少香氣的、甜酸果肉。短周期、長保存期限、不轉(zhuǎn)色、非常低的呼吸躍變。雄全同株的Syngenta Seeds品系。
MEHARI來自Syngenta的Charentais型雌雄同株雜種。轉(zhuǎn)色的，中等保存期限。
L53來自Syngenta的Charentais型雄全同株品系。轉(zhuǎn)色的、中等保存期限。小體積、圓扁外形。來源于var LUNASTAR，一種轉(zhuǎn)色的Charentais型Nunhems雌雄同株雜種TD來自Syngenta的Charentais型雌雄同株品系。不轉(zhuǎn)色的、長保存期限。來源于var TORNADO，一種來自Limagrain的不轉(zhuǎn)色Charentais型雌雄同株雜種。
本文引用的所有參考文獻(xiàn)均完整地并入本申請中作為參考。當(dāng)本文中公開范圍時，理解為落入這些范圍內(nèi)的所有單個數(shù)也是本發(fā)明的一部分。
以下實施例旨在舉例說明本發(fā)明的應(yīng)用。以下實施例不旨在完整地定義或以其它方式限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1制備香瓜提取物從香瓜果實取大約400g的楔形物，除去種子和外皮(1cm厚度)。將該果肉切成小塊，在warring攪拌器中攪拌30秒直到獲得無結(jié)塊的漿液。用Whatman紙過濾器過濾漿液，在Eppendorf離心機中10,000g離心該汁液，貯存在-20℃。
實施例2確定檸檬酸含量在實施例1中制備的樣品與檸檬酸裂合酶(CL)溫育以將檸檬酸轉(zhuǎn)化成草酰乙酸和乙酸。在蘋果酸脫氫酶(MDH)和乳酸脫氫酶(LDH)存在下，用NADH將草酰乙酸和其脫羧基的衍生物丙酮酸分別還原為L-蘋果酸和L-乳酸。NADH的減少與樣品中檸檬酸的量成比例，并可以在340nm下確定。在微量板中進行該試驗。向微量滴定板加入20μl稀釋的樣品。加入含有NADH、MDH和LDH的200μl試驗混合物，并在板中混合。使用含有CL的15μl起始溶液來啟動反應(yīng)?；旌习遄硬⒊掷m(xù)進行1小時反應(yīng)。使用微量滴定板讀數(shù)器(配備有KCJunior軟件和計算機的Biotek EL808讀數(shù)器)，測定340nm吸光度。使用校正曲線以計算樣品中的檸檬酸濃度。所述酶購自Roche Diagnostics。
實施例3測定蘋果酸含量將實施例1制備的樣品與L-蘋果酸脫氫酶(MDH)和NAD+一起溫育以將L-蘋果酸轉(zhuǎn)化為草酰乙酸。反應(yīng)平衡朝向蘋果酸側(cè)，但是使用肼通過衍生化作用迫使反應(yīng)平衡朝向草酰乙酸側(cè)。在該試驗中形成的NADH與樣品中的蘋果酸含量成比例?？梢栽?40nm測定NADH作為對蘋果酸的測量。
在微量板中進行該試驗。向微量滴定板中加入20μl稀釋的樣品。通過加入200μl含有肼、MDH和NAD+的、pH10的試驗混合物，起始反應(yīng)?；旌习遄樱⒃试S反應(yīng)進行1小時。使用微量滴定板讀數(shù)器(配備有KCJunior軟件和計算機的Biotek EL808讀數(shù)器)，測定340nm吸光度。使用校正曲線以計算樣品中的蘋果酸濃度。MDH購自RocheDiagnostics。
實施例4測定葡萄糖、果糖和蔗糖含量葡萄糖使用己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PDH)測定葡萄糖。用己糖激酶磷酸化葡萄糖得到葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)，之后在NADP和G-6-PDH的幫助下脫水為6-磷酸葡糖酸(分別為反應(yīng)1和2)。所形成的NADPH(H受體)的濃度與初始葡萄糖濃度定量相關(guān)，并在光譜的UV范圍內(nèi)于340nm進行測定。
果糖在相同試驗中測定果糖。果糖通過己糖激酶被磷酸化成果糖-6-磷酸(F-6-P)。用磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(PGI)將F-6-P轉(zhuǎn)化為G-6-P，之后按以上反應(yīng)2中所述轉(zhuǎn)化成6-PG。
蔗糖使用β-果糖苷酶將蔗糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖和果糖。根據(jù)以上所述的反應(yīng)1和2測定形成的葡萄糖。
在微量滴定板中進行該測定，使用微量滴定板讀數(shù)器(配備有數(shù)據(jù)收集軟件和計算機的Biotek ELx808)，測定吸光度值。酶購自RocheDiagnostics。
實施例5測定pH使用通過標(biāo)準(zhǔn)溶液校正到pH4和pH7的CRIMSON GLP21 pHmeter，測定實施例1所述樣品的pH。
實施例6香瓜植物的生長條件在不同條件下在不同的場所種植香瓜植物(見下表5)。表6顯示了這些試驗的數(shù)據(jù)，表7描述了在不同試驗中的生長條件。
表5試驗描述

FA秋，SP春，SU夏，PS大棚木樁支撐的作物，PV大棚藤蔓作物表6試驗日期

此處，SP03OF1是指2003年6月20日收獲的果實的分析數(shù)據(jù)。SP03OF2是指2003年7月4日收獲的果實。
表7AFA02PS的生長條件場所EL EJIDO T.St.
大棚

以1月1日起開始進行周的編號，29周是該年的第29周。
表7BSP03PV、SP03PS、SU03PS、FA03PS的生長條件場所EL EJIDO T.St.，大棚

場所EL EJIDO T.St.，大棚

表7CSP03OF的生長條件TORREPACHECO T.St.
露天田間

實施例7向原種系轉(zhuǎn)移低pH性狀1.IND-35系與所選的一組Syngenta原種系在EI EJIDO試驗站(西班牙)雜交。
所選的品系是a)YUCA-15選擇的原因是在中長周期(從結(jié)果至果實成熟的時間)中高的糖積累潛力。YUCA是通過5代自花授粉獲得的專有SyngentaSeeds品系。它是日本Rocky型香瓜，不轉(zhuǎn)色以及具有非常低的呼吸躍變。
b)OGEL-17選擇的原因是中短周期(從結(jié)果至果實成熟的時間)和中高的糖積累潛力。該品系是通過10代的自花授粉從通過商業(yè)雜種GUSTAL和RADICAL(Syngenta Seeds)親本系之間的雜交而育種產(chǎn)生的F1獲得的專有Syngenta Seeds品系。它是GALIA型香瓜，轉(zhuǎn)色并具有中等的呼吸躍變。
F1雜種產(chǎn)生自花授粉的F2后代?；诘蚿H和糖選擇F2果實(表8A)。
2.種植兩F2代并與新選擇的一組Syngenta原種系逐株植物地進行交叉授粉a)IND35/YUCA-15F2代與MG.755-68(755)雜交，MG.755-68(755)是一種通過5代自花授粉從商業(yè)雜種BETULO(Syngenta Seeds)獲得的專有Syngenta Seeds品系。它是GALIA轉(zhuǎn)色的中等呼吸躍變型香瓜，由于綠色果肉、高糖、短周期及相對高的檸檬酸含量而被選擇用于該目的。
b)IND35/OGEL-17F2代與SEN19C8(SN8)雜交。該品系是專有Syngenta Seeds品系，不轉(zhuǎn)色的，非常低的呼吸躍變，通過商業(yè)雜種EARLS SEINU(Yae Nogey Seeds Co.Isahaya，Nagasaki，日本)的6代自花授粉獲得。它是日本Rocky型香瓜，由于高糖和具有網(wǎng)紋(netting)而被選用于該目的。
在這些群體中，驗證了低pH性狀的單顯性遺傳調(diào)節(jié)，并且糖積累和所述低pH之間不存在連鎖(表3)。從每一群體(各150株植物)，選擇包括較高R.I.Brix程度和最低pH的重組體。收集交叉授粉的種子后代。從F2群體a)選擇的雜交后代包括標(biāo)識為755YUCIND-19、755YUCIND-49、755YUCIND-75的植物。
從F2群體b)選擇的雜交后代包括標(biāo)識為SN8OGLIND-03的植物。
755YUCIND系因蔗糖的積累而被選擇。SN8OGLIND因為檸檬酸的積累而被選擇。種植這些雜交后代，并產(chǎn)生了pH、糖和有機酸含量的數(shù)據(jù)。選擇組合了高糖、低pH和高檸檬酸含量的品系。表8B顯示所選植物的分析結(jié)果。
表8中間物的分析表8A對在F2中所選植物的分析數(shù)據(jù)摘錄(1998年秋Agadir)

表8B后代B1F1的分析數(shù)據(jù)摘錄(El Ejido 1999年春)

表8C后代B2&3F1的分析數(shù)據(jù)摘錄(El Ejido 1999年秋)

表8D后代B3F&2的分析數(shù)據(jù)摘錄(Torrepacheco 2000年春)

表8E分析數(shù)據(jù)摘錄(El Ejido 2000年秋)

表8F分析數(shù)據(jù)摘錄(El Ejido 2001)

實施例8性狀漸滲入SOLAZ在具有圓形和黃色帶縫外皮及白色果肉的無呼吸躍變LSL香瓜中漸滲低pH性狀。
1.選擇的SN8OGLIND-103后代植物與IOTYU雜交，IOTYU是通過數(shù)代自花授粉從傳統(tǒng)的開放授粉的日本品種Makuwauri EIJYU(Nantoseed Co.Ltd，Kashiwara，Nara，日本)獲得的專有Syngenta Seeds系。由于無呼吸躍變、不轉(zhuǎn)色、非常高的糖含量、高檸檬酸含量、和黃色果皮，而選擇了該品系。
2.來自前面雜交的所選后代植物與SOLAR-19雜交，SOLAR-19是通過5代自花授粉從商業(yè)雜種SOLARKING F1(Nunhems Zaden BV，Haelen，Holland)獲得的專有Syngenta Seeds品系。其是具有長保存期限的不轉(zhuǎn)色Galia型香瓜，由于無呼吸躍變、非常高的糖含量、白色果肉、黃色帶網(wǎng)紋的果皮而被選擇用于該目的。
從這些雜交后代進行七輪自花授粉。使用pH、糖和有機酸含量的分析數(shù)據(jù)，在自花授粉后代上進行選擇和固定(表8C和8D)。選擇固定的品系后代A)SOLAZ1由于低pH和高糖積累的組合、白粉菌耐受性、和具有夏季生長適應(yīng)性的植物而被選擇(表8E和F)。
B)SOLAZ2由于低pH和中等糖積累的組合以及具有春季生長適應(yīng)性的植物而被選擇(表8E和F)。
3.使用SOLAZ1和SOLAZ2后代作為雄性授粉者與三種專有Syngenta Seeds品系YUSOL1，2和3雜交，這些Syngenta Seeds品系通過6代自花授粉從來自YUCA-15×SOLAR-48(兩者是具有前述來源的專有Syngenta品系)雜交的繁殖雜種MD.997 F1獲得。
獲得了以下F1組合A)YUSOL1/SOLAZ1；當(dāng)使用SOLAZ1作為YUSOL1品系的授粉者時；B)YUSOL2/SOLAZ1；當(dāng)使用SOLAZ1作為YUSOL2品系的授粉者時；
C)YUSOL3/SOLAZ2；當(dāng)使用SOLAZ2作為YUSOL3品系的授粉者時。
表9和10顯示這些所選植物和商業(yè)可獲得的對照植物的分析結(jié)果。這些植物在實施例6所述條件下生長。顯示每一實驗中檢測的果實數(shù)目(nr.Frt)。按實施例1-5所述進行測量。蔗糖(suc)、己糖(hex)和總糖的數(shù)值的單位是g每100g鮮重(fwt)。檸檬酸和蘋果酸的數(shù)值單位是mg每100g鮮重(fwt)。
表9ASOLAZ

表9BYUSOL

表10A雜種SOLAZXYUSOL

表10B對照

實施例9性狀漸滲入YUSAZ A在具有圓形和黃色帶縫外皮的綠色果肉無呼吸躍變LSL香瓜中漸滲低pH性狀。
1.使用上述的MG.755-68系作為回歸親本，從755YUCIND-19進行直接回交。
來自前面雜交的所選后代植物與YUCA-64雜交，YUCA-64是通過5代自花授粉從與上述姐妹系相同的來源獲得的專有Syngenta Seeds品系。
選擇該品系的原因是綠色果肉、不轉(zhuǎn)色、無呼吸躍變，長保存期限、非常高的糖、非常脆的西瓜質(zhì)地(texture)和縫。
從該雜交后代進行3輪自花授粉。使用pH、糖和有機酸含量的分析數(shù)據(jù)，在自花授粉后代上進行選擇和固定(表8C-E)。
2.來自以上產(chǎn)生的后代的所選植物與YUSOL.3雜交，YUSOL.3是以上描述的一種專有Syngenta Seeds品系。該品系由于綠色果肉、較短的周期、非常高的糖、黃色果皮和縫而被選擇。
從前面的雜交后代進行5輪自花授粉。選擇和固定育種過程集中于具有短周期、綠色果肉、脆的西瓜質(zhì)地和黃色果皮的自花授粉后代。使用pH、糖和有機酸含量的分析數(shù)據(jù)輔助進行選擇和固定。由此選擇和固定了YUSAZ A后代品系。
3.YUSAZ A系用作雄性授粉者與三種專有Syngenta Seeds品系，YUSOL1(上述的一種專有Syngenta Seeds系)，雜交。獲得了F1組合YUSOL 1/YUSAZ A。
表11顯示這些所選植物的分析結(jié)果。這些植物在實施例6所述條件下生長。顯示了每次實驗中測試的果實數(shù)目(nr.Frt.)。按實施例1-5所述進行測量。蔗糖(suc)、己糖(hex)和總糖的數(shù)值單位是g每100g鮮重(fwt)。檸檬酸和蘋果酸的數(shù)值單位是mg每100g鮮重(fwt)。
表11AYUSAZ A

表11B使用YUSAZ A的F1雜種

顯示了YUSAZ A系的特征。YUSAZ A/1和YUSAZ A/2是兩個姐妹品系。F1雜種由與YUSOL系的雜交產(chǎn)生。
實施例10性狀漸滲入YUSAZ B在具有圓形和黃色帶縫的果皮的綠色果肉無呼吸躍變LSL香瓜中漸滲低pH性狀。
1.以上所述SN8OGLIND-103×IOTYU雜交后代的所選植物再次與IOTYU回交，IOTYU是不轉(zhuǎn)色的，具有非常低的呼吸躍變和綠色果肉的香瓜(見表8D)。
來自之前雜交的所選后代植物與YUCA-40雜交，YUCA-40是一種通過5代自花授粉從與上述姐妹品系相同的來源獲得的專有SyngentaSeeds品系(見表8E)。
選擇該品系的原因是綠色果肉、無呼吸躍變、長保存期限、非常高的糖、非常脆的西瓜質(zhì)地和縫。
2.從前面的后代在一輪的自花授粉后產(chǎn)生的后代中選擇的植物與YUSOL.3(前述一種專有Syngenta Seeds品系)雜交。選擇該品系的原因是綠色果肉、較短的周期、非常高的糖、黃色果皮和縫(見表8F)。
從前面的雜交后代開始進行5輪自花授粉。選擇具有綠色果肉、脆西瓜質(zhì)地、高檸檬酸含量和黃色果皮的自花授粉后代。
3.利用pH、糖和有機酸含量的分析數(shù)據(jù)輔助進行選擇和固定。選擇了固定的品系后代YUSAZ B(表12)。
YUSAZ B是“Citric+”香瓜植物的例子。
YUSAZ B系用作雄性授粉者與三種專有Syngenta Seeds品系，YUSOL1(上述的一種專有Syngenta Seeds系)，雜交。獲得F1組合YUSOL1/YUSAZ B(表12)。
植物在實施例6所述條件下生長。顯示了每一實驗中測試的果實數(shù)目(nr.Frt.)。按實施例1-5所述進行測量。蔗糖(Suc)、己糖(hex)和總糖的數(shù)值單位為g每100g鮮重(fwt)。檸檬酸和蘋果酸的數(shù)值單位是mg每100g鮮重(fwt)。
表12YUSAZ B

顯示了YUSAZ B系的特征。YUSAZ B/1和YUSAZ B/2是兩個姐妹品系。F1雜種由與YUSOL的雜交獲得。
實施例11性狀漸滲入MEHARI F1在橙色果肉香瓜中漸滲低pH性狀。所選擇的靶是將商業(yè)雜種MEHARI(Syngenta Seeds)轉(zhuǎn)化成兩個低pH版本，其中一個具有較高的檸檬酸含量，而一個具有較低的檸檬酸含量。
1.使用L53系作為回歸親本(一種專有Syngenta Seeds)從755YUCIND-49和755YUCIND-75品系進行直接回交。L53是Charentais型香瓜，由于具有高糖、低檸檬酸含量而被選擇用于該目的。L53是商業(yè)雜種MEHARI的親本(見表8F)。
在回交過程中以及在每一雜交的后代中，選擇具有低pH和較大或較小的酸感覺(較高或較低的檸檬酸含量)以及其它性狀與回歸親本L53更接近的植物。
在第二次回交(第三次雜交)后，獲得以下后代a)L53)3)×755YUCIND75-15/03/06/，因低pH和低檸檬酸含量而選擇b)L53)3+)×755YUCIND49-8/2/03/05/，因低pH和高檸檬酸含量而選擇。
從這些雜交后代開始進行四輪自花授粉并再與L53進行一次回交。利用pH、糖和有機酸含量的分析數(shù)據(jù)輔助在自花授粉后代上進行的選擇和固定育種過程。
2.選擇了固定的品系后代A)從前面的群體a)選擇的、固定了低檸檬酸含量和低pH、并且其它性狀接近回歸親本L53的L53AZ A。
L53AZ A系是“Citric-”香瓜植物的例子。
B)從前面群體b)選擇的、固定了低pH和高檸檬酸含量，并且其它性狀接近回歸親本L53的L53AZ B。
還針對在低pH性狀存在下濃郁的橙色果肉顏色，對植物進行了選擇。必須特別選擇果肉的橙色顏色強度，因為一般地差的橙色顏色強度傾向于與果肉中的低pH酸相關(guān)(見表4)。
使用后代品系L53AZ A和L53AZ B和L53系與MEHARI的另一親本系雜交以分別獲得MEHARI AZ A、MEHARI AZ B和MEHARI，目前商業(yè)F1。
所有這些產(chǎn)品、品系和雜交均在農(nóng)藝試驗中進行測試，從果實收集了分析數(shù)據(jù)(表13)。
植物在實施例6所述條件下生長。顯示了每一實驗中測試的果實數(shù)目(nr.Frt.)。按實施例1-5所述進行測量。蔗糖(suc)、己糖(hex)和總糖的數(shù)值單位為g每100g鮮重(fwt)。檸檬酸和蘋果酸的數(shù)值單位是mg每100g鮮重(fwt)。
表13AMEHARI，低pH/高pH

表13BMEHARI的雜種，低pH/高pH

實施例12感觀分析由專家組對本發(fā)明植物的果實進行感觀分析。該專家組由12名成員組成，這些成員特別在描述香瓜質(zhì)地、甜味和酸味方面進行了訓(xùn)練。在專家評定前進行了6項訓(xùn)練。本研究的訓(xùn)練計劃是-訓(xùn)練1閱讀品味詞典。在集會室(assembly room)中注釋6種產(chǎn)品并進行討論以查看哪一描述法難于獲得一致意見。
-訓(xùn)練2在感觀分析實驗室中注釋2個產(chǎn)品+2次重復(fù)，以查看該專家組就個人而言如何評價這些描述法。
-訓(xùn)練3將訓(xùn)練2的結(jié)果呈遞給該專家組。在集會室中注釋2個產(chǎn)品+2次重復(fù)，并進行討論。在各單個小房間中分別進行2個產(chǎn)品的注釋。
-訓(xùn)練4以不同濃度的糖和酸溶液作為工作對象，以評價該專家組在這些描述法上的困難。將訓(xùn)練3的結(jié)果呈遞給該專家組。在集會室中注釋3個產(chǎn)品+1次重復(fù)，并進行討論。在各單個小房間中分別進行3個產(chǎn)品的注釋+1次重復(fù)。
-訓(xùn)練5在集會室中注釋4個產(chǎn)品，并在各單個小房間中注釋2個產(chǎn)品+2次重復(fù)。這允許我們檢查在該訓(xùn)練內(nèi)品味員的可重復(fù)性。以酸溶液作為工作對象。
-訓(xùn)練6在集會室中注釋3個產(chǎn)品，在各單個小房間中注釋2個產(chǎn)物+2次重復(fù)，以檢查在該訓(xùn)練中品味員的可重復(fù)性。
在配備有獨立小房間的空調(diào)感觀分析實驗室中進行感觀分析。使用以下描述法以及有客觀標(biāo)準(zhǔn)的10分評估級別(0至9)。
甜味定義其涉及口中感覺到的甜味感覺。品評方式咀嚼產(chǎn)品直到其消失。評估甜味的強度。注釋0＝不甜，9＝非常甜酸味定義其涉及口中感覺到的酸味感覺。品評方式咀嚼產(chǎn)品直到其消失。評估酸味的強度。注釋0＝不酸，9＝非常酸。
準(zhǔn)備方案
-在冷水中洗滌香瓜-縱向切開香瓜-除去瓤和種子-每一半香瓜切成3份(縱切)-除去3份的末端-將每一份一切為2，以便一半香瓜有6份產(chǎn)物的呈遞-根據(jù)呈遞計劃(Latin Square)以隨機數(shù)字編碼呈遞樣品，從而避免呈遞順序的影響。
-相繼地提供產(chǎn)品。
表14和15顯示在不同果實上進行的兩種感觀分析的結(jié)果。表14中，植物在三月初播種，并在四月初以藤蔓作物形式移植到受保護的露天田間(open protected field)。在7月初收獲果實。表14A中，果實在10℃貯存7天至12天，之后在20℃貯存2天。在表14B中，果實在10℃貯存4天至8天，之后在20℃貯存2天。
表15中，植物在八月初播種，并在八月末以木樁撐扶的作物形式移植到大棚中。在11月初收獲果實。果實在5℃貯存4天至8天，之后在20℃貯存3天。
對表中所示數(shù)目的果實進行感觀分析。每一果實由12名合格的品味員進行檢測。每個品系的酸味和甜味的數(shù)字是果實數(shù)目乘以12(因為有12名品味員)的平均值。表14和15也顯示了對所測果實的pH和糖及有機酸的含量的測量結(jié)果。
表14A

表14B

表15


實施例13分子標(biāo)記分析從幼葉(15日齡幼苗)提取DNA。葉進行冷凍干燥并按照Dellaporta(Dellaporta 1983)的方法提取DNA。
PCR循環(huán)條件是94℃變性15秒，之后54℃退火15秒、72℃延伸30秒，共40個循環(huán)。樣品的DNA首先在94℃變性2分鐘并在PCR之后72℃延伸2分鐘。
PCR混合物包含1.65mM MgCl2、每種脫氧核糖核苷酸各60mM、1×Taq緩沖液、0.2單位Taq聚合酶、15-20ng模板DNA和非熒光引物各400nM或熒光標(biāo)記的引物各200nM。熒光引物用6-FAM、NED或HEX標(biāo)記。熒光PCR產(chǎn)物在ABI3700毛細(xì)管測序儀上分離，使用Applied Biosystem的Genescan和Genotyper片段分析軟件測量產(chǎn)物大小。
非熒光PCR產(chǎn)物通過電泳在3％瓊脂糖凝膠(Resophor，Eurobio)中以400V加上冷卻系統(tǒng)進行分離。凝膠用溴化乙錠染色。使用三個標(biāo)記，CMAT141(描述在Danin-Poleg等(2001)Theor.Appl.Genet.10261-72和Danin-Poleg等(2002)Euphytica 125373-384)和NE0585及NE1746。以下顯示了用于這些標(biāo)記的引物。

實施例14分析種質(zhì)使用以上標(biāo)記分析包含低pH性狀的多份香瓜種質(zhì)(accessions)。下表16中報道了擴增的片段的大小。所示大小(bp)不是絕對的而是相對于使用相同引物對檢測到的其它大小的產(chǎn)物而言的。擴增片段的真實(確切)大小(例如通過測序確定的)可能與此處所示大小稍有不同(+/-1bp)。
表16

實施例15保留在植物上的果實的果實特征的演變?nèi)缭谝陨媳?5中的植物一樣種植植物。在通過收獲日期(HDT)和授粉日期(PDT)間的差異計算的不同成熟時間點(周期)收獲果實。當(dāng)在該周期中于特定時間點上果實的平均蔗糖含量達(dá)到每100g fwt 2.0g蔗糖時，以及使用其它成熟標(biāo)志例如側(cè)葉衰老，認(rèn)為在該周期中的該時間點上達(dá)到成熟。表17顯示了結(jié)果。
這些結(jié)果基于各單個果實的測量結(jié)果，可以理解一些果實可能由于損傷、異常發(fā)育或其它環(huán)境因素而產(chǎn)生偏離的數(shù)值。
表17
















實施例16收獲后果實特征的演變A.收獲試驗SP 03OF植物的果實(見表6和7C)，12℃貯存1周之后20℃貯存3天或者12℃貯存6周之后20℃貯存2天。貯存后測量果實的特征并顯示在表18中。
B.如以上表14中的植物一樣種植植物。收獲果實，12℃貯存1周之后20℃貯存3天。貯存后測量果實的特征并顯示在表19中。
表18


表19

序列表<110>Syngenta Participations AG<120>新的香瓜植物<130>70317 WOPCT<140>
<141>
<150>US 60/535,631<151>2004-01-09<150>ES 200400473<151>2004-02-27<160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>1aagcacacca ccacccgtaa<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>2gtgaatggta tgttatcctt g<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>3gtatcatgtc ggagaaacg<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>4cctttatccc cactttttc<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>5ttctccgatg tgtcctctc<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸<400>6gtcgcttgga atatatcgg
權(quán)利要求
1.能夠產(chǎn)生果實的香瓜(Cucumis melo)植物，其中所述果實在成熟時包含a)每100g fwt至少大約400mg檸檬酸；b)大約4.2至大約5.6的pH；和c)每100g fwt至少大約5.0g糖。
2.權(quán)利要求1的香瓜植物，其中所述果實中檸檬酸與蘋果酸的比率大于4.4。
3.權(quán)利要求1的香瓜植物，其中所述果實包含每100g fwt少于大約85mg的蘋果酸。
4.權(quán)利要求1的香瓜植物，其中所述果實包含大約1.6至大約3.8的平均酸味和大約4.3至大約5.8的平均甜味。
5.權(quán)利要求4的香瓜植物，其中所述果實包含大約2.5至大約3.8的平均酸味和大約4.3至大約5.6的平均甜味。
6.權(quán)利要求4的香瓜植物，其中所述果實包含大約1.6至大約3.0的平均酸味和大約5.2至大約5.8的平均甜味。
7.權(quán)利要求1的香瓜植物，其中使用標(biāo)記CMAT141的引物，從所述植物的DNA擴增出大約168bp至大約178bp的DNA片段。
8.權(quán)利要求7的香瓜植物，其中所述DNA片段長168bp、173bp、169bp、172bp或178bp。
9.權(quán)利要求1的香瓜植物，其中使用標(biāo)記NE0585的引物，從所述植物的DNA擴增出大約218bp至大約253bp的DNA片段。
10.權(quán)利要求9的香瓜植物，其中所述DNA片段長230bp、232bp、218bp、229bp、234bp或239bp。
11.權(quán)利要求1的香瓜植物，其中使用標(biāo)記NE1746的引物，從所述植物的DNA擴增出大約121bp至大約145bp的DNA片段。
12.權(quán)利要求11的香瓜植物，其中所述DNA片段長124bp、127bp、133bp、142bp或145bp。
13.權(quán)利要求1的香瓜植物，其中在所述果實達(dá)到成熟后當(dāng)果實保留于植物上時，所述果實的pH持續(xù)至少2天保持在大約4.2至大約5.6的所述范圍內(nèi)。
14.權(quán)利要求1的香瓜植物，其中當(dāng)果實被收獲并于20℃貯存至少5天或者于8-12℃貯存至少7天、然后于20℃貯存3天時，所述果實的pH保持在大約4.2至大約5.6的所述范圍內(nèi)。
15.權(quán)利要求1的香瓜植物，其中在所述果實達(dá)到成熟后當(dāng)所述果實保留在植物上時，所述果實的檸檬酸持續(xù)至少2天保持等于或大于每100g fwt大約400mg。
16.權(quán)利要求1的香瓜植物，其中當(dāng)果實被收獲并于20℃貯存至少5天或者于8-12℃貯存至少7天、然后于20℃貯存3天時，所述果實的檸檬酸保持等于或大于每100g fwt大約400mg。
17.權(quán)利要求2的香瓜植物，其中在所述果實達(dá)到成熟后當(dāng)所述果實保留在植物上時，所述果實的檸檬酸與蘋果酸的比率持續(xù)至少2天保持大于4.4。
18.權(quán)利要求2的香瓜植物，其中當(dāng)果實被收獲并于20℃貯存至少5天或者于8-12℃貯存至少7天、然后于20℃貯存3天時，所述果實的檸檬酸與蘋果酸的比率保持大于4.4。
19.權(quán)利要求1的香瓜植物，其中所述植物能夠產(chǎn)生低轉(zhuǎn)色或不轉(zhuǎn)色的果實。
20.權(quán)利要求1的香瓜植物，其中所述植物能夠產(chǎn)生低呼吸躍變或無呼吸躍變的果實。
21.權(quán)利要求1的香瓜植物，其中所述果實的果肉是橙色、白色、綠色或黃色。
22.權(quán)利要求1的香瓜植物，其中所述果實的中果皮占所述果實總鮮重的50％以上。
23.權(quán)利要求1的香瓜植物，其中所述香瓜植物包含低pH基因。
24.權(quán)利要求1的香瓜植物，其中所述低pH性狀能夠從IND-35系植物或所述IND-35系的后代獲得，IND-35系的代表性種子以保藏號NCIMB 41202保藏。
25.權(quán)利要求24的香瓜植物，其中所述低pH基因在所述植物中是純合的或雜合的。
26.權(quán)利要求1的香瓜植物，其中所述果實在成熟時包含a)每100g fwt大約600mg至大約1,200mg檸檬酸；b)大約4.2至大約5.1的pH；c)每100g fwt大約5.0g至大約15.0g糖。
27.權(quán)利要求1的香瓜植物，其中所述果實在成熟時包含a)每100g fwt大約400mg至大約650mg檸檬酸；b)大約4.6至大約5.6的pH；和c)每100g fwt大約5.0g至大約15.0g糖。
28.權(quán)利要求1-27之任一項的香瓜植物，其中所述植物是自交系。
29.權(quán)利要求1-27之任一項的香瓜植物，其中所述植物是雜種。
30.權(quán)利要求1-27之任一項的香瓜植物，其中所述植物是雙單倍體。
31.權(quán)利要求1-30之任一項的香瓜植物的種子。
32.權(quán)利要求1-30之任一項的香瓜植物的果實。
33.權(quán)利要求1-30之任一項的香瓜植物的果肉。
34.權(quán)利要求32的香瓜植物的果實在鮮切產(chǎn)品中的用途。
35.權(quán)利要求33的香瓜植物的果肉在鮮切產(chǎn)品中的用途。
36.增加第一香瓜(Cucumis melo)植物的果實的檸檬酸含量的方法，包括a)獲得第一香瓜植物；b)將所述第一香瓜植物與包含低pH性狀的第二香瓜植物雜交；c)獲得后代香瓜植物；d)測定所述后代香瓜植物的果實的pH；和e)選擇與所述第一香瓜植物的果實相比具有增加的檸檬酸含量和較低的pH的所述后代香瓜植物的果實。
37.權(quán)利要求36的方法，其中與所述第一香瓜植物的果實相比，所述后代香瓜植物果實的檸檬酸含量增加大約1.5至大約3倍，而且所述果實的pH降低大約1至大約2.5個pH單位。
38.權(quán)利要求36的方法，其中所述第二香瓜植物是IND-35系的植物或所述IND-35系的后代，其中IND-35系的代表性種子以保藏號NCIMB41202保藏。
39.能夠產(chǎn)生果實的香瓜植物，其中所述果實在成熟時包含平均大約1.6至大約3.8的酸味和平均大約4.3至大約5.8的甜味。
40.權(quán)利要求39的香瓜植物，其中所述果實在成熟時包含平均大約2.5至大約3.8的酸味和平均大約4.3至大約5.6的甜味。
41.權(quán)利要求39的香瓜植物，其中所述果實在成熟時包含平均大約1.6至大約3.0的酸味和平均大約5.2至大約5.8的甜味。
42.權(quán)利要求39的香瓜植物，其中所述果實具有大約4.2至大約5.6的pH。
43.權(quán)利要求39的植物，其中所述果實具有每100g fwt至少大約400mg的檸檬酸含量。
44.權(quán)利要求39的植物，其中所述果實具有每100g fwt至少大約5.0g糖的糖含量。
45.權(quán)利要求40-44之任一項的香瓜植物的種子。
46.權(quán)利要求40-44之任一項的香瓜植物的果實。
47.權(quán)利要求40-44之任一項的香瓜植物的果肉。
48.權(quán)利要求46的香瓜植物的果實在鮮切產(chǎn)品中的用途。
49.權(quán)利要求47的香瓜植物的果肉在鮮切產(chǎn)品中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的植物，具體地涉及能夠產(chǎn)生具有令人愉悅的新味道的果實的香瓜植物及其種子。本發(fā)明還涉及本發(fā)明香瓜植物的果實，其中該果實含有有機酸、低pH和高糖含量。本發(fā)明還涉及制備和使用本文公開的植物和果實的方法。
文檔編號A01H5/08GK1930297SQ200580007392
公開日2007年3月14日 申請日期2005年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月9日
發(fā)明者卡薩努瓦 J·I·阿爾瓦雷茲, B·豐塞勒, J-L·M·E·尼克里特, J·E·范多恩, S·M·奧利維爾 申請人:辛根塔參與股份公司