專利名稱：：番茄抗性等位基因的偶聯(lián)方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及具有商業(yè)重要性的普通番茄(Lycopersiconesculentum，L.)緊密連鎖基因的使用方法。具體地講，本發(fā)明涉及培育番茄植物，所述植物包含呈互引相(couplingphase)(順式)的最有效的番茄黃化曲葉病毒抗性基因(Ty-1)和最有效的線蟲抗性基因(Mi-1)，使得這些緊密連鎖基因作為一個單元共遺傳。
背景技術：
：栽培番茄具有超過200種文獻記載的病害(CompendiumofTomatoDiseases.J.B.Jones，J.P.Jones，R.E.Stall，T.A.Zitter主編(1997)AmericanPhytopathologicalSocietyPress，St.Paul，MN)。為了抵御這些病原體導致的損害，種植者通常采用病蟲害綜合治理策略，包括栽培技術和殺蟲劑的使用。栽培技術的一個實例是在番茄植株上使用網，這樣的網能提供有效隔離帶病昆蟲感染農作物的物理屏障。盡管大量探索性研究已經證明了針對植物病害的有效的轉基因方法，但是目前尚沒有種植者可用的能抵御任何病原體的轉基因番茄品種。此外，還存在著公眾阻力的問題，尤其是在歐盟，再加上獲得法規(guī)部門批準需要高成本，這些問題事實上已經阻止了這一有前景的技術用于商業(yè)化番茄栽培。采用傳統(tǒng)育種方法，將抗病性基因漸滲到現(xiàn)代栽培品種中，這一直是用于抵御大部分植物病害的有效技術。因為這一技術不斷獲得成功，所以仍然是番茄育種學術研究和商業(yè)化程序的主要焦點。在上百種番茄病原體中，由線蟲和番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)引起的病害對于商業(yè)種植者來說最重要。線蟲是全世界流行的，其分布范圍幾乎從南極到北極。除了分布廣泛之外，各種不同種類的線蟲還是具有包括大多數植物和動物在內的各種宿主范圍的病原體。例如，線蟲引起各種病害，從人類蟯蟲病(蠕形蟯蟲(Enterobiusvermicularis)是病原體)至番茄根結病，范圍如此之大。盡管有50多種根結線蟲，但是感染番茄的3種最重要的線蟲是花生根結線蟲(Meloidogynearenaria)、南方根結線蟲(M.incognita)和爪哇根結線蟲(M.javanica)。線蟲的根結種是按其感染植物所產生的根部結構類型而命名的。一旦成功感染后，線蟲產生激發(fā)子(elicitor)，導致植物根部增厚，在根部產生1mm-10mm癭瘤或根瘤結。這些變化促使營養(yǎng)物從植物轉運到線蟲。感染后形態(tài)發(fā)生變化的根同時也減少了對植物的水和營養(yǎng)物的供應。植物表現(xiàn)出營養(yǎng)攝取減少，同時從地上部分也可觀察到活力普遍下降。受感染的植物也表現(xiàn)出更特化的病癥，例如矮化、枯萎和黃萎。因為在生長季節(jié)建立起線蟲蟲口密度，所以枯萎越加明顯并影響座果。根結線蟲的化學防治是有效的，殺線蟲劑甲基溴對所有根結線蟲都具有良好防治效果。因為各種原因，包括對殺蟲劑施藥者的健康考慮和對臭氧耗竭的考慮，全球甲基溴的使用量正在減少。該化學防治劑的最終禁用，使得開發(fā)防治番茄線蟲病的替代方法變得重要起來。TYLCV是雙生病毒(geminivirus)，屬于菜豆金黃花葉病毒組(Begomovirusgroup)。與在幾乎所有土壤中廣泛存在的線蟲不同，番茄黃化曲葉病毒的分布僅局限在傳播該病毒的昆蟲媒介粉虱(煙粉虱(Bemisiatabaci)的范圍內。全球番茄商業(yè)化生產在過去25年內已經從溫帶移向熱帶種植地區(qū)，這是因為勞動力成本更低、運輸更好以及有了北美自由貿易協(xié)定(NorthAmericanFreeTradeAgreement)和世界貿易組織協(xié)定(WorldTradeOrganizationAgreement)等協(xié)定。這樣的地理遷移符合煙粉虱(B.tabaci)的分布。因此，隨著番茄種植區(qū)移向熱帶氣候，由TYLCV引起的病害變得更加明顯。TYLCV可通過粉虱攝食而快速傳播給番茄。一旦在植物中，病毒就復制并擴散到整個植株，盡管通常病毒局限在韌皮部。TYLCV引起植物的嚴重癥狀，從葉子卷曲黃化，到因節(jié)間長縮短而導致的矮化以及停止開花?？傊?，這導致植物出現(xiàn)灌木化現(xiàn)象(bush-likeappearance)。作物減產可能很嚴重；在二十世紀九十年代早期，多米尼加共和國的番茄減產約95％，而據報道，美國佛羅里達州僅在一季(1991-1992)就造成約1.40億美元的損失(Moffat，Science(1999)2861835)。對粉虱進行化學防治是有效的，但是番茄商業(yè)化生產中濫用殺蟲劑，已經產生了具有殺蟲劑抗性的煙粉虱，它可攜帶20多種不同的感染番茄的菜豆金黃花葉病毒(Morales，(2001)，CropProtection；Polston和Anderson(1997)PlantDisease811358-1369；Zeidan等(1999)AsiaTrop.Res.Ext.1107-115)。隨著番茄線蟲防治的最先進化學方法被逐步淘汰，TYLCV的化學防治方法也在減少，原因是多方面的，包括昆蟲媒介對殺蟲劑的抗性以及殺蟲劑使用所帶來的公眾健康問題。同樣，采用基因工程方法來產生轉基因抗性栽培品種的高昂的開發(fā)成本，也妨礙了對TYLCV抗性栽培品種的開發(fā)。因此，本領域技術人員知道，需要這些化學防治策略和轉基因策略的替代方法，以便在番茄生產中防治線蟲、雙生病毒(TYLCV)和其它植物病害。天然存在的抗性基因的漸滲現(xiàn)象，目前仍然是防治番茄病原體的最有效方法。盡管抗性表型的遺傳可以是定量的和多基因的，但是植物通常具有許多受到個體單基因座控制的顯性到半顯性抗性基因。植物抗性基因通常編碼作為受體的蛋白質，這些受體與特異性病原體編碼的配體結合。這類植物的病原體特異性識別并在隨后響應的現(xiàn)象，首先是在二十世紀四十年代后期由Flor描述的，被稱為“基因對基因(gene-for-gene)”抗性(有關綜述參見Flor(1971)Ann.ReviewofPhytopathology9275-296)。這樣的特異性受體-配體復合物觸發(fā)信號轉導途徑，最終產生抗性表型(Baker等(1997)，Science276726-733；Staskawicz等(1995)Science268661-667)。在響應病原體攻擊的所述識別過程中，宿主的反應可以是加固細胞壁，氧化爆發(fā)(oxidativeburst)，防御性基因表達的誘導，有時還有感染部位細胞快速死亡(稱為超敏反應)。對于大多數育種目的來說，商業(yè)育種者針對的是種質(germplasm)(常稱為“栽培型”)。容易針對種質進行育種，因為當評價園藝性能時，它通常表現(xiàn)良好。栽培型提供的性能優(yōu)勢通常被缺乏等位基因多樣性而抵消。當針對栽培種質時，會權衡育種者是否接受——更好的總體表現(xiàn)，僅僅是缺乏等位基因多樣性。育種者通常接受這樣的權衡，因為當針對栽培材料進行工作時，進程會比針對遺傳多樣性來源的育種工作要快。相比之下，當育種者進行廣泛種內雜交或者種間雜交時，會發(fā)生相反的權衡。在這些實例中，育種者通常將栽培種質與非栽培型雜交。在這樣的雜交中，育種者可得到來自非栽培型的新等位基因，但是必須克服供方親本相關的遺傳拖曳(geneticdrag)。該方法除了具有這樣的育種策略的困難之外，還常因為生育力或繁殖力問題而失敗。有許多可以與栽培番茄雜交的野生近緣種，包括潘那利番茄(L.pennellii)、多毛番茄(L.hirsutum)、秘魯番茄(L.peruvianum)、智利番茄(L.chilense)、小花番茄(L.parviflorum)、克梅留斯基番茄(L.chmielewskii)、奇士曼尼番茄(L.cheesmanii)、櫻桃番茄(L.cerasiforme)和醋栗番茄(L.pimpinellifolium)。野生種和普通番茄栽培種之間的遺傳距離與它們之間進行種間雜交并成功培育具有新增性狀的新型商業(yè)栽培品種的難度相關(Geneticsandbreeding.MAStevens和CMRick.載于TheTomatocropAscientificbasisforimprovement.JGAtherton和JRudich主編，Chapman和Hall，(1994)，London)。例如，醋栗番茄、櫻桃番茄、奇士曼尼番茄、克梅留斯基番茄和小花番茄等野生種是最容易用作將性狀漸滲到現(xiàn)代番茄中的供體。相比之下，潘那利番茄、智利番茄、多毛番茄和秘魯番茄要將性狀漸滲到現(xiàn)代番茄中則困難得多(出處同上)。當使用這些更遠緣的物種時，通常得使用過渡物種(bridgingspecies)和胚胎拯救，用于早期世代雜交。甚至在采用這些額外步驟后，人們還得面對明顯的分離異常(segregationdistortion)、生育力問題、減少的重組和遺傳拖曳。甚至在后生世代，在基因組漸滲區(qū)內的重組抑制也存在充分減少遺傳阻力的主要拖曳，以培育成功的商業(yè)化栽培品種。因此，盡管人們在野生種中可鑒定出有用性狀并將該性狀漸滲到栽培種中，但是并不能保證成功。最成功的商業(yè)化番茄育種者畢生工作，但也不能成功完成野生種的漸滲以培育商業(yè)化栽培品種。阻止成功的障礙包括分離異常，它可產生難以漸滲的野生基因組區(qū)。此外，現(xiàn)代番茄的某些野生種是自交不親和的，意味著它們不能自花授粉。自交不親和性的結果是這些植物是高度雜合的，在許多基因座上都具有不同等位基因。這些野生種的高度雜合性也能阻礙最有效的目標等位基因的漸滲。將野生近緣種的新等位基因漸滲到馴化作物的困難，在許多作物中都存在，以線蟲抗性基因漸滲到番茄中為例。Bailey((1941)Proc.Am.Hort.Sci.38573-575)首先鑒定了野生種秘魯番茄作為線蟲抗性的潛在來源。隨后，Smith((1944)Proc.Am.Soc.Hort.Sci.44413-416)采用胚胎拯救，成功獲得了具有線蟲抗性性狀的種間雜種。Gilbert和McGuire((1955)將該基因座命名為Mi，隨后將Mi作圖到6號染色體上(Gilbert(1958)TomatoGenet.CoopRep.815-17)。在Mi基因座上源自秘魯番茄的抗性等位基因稱為Mi-1等位基因。源自普通番茄的敏感等位基因稱為野生型等位基因，記為‘+’。據信，含有Mi-1抗性等位基因的所有商業(yè)化番茄栽培品種都來自Smith所培育的種間雜種。盡管純合Mi-1品系早在1949年就已開發(fā)出來(Frazier和Dennett，(1949)Proc.Am.Soc.Hort.Sci.54225-236)，但是直到二十世紀七十年代中期，Mi-1等位基因才開始廣泛用于商業(yè)化栽培品種。以下兩個進展導致了它實現(xiàn)商業(yè)化。首先，Rick和Fobes報道了稱為堿性磷酸酶(Aps)的同工酶標記與Mi基因座之間的連鎖((1974)TomatoGenet.CoopRep.2425)。分子標記實驗的早期使用，使得育種者不用進行病理學實驗就可跟蹤性狀。其次，商業(yè)種植者更能接受雜種番茄栽培品種。盡管用Mi-1等位基因進行育種長達60多年，但是今天仍然存在與來自秘魯番茄的Mi-1漸滲相關的明顯遺傳拖曳，包括在脅迫條件下的局部壞死反應(Ho等(1992)ThePlantJournal，2971)、果實較小、座果較少。育種者發(fā)現(xiàn)，Mi-1等位基因當作為雜合子存在時是有效的，這使得它們能夠將線蟲抗性性狀僅從一個親本傳遞到雜種。這反過來又使得育種者通過使用在其6號染色體的該區(qū)具有普通番茄基因的第二個近交親本，極大地克服遺傳拖曳。雜交栽培品種的培育允許進行該育種策略。將顯性Mi-1等位基因育種到近交親本之一中，再將敏感等位基因(‘+’)育種到第二個近交親本中，該敏感等位基因(‘+’)周圍是普通番茄等位基因，后者允許掩蔽大部分遺傳拖曳?？稍陔s合條件下掩蔽遺傳拖曳，提供了間接證據即該基因組區(qū)內具有影響植物一般健康、果實大小和果實收率的基因，因為能夠在脅迫條件下分別掩蔽局部壞死反應、果實較小和座果較少。已經知道，植物抗性基因在基因組中成簇存在，在番茄中通常發(fā)現(xiàn)是在著絲粒附近。Mi基因座位于這些抗病性簇之一上，靠近6號染色體的著絲粒。除了具有Mi抗性基因座之外，其它的雙生病毒抗性基因、番茄粉孢(Oidiumlycopersicum)抗性基因(vandeBeek等(1994)Theoret.Appl.Genet.89467-473)和番茄黃支孢小種2和5(Cladosporiumfulvumraces2and5)兩個抗性基因(Dickinson等Mol.PlantMicrobeInteract.(1993)6341-347)也都在6號染色體的著絲粒區(qū)在遺傳上緊密連鎖。甚至過了幾十年后，Mi-1漸滲的困難還是無法減少性狀相關的遺傳拖曳。該難題的替代性解釋是Mi-1抗性基因是多效基因，直接造成遺傳拖曳；或者該基因組區(qū)存在重組抑制，限制了遺傳拖曳減少的進程。為了解決該問題，已經進行了各種實驗方法。采用遺傳學和細胞遺傳學組合，Zhong等((1999)Theoret.Appl.Genet.98365-370)表明，根據番茄基因組大小，根據～1cM遺傳距離的遺傳估計，Mi基因座和Aps基因座之間的物理距離應該為約750,000堿基對。然而，對其進行熒光原位雜交(FISH)，結果表明該物理距離實際上為40,000,000堿基對。這些基因座間遺傳距離和物理距離間的偏差，使Zhong等人預測，與基因組平均值相比，Mi基因座周圍的重組減少了約50倍。Kaloshian等((1998)Mol.Gen.Genet.257376-385)做了一個比較遺傳實驗，表明秘魯番茄x秘魯番茄的雜交，與源自普通番茄x秘魯番茄的種群相比，該區(qū)的重組高出8倍。除了這些實驗之外，眾所周知，在著絲粒區(qū)重組通常是被抑制的。Milligan等(1998，PlantCell101307-1320)采用轉基因互補方法，將克隆的Mi抗性基因引入到敏感型栽培品種Moneymaker中。在這些互補試驗中沒有觀察到基因多效性效應，這強烈地表明，Mi漸滲相關的園藝缺陷是因為遺傳拖曳。這些研究有助于人們理解抗病性基因向該6號染色體區(qū)漸滲的相關障礙。1998年，Kaloshian等介紹了基于PCR的共顯性分子標記，稱為REX-1，該標記比起Aps同工酶標記更接近Mi基因座(MolGenGenet.257376-385)?；贒NA的該標記很快就用于番茄育種程序，極大地促進了新型線蟲抗性雜種栽培品種的開發(fā)。盡管番茄育種團體已經通過科學出版物快速公開了他們在Mi-1線蟲抗性等位基因漸滲方面的進展，但是USPTO從該領域頒布的若干專利(美國專利6,414,226、6,096,944、5,866,764和6,639,132)中已經知道，這些困難的育種方法是難以成功的。有關番茄黃化曲葉雙生病毒(TYLCV)抗性的報告已經存在了近40年。早在1964年，Cohen就首次報道了某些耐受性基因型(Cohen和Harpaz(1964)Entomol.Exp.Appl.7155-166)，隨后又鑒定出醋栗番茄和秘魯番茄含有更高水平的TYLCV抗性(Cohen和Nitzany(1966)Phytopathology561127-1131)。在二十世紀九十年代，Pilowski和Cohen報道了具有多達5個隱性基因的秘魯番茄(PI126935)的耐受性(PlantDisease74248-250)。Michelson等人發(fā)現(xiàn)((1994)Phytopathology84928-933)、并且由Hoogstraten(美國專利6,414,226)后來獨立證實了智利番茄的TYLCV抗性。該抗性基因座稱為Ty基因座，而來自智利番茄的抗性等位基因稱為Ty-1。與Mi基因座相同，Ty基因座上的敏感等位基因稱為野生型，即‘+’。Zamir等人將Ty基因座作圖到6號染色體的著絲粒區(qū)((1994)Theoret.Appl.Genet.88141-146)。Ty-1等位基因作為顯性等位基因起作用，因此Ty-1等位基因固定的品系或是雜合的品系(Ty-1/‘+’)都對TYLCV具有抗性。含有來自智利番茄的Ty-1抗性基因的番茄近交系FDR16-2045也具有針對線蟲的抗性，因為來自智利番茄的抗性基因也漸滲到附近Mi基因座(Hoogstraten，美國專利6,414,226)?？咕€蟲和雙生病毒的這兩個抗性基因在FDR16-2045品系中共同遺傳，證明Ty和Mi基因座在遺傳位置上是緊密連鎖的。在Mi基因座上的線蟲抗性等位基因，是從智利番茄漸滲到FDR16-2045品系，稱為Mi-J。FDR16-2045品系是有價值的育種近交系，因為它允許育種者培育出含有有效抗線蟲和雙生病毒的抗性等位基因的商業(yè)化雜種，通過使用在Mi和Ty基因座具有‘+’型等位基因的第二近交親本，這些雜種能夠消除大部分遺傳拖曳。來自該漸滲的遺傳拖曳在脅迫條件下可表現(xiàn)為自我壞死、節(jié)間較長、果實較小和座果較少。然而，通過病理學測試已經發(fā)現(xiàn)，來自智利番茄的Mi-J等位基因不如來自秘魯番茄的Mi-1等位基因有效。當F1雜種中Mi-J等位基因與Mi基因座上的‘+’敏感等位基因配對時，這一點尤為明顯。采用分子技術，本發(fā)明人能夠設計分子標記試驗，以鑒別Mi基因座上三種可能的等位基因(Mi-1、Mi-J和‘+’)。因此，番茄育種者面對他們能力上的局限傳遞作圖到6號染色體著絲粒區(qū)的多個抗性基因，同時又保留掩蔽這些漸滲相關遺傳拖曳的能力。為了使用作圖到雜種栽培品種6號染色體區(qū)上的所有已知抗性基因，育種者必須使用具有來自秘魯番茄的含線蟲抗性基因Mi-1的漸滲的一個親本，來自智利番茄的含TYLCV抗性基因Ty-1的漸滲的另一親本，來自多毛番茄的含粉孢屬(Oidium)抗性基因的另一親本，來自醋栗番茄的含支孢屬(Cladosporium)各小種抗性基因的漸滲的另一親本，以及來自普通番茄的含‘+’型等位基因的又一親本，以便掩蔽這些漸滲中某些相關的遺傳拖曳。這一任務對育種者來說是不可能的，因為他們僅有兩個可供選擇的親本系，以培育雜種栽培品種。Ho等((1992)ThePlantJournal2971-982，參見圖6)和Liharska等((1996)Genome39485-491，參見圖1)也用圖解說明了這一難題。因此，仍然需要鑒定已知具有被強烈抑制的重組的基因組區(qū)的重組事件，而且該區(qū)將含有最有效的線蟲抗性等位基因Mi-1(該基因原先是來自秘魯番茄的漸滲)，以及最有效的TYLCV抗性等位基因Ty-1(該基因原先是來自智利番茄的漸滲)。以這種方式并置的緊密連鎖的等位基因被認為是呈互引相，即順式。這種呈順式的有效抗性等位基因的組合將允許番茄育種者培育出具有最有效抗TYLCV和線蟲抗性的番茄雜種，同時又保留具有第二近交親本的自由性，以掩蔽遺傳拖曳或傳遞額外抗性基因(例如粉孢屬抗性基因、支孢屬抗性基因)或傳遞在該病害簇上有待發(fā)現(xiàn)的抗性等位基因。發(fā)明概述本發(fā)明提供一種普通番茄植物，所述植物在其基因組中包含至少一個番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)抗性等位基因和至少一個根結線蟲抗性等位基因，其特征在于所述抗性等位基因以互引相存在于同一條染色體的不同基因座上，該植物對TYLCV具有抗性并且對至少一種選自花生根結線蟲、南方根結線蟲和爪哇根結線蟲的根結線蟲具有高度抗性。也提供一種普通番茄植物，所述植物在其基因組中包含至少一個番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)抗性等位基因和至少一個根結線蟲抗性等位基因，其特征在于所述抗性等位基因以互引相存在于同一條染色體的不同基因座上，該植物對TYLCV和至少一種選自花生根結線蟲、南方根結線蟲和爪哇根結線蟲的根結線蟲都具有抗性，其中所述根結線蟲抗性等位基因不是來自智利番茄的Mi-J等位基因。在一個優(yōu)選的實施方案中，提供根結線蟲抗性評分小于約1.0的本發(fā)明植物，而在又一個優(yōu)選的實施方案中，提供根結線蟲抗性評分小于約0.5、更優(yōu)選小于約0.25和甚至更優(yōu)選小于約0.05的本發(fā)明植物。在一個實施方案中，所述植物是雜種植物。在一個優(yōu)選的實施方案中，TYLCV抗性等位基因是稱為Ty-1的等位基因。在另一個優(yōu)選的實施方案中，根結線蟲抗性等位基因是稱為Mi-1的等位基因。在又一個優(yōu)選的實施方案中，TYLCV抗性等位基因和根結線蟲抗性等位基因分別來自智利番茄和秘魯番茄。優(yōu)選TYLCV抗性等位基因和根結線蟲抗性是非轉基因的。本發(fā)明的另一方面提供所述普通番茄植物的果實或種子。本發(fā)明可提供近交的商業(yè)化普通番茄植物，或者本發(fā)明的植物可用作與另一普通番茄植物雜交的親本。因此，本發(fā)明提供雜種普通番茄植物，所述植物是通過將本發(fā)明植物與缺乏TYLCV抗性等位基因和缺乏根結線蟲抗性等位基因的近交植物雜交的方法而產生的。在本發(fā)明該方面的一個優(yōu)選實施方案中，提供雜種普通番茄植物，其中TYLCV抗性等位基因和根結線蟲抗性等位基因都是雜合的。更優(yōu)選所述雜種植物具有良好園藝特征，甚至更優(yōu)選雜種植物具有高度降低的通常與野生番茄品種漸滲相關的遺傳拖曳，提供TYLCV抗性等位基因和根結線蟲抗性等位基因。優(yōu)選所述雜種植物表現(xiàn)出高度降低的與野生種智利番茄相關的遺傳拖曳效應以及高度降低的與野生種秘魯番茄相關的遺傳拖曳效應。更優(yōu)選所述雜種植物表現(xiàn)出高度降低的選自以下癥狀的遺傳拖曳癥狀自我壞死、節(jié)間較長、果實較小、座果較少及園藝上低劣的植物結構(architecture)。TYLCV抗性等位基因和根結線蟲抗性等位基因的基因座出現(xiàn)在染色體的同一抗病性簇內。因此，在本發(fā)明的一個甚至更優(yōu)選的實施方案中，在簇內提供與Ty-1TYLCV抗性等位基因和Mi-1根結線蟲抗性等位基因呈互斥相(repulsionphase)即反式(intrans)的至少一個額外抗病性等位基因。在本發(fā)明該方面的一個替代實施方案中，額外的抗病性等位基因提供對選自支孢屬小種2、支孢屬小種5和粉孢屬的病害的抗性。附圖簡述參考以下附圖，將會更詳細地描述本發(fā)明的各種示例性圖2顯示Mi+、Mi-1和Mi-J等位基因附近的標記基因座多核苷酸序列的比較以及對陰影框內多核苷酸序列之間的20個單核苷酸多態(tài)性的鑒定。圓圈表明在堿基對603和754的多態(tài)性。圖3顯示5個植物基因型的平均線蟲抗性評分，包括在Mi基因座的不同等位基因組合。發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種番茄植物(普通番茄)，該植物是由重組事件產生的并且具有與Ty-1(該基因原先是來自智利番茄的漸滲)呈順式排列的Mi-1(該基因原先是來自秘魯番茄的漸滲)。定義植物學術語林奈(Linnaeus)被認為是植物分類學之父。盡管他最初將現(xiàn)代番茄歸類于茄屬(Solanum)，但是它的科學名稱多年來一直是普通番茄(Lycopersiconesculentum)。同樣，現(xiàn)代番茄的野生近緣種一直歸類于番茄屬(Lycopersicon)，例如潘那利番茄(L.pennellii)、多毛番茄(L.hirsutum)、秘魯番茄(L.peruvianum)、智利番茄(L.chilense)、小花番茄(L.parviflorum)、克梅留斯基番茄(L.chmielewskii)、奇士曼尼番茄(L.cheesmanii)、櫻桃番茄(L.cerasiforme)和醋栗番茄(L.pimpinellifolium)。在過去幾年里，番茄研究者和植物學家們一直在爭論，是否重新劃分這些物種名稱。建議給予現(xiàn)代番茄的新科學名稱是Solanumlycopersicum。同樣，野生種的名稱也可改變。潘那利番茄(L.pennellii)可改為Solanumpennellii，多毛番茄(L.hirsutum)可改為S.habrochaites，秘魯番茄(L.peruviaraum)可分為S.‘Nperuvianum’和S.‘CallejondeHuayles’、S.peruvianum和S.corneliomuelleri，小花番茄(L.parviflorum)可改為S.neorickii，克梅留斯基番茄(L.chmielewskii)可改為S.chmielewskii，智利番茄(L.chilense)可改為S.chilense，奇士曼尼番茄(L.cheesmaniae)可改為S.cheesmaniae或S.galagense，醋栗番茄(L.pimpinellifolium)可改為S.pimpinellifolium(SolanaceaGenomeNetwork(2005)Spooner和Knapp；http://www.sgn.cornell.edu/help/about/solanumnomenclature.html)。因此，盡管可以為了清楚的目的，改變番茄及其近緣種的名稱，但是現(xiàn)代番茄及其野生近緣種用現(xiàn)有名稱來定義，這全都落入番茄屬(Lycopersicon)之內。線蟲根結線蟲(Meloidogynespp.)在土壤中很常見，大多數具有廣泛宿主范圍，在許多一年生和多年生作物中造成麻煩。番茄是其中受影響最嚴重的，線蟲在所有番茄種植區(qū)都造成麻煩。根結線蟲難以鑒定，有50多種已鑒定，盡管少數種(例如爪哇根結線蟲、南方根結線蟲和花生根結線蟲)給番茄種植者造成很多麻煩。本文所用的術語“等位基因”是指在特定基因座上的基因的一個或多個替代形式，所有這些等位基因在一個特定基因座上涉及一個性狀或特征。在生物體的雙倍體細胞中，給定基因的等位基因位于染色體上的特定位置即基因座上。一個等位基因存在于同源染色體對的每條染色體上。雙倍體植物種在特定基因座上可包含大量不同的等位基因。本文所用的術語“基因座”是指染色體上的特定位置或位點，其上可存在例如基因或遺傳標記?！癕i基因座”在本文中是指番茄基因組上的位置，其中一個或多個等位基因位于其上，這些基因決定植物或植物組織的根結線蟲抗性程度。術語“Ty基因座”在本文中是指番茄基因組上的位置，其中一個或多個等位基因位于其上，這些基因決定植物或植物組織的TYLCV抗性程度。本文所用的術語“互引相(inthecouplingphase)”和“順式(incis)”是指兩個不同基因座的等位基因在一條(同源)染色體上發(fā)生連鎖的遺傳狀態(tài)。例如，當等位基因Ty-1和Mi-1位于一條同源染色體上時，這些等位基因就呈“互引相”。相反，如果等位基因Ty-1和Mi-1位于同源對的不同同源染色體上，它們則稱為“互斥相(intherepulsionphase)”，即“反式(intrans)”?！爸亟M”或“重組事件”在本文中是指植物具有因雜交和同源染色體獨立分配(assortment)而導致的新遺傳組合?！癟YLCV抗性等位基因”，是指當存在于基因組時賦予對番茄黃化曲葉病毒感染和/或損害的“抗性”或“中度抗性”的等位基因。當采用“TYLCV抗性測定”(參見下文)測得一種或多種植物的平均病害評分介于0和1之間或者等于0或1時，則這類植物被認為具有針對TYLCV的“抗性”。當采用TYLCV抗性測定測得一種或多種植物的平均病害評分約為2時，則這類植物被認為具有針對TYLCV的“中度”抗性。平均病害評分約為3以上的植物被認為是敏感型的?！案Y線蟲抗性等位基因”，是指當存在于基因組時賦予對至少一種或多種選自以下線蟲的抗性的等位基因南方根結線蟲、爪哇根結線蟲和花生根結線蟲。當采用“根結線蟲抗性測定”(參見下文)測得一種或多種植物的平均病害評分小于約0.1時，則這類植物被認為具有針對至少一種所述根結線蟲的“高度抗性(highlyresistant)”。例如Mi-1/Mi-1植物和Mi-1/+植物是高度抗性的。當一種或多種植物的平均病害評分約為0.1以上(但小于1.0)時(例如具有等位基因MiJ/MiJ的植物)，則這類植物被認為具有“中度抗性(intermediateresistance)”。平均病害評分為1.0以上(但小于2.0)的植物被認為具有“低度抗性(moderateresistance)”(例如具有等位基因MiJ/+的植物)，而平均病害評分為2.0以上的植物被認為是敏感型的(例如具有等位基因+/+的植物)?！癟YLCV抗性測定”是指如實施例所述，用0-4級量表，對于在發(fā)生自然TYLCV感染的田野上生長的多個植株，在感染后一個或多個時間點對其病害癥狀進行評分，并求出Ty基因座上具有特定等位基因組成(基因型)的多個植株的平均病害評分。“線蟲抗性測定”是指如實施例所述，用0-4級量表，對于在接種過南方根結線蟲、爪哇根結線蟲或花生根結線蟲接種物的土壤中生長的多個植株，在約28天后對其根結進行評分，并求出在Mi基因座上具有特定等位基因組成(基因型)的多個植株的平均病害評分。本文所用的術語“雜合”，是指當兩個不同的等位基因存在于特定基因座上，但是各自位于二倍體生物細胞內相應的同源染色體對上的遺傳狀況(例如Mi-1/+)。相反，本文所用的術語“純合”，是指當兩個相同的等位基因存在于特定基因座上，但各自位于二倍體生物細胞內相應的同源染色體對上的遺傳狀況(例如Mi-1/Mi-1)。本文所用的術語“植物”包括完整的植株(全植物)或其任何部分或衍生物，例如植物細胞、植物原生質體、植物細胞組織培養(yǎng)物(由此可再生出番茄植物)、植物愈傷組織、植物細胞團和作為完整植物或植物部分的植物細胞，例如胚胎、花粉、胚珠、果實(例如收獲的番茄)、花、葉、種子、根、根尖等等?！胺肿訙y定”(或試驗)是指(直接或間接)表示Mi或Ty基因座上特定等位基因存在與否的(基于DNA的)測定。而且，它允許人們確定單個植株的Ty或Mi基因座上特定等位基因是純合還是雜合的。例如，在一個實施方案中，使用PCR引物，擴增與Mi或Ty基因座連接的核酸，擴增產物用酶消化，然后根據擴增產物的電泳分離圖，人們可確定單個植株中是存在Mi還是存在Ty等位基因以及Mi或Ty基因座上等位基因的合子性(zygosity)(即各基因座上的基因型)。實例是SCAR、CAPS和類似測定。本文所用的術語“品種(variety)”或“栽培品種(cultivar)”是指已知最低級別的一種植物學分類單元內的植物集合，它可通過特征性表達而界定，是給定基因型或基因型組合的結果。本文所用的術語“野生型”是指在普通番茄中發(fā)現(xiàn)的天然存在的等位基因。在線蟲抗性基因座Mi和TYLCV基因座Ty上，這些來自普通番茄的野生型等位基因賦予對這些病原體的敏感性，并且在本文中被稱為Mi+和Ty+，或者簡稱為“+”。本文所用的術語“變異體”或“多態(tài)變異體”是指與給定核酸序列基本上相似的核酸序列。例如，術語“其變異體”或“任何SEQIDNO1-11的變異體”是指所述多核苷酸序列中具有一個或多個(例如2、3、4、5或更多個)核苷酸缺失的多核苷酸序列(缺失變異體)，或者所述多核苷酸序列的核苷酸被一個或多個其它核苷酸取代(取代變異體)或有一個或多個核苷酸插入到所述多核苷酸序列中(插入變異體)。SEQIDNO1-11的變異體包括與任何SEQIDNO1-11“基本上相似”的任何核苷酸序列。與SEQIDNO1-11基本上相似的序列是包含與一個或多個SEQIDNO1-11序列具有至少約90％、更優(yōu)選91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高核酸序列同一性的核酸序列，當優(yōu)化比對時，使用例如Needleman和Wunsch算法，用例如GAP或BESTFIT程序，采用缺省參數。GAP缺省參數是空位產生罰分＝50(核苷酸)和空位延伸罰分＝3(核苷酸)。對于核苷酸，所用的缺省打分矩陣是nwsgapdna(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS89，915-919)?？梢圆捎糜嬎銠C程序確定序列比對和％序列同一性的分值，例如GCG威斯康星軟件包，10.3版，得自AccelrysInc.，9685ScrantonRoad，SanDiego，CA92121-3752，USA，或者開放式源碼的軟件EmbossforWindows(現(xiàn)行版本2.7.1-07)。變異體也包括任何這些序列的片段或部分。本發(fā)明的植物和植物部分在一個實施方案中，本發(fā)明提供番茄植物(普通番茄)以及所述植物的植物細胞和組織、種子或果實，該植物在其基因組中包含與Ty-1(該基因原先是來自智利番茄的漸滲)呈順式排列的Mi-1等位基因(該基因原先是來自秘魯番茄的漸滲)。這些植物可用如下方法產生可以通過將公眾可得的商業(yè)化品種(各自包含(優(yōu)選固定的)目標等位基因(在本文中是Mi-1或Ty-1))進行雜交，再從得自雜交的F2植物中、或者經F1進一步自交或雜交(例如F2或回交群體)而得到的任何更遠的世代中，選擇包含順式Mi-1和Ty-1的重組植物。因為重組發(fā)生率極其低，所以需要大量事件，優(yōu)選采用一種或多種Mi等位基因特異性分子測定或等位基因鑒別分子測定(例如SCAR或CAPS測定)，來進行選擇。例如，如實施例所述，可以使用在本文中被稱為“Ty基因座的SCAR測定”、“Mi基因座的1號SCAR測定”和“Mi基因座的2號SCAR測定”這三種SCAR測定中的一種或多種。在這些測定中，在PCR反應中使用3種引物對(SEQIDNO1和2、SEQIDNO3和4、SEQIDNO5和6)，接著通過酶限制性消化，然后檢測所得片段，測定PCR擴增產物間的多態(tài)性?？梢岳斫猓Ｒ?guī)實驗可用于開發(fā)類似的測定方法。例如可使用任何引物序列的“變異體”、或與Mi和Ty基因座上或其附近的基因組的其它部分雜交的引物或探針。包含呈順式的Mi-1和Ty-1的植物可以是純合或雜合的。這些植物可用于進一步雜交，以將等位基因作為一個單元轉移到其它番茄植物，產生例如雜種或近交系。在一個優(yōu)選的實施方案中，提供雜種植物，這些植物在同源染色體中包含呈互引相的Mi-1和Ty-1等位基因和敏感等位基因即Mi+和Ty+等位基因。這些植物具有的益處是當這些等位基因以純合狀態(tài)存在時，具有明顯降低的通常與Mi-1和Ty-1等位基因相關的遺傳拖曳癥狀或者沒有遺傳拖曳癥狀。遺傳拖曳癥狀，是指與缺乏Mi-1和Ty-1等位基因的植物相比，一種或多種選自以下的癥狀自我壞死、節(jié)間較長、果實較小、座果較少及園藝上低劣的結構。本領域技術人員知道，遺傳拖曳的這類癥狀將會給種植者對近交或雜交植物系的商業(yè)可接受性帶來負面影響。一般而言，可通過一種或多種所述癥狀的存在，來確定遺傳拖曳的不利水平的存在，進而確定植物品系成為商業(yè)上不可接受的程度。本發(fā)明的番茄植物包括平均線蟲抗性評分小于約0.25，優(yōu)選小于約0.2，更優(yōu)選小于約0.1或小于約0.05，例如0.03或0.02。另外，這些植物對TYLCV具有抗性，當用所述測定方法進行檢測時，其平均TYLCV抗性評分小于或等于1.0。包含其它線蟲抗性等位基因和TYLCV抗性等位基因的植物在另一個實施方案中，本發(fā)明提供產生和/或選擇以上重組體的方法，以及產生和/或選擇其它重組體的方法，所述其它重組體具有呈互引相(順式)的至少一個Mi抗性等位基因和至少一個TYLCV抗性等位基因，優(yōu)選普通番茄的6號染色體。所述植物的特征是當用本文所述的抗性測定方法進行檢測時，對花生根結線蟲、南方根結線蟲和/或爪哇根結線蟲等線蟲具有高度、中度或低度抗性，并且對TYLCV具有抗性或中度抗性。也提供用該方法造成的重組事件，以及這些植物的組織、細胞、種子和果實，并使用任何這些植物來產生包含呈順式的Mi和Ty抗性等位基因的雜種或近交植物。然而，包含呈互引相的來自智利番茄的Mi-J等位基因和Ty-1等位基因的植物確實被排除在外，因為意外發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術中已存在這樣的植物(美國6,414,226)，盡管它們并不是按照本發(fā)明培育出來。在任何情況下，具有呈互引相的來自智利番茄的Mi-J等位基因和Ty-1等位基因的植物都沒有顯示出高水平的線蟲抗性，也就是說，按本文的定義不是高度抗性的。因此，特別優(yōu)選賦予TYLCV抗性和線蟲高度抗性的植物。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及培育番茄植物，所述植物包含呈互引相的賦予TYLCV抗性的等位基因和賦予根結線蟲抗性的等位基因。賦予TYLCV抗性的等位基因和編碼根結線蟲抗性的等位基因可首先來源于不同的種質資源(即不同種的番茄)，例如但不限于普通番茄、櫻桃番茄、醋栗番茄、奇士曼尼番茄、小花番茄、克梅留斯基番茄、多毛番茄、潘那利番茄、秘魯番茄、智利番茄或類番茄茄(Solanumlycopersicoides)。因此，在一個實施方案中，提供培育普通番茄植物的方法，所述植物包含在兩個基因座上呈互引相的至少一個TYLCV抗性等位基因和至少一個根結線蟲抗性等位基因，其中所述方法包括以下步驟(a)讓包含TYLCV抗性等位基因的番茄植物與包含根結線蟲抗性等位基因的番茄植物雜交，(b)采用一種或多種分子測定方法，分析所述雜交后代的這兩個基因座是否各自存在抗性等位基因，和(c)選擇一種或多種包含呈互引相的抗性等位基因的植物?？扇芜x在所述方法的任一階段進行抗性測定。還任選進行步驟(d)，該步驟(d)包括讓所得植物自交或者讓所得植物與另一番茄植物雜交，以產生雜種植物。在一個優(yōu)選的實施方案中，由此方法獲得的植物具有TYLCV抗性和線蟲高度抗性(如定義所述)?？刹捎脤嵤├龅牟±韺W試驗，選擇步驟(a)的起始植物。它們可以是野生或栽培植物，或是改良植物，例如誘變植物或轉化植物。例如，可以使用TILLING(TargetingInducedLocalLesionsINGenomics；McCallum等，2000，NatBiotech18455；McCallum等，2000，PlantPhysiol.123，439-442)或ECOTILLING(Henikoff等，2004，PlantPhysiologyPreview，2004年5月21日)等方法，產生和/或選擇具有改進的病原體抗性和/或Ty或Mi基因座的等位基因突變的植物。然后，這些植物可用作Ty和Mi抗性等位基因的來源。然后，用本發(fā)明的一種或多種分子測定方法(如下所述)，分析雜交后代。所分析并從所述植物中選出的后代可以是后代的任何不同世代，例如F2代、F3代等，回交代(BC1、BC2等)等，這取決于所需的雜交/選擇方案和所用植物中存在的等位基因。分子測定優(yōu)選在F2植物上進行。另外，可采用病理學測定和/或一種或多種分子測定方法，重復測定不同世代的后代。幾種分子測定方法可在同一代進行，或者一種或多種不同測定方法可在不同世代進行。因此，步驟(a)、(b)和/或(c)可重復若干次。其目的是鑒定包含呈互引相的所需Ty和Mi抗性等位基因的重組體(步驟c)。在該方法中，任何Ty抗性等位基因都可與任何Mi抗性等位基因組合(以互引相)?？梢圆捎梅肿訙y定方法，根據例如在Ty-基因座或其附近以及在Mi-基因座或其附近的核酸序列，將所述植物與其它植物區(qū)分開來。這樣的分析允許待測的這兩個基因座上的等位基因組合。例如，本發(fā)明的植物包含Mi基因座附近的SEQIDNO8或與其基本上相似的核酸序列(并在Mi基因座上表現(xiàn)出Mi抗性等位基因)、以及Ty基因座附近的SEQIDNO10或與其基本上相似的核酸序列(并在連鎖Ty基因座上表現(xiàn)出Ty抗性等位基因)，其中這些區(qū)域以互引相連接。優(yōu)選本文所述的一種或多種基于PCR的測定方法，用于區(qū)別Mi和和Ty基因座的不同基因型并選擇具有呈互引相的所需等位基因的重組植物。采用分子生物學、植物病理學和傳統(tǒng)育種技術，可以對包含呈互引相的Mi和Ty抗性等位基因的重組植物進行選擇，并使這個單一孟德爾單元向其它植物漸滲。在一個優(yōu)選的方法中，本發(fā)明使用分子生物學技術，以鑒別Ty和Mi基因座上的不同等位基因，以便將所需的TYLCV抗性和根結線蟲抗性等位基因順式結合到栽培番茄的基因組中。本發(fā)明有利于培育具有TYLCV和根結線蟲多重抗性的番茄雜種，同時提高了植物育種者掩蔽遺傳拖曳(該遺傳拖曳通常與這些性狀相關)的能力，同時保留了將Ty抗性和Mi抗性與粉孢屬(Oidium)抗性基因、支孢屬(Cladosporium)抗性基因或該基因簇上存在的有待發(fā)現(xiàn)的抗性基因相結合的自由。以舉例但非限制性方式來說，本發(fā)明提供對番茄種質的開發(fā)，所述番茄種質包含呈互引相的任何Ty抗性等位基因和任何Mi抗性等位基因，優(yōu)選作為順式共遺傳單元位于6號染色體上。一旦鑒定了植物具有高水平抗性(例如與Ty-1和Mi-1所提供的抗性水平相比)，則可以對本文所公開的與Mi和Ti基因座緊密連鎖的核酸區(qū)進行測序，其在連鎖標記區(qū)的序列信息用于開發(fā)分子測定，用于這些植物中所發(fā)現(xiàn)的等位基因。鑒定不同種質中的Mi或Ty抗性等位基因也有替代方法，這對本領域技術人員來說是顯而易見的。這些方法的更多細節(jié)如下。如上所述，本發(fā)明采用分子生物學、植物病理學和傳統(tǒng)育種技術。在一個實施方案中，所用的分子生物學技術包括使用例如核酸引物的標記測定，所述引物與連接Mi和/或Ty基因座的核酸區(qū)雜交(和擴增)，其更詳細討論如下。本發(fā)明不僅包括實施例中公開的具體測定方法(包括Ty-1和Mi-1等位基因)，而且包括任何可供開發(fā)并用于向番茄中漸滲呈互引相的任何編碼TYLCV抗性的等位基因以及任何編碼根結線蟲抗性的等位基因的測定方法。例如，本發(fā)明包括向番茄中漸滲Ty和/或Mi基因座任何變異體(例如直向同源物或進化分歧的天然等位基因或經誘變產生的等位基因)及包含呈順式的所述等位基因的植物世代。本文還提供通過任何所述方法得到的植物，并且使用這些植物作為親本與另一普通番茄植物進行雜交。要注意的是，本發(fā)明在技術上并不限于一種或多種具體的番茄品種，但是通常適用于番茄植物(包括自交系、雜種等)。本發(fā)明的分子測定方法本文提供許多分子測定方法，這些方法鑒別植物的Ty-基因座上Ty-1和Ty+的存在與否以及Mi基因座上Mi-1、Mi-J和/或Mi+的存在與否。這些測定方法中的一種或多種方法可用于標記輔助選擇，即測定植物在Mi和Ty基因座上的等位基因組合并選擇具有呈互引相的所需Mi和Ty抗性等位基因的植物?？墒褂贸Ｒ?guī)分子生物學技術，開發(fā)用于任何Mi和Ty抗性等位基因的類似測定。例如，可以使用SEQIDNO7-9(或變異體核酸序列)或者SEQIDNO10或11(或其變異體)的任何10、12、14、16、18、20、21、22、23、24、25、26、30或更多個連續(xù)核苷酸片段，來設計PCR引物對或核酸雜交探針，并開發(fā)鑒別分子測定方法，該方法是基于用所述引物對所擴增區(qū)域以及所述探針所雜交的核酸序列的核酸信息。所開發(fā)的測定方法的具體類型并不重要，只要它可鑒別Mi和/或Ty基因座上的Mi抗性等位基因和Ty抗性等位基因以及純合性/雜合性。在下文和實施例中給出不同類型的測定方法的實例。為了進行本發(fā)明方法中的標記輔助選擇，主題番茄植物或植物部分例如先進行DNA提取，該DNA提取技術是本領域已知的(參見Hnetkovsky等，CropSci.，36(2)393-400(1996))。一旦完成提取，即可進行分子測定，包括但不限于經切割的擴增多態(tài)序列(cleavedamplifiedpolymorphicsequence，CAPS)測定(參見Akopyanz等，NucleicAcidResearch，206221-6225(1992)和Konieczny&Ausubel，ThePlantJournal，4403-410(1993))或SCAR測定。SCAR測定包括通過PCR擴增基因座(例如Ty基因座或Mi基因座附近的特定基因座)上的DNA，然后用限制酶消化。核酸序列間的多態(tài)性是例如通過得到不同大小的限制片段，來區(qū)別不同等位基因(例如但不限于Mi+、Mi-J和/或Mi-1等位基因)。在這些測定中使用核酸引物和酶，以便鑒定番茄植物基因組內Ty和/或Mi基因座上存在哪些等位基因，而且，如果所述等位基因存在的話，這些等位基因是以純合狀態(tài)還是雜合狀態(tài)存在。得自這兩個基因座的信息用于鑒定在Ty和Mi基因座上具有呈互引相(即順式)的特定等位基因組合的植物。為了進行標記輔助選擇試驗，本領域技術人員一開始先比較供體來源(即含有抗病性性狀的種質)的DNA序列與來自受體來源(即含有特定病原體的敏感‘+’等位基因的種質)的相應DNA序列?；蛘撸梢栽谶z傳上與目標性狀緊密連鎖的基因組的相應位置上，對供體DNA和受體DNA間進行序列比較。對于Ty和Mi基因座，鄰近這些性狀的多態(tài)性的鑒定是本領域已知的(參見Zamir等，Theor.Appl.Genet.88141(1994)；Williamson等，Theor.Appl.Genet.87757(1994))。對于Ty-1等位基因，Zamir等人發(fā)現(xiàn)限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)TG97，它首先由Tanskley作圖(Tanskley等，Genetics1321141(1992))到與Ty基因座緊密連鎖。同樣，Williamson等人發(fā)現(xiàn)REX-1基因座與Mi基因座緊密連鎖。在一個實施方案中，所用的分子測定是SCAR測定，或實施例所述的幾種SCAR測定。例如，SEQIDNO10提供來自智利番茄LA1969的Ty-1等位基因附近的多核苷酸序列。SEQIDNO11提供來自普通番茄TG97基因座的野生型Ty+等位基因附近的多核苷酸序列。圖1顯示了這些序列的比較，強調這兩個序列間存在的幾個單核苷酸多態(tài)性(SNP)。SNP可以是取代突變體、插入體或缺失體，這些通常稱為INDELS。使用等位基因間的多態(tài)性，本領域技術人員將會知道，可以開發(fā)任何數量的標記輔助測定和引物(或探針)，用于SNP。所述測定可用于鑒別出抗性Ty-1等位基因與敏感Ty+等位基因。例如，引物對SEQIDNO1和2擴增約398bp的片段(用PCR擴增，用例如基因組番茄DNA作為模板)。隨后將擴增產物與酶TaqI(該酶識別和限制序列T↓CGA)一起孵育，使得從包含Ty-1等位基因的植物擴增而來的398bp產物經限制切割為約95bp和約303bp的兩個核酸片段。因此，Ty-1純合植物產生這兩個片段(可觀察到例如凝膠上的條帶或用其它方法來觀察)，而Ty+等位基因純合的植物將會產生約398bp的單一片段。雜合植物(Ty-1/Ty+)產生所有3個片段。根據Williamson等(TheoreticalandAppliedGenetics87757-763(1994))所公開的數據，采用類似方式，測定普通番茄、秘魯番茄和智利番茄靠近稱為REX-1的Mi的基因座上的多核苷酸序列。這三個多核苷酸序列見SEQIDNO7(對于Mi+特異性的)、SEQIDNO8(Mi-1)和SEQIDNO9(Mi-J)。這些多核苷酸序列的比較見圖2，該圖揭示出這三個序列間的20個SNP。可以理解，可以容易地修改本文所述的SCAR測定或用其它分子測定來替代，本文所述的SCAR測定也容易開發(fā)用于Ty-和/或Mi-基因座的任何等位基因。另外，該測定可根據并非SNP的其它多態(tài)性，例如兩個或多個核苷酸的缺失、插入或取代。如上所述，可以設計特異性引物或簡并引物，與所有或部分SEQIDNO7-11或者其任何變異體的所有或部分或基因組側翼區(qū)雜交并擴增?；蛘?，可以設計引物，以直接擴增部分抗性等位基因或鄰近Mi基因座和Ty基因座的其它核酸區(qū)。此外，需要時，可以修飾本發(fā)明的引物，用于其它標記輔助選擇測定，例如但不限于TaqMan測定(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)，使用本領域已知技術，包括但不限于美國專利第5,464,746號、第5,424,414號和第4,948,882號所介紹的技術。為了設計新的分子試驗，以鑒別新的Ty或Mi抗性等位基因，本領域技術人員知道，應該例如先測定在Mi或Ty基因座上或其附近的標記基因座的DNA序列(使用例如PCR擴增和本文所述的引物對并對擴增產物進行測序)，然后與其它標記序列(在Mi和Ty基因座的其它等位基因上或其附近)的相應DNA進行序列比較。有了該DNA比較后，本領域技術人員能夠鑒別新序列多態(tài)性或者是否存在先前用其它對比未發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性。使用這些數據，人們可以設計新的分子試驗，或者使用現(xiàn)有試驗，以便于選擇在Ty和Mi基因座上呈順式的任何等位基因組合。上述方法的類似方法可用于選擇和/或漸滲編碼根結線蟲抗性的等位基因。以舉例但非限制性方式來說，將會介紹用于確定番茄植物基因組中存在Mi-1等位基因的測定方法。用于確定Mi-1等位基因存在的測定方法可以按照如上所述的鑒定Ty-1等位基因的類似方式來進行。然而，如果懷疑所研究的植物可能含有Mi-J等位基因時，則對植物基因組中存在Mi-1等位基因的鑒定可能涉及(但并非必要)采用兩種分子測定方法，例如實施例所述的方法。在任何情況下，進行這些測定的順序并不重要。上述測定可單獨和聯(lián)合用于育種程序，以便于育種和/或選擇含有呈互引相的Ty抗性等位基因和Mi抗性等位基因的番茄植物。這些方法如何使用的一個非限制性實例描述如下，用于選擇含有呈互引相的Mi-1和Ty-1的植物。第一種近交番茄系可與第二種近交番茄系雜交，產生雜種植物。用于該雜交的一種番茄植物含有Ty-1等位基因，而第二種植物則在其基因組中含有Mi-1等位基因。然后，讓所得植物(F1雜種)自花授粉，受精和結籽(F2種子)。由F2種子生長出F2植物(或進一步自交或雜交，例如與親本之一回交)。然后提取這些植物的DNA，該技術是本領域已知的(參見Hnetkovsky等，1996，CropSci.，36(2)393-400)，并且對搗碎的組織樣品直接進行PCR。因此，上述測定可用于鑒定含有雜合態(tài)Ty-1等位基因和純合態(tài)Mi-1等位基因的F2植物(或其它后代)?；蛘?，人們可以鑒定含有純合態(tài)Ty-1等位基因和雜合態(tài)Mi-1等位基因的F2植物。因此，采用一種或多種分子測定方法，例如所述SCAR測定，可以鑒定包含呈互引相的Ty-1和Mi-1的重組植物。因為Ty和Mi基因座間的重組率低，所以發(fā)現(xiàn)F2代的重組體很罕見。本文所述的測定也可用于測定Ty-1和/或Mi-1等位基因是否以純合態(tài)或雜合態(tài)存在于植物基因組中。根據該測定的結果，可能需要進一步進行育種和分子表征。例如，如果育種程序的目標是產生近交系，且對于所測定的特定番茄植物的上述一種或多種測定的結果表明，該植物在其基因組中含有純合態(tài)的Mi-1等位基因和雜合態(tài)的Ty-1等位基因，那么可采用一種或多種本文所述的測定，對該植物進行進一步自花受精、育種和/或分子表征，直到確定所述植物及其后代在自交后，在其基因組中同時含有純合態(tài)的Mi-1等位基因和Ty-1等位基因為止。一旦產生了呈互引相(即順式)的Mi-1和Ty-1等位基因，它們將共同遺傳。這樣的多重抗性等位基因的遺傳單元給植物育種者提供了產生新雜種的靈活性，同時也讓植物育種者能夠掩蔽野生種對第二種近交親本漸滲的遺傳拖曳效應。另外，與其它抗性基因(例如粉孢屬和支孢屬抗性基因)的組合也是可能的。如上所述，本發(fā)明的方法可用于產生新的優(yōu)良近交系。這些近交系隨后可用于經育種產生賦予TYLCV抗性和根結線蟲抗性并具有其它商業(yè)所需特征的雜種番茄植物。所述近交系可用于育種，因為這些品系允許Ty-1和Mi-1等位基因作為一個共遺傳單元一起轉移，便于快速育種。此外，上述方法也可用于證實近交系在其基因組中事實上含有純合態(tài)的Ty-1等位基因和Mi-1等位基因并且保持其純合性。一旦得到這樣的證實，該近交系可用于與第二種近交系雜交，以將Ty-1等位基因和Mi-1等位基因作為一個共遺傳單元一起轉移到雜種番茄植物。第二種近交系可攜帶野生型等位基因Ty+和Mi+，以掩蔽遺傳拖曳的效應。本發(fā)明的試劑盒在再一個實施方案中，提供了用于測定Mi和/或Ty基因座上等位基因組成的分子測定。所述測定包括從一種或多種番茄植物中提取DNA，采用至少一個PCR引物對來擴增與Mi和/或Ty基因座連接或在其上的DNA部分，任選用一種或多種限制酶消化擴增產物，然后觀察DNA片段。還提供了檢測試劑盒，用于檢測植物或植物組織的Mi基因座和Ty基因座的等位基因組成。所述試劑盒包括一個或多個引物對，例如SEQIDNO1和2、SEQIDNO3和4和/或SEQIDNO5和6或它們的變異體。此外，還包括使用說明書和任選的植物材料或DNA(例如對照組織)。實施例線蟲抗性的功效評價FDR16-2045品系是美國專利6,414,226的主題。它在Ty基因座上含有Ty-1等位基因；該等位基因的起源來自智利番茄(一種現(xiàn)代番茄即普通番茄(L.esculentum)的野生近緣種)的漸滲。Ty-1等位基因賦予對商業(yè)上重要的病原體番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)的抗性。因為與該漸滲共遺傳，F(xiàn)DR16-2045品系在附近Mi基因座上含有Mi-J等位基因。Mi-J等位基因賦予對根結線蟲(另一類商業(yè)上重要的病原體)的抗性。在育種和病理學實驗中，Mi-J等位基因所賦予的根結線蟲抗性水平不如Mi基因座上的替代等位基因Mi-1有效。當Mi-J等位基因呈現(xiàn)出與來自普通番茄的‘+’型敏感等位基因配對的雜合態(tài)時，這一點尤為明顯。因此，本文所述的一系列病理學實驗定量測定了使用Mi-1和Mi-J抗性等位基因的抗性水平。實施例1用于測定南方根結線蟲抗性的病理學試驗使用活病原體測定，評價針對南方根結線蟲(一種番茄根結線蟲病的致病因子)的抗性?？剐栽u分根據癭瘤形成范圍和大小而定。表1提供了根結線蟲抗性測定的評分系統(tǒng)。采用0-4的量表(表1)，以評定南方根結線蟲病癥狀的分值。表1將來自敏感番茄系的植物感染2個月，制備南方根結線蟲接種物；此時，受感染植物的根部顯示出來自病原體的成熟卵塊。為了制備接種物，收獲根部，切成4-5厘米的小塊。試驗是在被感染接種物存在下使種子萌發(fā)。將種子播種到含有泥炭、蛭石和沙子(分別為4∶1∶1的比例)的土壤混合物的溫室育苗臺上。將來自某一個品系的種子成行播種，間距約4cm，行距4.5-5cm。在各行間以約12cm的間距打小洞，用于接種物。向這些洞內放入兩三塊制備好的接種物，用土覆蓋。每行兩側接種物交錯間隔，每粒種子距離接種物約6-7cm。幼苗在白晝溫度范圍為22-26℃的溫室內萌發(fā)生長。播種后28天，將每棵植株拔出，檢查根部癭瘤的存在，進行評分。用育種系、雜交系和對照系進行試驗，一式兩份。線蟲抗性的病理學試驗結果見表2。表21SuperRed是適于中東的市售普通番茄品種，由本發(fā)明的受讓人SeminisVegetableSeeds，Inc銷售。2Sadiq是適于中東的市售普通番茄品種，由本發(fā)明的受讓人SeminisVegetableSeeds，Inc銷售。3Margo是適于中東的市售普通番茄品種，由本發(fā)明的受讓人SeminisVegetableSeeds，Inc銷售。4MarmandeVerte是花青苷較少的品種，是公眾已知品種Marmande的突變型，在CommunityVarietyCatalogueoftheEuropeanCommunity(PublicationJournaloftheEU，C167A)上列出。左邊一欄是被測品系名稱。它們排列成包括育種系、雜交系和對照系在內的三個部分。旁邊一欄列出Mi和Ty基因座上的基因型。這些基因型通過本文所述的分子標記試驗測得。再旁邊兩個5欄包括在兩種獨立情況下進行試驗所評定的分值。最后5欄匯總這兩次試驗的結果。因為有14份在Ty和Mi基因座上具有不同基因型的樣品，所以表2中的表現(xiàn)趨勢難以識別。在14份樣品中，僅有5個是在Mi基因座的基因型。一種基因型是純合的，均來自普通番茄的敏感等位基因。這稱為+/+。第二種基因型是雜合的，是Mi-J等位基因與敏感‘+’等位基因配對。第三種基因型具有純合態(tài)Mi-J等位基因。第四、五種基因型含有Mi-1等位基因，分別以純合子和與‘+’等位基因構成的雜合子形式存在。當表2中的數據按照Mi基因座的基因型進行匯總和平均時，不同等位基因組合對線蟲抗性的功效就變得清楚了(圖3)。在圖3中，提供了對表2中的基因型的平均病害評分。按照Mi基因座上的基因型分析表2中的品系。這些基因型種類見Y軸。X軸提供這5類基因型的平均病害評分。圖3顯示最初來自秘魯番茄漸滲的Mi-1等位基因，賦予對線蟲的最強水平抗性。也很清楚，無論Mi-1以雜合子(含敏感‘+’等位基因)或以純合子存在，抗性都很強。這證明Mi-1等位基因以顯性方式賦予抗性。與其它基因型相比，基因型Mi-1/Mi-1和Mi-1/+對線蟲抗性賦予高度抗性表型。按照本文所述的方法進行測定，這種“高度抗性”類型定義為平均抗性分值小于0.1。下一個最具抗性的種類是來自具有以純合態(tài)存在的Mi-J等位基因的品系，該等位基因是來自智利番茄的漸滲。這類抗性定義為“中度抗性”，平均分值大于或等于0.1，但小于1.0。因此，近交系FDR16-2045具有中度水平的抗性。第三類抗性定義為“低度抗性”，其實例是具有與敏感等位基因‘+’配對的雜合態(tài)Mi-J等位基因的品系。該類的平均抗性評分大于或等于1.0，但小于2.0。如果近交系FDR16-2045用作近交親本以產生雜種栽培品種，并且如果第二親本含有敏感‘+’等位基因，則該雜種將會僅表現(xiàn)出低度抗性。當比較Mi-J等位基因在中度抗性和低度抗性種類中的表現(xiàn)時，顯而易見，該基因以半顯性方式起作用。最后一類定義為敏感型，包括那些具有純合態(tài)的來自普通番茄的敏感等位基因的品系(即+/+)。該敏感類定義為平均病害評分大于2。這些試驗結果表明，使用來自秘魯番茄(Mi-1)、智利番茄(Mi-J)和普通番茄(‘+’)的等位基因進行番茄育種時，可以達到不同水平的抗性。根據這些數據，番茄育種者可將在Ty基因座(Ty-1)含有抗性等位基因的近交系與在Mi基因座(Mi-1)含有最佳抗性等位基因的近交系雜交，產生雜種栽培品種。但是，該策略有兩個關鍵性限制。首先，這使得育種者不能傳遞作圖到6號染色體著絲粒區(qū)的病害簇的其它抗病性基因。已知作圖到該區(qū)的其它抗病性基因的實例是支孢屬小種2和小種5抗性基因和粉孢屬抗性基因。其次，因為育種者將原先各自來自野生種的兩個區(qū)進行漸滲(已知各自都能導致遺傳拖曳)，這限制了他或她掩蔽因使用來自現(xiàn)代番茄(L.esculentum)基因而導致的遺傳拖曳效應的能力。在本文所述的番茄植物中以順式存在的Ty-1和Mi-1提供了等位基因的新組合，這樣的組合可克服這些限制，使得番茄育種者對產生具有多重抗病性的栽培品種具有更多選擇性。實施例2番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)抗性測定方案該實施例描述了測定番茄植物對TYLCV是具有抗性、中度抗性還是敏感型的方案。讓植物在大田生長，通過煙粉虱進行TYLCV自然感染。自然存在的大田感染是測定病毒流行區(qū)內抗性的優(yōu)選方法，因為可以通過不同政府部門來控制病毒病原體的活動(對病害進行檢疫)。例如，美國農業(yè)部通常不允許將TYLCV病原體帶入通常不存在該病原體的美國大部分番茄種植區(qū)。在受控條件下進行病害篩選，是非常麻煩的，因為需要飼養(yǎng)昆蟲(煙粉虱)用于病毒傳播。使用0-4級量表(表3)，評定TYLCV病害癥狀表3當植物品系或品種的平均評分為0-1時，則認為它賦予TYLCV抗性；當平均評分為約2時，則具有中度抗性；而當平均評分大于3時，則為敏感型?；蛘撸部刹捎帽绢I域技術人員已知的測定TYLCV的方案?！錞omatoYellowLeafCurlVirusfromSardiniaisawhitefly-transmittedmonopartitegeminivirus(來自撒丁的番茄黃化曲葉病毒是粉虱傳播的monopartite雙生病毒)″；A.Keyyr-Pour，M.Bendahmane，V.Matzeit，G.P.Acotto，S.Crespi，B.Gronenborn；NucleicAcidResearch，第19卷，第6763-6769頁；TomatoYellowLeafCurlVirusawhitefly-transmittedgeminiviruswithasinglegenomiccomponent(番茄黃化曲葉病毒粉虱傳播的具有單一基因組組分的雙生病毒)″，N.Navot，E.Pichersky，M.Zeidan，D.Zamir，H.Czosnek.Virology，185，1991，第151-161頁。用于鑒別Mi和Ty基因座上的等位基因組成的分子試驗3種分子標記試驗用于測定Mi和Ty基因座的基因型。在Ty基因座上，僅需要一個共顯性分子標記試驗來鑒別兩種可能的等位基因Ty-1和‘+’。本領域技術人員將會知道，共顯性測定定義為鑒別雙等位基因基因座上所有3個等位基因可能性的試驗。在這些基因座上，可以對3種基因型進行評分——分別為純合型和雜合型。通常，標記測定，例如序列特征性擴增區(qū)域(sequencedcharacterizedamplifiedregions，即SCAR測定)、酶解擴增多態(tài)位點(cleavedamplifiedpolymorphicsites，即CAPS測定)和單核苷酸多態(tài)(singlenucleotidepolymorphic，即SNP測定)通常都是共顯性測定。相比之下，多態(tài)DNA隨機擴增和擴增片段-長度多態(tài)性(AFLP)通常都是顯性標記，所提供的信息不如共顯性標記那么多。在Mi基因座上，需要兩個試驗來測定這三個等位基因(Mi-1、Mi-J和‘+’)間的可能組合。盡管并非限制性的，但是本文所述的標記測定全都是SCAR型測定。與大多數其它分子標記試驗一樣，用聚合酶鏈式反應(即PCR)來進行SCAR測定，PCR可用極少量原料來擴增DNA約十億倍。PCR的使用方法是本領域技術人員眾所周知的，它使得研究人員僅需收獲極少量植物樣品，就可進行試驗。需要小于1cm2的葉片材料、優(yōu)選生長活躍的新生組織，來進行這些試驗。這么少的樣品使得這些標記試驗通常是非破壞性的。之所以認為它們是非破壞性的，是因為采樣不會以任何方式干擾植物的生長發(fā)育。因此，這么少的樣品不會影響大量后續(xù)試驗的結果，包括病理學試驗、果實生化分析、收率試驗或園藝學評價。除了是非破壞性的之外，SCAR測定在時間上也具有額外優(yōu)勢。通常，可在24小時之內確定目標基因座上的基因型。所用的3種分子標記試驗都需要分離基因組DNA。實施例3用于標記試驗的番茄DNA的分離以非限制性方式來說，以下方案可用于提取番茄DNA，用于后續(xù)分子標記試驗。本領域技術人員知道，在現(xiàn)有技術中，有許多DNA提取方案是可行的。本方案所述的所有化學品可得自SigmaChemicalCompany，SaintLouis，Missouri。該方法包括以下步驟1.采集植物部分，大小約為96孔微量滴定板各孔的大小。優(yōu)選使用種子樣品或取自嫩葉的組織樣品。2.向樣品中加入150μl提取緩沖液(200mMTris-HCl，pH7.5；250mMNaCl；25mMEDTA；0.5％SDS)，浸泡組織。3.將板于1900-xg、15℃離心15分鐘。4.將100μl上清液部分移至新的96孔板中，該板各孔裝有100μl2.5M乙酸鉀(pH6.5)。以200rpm振搖混合2分鐘。5.將板于1900-xg、15℃離心15分鐘。6.將75μl上清液部分移至新的96孔板中，該板裝有75μl異丙醇?；旌虾?，以200rpm振搖2分鐘。7.將板于1900-xg、15℃離心15分鐘。8.取出上清液部分，將200μl70％乙醇加入到沉淀部分。以200rpm振搖5分鐘，然后在-20℃孵育過夜。9.將板于1900-xg、15℃離心15分鐘。10.取出上清液部分。將200μl70％乙醇加入到沉淀部分，使乙醇在室溫下洗滌沉淀物達1小時。11.將板于1900-xg、15℃離心15分鐘。12.棄去上清液部分，將沉淀部分在室溫下干燥。這要花約1小時。13.在37℃，將沉淀部分溶于100μlTE(10mMTris，pH8.0，1mMEDTA，5μg/mlRNA酶A)中達15分鐘。除非繼續(xù)進行PCR步驟，否則，可將所得DNA貯存于4℃或-20℃。實施例4用于SCAR測定的通用PCR條件3種SCAR標記測定都共享類似的設計和實施方法。每種測定都含有稱為引物的一對特異性DNA寡核苷酸，因為它們將用于PCR反應，以引發(fā)DNA合成。這些引物的長度通常介于15-25個核苷酸；這些核苷酸的序列段是與有待擴增的標記基因座上的底物DNA序列相匹配的。設計這些引物，使得它們能促進通常介于100-1,000堿基對的擴增子的合成。本領域技術人員知道怎樣設計這些引物，以產生SCAR型測定，并且通常還使用軟件程序，例如公眾可得的Primer3軟件(WhiteheadInstitute，Cambridge，MA)，以輔助設計?？梢圆捎帽绢I域已知方法來合成引物，或者從許多委托合成寡核苷酸公司購買。用于這些測定的所有引物都購自OperonCompany，Alameda，CA。PCR反應的其它試劑可購自許多商業(yè)供應商；在本文所述的測定中，我們從PharmaciaCompany，Kalamazoo，MI購買了4種脫氧核糖核苷酸-5′三磷酸(dNTP)，從AppliedBiosystemsCompany，F(xiàn)osterCity，CA購買了PCR緩沖液和Taq聚合酶。本領域技術人員知道，在進行SCAR測定時可以有些靈活性，因為可以使用多種類型的PCR儀和測定條件。對于3種測定的每一種，采用得自AppliedBiosystemsCompany，F(xiàn)osterCity，CA的9700型PCR儀，使用以下運行參數。起始變性步驟是94℃2分鐘，接著是35次擴增循環(huán)。每次擴增循環(huán)具有以下3個步驟92℃30秒、50℃30秒、72℃90秒。第35次循環(huán)后，將樣品在72℃保持5分鐘。盡管這已結束PCR擴增測定，但是PCR儀的程序是在25℃保持最終反應，直到研究人員干預。本領域技術人員知道，PCR測定條件上有相當大的靈活性。PCR反應可在1μlDNA模板、各10皮摩爾的兩種測定-特異性PCR引物、終體積各200μM的4種dNTP、2.5μl10XPCR緩沖液和1.25單位Taq聚合酶中進行。用無菌水使反應終體積至25μl。各SCAR測定在PCR反應完成之后怎樣揭示多態(tài)性方面也具有共性。對于每次試驗，PCR反應所得DNA擴增區(qū)可含有多態(tài)限制酶識別位點。替代等位基因可以具有或不具有該識別位點。當用特異性限制酶消化PCR產物時，擴增子可不被切割(因為不存在限制酶位點)，或者可被不對稱消化成兩個片段?；蜃幕蛐涂蓽y定如下通過在瓊脂糖凝膠上電泳分離這些片段、凝膠用溴化乙錠(這是一種與DNA結合的染色劑)染色，然后在紫外線下激發(fā)DNA并用肉眼觀察這些片段。PCR反應片段大小是通過將其與在瓊脂糖凝膠電泳的附近泳道上的已知大小標準進行比較而確定的。2種SCAR測定使用限制酶TaqI，以揭示多態(tài)性。對于這些測定，在PCR反應后，向反應物中加入3μl10X限制酶緩沖液、0.25μlTaqI限制酶和1.75μl水，然后在65℃孵育約3小時。第3次測定使用限制酶NlaIII，以揭示基因型。在該試驗中，在PCR反應后，向反應物中加入3.5μl10X限制酶緩沖液、0.25μlNlaIII和6.25μl水，然后在37℃孵育約3小時。本領域技術人員知道，限制酶和緩沖液可購自許多商業(yè)賣主。我們使用來自NewEnglandsBiolabs，Beverly，MA的試劑。在用限制酶消化后，按照本領域眾所周知的方法(Currentprotocolsinmolecularbiology(1994)F.Ausubel主編，JohnWileyandSons，NewYork)，將產物在1-2％(w/v)瓊脂糖凝膠上進行電泳分離。實施例5Ty基因座上的SCAR試驗Zamir將Ty-1基因作圖到稱為TG97的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標記附近((1994)Theoret.Appl.Genet.88141-146)。因為RFLP測定較難進行，對植物造成破壞，成本高，實驗進度慢，所以該RFLP轉變成SCAR標記，即通過對RFLP基因座進行測序，使用‘+’等位基因和抗性等位基因Ty-1作為底物。對這些序列進行比較，能夠發(fā)現(xiàn)多態(tài)限制位點。如本文所述進行SCAR試驗，使用以下特異性引物對。SEQID15′TAATCCGTCGTTACCTCTCCTT3′，和SEQID25′CGGATGACTTCAATAGCAATGA3′?？梢酝ㄟ^在PCR后用限制酶TaqI進行消化，揭示多態(tài)性。如果Ty-1等位基因以純合子存在，398堿基對的PCR擴增子將會被消化成95和303堿基對片段，因為由該等位基因產生的擴增子含有TaqI限制性識別位點。如果‘+’型等位基因以純合子存在，398堿基對PCR擴增子將不會被TaqI酶消化。對于雜合樣品來說，約一半PCR反應物將會消化成95和303堿基對片段，而另一半PCR反應物則不會被消化。當用電泳分離時，雜合子將具有3種長度的片段即95、303和398堿基對。按照此方式，可以快速準確地測定Ty基因座的基因型。實施例6Mi基因座上的SCAR試驗1(鑒別Mi-1或Mi-J等位基因及‘+’等位基因)根據Williamson等(TheoreticalandAppliedGenetics87757-763(1994))所公布的數據，測定了普通番茄、秘魯番茄和L.在鄰近Mi基因座上的多核苷酸序列，稱為REX-1。如本文所述進行SCAR試驗(也由Williamson等人描述)，使用以下特異性引物對。SEQID35′AACCGTGGACTTTGCTTTGACT3′，和SEQID45′TAAGAACAGGGACTCAGAGGATGA3′。與本文所述的用于Ty基因座的SCAR測定類似，Mi基因座的SCAR測定#1也使用多態(tài)TaqI限制酶識別位點；可通過用限制酶TagI酶促消化PCR產物，揭示該多態(tài)性。如果Mi-1等位基因或Mi-J等位基因以純合子存在，或者Mi-1等位基因和Mi-J等位基因以雜合子存在，則595堿基對的PCR擴增子將會被消化成145和450堿基對片段，因為這些等位基因含有TaqI限制性識別位點。如果‘+’型等位基因以純合子存在，則595堿基對的PCR擴增子將不會被TaqI酶消化。對于雜合樣品(Mi-1/+或Mi-J/+)來說，約一半PCR反應物將會消化成145和450堿基對片段，而另一半PCR反應物則不會被消化。當用電泳分離時，這些雜合子將具有3種長度的片段即145、450和595堿基對。按照此方式，可以測定抗性等位基因(Mi-1或Mi-J)是否存在，或者敏感等位基因(‘+’)是否存在，或者抗性等位基因(Mi-1或Mi-J)和敏感等位基因(‘+’)是否以雜合子形式存在。實施例7Mi基因座上的SCAR試驗2(鑒別Mi-J與Mi-1或‘+’等位基因)因為以上實施例5所述的SCAR試驗不能鑒別Mi-1和Mi-J抗性等位基因，所以在REX-1標記上開發(fā)了另一種SCAR測定。該試驗是通過對在該標記基因座的Mi-1、Mi-J和‘+’等位基因進行測序而開發(fā)的。遺憾的是，對于3個等位基因的每一個來說，沒有具有不同多態(tài)性的單個核苷酸。發(fā)現(xiàn)單個堿基多態(tài)性在稱為NlaIII的限制酶識別位點上。具體地講，Mi-J等位基因含有該識別位點，而Mi-1和‘+’等位基因不含該識別位點。根據該多態(tài)性，開發(fā)出第二種SCAR測定，可如本文所述進行該測定，使用以下特異性引物對SEQID55′CTACGGAGGATGCAAATAGAASEQID65′AATCATTATTGTCACACTTCCCC可以按照本文所述的方法，進行PCR反應，通過用限制酶NlaIII消化反應物，揭示該多態(tài)性。如果Mi-J等位基因存在的話，282堿基對的擴增子將會被消化成124和158堿基對片段。如果Mi-1等位基因或者‘+’等位基因存在的話，擴增子則不會被NlaIII酶消化。雜合子(Mi-J/Mi-1或Mi-J/+)將具有所有3種片段(124、158和282堿基對)。使用Mi基因座(實施例5和6)上的SCAR測定，可以測定Mi基因座的基因型，無論這三個可能等位基因以哪種組合存在(Mi-1、Mi-J或‘+’)。實施例8在Mi和Ty基因座上結合最有效等位基因的育種方案從兩個親本系(分別含有固定的緊密連鎖的目標等位基因)開始，本領域技術人員將會知道一些遺傳策略可達到將這些目標性狀順式結合在一起的目標。然而，所有這些策略都始于分別含有目標性狀的親本系的雜交，以產生F1雜種。優(yōu)選親本系應各自固定一個目標性狀。F1植物可以自花授粉，以產生分離的F2群體，或者它可以與親本之一回交。無論雜交策略如何，本領域技術人員都將會知道，可以產生新的目標重組體，因為F1植物通過減數分裂產生配子。以非限制性方式來說，按照F2策略，順式結合Mi-1和Ty-1等位基因。具體地講，1997年秋季在法國尼姆(Nimes)進行了近交育種系FIR16-176和FDR16-2045間的雜交。這些育種系都來自本發(fā)明的受讓人SeminisVegetableSeeds，Inc.的番茄育種程序。近交系FIR16-176在Ty基因座含有敏感等位基因‘+’，在附近Mi基因座含有Mi-1等位基因。近交系FDR16-2045是美國專利6,414,226的主題，在Ty基因座含有Ty-1等位基因，在附近Mi基因座含有Mi-J等位基因。因此，稱為#1652817的F1植物在Ty和Mi基因座含有一對順式配對的等位基因，代表親本基因型。這些配對的等位基因通常一起加下劃線，下劃線代表基因座是遺傳連鎖的。例如，F(xiàn)1植物具有順式配對的‘+’Mi-1和Ty-1Mi-J。盡管當親本經歷了減數分裂時可以發(fā)生重組，但是卻沒有發(fā)生有效重組，因為這些品系各自固定在Mi和Ty基因座上。F1植物#1652817自花授粉，產生F2群體。因為F1植物通過減數分裂產生配子，所以大多數配子保留來自原有親本的等位基因組合(‘+’Mi-1和Ty-1Mi-J)。Ty和Mi基因座間的遺傳距離決定了產生重組配子(‘+’Mi-J和Ty-1Mi-1)的相對頻率。因為Ty和Mi基因座位置靠近，許多研究人員已經表明，重組在6號染色體的該區(qū)內是被抑制的，本領域技術人員可以預計，與親本配子相比，重組配子的數量將非常低。然后如本文所述，開發(fā)了一系列分子試驗，以鑒定具有順式Ty-1和Mi-1等位基因的重組體，因為如果沒有多年、多世代篩選，想通過表型病理學篩選，對該順式配對的表型進行鑒定是不可能的。本領域技術人員將會知道，對順式配對的等位基因進行表型鑒定是可能的，但是顯而易見，本文所述的分子鑒定方法，對于鑒定這些有用的等位基因組合來說，是更快速且有效得多的方法。2000年1月，對來自F1雜種1652817自交的504株F2幼苗進行采樣，用于DNA提取(實施例3)，然后采用本文所述的方法(實施例4和5)，對各樣品測定Ty基因座上的基因型。127株植物是敏感‘+’等位基因純合的；棄去這些植物。剩下377株植物是Ty-1等位基因雜合(Ty-1/‘+’)或者是Ty-1等位基因純合(Ty-1/Ty-1)，采用本文所述的方法(實施例4、6、7)，對它們進行分析，測定附近Mi基因座的基因型。選擇任何含有一個有利等位基因作為雜合子(Ty-1或Mi-1)和具有其它有利等位基因(Ty-1或Mi-1)固定作為純合子的植物，作為具有順式Ty-1和Mi-1等位基因。沒有預計到會有重組體，因為已有許多文件記載，在6號染色體的該區(qū)內重組是受抑制的。因此，沒有預計到會發(fā)現(xiàn)8個這樣的重組體。Kaloshian等人((1998)Mol.Gen.Genet.257376-385)表明，當將秘魯番茄和秘魯番茄的雜交，與普通番茄和秘魯番茄的雜交相比較時，該區(qū)的重組率高約8倍。甚至這一可能的解釋用于相當高的重組體產生率，但是這仍然無法預計的，因為所進行的雜交在其基因組區(qū)中含有多毛番茄和秘魯番茄DNA，而不是Kaloshian等(出處同上)的秘魯番茄與秘魯番茄的雜交。Mi-1和Ty-1漸滲已知分別導致遺傳拖曳。因此，因為發(fā)現(xiàn)的8個重組體中的每個都是獨特重組事件，這是減少與這些性狀的漸滲相關的拖曳的機會。進行了很多園藝上的評價，從這些評價中選出稱為#20和#251的兩株植物進行改進。這些植物都是Ty-1等位基因雜合(Ty-1/‘+’)和Mi-1等位基因純合的。因此，這些植物都含有呈順式的Ty-1和Mi等位基因，盡管該有利的順式組合不是固定的。在2000年春季，使F2植物#20和251自花授粉，產生F3群體。這些群體分別稱為97.5281.M20和97.5281.M251。采用本文所述的方法(實施例3-7)，對于這兩次事件，將Ty-1和Mi-1等位基因以純合態(tài)固定。為了確保分子試驗精確預測抗性表型，按照本文所述的方法(實施例1)，對這些來自植物#20和#251(97.5281.M20.M.1.1、97.5281.M251.M.1.1、97.5281.M251.M.2.1)的固定品系進行試驗，測定根結線蟲抗性。表2顯示這些具有獨特的Ty-1和Mi-1等位基因順式排列的品系對根結線蟲都具有高度抗性。采用本文所述的方法(實施例2)，在土耳其Antalya也測定了這些相同品系(97.5281.M20.M.1.1、97.5281.M251.M.1.1、97.5281.M251.M.2.1)的TYLCV。這些具有獨特的Ty-1和Mi-1等位基因順式排列的品系對TYLCV都具有抗性。Ty-1和Mi-1有效抗性等位基因的這種順式組合，使得番茄育種者能夠產生番茄雜種，所述雜種對TYLCV具有抗性而且對線蟲具有高度抗性，同時又保留具有第二近交親本的自由性，以掩蔽遺傳拖曳或傳遞額外的粉孢屬抗性基因或支孢屬抗性基因或傳遞在該病害簇上有待發(fā)現(xiàn)的抗性等位基因。該新方法為番茄種植者提供了控制大量病害病原體的機會，并且具有可接受的園藝品質，而不只是依賴于化學殺蟲劑進行控制，或者也不依賴于轉基因抗性策略。序列表<110>塞米尼斯蔬菜種子公司(SeminisVegetableSeeds)Hoogstraten，JacobusGerardusJoannesBraun，CarlJ<120>將抗性等位基因漸滲到番茄中的方法<130>34703/0041<140>US10/777,984<141>2004-02-12<160>11<170>PatentInversion3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>普通番茄(Lycopersiconesculentum)<400>1taatccgccgttacctctcctt22<210>2<211>22<212>DNA<213>普通番茄(Lycopersiconesculentum)<400>2cggatgacttcaatagcaatga22<210>3<211>22<212>DNA<213>秘魯番茄(Lycopersiconperuvianum)<400>3aaccgtggactttgctttgact22<210>4<211>24<212>DNA<213>普通番茄(Lycopersiconesculentum)<400>4taagaacagggactcagaggatga24<210>5<211>21<212>DNA<213>普通番茄(Lycopersiconesculentum)<400>5ctacggaggatgcaaatagaa21<210>6<211>23<212>DNA<213>普通番茄(Lycopersiconesculentum)<400>6aatcattattgtcacacttcccc23<210>7<211>916<212>DNA<213>普通番茄(Lycopersiconesculentum)<400>7gacacggacccactattctgaaactgatggtcattctttctctccttatcggagccttgg60tctgagtttccagtcttgcaagcaaagtgactagcttgacgtaagggatctgcacttaca120tcggtatcctgttgagttgcataaccagaaaccatggactttgctttgacttttttacct180gattcacgatgaacatctttctcctctaattcagcttcagataatagatcataactcttg240ccattgcaggcattatccttcttaaccatactggatttattggagaacacatcattttca300ccatcagaagacctcttgggactagaagtgggtaaggctgaagagggagcaacagaaggt360cgcgaattgcatagatccttttgtgaagaatctgcagctttaacactcaacaaagataga420gtactatccagatcttgcccagcctgctgttcctttttaacttgacctgttccagcacta480cctttgcttgcactagtgtccttccggtcagacaaggagacccttgctaccttttccttc540ctagagatgtcatcacatattttttccatagaatcctggggattacatgtcaaggaatct600cgcagttctctcccttttctcttaatcggagaatcattattgtcacacttccccttatgc660gttgacacatcggaaatataagcttctgggttctttgctgaaaccaagtctttctttgaa720tcatcctctgagtccctgttcttacatttgtcacgaatcatctctggcattttactgctt780gaactccatctagacttttcaacaacagggcaaaaggtctggttctcgtcatcgagtgca840tcatcttgtataatttttttggaagatacatctgattccacttcacttgtgttccttcta900tttgcatcctccgtag916<210>8<211>915<212>DNA<213>秘魯番茄(Lycopersiconperuvianum)<400>8gacacggacccactattctgaaaccgatggtcattctttctctccttatcggagccttgg60tctgaatttcccgtcttgcaagcaaattgactagcttgacgtaagggatctgcacttgca120tcggtatcctgttgagttgcataaccagaaaccgtggactttgctttgacttttttacct180gattcacgatggacatctttctcctctaattcagcttcagataatagatcataactcttg240ccattgcaggcattatccttcttaaccatactggatttattggagaacccatcattttca300ccatcagaagacctcttggcactagaagtgggaaaggctgaagagggagcaacagaaggt360cgcgaattgcatagatccttttgtgaagaatctgcagctttaacactcaacaaagataga420gtactatccagatcttgcccagcctgctgttcctttttaacttgacctgttccagcacta480cctttgcttgcactagtgtccttccggtcagacaaggagacccttgctaccttttccttc540ctggagatgtcatcacatattttttccatagaatcttggggattacatgtcaaggaatct600cgaagttctctcccttttctcttaatcggagaatcattattgtcacacttccccttatgc660gttgacacatcggaaatataagcttctgggttctttgctgaaaccaagtctttctttgaa720tcatcctctgagtccctgttcttacatttctcacgaatcatctctggcattttactgctt780gaactccatctagacttttcaacaacagggcagaaggtctggttctcgtcatcgagtgca840tcatctcgtataatttttttggaagatacatctgattccacctcacttgtgttccttcta900tttgcatcctccgta915<210>9<211>916<212>DNA<213>智利番茄(Lycopersiconchilense)<400>9gacacggacccactattctgaaactgatggtcattctttctctccttatcggagccttgg60tctgactttccagtcttgcaagcaaattgactagcttgacgtaagggatctgcacttaca120tcggtatcctgttgagttgcataaccagaaaccgtggactttgctttgacttttttacct180gattcacgatggacaactttctcctctaattcagcttcagataatagatcataactcttg240ccattgcaggcattatccttcttaaccatactggatttattggagaacccatcattttca300ccatcagaagacctcttgggactagaagtgggtaaggctgaagagggagcaacagaaggt360cgcgaattgcatagatccttttgtgaagaatctgcagctttaacactcaacaaagataga420gtactatccagatcttgcccagcctgctgttcctttttaacttgacctgttccagcacta480cctttgcttgcactagtgtccttccggtcagacaaggagacccttgctaccttttccttc540ctggagatgtcatcacatattttttccatagaatcctggggattacatgtcaaggaatct600cgaagttctctcccttttctcttaatcggagaatcattattgtcacacttccccttatgc660gttgacacatcggaaatataagcttctgggttctttgctgaaaccaagtctttctttgaa720tcatcctctgagtccctgttcttacatttgtcatgaatcatctctggcatcttactgctt780gaactccatctagacttttcaacaacagggcagaaggtctggttctcgtcatcgagtgca840tcatcttgtataatttttttggaagatacatctgattccacctcacttgtgttccttcta900tttgcatcctccgtag916<210>10<211>406<212>DNA<213>智利番茄(Lycopersiconchilense)<220><221>N<222>(328)..(328)<223>n為a、c、g或t<220><221>其他特征<222>(368)..(368)<223>n為a、c、g或t<400>10otaatccgtcgttacctctcctttgaactaaaatttttttgtcaaaagttacaaatctgt60ttattttatatattttttttcttggaattactatcgatatttttgtaattagaaggttag120aattggagtatatatgttgtgattggaacgatttgttgttgcctttatggtggcaattat180gtttacatgtgtcattggctaacttactgagtcatcttacttttttaataagaatgcttc240aaatgtttataatttcattagctcaatggtaattgtatttattgatgcatatatcttttt300tgttctagtttctgattatatcatgtancgaaacttatataaaaaataattagtaatagt360agtagaanatttatgacatcattgctattgaagtcatccggaatct406<210>11<211>407<212>DNA<213>普通番茄(Lycopersiconesculentum)<220><221>其他特征<222>(406)..(406)<223>n為a、c、g或t<400>11ctaatccgtcgttacctctcctttgaactaaaaatttgttgtcaaaagttacaaatctgt60ttattttatatacttttttcttggaattactatctttatttttgtaattagaaggttaga120attggagtatatatgttgtgattggaccgagttgctattgcctttatggtggaaattatg180tttacatgtgtcattgggtaacttactgagtcatcttacttttttaataagaatgcttca240tatgtttataattccattagctcaatggttattgtatttattgatgcatatatctttttt300gttctagtttctgattatatcatgtagcgaaacttatataaaaaataaatagtaatagta360gtagataattatgacatcattgctattgaagtcatccggaatctanc40權利要求1.一種普通番茄(Lycopersiconesculentum)植物，所述植物在其基因組中包含至少一個番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)抗性等位基因和至少一個根結線蟲抗性等位基因，其特征在于所述抗性等位基因以互引相存在于同一條染色體的不同基因座上，所述植物對TYLCV具有抗性，并且所述植物對至少一種選自花生根結線蟲(Meloidogynearenaria)、南方根結線蟲(Meloidogyneincognita)和爪哇根結線蟲(Meloidogynejavanica)的根結線蟲具有高度抗性。2.權利要求1的植物，所述植物的根結線蟲抗性評分小于約0.1。3.權利要求1的植物，所述植物的根結線蟲抗性評分小于約0.05。4.權利要求1的植物，所述植物的根結線蟲抗性評分小于約0.04。5.權利要求1的植物，所述植物的根結線蟲抗性評分小于約0.03。6.權利要求1的植物，其中TYLCV抗性等位基因是稱為Ty-1的等位基因。7.權利要求1的植物，其中根結線蟲抗性等位基因是稱為Mi-1的等位基因。8.權利要求1的植物，其中所述染色體是6號染色體。9.權利要求1的植物，其中所述TYLCV抗性等位基因和所述根結線蟲抗性都是非轉基因的。10.權利要求1的植物，其中所述TYLCV抗性等位基因和所述根結線蟲抗性等位基因分別來自智利番茄(Lycopersiconchilense)和秘魯番茄(Lycopersiconperuvianum)。11.權利要求1的植物的果實或種子。12.一種雜種普通番茄植物，所述植物是通過將權利要求1的植物與缺乏所述TYLCV抗性等位基因和缺乏所述根結線蟲抗性等位基因的近交植物進行雜交而產生的。13.權利要求1的雜種普通番茄植物，其中所述TYLCV抗性等位基因和所述根結線蟲抗性等位基因都是雜合的。14.權利要求13的植物，所述植物具有良好的園藝特征。15.權利要求13的植物，所述植物沒有可檢測的通常與野生番茄種漸滲相關的遺傳拖曳，所述漸滲提供所述TYLCV抗性等位基因和所述根結線蟲抗性等位基因。16.權利要求15的植物，其中所述遺傳拖曳效應通常是與野生種智利番茄相關的效應。17.權利要求15的植物，其中所述遺傳拖曳效應是與野生種秘魯番茄相關的效應。18.權利要求15的植物，所述植物沒有選自以下癥狀的遺傳拖曳癥狀自我壞死、節(jié)間較長、果實較小、座果較少及園藝上低劣的植物結構。19.權利要求13的植物，其中所述TYLCV抗性等位基因和所述根結線蟲抗性等位基因所在的基因座是在所述染色體的相同抗病性簇內。20.權利要求19的植物，所述植物包含所述簇內的至少一個額外的抗病性等位基因，其中所述額外的抗病性等位基因位于與具有所述TYLCV抗性等位基因和所述根結線蟲抗性等位基因的所述染色體呈反式的染色體上。21.權利要求20的植物，其中所述額外的抗病性等位基因提供針對選自支孢屬小種2(Cladosporiumrace2)、支孢屬小種5(Cladosporiumrace5)和粉孢屬(Oidium)的病害的抗性。22.權利要求1的植物作為親本在與另一種普通番茄植物雜交中的用途。23.權利要求1的近交商業(yè)化普通番茄植物。全文摘要普通番茄(Lycopersiconesculentum)植物，該植物在其基因組中包含至少一個番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)抗性等位基因和至少一個根結線蟲抗性等位基因，其特征在于這些抗性等位基因以互引相存在于同一條染色體的不同基因座上，該植物對TYLCV和至少一種選自花生根結線蟲(Meloidogynearenaria)、南方根結線蟲(Meloidogyneincognita)和爪哇根結線蟲(Meloidogynejavanica)的根結線蟲都具有高度抗性。文檔編號A01H1/00GK1946285SQ200580012147公開日2007年4月11日申請日期2005年2月11日優(yōu)先權日2004年2月12日發(fā)明者J·G·J·霍格斯特拉滕,C·布勞恩三世申請人:塞米尼斯蔬菜種子公司