專利名稱：植物發(fā)根誘導(dǎo)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過插枝繁殖植物時促進或誘導(dǎo)發(fā)根的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑。更詳細地說，本發(fā)明特別涉及，將松、杉、茶樹、胡桃等的難以發(fā)根的植物通過插枝進行繁殖時，促進或誘導(dǎo)發(fā)根的乙酮醇不飽和脂肪酸作為有效成分的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑。本發(fā)明進一步涉及，使得非常困難或不可能通過插枝進行繁殖的金絲桃或染井吉野櫻花樹的繁殖成為可能的、上述乙酮醇不飽和脂肪酸作為有效成分的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑。
背景技術(shù)：
植物的繁殖通常利用種子或插枝來進行，在前者利用種子繁殖的場合，通常要求種子為純系。這是因為不使用純系的種子則所繁殖植物的遺傳特性會成為各種各樣，但是在種子繁殖中很多植物難以獲得純系的種子。進而，在種子繁殖中，也有繁殖對象被限定于容易采得種子的植物這樣一些其他的問題。
因此，上述利用插枝的繁殖也被廣泛地使用，但是在插枝中很多植物難以發(fā)根，作為這樣的植物，例如有松、樅、鐵杉、杉、茶樹、木蘭、鵝掌楸、樸樹、栗子樹、橡樹、鵝耳櫪、胡桃、楊梅等。
因此，將這些植物進行插枝時，通常使用“ル一トン(有效成分1-萘基乙酰胺)”、“オキシベロン(有效成分吲哚丁酸)”等的植物生長素類發(fā)根誘導(dǎo)劑。但是，即使使用植物生長素類的發(fā)根誘導(dǎo)劑，上述植物發(fā)根困難的情況也很多。因此，發(fā)根誘導(dǎo)劑的使用量必然變多，從而讓人擔(dān)心會引起環(huán)境污染。進而，其使用方式煩雜，并且難以進行簡單的大量處理。即，必須將插枝或插芽的切口在高濃度的植物生長素溶液中浸漬數(shù)小時，或者在其每一個切口上都添加植物生長素的粉劑，不能以簡單方法來利用。
進而，先利用植物生長素類藥劑處理，再利用硝酸銀、高錳酸鉀、石灰水、乙醇等進行前處理的方法也被廣泛地實施，這樣不僅使發(fā)根誘導(dǎo)劑的使用煩雜，還進一步存在環(huán)境污染方面的問題。而且現(xiàn)狀是，即使以這樣的煩雜工序來進行，以樹木為主發(fā)根困難的植物的數(shù)量也很多。另外，作為樹木的特點，可以列舉如下，雖然在幼樹時可發(fā)根，但隨著其生長則迅速喪失了發(fā)根形成能力。因為這樣的性質(zhì)，能夠使用插枝的數(shù)量受到限制，這也是植樹造林工作困難的很大的原因。
本發(fā)明者們希望改變發(fā)根誘導(dǎo)劑的上述現(xiàn)狀，并且深切感受到其開發(fā)的社會必要性，進而著眼于其前景而努力進行發(fā)根誘導(dǎo)劑的研究開發(fā)，結(jié)果開發(fā)了吲哚類衍生物，發(fā)現(xiàn)其具有發(fā)根誘導(dǎo)性能，關(guān)于該衍生物已提出了專利申請(參照特開平10-77268號公報)。
本發(fā)明者們開發(fā)的上述吲哚類衍生物，作為植物發(fā)根誘導(dǎo)劑可通過散布等簡單的方法加以利用，在這方面可消除現(xiàn)有的植物生長素類發(fā)根誘導(dǎo)劑使用方式煩雜的缺點。
但是，上述吲哚類衍生物，與作為植物生長素類發(fā)根誘導(dǎo)劑代表性化合物的吲哚乙酸、吲哚丁酸等相同，也是吲哚類化合物，很難說其發(fā)根誘導(dǎo)性能充分地滿足了需要。
另外，除此以外，在植物生長素類發(fā)根誘導(dǎo)劑中還有萘乙酸等，但是顯示發(fā)根性能的化合物是有限范圍內(nèi)的物質(zhì)，還完全不知道脂肪族化合物、特別是以脂肪酸為基本骨架的物質(zhì)的發(fā)根誘導(dǎo)作用。
從這樣的情況出發(fā)，本發(fā)明者認為應(yīng)該從更廣范的化合物中尋找具有更優(yōu)異的發(fā)根誘導(dǎo)作用的化合物，其后持續(xù)努力進行了發(fā)根誘導(dǎo)劑及適合于發(fā)根誘導(dǎo)劑的新化合物的研究開發(fā)。這時，本發(fā)明者建立了以下假說，即，特別對于樹木來說，難以誘導(dǎo)發(fā)根，是否與休眠現(xiàn)象有關(guān)，并將焦點放在其控制上進行了研究。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，被認為具有“花芽形成促進作用”、“成長促進作用”、“休眠抑制作用”等的特定的乙酮醇脂肪酸(參照特開平11-29410號公報)，令人驚奇地也具有促進發(fā)根的作用，而且可通過散布等的簡單方法加以利用，并成功地開發(fā)了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種植物發(fā)根誘導(dǎo)劑，其具有植物發(fā)根誘導(dǎo)作用，特別是松、杉、茶樹、胡桃等的難以發(fā)根的植物通過插枝進行繁殖時具有優(yōu)異的發(fā)根促進或誘導(dǎo)性能，并且可通過散布等的簡單方法加以利用，而且將與現(xiàn)有的植物生長素類發(fā)根誘導(dǎo)劑化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)有很大差別的化合物，即乙酮醇不飽和脂肪酸作為有效成分。
本發(fā)明的另外的目的在于，提供一種對于金絲桃、染井吉野櫻花樹也是有效的發(fā)根劑，其將即使對于更難發(fā)根的金絲桃或所謂不可能發(fā)根的染井吉野櫻花樹，也令人吃驚地具有發(fā)根作用的上述乙酮醇脂肪酸中的特定α-乙酮醇不飽和脂肪酸作為有效成分。
本發(fā)明提供如上所述的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑，該植物發(fā)根誘導(dǎo)劑是含有乙酮醇不飽和脂肪酸而成的，所述乙酮醇不飽和脂肪酸是碳原子數(shù)為5～24的乙酮醇脂肪酸，碳原子間的雙鍵數(shù)為1～6個，并且具有α-乙酮醇結(jié)構(gòu)或γ-乙酮醇結(jié)構(gòu)。
作為上述乙酮醇不飽和脂肪酸，特別優(yōu)選9-羥基-10-氧代-12(Z)，15(Z)-十八碳二烯酸。
另外，本說明書和權(quán)利要求書中的“Z”和“E”，表示順式·反式異構(gòu)體，其中Z表示順式體，E表示反式體。另外，其下面附注的下劃線，表示Z”和“E”本來應(yīng)該以斜體進行標(biāo)記。
在本說明書和權(quán)利要求書的記載中，單數(shù)形，除非從其前后的記載明確其為單數(shù)的情況，也包含復(fù)數(shù)形。
本發(fā)明，提供了在通過插枝繁殖植物時可發(fā)揮必要的優(yōu)異發(fā)根性能的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑，特別是開辟了將松、杉、茶樹、胡桃等難以發(fā)根的植物通過插枝進行繁殖的途徑，并且提供將能夠表現(xiàn)出優(yōu)異的發(fā)根促進性能或誘導(dǎo)性能的乙酮醇不飽和脂肪酸作為有效成分的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑。
進而，本發(fā)明開辟了將更難以發(fā)根的金絲桃科、金絲桃屬的金絲桃(美容柳)(日本名ビヨウヤナギ、學(xué)名Hypericumchinensevar.salicifolla)和認為不能發(fā)根的薔薇科、櫻屬的染井吉野(櫻)(日本名ソメイヨシノ、學(xué)名PrunusyedoensisMatsumura)通過插枝進行繁殖的途徑。另外，對于因為生長迅速、樹干筆直的性質(zhì)而用于復(fù)合板材料的豆科、合歡(バラセリアンテス)屬的南洋楹(日本名モルツカネム、學(xué)名ParaserianthesfalcatariaBecker)，也可通過插枝進行繁殖。
另外，本發(fā)明的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑具有下述優(yōu)點，其不必如現(xiàn)有的植物生長素類發(fā)根誘導(dǎo)劑那樣，以如下方法來使用，即，將插枝或插芽的切口在高濃度的植物生長素溶液中浸漬數(shù)小時、或者在其每一個切口上都添加植物生長素的粉劑，而是可作為液劑或乳劑以散布、滴下或涂布等的簡單的方法來使用。
本發(fā)明的發(fā)根誘導(dǎo)劑的有效成分化合物，是以天然存在的不飽和脂肪酸作為基本骨架，在其上加成了2個氧和1個氫的具有單純的乙酮醇結(jié)構(gòu)的衍生物，而且因為在低濃度下可表現(xiàn)出規(guī)定的性能，所以也可降低現(xiàn)有的植物生長素類發(fā)根誘導(dǎo)劑污染環(huán)境的可能性。
進而，作為其有效成分的乙酮醇不飽和脂肪酸，是以不飽和脂肪酸作為基本骨架的脂肪族化合物，該不飽和脂肪酸與作為現(xiàn)有的植物生長素類發(fā)根誘導(dǎo)劑化合物代表性有效成分的吲哚類化合物或萘乙酸等的芳香族化合物相比，基本骨架有很大差異，化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)具有植物發(fā)根誘導(dǎo)作用，完全在預(yù)測的范圍之外。
因而，本發(fā)明在以下的方面，特別是植物發(fā)根誘導(dǎo)劑方面開辟了新的領(lǐng)域，并提供了卓越的技術(shù)。


該圖為表示實施例3的金絲桃發(fā)根誘導(dǎo)性能試驗結(jié)果的示意圖。
具體實施例方式
下面，詳細說明包含本發(fā)明最佳實施方式的本發(fā)明的實施方式。
作為本發(fā)明的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑有效成分的乙酮醇不飽和脂肪酸，如上所述，其是碳原子數(shù)5～24的乙酮醇脂肪酸，碳原子間的雙鍵為1～6個，并且具有α-乙酮醇結(jié)構(gòu)或γ-乙酮醇結(jié)構(gòu)。
上述具有α-乙酮醇結(jié)構(gòu)或γ-乙酮醇結(jié)構(gòu)的乙酮醇不飽和脂肪酸，是構(gòu)成羰基的碳原子與結(jié)合有羥基的碳原子為α位或γ位的不飽和脂肪酸。
上述乙酮醇不飽和脂肪酸也可用通式來表示，用通式表示時，前者的具有α-乙酮醇結(jié)構(gòu)的乙酮醇不飽和脂肪酸，為以下的通式(I)和(II)；后者的具有γ-乙酮醇結(jié)構(gòu)的乙酮醇不飽和脂肪酸，為以下的通式(III)和(IV)。
對于上述的具有α-乙酮醇結(jié)構(gòu)的乙酮醇不飽和脂肪酸必須加以選擇，使得在上述通式(I)和(II)中，R1為直鏈烷基或具有雙鍵的直鏈不飽和烴基，R2為直鏈亞烷基或具有雙鍵的直鏈不飽和烴鏈，并且至少R1和R2中的任一方具有1個雙鍵，且乙酮醇不飽和脂肪酸的全部碳數(shù)為5～24個，碳原子間的全部雙鍵為1～6個。
另外，對于具有γ-乙酮醇結(jié)構(gòu)的乙酮醇不飽和脂肪酸必須加以選擇，使得在上述通式(III)和(IV)中，R3為直鏈烷基或具有雙鍵的直鏈不飽和烴基，R4為直鏈亞烷基或具有雙鍵的直鏈不飽和烴鏈，并且乙酮醇不飽和脂肪酸的全部碳數(shù)為7～24個，碳原子間的全部雙鍵為1～6個。
對于上述乙酮醇不飽和脂肪酸，優(yōu)選將碳原子數(shù)為18、且有2個碳原子間雙鍵的化合物作為本發(fā)明發(fā)根誘導(dǎo)劑有效成分的化合物。作為優(yōu)選的乙酮醇脂肪酸的具體例，可列舉出，符合通式(I)的9-羥基-10-氧代-12(Z)，15(Z)-十八碳二烯酸[以下，也稱為特定乙酮醇脂肪酸(Ia)]，符合通式(II)的13-羥基-12-氧代-9(Z)，15(Z)-十八碳二烯酸[以下，也稱為特定乙酮醇脂肪酸(IIa)]，符合通式(III)的13-羥基-10-氧代-11(E)，15(Z)-十八碳二烯酸[以下，也稱為特定乙酮醇脂肪酸(IIIa)]，符合通式(IV)的9-羥基-12-氧代-10(E)，15(Z)-十八碳二烯酸[以下，也稱為特定乙酮醇脂肪酸(IVa)]等。
下面，記載特定乙酮醇脂肪酸(Ia)～(IVa)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

1.關(guān)于本植物發(fā)根誘導(dǎo)劑有效成分化合物的制備方法下面，對于作為本發(fā)明的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑有效成分的具有α或γ-乙酮醇結(jié)構(gòu)的乙酮醇不飽和脂肪酸的制備方法，用上述特定乙酮醇脂肪酸(Ia)～(IVa)為例來詳細說明。
特定的乙酮醇脂肪酸，可以利用與希望的乙酮醇脂肪酸的具體結(jié)構(gòu)相適應(yīng)的方法來制備，其如下所述。
(1)明確包含于天然物質(zhì)中的特定乙酮醇脂肪酸，可通過從該天然物質(zhì)中提取精制來制備(以下，稱為提取法)。
(2)根據(jù)植物體內(nèi)的脂肪酸代謝途徑，通過使脂肪加氧酶等的酶作用于不飽和脂肪酸，可獲得特定乙酮醇脂肪酸(以下，稱為酶法)。
(3)根據(jù)需要的特定乙酮醇脂肪酸的具體結(jié)構(gòu)，使用已知通常的化學(xué)合成法可獲得特定乙酮醇脂肪酸(以下，稱為化學(xué)合成法)。
關(guān)于這些制備方法，下面具體地進行說明。
(1)關(guān)于提取法特定乙酮醇脂肪酸(Ia)，可從作為浮萍科植物一種的青萍(Lemnapaucicostata)中提取精制來獲得。
成為該提取法原料的青萍(Lemnapaucicostata)是一種小型水草，其浮游于池塘和水田的水面上，并且漂浮于水面上的葉狀體下各自有一根根深入水中，已知其相對繁殖速度很快。其花在葉狀體的體側(cè)形成，2朵僅由1根雄蕊形成的雄花和1朵由雌蕊形成的雌花，共同被包含于小花苞內(nèi)。對該青萍的粉碎物實施離心分離(8000×g·10分鐘左右)，在所得的上清液和沉淀物中，可以將除去上清液的部分作為含有特定乙酮醇脂肪酸(Ia)的部分使用。這樣，特定乙酮醇脂肪酸(Ia)就可以將上述粉碎物作為起始材料進行分離、精制。
進而，作為優(yōu)選的起始材料，可以列舉出，將青萍漂浮或浸漬后使特定乙酮醇脂肪酸(Ia)溶出的水溶液。通過使用該水溶液可獲得特定乙酮醇脂肪酸(Ia)的濃度高的溶出液，可有效地制備特定乙酮醇脂肪酸(Ia)。此時，如后述那樣通過使用給予了干燥應(yīng)激等應(yīng)激者，可以獲得更高濃度的溶出液，所以優(yōu)選。制備該水溶液的具體例，記載于后述的實施例中。浸漬時間，在室溫下2～3小時左右即可，沒有特別的限制。
用上述的方法制備特定乙酮醇脂肪酸(Ia)的起始材料時，通過預(yù)先給予特定的應(yīng)激，可在青萍內(nèi)進行誘導(dǎo)以更好地產(chǎn)生特定乙酮醇脂肪酸(Ia)，在特定乙酮醇脂肪酸(Ia)的制備效率上優(yōu)選。具體來說，作為上述特定的應(yīng)激可列舉出干燥應(yīng)激、熱應(yīng)激、滲透壓應(yīng)激等。
干燥應(yīng)激，例如可在低濕度(優(yōu)選相對濕度為50％以下)室溫下，優(yōu)選為24～25℃左右，通過將青萍以張開的狀態(tài)放置于干燥過的濾紙上來給予應(yīng)激。這時的干燥時間，根據(jù)成為干燥對象的青萍的放置密度而不同，大概為20秒以上，優(yōu)選為5分鐘～5小時。
熱應(yīng)激，例如可通過將青萍浸漬于熱水中來給予應(yīng)激。這時熱水的溫度，應(yīng)根據(jù)浸漬時間而進行選擇。例如浸漬5分鐘左右時，可為40～65℃，優(yōu)選為45～60℃，更優(yōu)選為50～55℃。該熱應(yīng)激處理后，優(yōu)選迅速地將青萍放回至常溫的水中。
滲透壓應(yīng)激，例如通過使青萍接觸高濃度的糖溶液等的高滲透壓溶液來給予應(yīng)激。這時的糖濃度，例如是甘露醇溶液則為0.3M以上，優(yōu)選為0.5～0.7M。處理時間，例如使用0.5M甘露醇溶液時為1分鐘以上，優(yōu)選為2～5分鐘。
這樣，可有效地制備含有期望的特定乙酮醇脂肪酸(Ia)的起始材料。
另外，作為上述各種起始材料的來源的青萍的植株的種類，沒有特別限定，但p441植株，對于特定乙酮醇脂肪酸(Ia)的制備是特別優(yōu)選的植株。
將如上述那樣制備的起始材料進行如下的分離·精制操作，可制備期望的特定乙酮醇脂肪酸(Ia)。另外，這里所示的分離方法為例示，用于從上述起始材料制備特定乙酮醇脂肪酸(Ia)的分離方法，并不限定于上述例示的方法，可以沒有特別限制地采用各種方法。
對于如上述那樣制備的起始材料，首先進行溶劑提取，優(yōu)選提取出含有特定乙酮醇脂肪酸(Ia)的成分。在該溶劑提取中使用的溶劑，沒有特別的限制，可使用例如氯仿、乙酸乙酯、乙醚等。在這些溶劑中，基于比較容易除去雜質(zhì)的觀點而優(yōu)選氯仿。
對于該溶劑提取中獲得的油層級分，可使用已知通常的方法進行洗滌·濃縮，利用高效液相色譜法(HPLC)，該HPLC使用了ODS(十八烷基硅烷)柱等的逆相分配柱色譜用柱，通過鑒定、分離可以制備同樣也可作為花芽形成誘導(dǎo)活性級分的特定乙酮醇脂肪酸(Ia)。另外，特定乙酮醇脂肪酸被確認具有花芽形成誘導(dǎo)活性已是公知的(參照特開平10-324602號公報等)。
當(dāng)然，可以根據(jù)起始材料的性質(zhì)等來組合使用已知通常的其他的分離方法，例如超濾、凝膠過濾色譜等。以上，對于利用提取法來制備特定乙酮醇脂肪酸(Ia)的步驟進行了說明，期望形態(tài)的特定乙酮醇脂肪酸，存在于青萍以外的植物時，通過使用上述的方法、或上述方法的變化方法，也可制備該特定乙酮醇脂肪酸。
(2)關(guān)于酶法作為酶法的起始材料的典型材料，可列舉出，在期望的特定乙酮醇脂肪酸的結(jié)構(gòu)中相應(yīng)位置上存在雙鍵，并且其碳數(shù)為5～24的各種不飽和脂肪酸。作為該不飽和脂肪酸，可列舉出例如，油酸、異油酸、亞油酸、α-亞麻酸、γ-亞麻酸、花生四烯酸、9，11-十八碳二烯酸、10，12-十八碳二烯酸、9，12，15-十八碳三烯酸、6，9，12，15-十八碳四烯酸、11，14-二十碳二烯酸、5，8，11-二十碳三烯酸、11，14，17-二十碳三烯酸、5，8，11，14，17-二十碳五烯酸、13，16-二十二碳二烯酸、13，16，19-二十二碳三烯酸、7，10，13，16-二十二碳四烯酸、7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸、4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸等，但并不限定于這些不飽和脂肪酸。
這些不飽和脂肪酸，大致是動物·植物等所含的不飽和脂肪酸，可使用通過已知的通常方法從這些動物·植物等中提取·精制者、或者通過已知的通常方法進行化學(xué)合成者，當(dāng)然也可以使用市售品。在該酶法中，將上述的不飽和脂肪酸作為底物，使脂肪加氧酶(LOX)進行作用，在這些不飽和脂肪酸的碳鏈上導(dǎo)入氫過氧基(-OOH)。
上述脂肪加氧酶，是將分子型氧作為氫過氧化基導(dǎo)入到不飽和脂肪酸的碳鏈上的氧化還原酶，無論動物·植物都已確認其存在，另外，即使在以酵母菌屬為代表的酵母中也確認其存在。
例如，如果是植物，則是在所有的被子植物(具體來說，可適用后述本發(fā)明的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑的所有的雙子葉植物和單子葉植物)中，已確認其存在的酶。
這些植物中，特別優(yōu)選大豆、亞麻、苜蓿、大麥、蠶豆、羽扇豆、兵豆、豌豆、馬鈴薯、小麥、蘋果、面包酵母、棉花、黃瓜、醋栗、葡萄、西洋梨、四季豆、稻米、草莓、向日葵、或茶等作為脂肪加氧酶的原料。另外，因為葉綠素阻礙脂肪加氧酶的上述活性的傾向很強，所以最好盡可能地選擇在植物中不存在葉綠素的種子、根、果實等作為脂肪加氧酶的原料。
在本發(fā)明中的脂肪加氧酶，只要是可將氫過氧化基導(dǎo)入到不飽和脂肪酸的碳鏈的期望位置上者即可，并不限定其來源，但在特定乙酮醇脂肪酸(Ia)的場合，盡可能優(yōu)選使用可選擇性地將亞油酸或亞麻酸的9位的雙鍵部分氧化的脂肪加氧酶。作為這樣的選擇性脂肪加氧酶的代表性酶，可列舉出例如，來源于稻米胚芽(rice germ)的脂肪加氧酶[Yamamoto，A.，F(xiàn)uji，.Y.，Yasumoto，K.，Mitsuda，H.，Agric.Biol.Chem.，44，43(1980)等]。
作為上述選擇性脂肪加氧酶的底物而選擇的不飽和脂肪酸，優(yōu)選使用亞油酸或α-亞麻酸。另外，以不飽和脂肪酸作為底物來進行脂肪加氧酶處理時，當(dāng)然優(yōu)選在所使用的脂肪加氧酶的最適溫度和最適pH下進行酶反應(yīng)。另外，通過上述的脂肪加氧酶反應(yīng)步驟所產(chǎn)生的、不希望產(chǎn)生的雜質(zhì)，利用已知通常的方法，例如上述(1)中所述的HPLC等，可容易地進行分離。
上述脂肪加氧酶，可以是利用已知的通常方法從上述植物等中提取·精制的酶，或者也可以使用市售品。這樣就可以從上述不飽和脂肪酸制備氫過氧化不飽和脂肪酸。該氫過氧化不飽和脂肪酸，可作為用特定的乙酮醇脂肪酸的酶法進行制備步驟的中間體而占有位置。
作為上述氫過氧化不飽和脂肪酸，例如作為上述特定乙酮醇脂肪酸(Ia)的中間體，可列舉出，可將脂肪加氧酶作用于α-亞麻酸而獲得的9-氫過氧化基-10(E)，12(Z)，15(Z)-十八碳三烯酸；另外作為特定乙酮醇脂肪酸(IIIa)的中間體，可列舉出13-氫過氧化基-9(Z)，10(E)，15(Z)-十八碳三烯酸。
關(guān)于這些氫過氧化不飽和脂肪酸，將前者的9-氫過氧化基-10(E)，12(Z)，15(Z)-十八碳三烯酸作為與本發(fā)明相關(guān)聯(lián)的氫過氧化脂肪酸(Ia′)，另外將后者的13-氫過氧化基-9(Z)，11(E)，15(Z)-十八碳三烯酸作為與本發(fā)明相關(guān)聯(lián)的氫過氧化脂肪酸(IIIa′)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式記載如下。
特定乙酮醇脂肪酸，可通過將氫過氧化不飽和脂肪酸作為底物，并使環(huán)氧丙烯合酶(alleneoxide synthase)與其進行作用來制備。該環(huán)氧丙烯合酶，是具有將氫過氧化基經(jīng)環(huán)氧化而變換為乙酮醇體活性的酶，并且是與上述脂肪加氧酶同樣存在于植物、動物及酵母的酶，如果是植物，則在所有的被子植物[具體來說，后述的可適用本發(fā)明植物發(fā)根誘導(dǎo)劑的所有雙子葉植物及單子葉植物]中已存在的酶。另外，該環(huán)氧丙烯合酶，如果是植物，則已確認其存在于大麥、小麥、玉蜀黍、棉花、茄子、亞麻(種等)、萵苣、燕麥、菠菜、向日葵等中。
關(guān)于在本發(fā)明中制備特定乙酮醇脂肪酸中使用的環(huán)氧丙烯合酶，例如，只要是可將上述的9-氫過氧化基-10(E)，12(Z)，15(Z)-十八碳三烯酸的9位的氫過氧化基進行脫水來形成環(huán)氧基，進而通過OH-的親核反應(yīng)，結(jié)果獲得期望的特定乙酮醇脂肪酸者即可，并沒有特別限定。這里所使用的環(huán)氧丙烯合酶，可使用通過已知的通常方法從上述植物中提取·精制的酶，也可以使用市售品。并且，上述的2步驟的酶反應(yīng)，可分別進行，也可以連續(xù)進行。
在利用上述的環(huán)氧丙烯合酶進行處理時，當(dāng)然優(yōu)選在所使用的環(huán)氧丙烯合酶的最適溫度及最適pH下進行酶反應(yīng)。進而，對于上述酶，可使用粗純化品或純化品，通過使用其來進行上述酶反應(yīng)，可獲得期望的特定乙酮醇脂肪酸。另外，將上述酶固定于載體上，制備這樣的固定化酶并通過對底物進行柱處理或批處理等，可獲得期望的特定乙酮醇脂肪酸。
另外，作為上述2步驟中使用的酶的制備法，也可以使用基因工程的方法。即，將編碼這些酶的基因，利用一般方法從植物等中提取·獲得，或者根據(jù)酶的基因序列利用化學(xué)合成來獲得，利用這樣的基因，將大腸桿菌或酵母等的微生物、動物培養(yǎng)細胞、植物培養(yǎng)細胞等進行轉(zhuǎn)化，在這些轉(zhuǎn)化細胞中，通過使重組酶蛋白質(zhì)進行表達，可獲得期望的酶。
在利用形成環(huán)氧基后的OH-的親核反應(yīng)(上述)來獲得特定乙酮醇脂肪酸的場合，根據(jù)該親核物的上述環(huán)氧基附近的作用形式，除了生成α-乙酮醇脂肪酸之外，還可生成γ-乙酮醇化合物。
該γ-乙酮醇化合物，通過使用上述(1)所述的HPLC等已知的通常分離方法，能夠容易地與α-乙酮醇化合物分離。
(3)關(guān)于化學(xué)合成法特定乙酮醇脂肪酸可通過使用已知的通?；瘜W(xué)合成法來制備。例如，從一端具有醛基等的反應(yīng)性基團、另一端附加有結(jié)合了保護基團的羧基末端的飽和碳鏈，利用已知的通常方法來合成，另外可將順-3-己烯-1-醇等的不飽和醇等作為起始材料，來合成在期望的位置上具有不飽和基團的、具有反應(yīng)性末端的不飽和碳鏈。然后，使上述飽和烴鏈與該不飽和烴鏈反應(yīng)，從而可制備特定的乙酮醇脂肪酸。另外，在這一連串的反應(yīng)中，在不希望發(fā)生反應(yīng)的末端添加保護基或用于促進反應(yīng)的催化劑，可根據(jù)具體的反應(yīng)形式來適當(dāng)選擇。
具體地說，例如可通過下面那樣的步驟來合成特定乙酮醇脂肪酸。
i)特定乙酮醇脂肪酸(Ia)的合成以壬二酸單乙酯作為起始材料，使其與N，N’-羰基二咪唑反應(yīng)，成為酸咪唑鹽后，低溫下進行LiAlH4還原來合成相應(yīng)的醛。另外，上述起始材料為例如1，9-壬二醇等的二醇，也可合成同樣的醛。
此外，使順-3-己烯-1-醇(cis-3-hexen-1-ol)與三苯膦和四溴化碳反應(yīng)，再使獲得的溴化物與三苯膦反應(yīng)，進而通過在n-BuLi的存在下與氯乙醛反應(yīng)生成順式烯烴，進一步使其與甲硫甲基對甲苯基砜反應(yīng)后，在NaH的存在下與上述的醛反應(yīng)，再將衍生的仲醇以叔丁基二苯基甲硅烷基氯(TBDPSCI)進行保護，再通過酸加水分解、然后脫保護，可合成期望的特定乙酮醇脂肪酸(Ia)。
以下，以簡單的流程圖表示該特定乙酮醇脂肪酸(Ia)的合成步驟。
ii)特定乙酮醇脂肪酸(IIa)的合成以壬二酸單乙酯作為起始材料，通過使其與亞硫酰氯反應(yīng)成為酰氯，其后進行NaBH4還原生成酸醇。然后，將此酸醇的游離羧酸保護后，使其與三苯膦和四溴化碳反應(yīng)，再使獲得的溴化物與三苯膦反應(yīng)，進而通過在n-BuLi的存在下與氯乙醛反應(yīng)生成順式烯烴，進一步使其與甲硫甲基對甲苯基砜反應(yīng)。
在n-BuLi的存在下，該反應(yīng)物與另外的通過順-3-己烯-1-醇的PCC氧化而衍生的醛進行反應(yīng)，最后利用脫保護，可合成期望的特定乙酮醇脂肪酸(IIa)。以下，表示該特定乙酮醇脂肪酸(IIa)的合成步驟的一例的簡單流程圖。
iii)本發(fā)明的乙酮醇脂肪酸(IIIa)的合成以甲基乙烯基酮作為起始材料，在LDA和DME的存在下與氯化三甲基硅烷反應(yīng)，將所得的甲硅烷基醚，在低溫(-70℃)下添加MCPBA和三甲基胺氫氟酸鹽，從而制成酮醇。其后，將該酮醇的羰基保護后，將三苯膦和三氯丙酮作為反應(yīng)試劑，在烯烴上不加成氯化物而使之反應(yīng)。
然后，將該反應(yīng)生成物在三丁基胂和K2CO3的存在下，使其與甲酸反應(yīng)，生成反式烯烴再成為氯化物。其后，使該氯化物與順-3-己烯-1-醇的PCC氧化物衍生的醛進行反應(yīng)，再進行該反應(yīng)生成物與6-庚酸的結(jié)合反應(yīng)，最后通過脫保護，可合成期望的特定乙酮醇脂肪酸(IIIa)。
以下，表示關(guān)于該特定乙酮醇脂肪酸(IIIa)的合成步驟的簡單流程圖。
2.關(guān)于本發(fā)明的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑本發(fā)明的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑的有效成分，是如上所述的碳原子數(shù)為5～24的乙酮醇脂肪酸，碳原子間的雙鍵數(shù)為1～6個，并且具有α-乙酮醇結(jié)構(gòu)或γ-乙酮醇結(jié)構(gòu)的乙酮醇不飽和脂肪酸。
上述具有α-乙酮醇結(jié)構(gòu)的乙酮醇不飽和脂肪酸，碳原子數(shù)為5～24，碳原子間的雙鍵數(shù)為1～6個，可用通式(I)或(II)表示。另外，上述具有γ-乙酮醇結(jié)構(gòu)的乙酮醇不飽和脂肪酸，碳原子數(shù)為7～24，碳原子間的雙鍵數(shù)為1～6個，可用通式(III)或(IV)表示。另外，這樣的通式中的R1、R2、R3、R4如上所述。
本發(fā)明的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑，通過散布等的簡單方法將其用于植物，可促進或誘導(dǎo)這些植物的發(fā)根。
作為其使用形式，可以將作為有效成分的化合物或配合了有效成分化合物的制劑制成水溶液以散布、涂布、浸漬等的簡單方法用于植物。特別在用于染井吉野櫻、金絲桃或南洋楹的插枝的發(fā)根時，可以將含有特定乙酮醇脂肪酸(Ia)的溶液涂布或散布于這些切斷的樹枝上，或?qū)⑦@些切斷的樹枝浸漬在上述溶液中。
關(guān)于上述特定乙酮醇脂肪酸對于植物的施用量，其上限沒有特別限定。即，使用本發(fā)明的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑，即使大量地施用特定乙酮醇脂肪酸，也幾乎沒有發(fā)現(xiàn)生長抑制等的對于植物的負面效果。一直以來使用的植物生長素或細胞分裂素這樣的植物激素劑，過量施用時會顯著地顯現(xiàn)出對于植物的負面效果，在其使用時，必須特別注意不要過量施用，與之相比，本發(fā)明的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑可以說非常優(yōu)異。
另外，上述的特定乙酮醇脂肪酸對于植物的施用量的下限濃度，根據(jù)植物個體的種類或大小而不同，但對于1個植物個體進行1次施用時，大體上為1μmM程度以上的標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑中的特定乙酮醇脂肪酸的配合量，可根據(jù)其使用形式或作為使用對象的植物的種類，進而根據(jù)本發(fā)明的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑的具體的劑型等進行選擇。
作為本發(fā)明的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑的形態(tài)，可直接使用作為有效成分的特定乙酮醇脂肪酸，但也可以將上述有效成分與基劑以外的添加劑配合成組合物使用。對于有效成分的配合濃度沒有特別限制，考慮上述的特定乙酮醇脂肪酸的施用標(biāo)準(zhǔn)時，相對于藥劑(組合物)總量，優(yōu)選0.1～100ppm左右，進一步優(yōu)選1～50ppm左右。
作為本發(fā)明的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑(組合物)的劑型，可列舉出例如，液劑、固型劑、粉劑、乳劑、底床添加劑等的劑型，根據(jù)其劑型，在不損害作為本發(fā)明所期望效果的植物發(fā)根誘導(dǎo)作用的限度內(nèi)，可適當(dāng)配合在制劑學(xué)上可適合使用的已知的載體成分、制劑用輔料等。例如，作為載體成分，本發(fā)明的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑為底床添加劑或固型劑時，大致有滑石、粘土、蛭石、硅藻土、高嶺土、碳酸鈣、氫氧化鈣、白土、硅膠等無機質(zhì)或小麥粉、淀粉等的固體載體，另外在為液劑時，大致有水、二甲苯等的芳香族烴類，乙醇、乙二醇等的醇類，丙酮等的酮類，二烷、四氫呋喃等的醚類，二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙腈等的液體載體可作為上述的載體成分而被使用。
另外，作為制劑用輔料，可適當(dāng)配合例如，烷基硫酸酯類、烷基磺酸鹽、烷基芳基磺酸鹽、二烷基磺基琥珀酸鹽等的陰離子表面活性劑，高級脂肪族胺的鹽類等的陽離子表面活性劑，聚氧乙烯二醇烷基醚、聚氧乙烯二醇?；ァ⒕垩跻蚁┒级嘣减；?、纖維素衍生物等的非離子表面活性劑、明膠、酪蛋白、阿拉伯膠等的增粘劑、增量劑、粘合劑等。進而，根據(jù)需要，在不損害本發(fā)明所期望目的的限度內(nèi)，可在本發(fā)明的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑中配合一般的植物生長調(diào)節(jié)劑、苯甲酸、煙酸、煙酸酰胺、2-哌啶酸等。
本發(fā)明的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑，可根據(jù)其劑型相應(yīng)的方法用于各種植物。其最具特征的地方是，不僅是植物的生長點，對于以莖、葉為首的植物體的一部或全部，可利用液劑、乳劑進行散布、滴下或涂布等，這方面與現(xiàn)有的植物生長素類發(fā)根誘導(dǎo)劑有很多不同。
植物生長素類發(fā)根誘導(dǎo)劑，在插入土壤前必須將插枝或插芽的切口浸漬于高濃度的植物生長素溶液中數(shù)小時，或在其每一個切口上都添加植物生長素的粉劑，難以進行大量處理。
本發(fā)明的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑，將需要數(shù)量的插枝或插芽直接插入土壤中，其后，可集中利用散布器等進行散布，因此可避免上述困難，是適合于大量處理的發(fā)根誘導(dǎo)劑。
作為適合于這樣的大量處理的可散布的發(fā)根誘導(dǎo)劑，在本發(fā)明人開發(fā)之時，具有上述特定結(jié)構(gòu)的吲哚內(nèi)酯體(參照特開平10-77268號公報)恐怕是唯一的一種，但是該特定吲哚內(nèi)酯體，與各種植物生長素類同樣對于休眠中的植物效果弱，使用場合受到限制。本發(fā)明的發(fā)根誘導(dǎo)劑，具有可誘導(dǎo)休眠中的植物發(fā)根的重要特點。
關(guān)于本發(fā)明的發(fā)根誘導(dǎo)劑向植物的施用，其頻度根據(jù)植物個體的種類或施用目的等而不同，但基本上只要一次施用就可獲得期望的效果。多次施用時，給予一周以上的施用間隔是有效的。
可適合使用本發(fā)明的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑的植物的種類，沒有特別限制，除被子植物(雙子葉植物·單子葉植物)以外，對于菌類、地衣類、苔蘚類、蕨類及裸子植物也有效。
在被子植物中，作為雙子葉植物，可例示例如，包括牽牛屬植物(牽?；?、打碗花屬植物(日本打碗花、打碗花、濱旋花(ハマヒルガオ))、番薯屬植物(參薯(グンバイヒルガオ)、番薯)、菟絲子屬植物(日本菟絲子、南方菟絲子(マメダオシ))的旋花科植物；石竹屬植物、繁縷屬植物、高嶺爪草(タカネツメクサ)屬植物、卷耳屬植物、漆姑草植物、蚤綴屬植物、莫石竹屬植物、異花假繁縷(ワチガイソウ)、濱繁縷屬植物、大爪草屬植物、擬漆姑草屬植物、蠅子草屬植物、剪秋羅屬植物、秋羅(フシグロ)屬植物、狗筋蔓(ナンバンハコベ)屬植物等的以石竹科植物為首的，木麻黃科植物、三白草科植物、胡椒科植物、金粟蘭科植物、楊柳科植物、楊梅科植物、胡桃科植物、樺木科植物、殼斗科植物、榆科植物、?？浦参?、蕁麻科植物、苔草科植物、山龍眼科植物、鐵青樹科植物、檀香科植物、桑寄生科植物。
進而，作為雙子葉植物，還可例示例如，馬兜鈴科植物、帽蕊草科植物、蛇菰科植物、蓼科植物、藜科植物、莧科植物、紫茉莉科植物、假繁縷科植物、商陸科植物、番杏科植物、馬齒莧科植物、木蘭科植物、昆欄科植物、連香樹科植物、睡蓮科植物、金魚藻科植物、毛茛科植物、木通科植物、小檗科植物、芳基科植物、臘梅科植物、樟科植物、罌粟科植物、白花菜科植物、十字花科植物、茅膏菜科植物、豬籠草科植物、景天科植物、虎耳草科植物、海桐花科植物、金縷梅科植物、懸鈴木科植物、薔薇科植物、豆科植物、酢醬草科植物、牦牛兒苗科植物、亞麻科植物、蒺藜科植物、蕓香科植物、苦木科植物、楝科植物、遠志科植物、大戟科植物、水馬齒科植物。
另外，還可例示黃楊科植物、巖高蘭科植物、馬?？浦参?、漆樹科植物、冬青科植物、衛(wèi)茅科植物、省沽油科植物、茶茱萸科植物、槭樹科植物、七葉樹科植物、無患子科植物、清風(fēng)藤科植物、鳳仙花科植物、鼠李科植物、葡萄科植物、杜英科植物、椴科植物、錦葵科植物、梧桐科植物、獼猴桃科植物、山茶科植物、藤黃科植物、溝繁縷科植物、怪柳科植物、堇菜科植物、大風(fēng)子植物、旌節(jié)花科植物、西番蓮科植物、秋海棠科植物、仙人掌科植物、瑞香科植物、胡頹子科植物、千屈菜科植物、石榴科植物、紅樹科植物、八角楓科植物、野牡丹科植物、菱科植物、柳葉菜科植物、小二仙草科植物、杉葉藻科植物、五加科植物、傘形科植物、山茱萸科植物、巖梅科植物、山柳科植物。
進而，可例示出，鹿蹄草科植物、杜鵑花科植物、紫金?？浦参?、報春花科植物、白花丹科植物、柿科植物、山礬科植物、安息香科植物、木犀科植物、馬錢科植物、龍膽科植物、夾竹桃科植物、蘿摩科植物、花蔥科植物、紫草科植物、馬鞭草科植物、紫蘇科植物、茄科植物(茄子、番茄)、玄參科植物、紫葳科植物、胡麻科植物、列當(dāng)科植物、古苣苔科植物、貍藻科植物、爵床科植物、苦檻藍科植物、透骨草科植物、車前草科植物、茜草科植物、忍冬科植物、五?；浦参?、敗醬科植物、川續(xù)斷科植物、葫蘆科植物、桔梗科植物、菊科植物等。
同樣地，作為單子葉植物，可例示出，包括紫背浮萍屬植物(紫萍)以及浮萍屬植物(青萍、品藻)的浮萍科植物、包括卡特蘭屬植物、蘭屬植物、石斛屬植物、蝴蝶蘭屬植物、萬代蘭屬植物、兜蘭屬植物、瘤瓣蘭屬植物等的蘭科植物、香蒲科植物、黑三棱科植物、眼子菜科植物、茨藻科植物、芝菜科植物、澤瀉科植物、水鰲科植物、霉草科植物、禾本科植物(水稻、大麥、小麥、黑麥、玉蜀黍)、莎草科植物、棕櫚科植物、天南星科植物、谷精草(ほしぐさ)科植物、鴨跖草科植物、雨久花科植物、燈心草科植物、百部科植物、百合科植物(蘆筍等)、石蒜科植物、薯蕷科植物、鳶尾科植物、芭蕉科植物、姜科植物、美人蕉科植物、水玉簪科植物等。
實施例下面，將本發(fā)明的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑中使用的化合物的制造例以及利用該化合物進行的發(fā)根誘導(dǎo)性能試驗例，作為實施例來具體地表示，但本發(fā)明不限定于這些實施例，當(dāng)然應(yīng)該根據(jù)權(quán)利要求書的記載所特別指定的范圍。
實施例1制備例特定乙酮醇脂肪酸(Ia)的制備如下所述，利用酶法來制備作為本發(fā)明植物發(fā)根誘導(dǎo)劑的一種的、并且為特定乙酮醇脂肪酸(Ia)的[9-羥基-10-氧代-12(Z)，15(Z)-十八碳二烯酸]。
1.來自稻米胚芽的脂肪加氧酶的制備將350g稻米胚芽用石油醚洗滌，再進行脫脂以及干燥的產(chǎn)物(250g)，懸浮于1.25L的0.1M醋酸緩沖液(pH4.5)中，將該懸浮物進行勻漿化。其后，將該勻漿提取液在16000rpm進行15分鐘離心分離，獲得上清液(0.8L)。
然后，向該得到的上清液中加入140.8g(30％飽和)硫酸銨，4℃下放置一夜，以9500rpm再次進行30分鐘離心，向獲得的上清液(0.85L)中加入232g(70％飽和)硫酸銨，4℃下放置5小時。其后，以9500rpm進行30分鐘離心，將由此獲得的沉淀物(稻米胚芽提取液的硫銨30～70飽和級分)溶解于pH4.5的300mL醋酸緩沖液中，63℃下進行5分鐘加熱處理。進而，除去生成的沉淀物，再將獲得的上清液用RC透析管(Spectrum社制Pore4MWCO 12000～14000)通過透析來脫鹽后，獲得期望的來自稻米胚芽的脂肪加氧酶的粗酶液。
2.來自亞麻種子的環(huán)氧丙烯合酶的制備亞麻種子是購自一丸フアルコス公司，在200g的該亞麻種子中，添加250mL的丙酮，進行勻漿化(20s×3)，以多孔板漏斗過濾所得的沉淀物并除去溶劑。接著，將該沉淀物再次懸浮于250mL的丙酮中，并進行勻漿化(10s×3)，再次獲得沉淀物。將該沉淀物用丙酮和乙醚洗滌后，進行干燥，獲得亞麻種子的丙酮粉末(150g)。
將該亞麻種子丙酮粉末中的20g，冰冷下懸浮于400mL的50mM磷酸緩沖液(pH7.0)中，將其在4℃下進行1小時攪拌器攪拌后再提取。將獲得的提取物以11000rpm進行30分鐘離心，再向由此獲得的上清液(380mL)中加入105.3g(0～45％飽和)硫酸銨，在冰冷下靜置1小時，進而以11000rpm進行30分鐘離心，再將獲得的沉淀物溶解于150mL的50mM磷酸緩沖液(pH7.0)中，進行透析并脫鹽(3L×3)，獲得期望的來自亞麻種子的環(huán)氧丙烯合酶的粗酶液。
3.α-亞麻酸鈉鹽的制備作為起始材料的α-亞麻酸，因為在水中的溶解性顯著地低，為使其容易作為酶底物而起作用，所以將α-亞麻酸進行鈉鹽化。即，將530mg碳酸鈉溶解于10mL純水中并加熱至55℃，向其中滴加278mg的α-亞麻酸(ナカライテスク社)，攪拌3小時。反應(yīng)結(jié)束后，用離子交換樹脂(Dowex50W-X8(H+型)ダウケミカル公司生產(chǎn))進行中和而生成沉淀物。將其過濾并分離樹脂，用MeOH溶解后，減壓下蒸去溶劑。將獲得的生成物用異丙醇進行重結(jié)晶，獲得期望的α-亞麻酸的鈉鹽(250mg，83％)。
4.特定乙酮醇脂肪酸(Ia)的制備將由上述3獲得的α-亞麻酸鈉鹽(15mg50μmol)溶解于30mL的0.1M的磷酸緩沖液(pH7.0)中。向所得的溶液中，在氧氣流通下、25℃添加3.18mL的由上述1獲得的來自稻米胚芽的脂肪加氧酶的粗酶液，攪拌30分鐘，其后，進一步添加3.18mL的同樣來自稻米胚芽的脂肪加氧酶的粗酶液，攪拌30分鐘。
該攪拌結(jié)束后，向該脂肪加氧酶反應(yīng)物中，在氮氣氣流下添加34.5mL的由上述2獲得的環(huán)氧丙烯合酶的粗酶液，攪拌30分鐘后，冰冷下添加稀鹽酸，將反應(yīng)溶液的pH調(diào)整至3.0。
然后，將該反應(yīng)溶液用CHCl3-MeOH＝10∶1進行萃取。向萃取獲得的有機層中加入硫酸鎂進行脫水，減壓下蒸去溶劑進行干燥。
將這樣獲得的粗產(chǎn)物進行HPLC，分取被確認為該特定乙酮醇脂肪酸(Ia)的峰(保留時間16分鐘附近)。向分取的級分中加入氯仿，分離氯仿層并用水洗滌，再用蒸發(fā)器蒸去這些氯仿，獲得純化物。
為了確認該獲得的純化物的結(jié)構(gòu)，以重甲醇溶液測定1H及13C-NMR光譜，該測定光譜示于表1。
表I


其結(jié)果，在1H-NMR中，確認有來源于末端甲基[δ0.98(t)]、2組烯鍵[(δ5.25，5.40)，(δ5.55，5.62)]、仲羥基[δ4.09(dd)]以及多個亞甲基的信號，可推定為特定乙酮醇脂肪酸(Ia)。進而，將上述測定的表I的13C-NMR的化學(xué)位移值，與特定乙酮醇脂肪酸(Ia)的13C-NMR的化學(xué)位移值([特開平10-324602號公報、特別是其第7頁第11欄倒數(shù)第1行以后所記載的“制備例(萃取法)”中的13C-NMR的化學(xué)位移值(第8頁左欄第3行以后的段落號 及段落號 )])相比較是一致的。
因此，如上述那樣利用酶法獲得的合成品，確定地可以確認為特定乙酮醇脂肪酸(Ia)，9-羥基-10-氧代-12(Z)，15(Z)-十八碳二烯酸。
評價試驗1特定乙酮醇脂肪酸(Ia)的發(fā)根誘導(dǎo)性能評價在8月將繡球花(品種名不明)的第2節(jié)部分切開，排列在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中。
調(diào)制特定乙酮醇脂肪酸(Ia)的水溶液(濃度100μM及200μM)，用噴霧器向上述切開的繡球花噴霧，蓋上蓋放置2小時。另外，對照區(qū)用純水噴霧，與特定乙酮醇脂肪酸(Ia)的情況同樣地放置。其后，加水，在25℃、連續(xù)光下放置20天。
分別計算5個個體的平均的發(fā)根數(shù)時，水處理區(qū)為1.1個，特定乙酮醇脂肪酸(Ia)的100μM區(qū)為3.2個，200μM區(qū)為3.1個。
評價試驗2特定乙酮醇脂肪酸(Ia)的發(fā)根誘導(dǎo)性能評價在12月將繡球花(品種名不明)的含有休眠芽的枝切為5cm左右，在裝入了由赤玉土和蛭石(7∶3)構(gòu)成的土壤的盆中進行插枝。將水或特定乙酮醇脂肪酸(Ia)(10μM、100μM)進行噴霧后，在25℃的生物室(biochamber)(12小時明暗周期)中培養(yǎng)1個月。測定在將插枝由土壤中拔出時的直接帶土的重量和發(fā)根數(shù)，并將該測定結(jié)果示于下面的表II。另外，帶土重量的增加，是伴隨細根的發(fā)達等的保土率的提高以及伴隨葉芽的繁殖的結(jié)果，這反應(yīng)了發(fā)根誘導(dǎo)效果性能的優(yōu)異。
表II

該測定結(jié)果，反應(yīng)了特定乙酮醇脂肪酸(Ia)特別促進了葉芽的發(fā)達。
如上所述，確認上述的乙酮醇脂肪酸有植物發(fā)根誘導(dǎo)作用，完全是預(yù)測范圍之外的事。
實施例2在該實施例2中，使用作為本發(fā)明發(fā)根劑的有效成分化合物的特定乙酮醇脂肪酸(Ia)，即9-羥基-10-氧代-12(Z)，15(Z)-十八碳二烯酸，來進行染井吉野(櫻)的發(fā)根誘導(dǎo)性能試驗，并顯示其觀察結(jié)果，但本發(fā)明并不限定于該實施例，當(dāng)然應(yīng)該是根據(jù)權(quán)利要求書的記載而特別指定的范圍。該評價試驗方法及試驗結(jié)果如下所述。
染井吉野(櫻)的發(fā)根誘導(dǎo)性能試驗使用只有本發(fā)明的發(fā)根劑、或其與現(xiàn)有的發(fā)根劑的組合等的15種的試驗區(qū)，進行關(guān)于染井吉野(櫻)的發(fā)根誘導(dǎo)性能試驗。
該試驗中所使用的現(xiàn)有的發(fā)根劑，有下述式(V)表示的吲哚衍生物(以下，簡稱為“IBL”。參照特開平10-77268號公報)及作為市售發(fā)根劑的オキシベロン(以下，簡稱為“Oxy”。バイエルクロツプサイエンス株式會社制)。
另外，在本試驗中，上述特定乙酮醇脂肪酸(Ia)簡稱為“KODA”。
(式中，R為亞乙基)發(fā)根劑組成各試驗區(qū)使用的發(fā)根劑組成如下所述。
試驗區(qū)(1)水試驗區(qū)(2)KODA 10μM試驗區(qū)(3)KODA 100μM試驗區(qū)(4)Oxy試驗區(qū)(5)IBL50ppm試驗區(qū)(6)IBL100ppm試驗區(qū)(7)KODA 10μM+Oxy試驗區(qū)(8)KODA 100μM+Oxy試驗區(qū)(9)KODA 10μM+IBL50ppm試驗區(qū)(10)KODA 100μM+IBL50ppm試驗區(qū)(11)KODA 10μM+IBL100ppm試驗區(qū)(12)KODA 100μM+IBL100ppm試驗區(qū)(13)KODA 10μM+IBL50ppm+Oxy試驗區(qū)(14)KODA 100μM+IBL50ppm+Oxy試驗區(qū)(15)KODA 100μM+IBL100ppm+Oxy。
發(fā)根試驗步驟試驗使用的染井吉野(櫻)的枝是由住友林業(yè)綠化(株)購入。將其由頂端起切成5～8cm左右的長度，插入以7∶3的比例配合有赤玉土和蛭石的盆中的混合土壤中。此時，各試驗區(qū)使用10個枝。另外，因為該試驗的開始是在3月上旬，所以葉還沒有展開。
發(fā)根試驗所使用的オキシベロン(Oxy)，是將オキシベロン液劑(含有0.4％的吲哚丁酸，バイエルクロツプサイエンス株式會社制)稀釋40倍，然后將使用Oxy的試驗區(qū)(4)(7)(8)(13)(14)(15)用的染井吉野(櫻)的枝在其中浸漬3小時，再分別插枝于各自的試驗區(qū)的土壤中。
測定試驗開始7周之后還存活的插枝的數(shù)的結(jié)果，如下所示。試驗區(qū)(1)0％試驗區(qū)(2)10％試驗區(qū)(3)10％試驗區(qū)(4)0％試驗區(qū)(5)0％試驗區(qū)(6)0％試驗區(qū)(7)30％試驗區(qū)(8)10％試驗區(qū)(9)20％試驗區(qū)(10)30％試驗區(qū)(11)20％試驗區(qū)(12)30％試驗區(qū)(13)10％試驗區(qū)(14)20％試驗區(qū)(15)30％。
另外，上述存活的插枝全部確認有活躍的發(fā)根。
由上述可知，本發(fā)明的發(fā)根劑，具有對于以往不可能插枝的染井吉野(櫻)的優(yōu)異的發(fā)根誘導(dǎo)性能。
實施例3在該實施例3中，與實施例2同樣地使用特定乙酮醇脂肪酸(Ia)，進行金絲桃的發(fā)根誘導(dǎo)性能試驗。
在各試驗區(qū)中使用的發(fā)根劑組成及發(fā)根步驟，與實施例2相同。該試驗的結(jié)果，使用本發(fā)根劑(10μM)及IBL(50ppm)的場合，發(fā)現(xiàn)金絲桃的插枝為100％生存。
另外，該發(fā)根性能試驗如圖1所示的那樣，通過該圖1可知，在試驗區(qū)(1)、試驗區(qū)(2)、試驗區(qū)(3)、試驗區(qū)(8)、試驗區(qū)(11)、試驗區(qū)(13)、試驗區(qū)(14)、試驗區(qū)(15)中，與水處理區(qū)(試驗區(qū)1)比較，發(fā)根量明顯增加。
由以上的結(jié)果可知，使用本發(fā)明的發(fā)根劑對于根的增大是必要充分的條件。
另外，在圖1的柱形圖的頂部配置的“*”的記號，表示在顯著性差檢查中的顯著性水平，1個該記號表示顯著性水平為5％以下，2個該記號表示顯著性水平為1％以下，3個該記號表示顯著性水平為0.5％以下。
即，在柱狀圖的頂部配置有“*”的試驗區(qū)，表示與水處理區(qū)(試驗區(qū)(1))相比較發(fā)根量明顯增加的區(qū)。
實施例4南洋楹的發(fā)根誘導(dǎo)性能試驗作為復(fù)合板制造原料有用的南洋楹(Paraserianthesfalcataria)是熱帶樹木，與其他的樹種同樣，隨著樹齡增加而不能插枝。使用不能插枝的南洋楹，用KODA或現(xiàn)有的發(fā)根誘導(dǎo)劑オキシベロン(バイエルクロツプサイエンス株式會社制)，嘗試插枝繁殖。培養(yǎng)土使用赤玉土小粒。將2個月后的結(jié)果示于表III，即使用オキシベロン，南洋楹的發(fā)根也完全沒有被誘導(dǎo)，而通過將10μM的KODA進行噴霧可獲得44％的發(fā)根率。
表III

工業(yè)上的可利用性如上所述，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的乙酮醇脂肪酸具有植物發(fā)根誘導(dǎo)作用，完全在預(yù)測范圍之外。
權(quán)利要求
1.一種植物發(fā)根誘導(dǎo)劑，其是含有乙酮醇不飽和脂肪酸而構(gòu)成的，該乙酮醇不飽和脂肪酸是碳原子數(shù)為5～24的乙酮醇脂肪酸，碳原子間的雙鍵數(shù)為1～6個，并且具有α-乙酮醇結(jié)構(gòu)或γ-乙酮醇結(jié)構(gòu)。
2.如權(quán)利要求1所述的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑，上述乙酮醇不飽和脂肪酸為9-羥基-10-氧代-12(Z)，15(Z)-十八碳二烯酸。
全文摘要
本發(fā)明提供一種含有乙酮醇不飽和脂肪酸(特別優(yōu)選9－羥基－10－氧代－12(Z)，15(Z)－十八碳二烯酸)的植物發(fā)根誘導(dǎo)劑，該乙酮醇不飽和脂肪酸是碳原子數(shù)為5～24的乙酮醇脂肪酸，碳原子間的雙鍵數(shù)為1～6個，并且具有α－乙酮醇結(jié)構(gòu)或γ－乙酮醇結(jié)構(gòu)，通過使用該植物誘導(dǎo)劑，在松、杉、茶樹、胡桃等難以發(fā)根的植物通過插枝進行繁殖時，可促進或誘導(dǎo)發(fā)根，進而，可用于被認為不能發(fā)根的染井吉野(櫻)、所謂插枝困難的金絲桃以及作為復(fù)合板材料有用的南洋楹插枝時的發(fā)根，并且可通過散布等簡單方法加以利用。
文檔編號A01N37/42GK1946289SQ200580013240
公開日2007年4月11日 申請日期2005年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月27日
發(fā)明者橫山峰幸, 田中修, 中村健太郎 申請人:株式會社資生堂