專利名稱：阿爾茨海默病的轉基因模型及其在治療多種神經(jīng)變性疾病中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及阿爾茨海默病的非人轉基因模型及其應用，包括鑒定可用于治療阿爾茨海默病的化合物的方法、應用這樣的化合物進行治療的方法和類似方法。
背景技術：
阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是最常見的癡呆癥，其特征是老年斑(senile plaques)、神經(jīng)原纖維纏結(neurofibrillary tangles)和腦中突觸和神經(jīng)元的丟失。老年斑的主要蛋白成分是β-淀粉樣肽(Aβ)，它是通過其前體β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein)(APP)的蛋白水解切割而產(chǎn)生的。淀粉樣蛋白假說指出，Aβ啟動了造成AD的級聯(lián)事件。淀粉樣蛋白毒性的精確機制尚不清楚，但是已經(jīng)積累了突觸是Aβ?lián)p害的早期易受攻擊位點的證據(jù)(參見，例如，Selkoe，D.J.，Science 298789-91(2002))。與此觀點一致的是，腦中具有高水平Aβ的一些APP轉基因小鼠在老年斑形成之前表現(xiàn)出突觸丟失、行為改變和突觸傳遞減弱(參見，Hsia，A.Y.et al.，Proc Natl Acad Sci USA 963228-33(1999)和Mucke et al.，J.Neurosci.204050-8(2000))。近來，已表明，APP也在Asp664(APP695編號)處被胱天蛋白酶(caspase)切割，胱天蛋白酶是介導凋亡的半胱氨酸蛋白酶(參見Gervais，F(xiàn).G.et al.Cell 97395-406(1999)和Lu，D.C.et al.Nat Med 6397-404(2000))。這樣的加工過程釋放出細胞毒性的羧基端肽APP-C31；然而，還不清楚胱天蛋白酶對APP的加工在AD中可能起到的作用(如果有的話)。在通過胱天蛋白酶進行細胞質內切割之后產(chǎn)生細胞毒性肽的這種情形，與已經(jīng)被說明的依賴性受體諸如DCC(在結腸直腸癌中被缺失)、RET(在轉染期間被重排)和UNC5H1-3(不協(xié)調基因5同源物1-3)中發(fā)生的情形相似，這表明，APP可能作為依賴性受體而發(fā)揮功能(Bredesen et al，Physiological Reviews，press 2004)。
因此，使得能夠研究蛋白酶例如胱天蛋白酶在此類神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默病的發(fā)展中所起的作用的轉基因模型的開發(fā)，將具有重要意義。此外，獲得這樣的轉基因模型，將有助于對神經(jīng)變性疾病的新的治療的開發(fā)。
發(fā)明概述 根據(jù)本發(fā)明，證明了在阿爾茨海默病的轉基因模型中，所選擇的突變諸如APP中的Asp->Ala(D664A)突變(其防止在胱天蛋白酶切割位點處進行切割)既防止海馬突觸丟失又防止齒狀回萎縮，雖然這些突變不干擾Aβ的生成或淀粉樣斑塊的形成。
因此，鑒于這些發(fā)現(xiàn)，開發(fā)出了用于鑒定阻斷在APP的Asp664處的切割的藥劑的方法，包括可用于此種目的的轉基因動物，以及應用它們來治療神經(jīng)變性疾病的方法。在神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默病的發(fā)展中進行早期干預，將有助于突觸功能的恢復，并減少神經(jīng)元網(wǎng)絡的丟失，神經(jīng)元網(wǎng)絡的丟失是神經(jīng)變性疾病的晚期階段的特點。


圖1均涉及PDAPP和PDAPP(D664A)轉基因小鼠的表征。
圖1A圖示了在制備PDAPP和PDAPP(D664A)轉基因小鼠中應用的構建物的引出(derivation)。
圖1B圖示了在各種實驗動物中對可溶性Aβ的檢測。
圖1C總結了不同實驗動物中Aβ斑塊的數(shù)目。
圖1D圖示了16月齡PDAPP(D664A)小鼠的經(jīng)染色的腦切片，顯示出Aβ斑塊的存在。
圖1E圖示了在體內對APP在Asp664處進行的切割。使用對由在Asp664處對APP進行切割而產(chǎn)生的新表位具有特異性的抗體證明，與對照小鼠和PDAPP(D664A)小鼠相比，在PDAPP中的切割增加。
圖2均說明D664A突變對突觸丟失和齒狀回萎縮的影響。
圖2A總結了多種實驗動物中突觸前密度的定量。
圖2B總結了海馬總體積和其亞區(qū)域的體積，正如應用Imaris3D(BitplaneAG， Switzerland)三維重建所確定(參見圖2C)和經(jīng)卡瓦列里分析(Cavalieri analysis)所證實。
圖2C顯示了代表性PDAPP(紅色)和B21(黃色)轉基因小鼠的齒狀回分子層的3D表而重建的正交面、矢狀面和冠狀面視圖。
圖3均說明D664A突變對基礎突觸傳遞的影響。
圖3A示出了幾個細胞外記錄的場EPSPs，應用它們來評價3-7月齡雜合Tg和非Tg PDAPPJ20和PDAPP(D664A)B21小鼠的海馬CA3和CA1細胞之間的基礎突觸傳遞強度。正如所述，非轉基因小鼠和轉基因小鼠在增加的刺激強度下的代表性場EPSPs被顯示出來。注意在PDAPPJ20 Tg小鼠中，引發(fā)相對小的EPSP需要大的輸入(參見帶有放大的時間標度的插圖箭頭指示出纖維群峰，它是被活化的軸突數(shù)目的間接度量)。
圖3B示出了Tg和非Tg動物的EPSP起始斜率除以纖維群峰的幅度(數(shù)據(jù)針對非Tg同窩動物進行標準化)，正如所述。每個數(shù)據(jù)點代表了獲自6-7只小鼠的17-22張切片的平均結果。統(tǒng)計學分析(ANOVA)表明了顯著的群組效應(p＜0.0005)。Post-hoc Tukey檢驗證實，PDAPPJ20小鼠具有比所有其它組顯著低的基礎突觸傳遞(p＜0.01)，而在其它組中彼此之間并沒有顯著不同。
圖3C示出了雙脈沖易化(paired-pulse facilitation)，其被表示為一對刺激誘發(fā)的fEPSPs的平均幅度的比值。數(shù)據(jù)在圖中表示為均值+/-SEM。
圖4均說明了D664A突變對PDAPP誘導的海馬神經(jīng)發(fā)生增強的影響。
圖4A示出了對海馬齒狀回的顆粒下區(qū)中的增生細胞的BrdU標記。對十二個月對照(非-Tg)、PDAPP和PDAPP(D664A)小鼠腹膜內給予BrdU，持續(xù)3天，一周后處死。通過免疫組織化學方法檢測被BrdU標記的細胞(黑點)。顯示的圖像代表4-6個動物/組。
圖4B說明了BrdU標記的定量。顯示的數(shù)據(jù)是平均細胞數(shù)目±SD(n＝4-6)；用學生t檢驗(Student′s t test)評價差異的顯著性。
圖5提供了通過卡瓦列里分析和三維重建得到的體積之間的關聯(lián)。
發(fā)明詳述 根據(jù)本發(fā)明，提供了非人轉基因動物，其包含編碼突變人β-淀粉樣前體蛋白(APP)或APP樣蛋白的核苷酸序列，其中所述突變人APP或APP樣蛋白包括導致該突變人APP或APP樣蛋白對在Asp664處的切割具有抵抗性的突變，并且其中編碼該突變人APP或APP樣蛋白的核苷酸序列被可操縱地連接到合適的啟動子。
在本發(fā)明的一個方面，在Asp664處的切割是受蛋白酶誘導的。在本發(fā)明的目前的一個優(yōu)選方面，在Asp664處的切割是受胱天蛋白酶誘導的。
在本發(fā)明的一個方面，突變人APP或APP樣蛋白包括在殘基664處的突變。本領域技術人員知道，事實上除天然Asp之外的在位點664處的任何殘基都會降低蛋白酶如胱天蛋白酶在位點664處切割APP或APP樣蛋白的能力。目前優(yōu)選的位點664處的突變包括將天然Asp轉變?yōu)锳la、Glu、Gln或者類似氨基酸。
在本發(fā)明的另一方面，突變人APP或APP樣蛋白包括與殘基664相鄰的一個或多個突變，從而降低蛋白酶如胱天蛋白酶在位點664處切割APP或APP樣蛋白的能力。
如本領域技術人員容易得知的，在產(chǎn)生本發(fā)明的轉基因動物中應用的啟動子可以是組成型活性的或誘導型的。合適的啟動子是本領域技術人員公知的，包括能夠識別T4、T3、Sp6和T7聚合酶的啟動子，噬菌體λ的PR和PL啟動子，大腸桿菌(E.coli)的trp啟動子、recA啟動子、熱激啟動子和lacZ啟動子，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)的α-淀粉酶和σ28-特異性啟動子，芽孢桿菌(Bacillus)噬菌體的啟動子，鏈霉菌(Streptomyces)啟動子，噬菌體λ的int啟動子，pBR322的β-內酰胺酶基因的bla啟動子，和氯霉素乙酰轉移酶基因的CAT啟動子。原核啟動子在Glick，J Ind.Microbiol. 1277(1987)；Watson et al，MOLECULAR BIOLOGY OF THEGENE，4th Ed.，Benjamin Cummins(1987)；Ausubel et al，supra和Sambrook et al，supra有綜述。
啟動子區(qū)在長度和序列上變化，并且還可以包括序列特異性DNA結合蛋白的一個或多個DNA結合位點，和/或增強子或沉默子。示范性啟動子包括CMV啟動子或P5啟動子，作為調控感興趣的基因或編碼序列的啟動子。這樣的啟動子以及其突變是已知的，在本領域中有所描述(參見，例如，Hennighausen et al.，EMBOJ.，5，1367-1371(1986)；Lehner et al，J.Clin.Microbiol，29，2494-2502(1991)；Lang etal.，Nucleic Acids Res.，20，3287-95(1992)；Srivastava et al.，J.Virol.，45，555-564(1983)；Green et al.，J.Virol.，36，79-92(1980)；Kyostio et al.，supra)。然而，也可以應用其它啟動子，如Ad2或Ad5主要晚期啟動子和三聯(lián)前導序列、勞斯肉瘤病毒(RSV)長末端重復序列和其它組成型啟動子，如已在文獻中描述的。例如，皰疹胸苷激酶啟動子(Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，78，144-145(1981))、金屬硫蛋白基因的調節(jié)序列(Brinster et al.，Nature，296，39-42(1982))、來自酵母或其它真菌的啟動子元件如Gal 4啟動子、醇脫氫酶啟動子、磷酸甘油激酶啟動子和堿性磷酸酶啟動子都可以被應用。類似地，從哺乳動物細胞的基因組分離的啟動子或從在這些細胞中生長的病毒(例如，Ad、SV40、CMV和類似物)分離的啟動子都可以被應用?？紤]用于本文的其它啟動子包括肌動蛋白啟動子、PDGF-β啟動子、PrP(神經(jīng)元特異性)啟動子、神經(jīng)元特異性烯醇酶啟動子和類似啟動子。
代替使用組成型啟動子，啟動子也優(yōu)選地可以響應于適當?shù)男盘柋簧险{和/或下調。例如，可以應用誘導型啟動子如IL-8啟動子，它對TNF或別的細胞因子具有反應性。適當?shù)恼T導型啟動子系統(tǒng)的其它例子包括但不限于，金屬硫蛋白誘導型啟動子系統(tǒng)、細菌lac表達系統(tǒng)和T7聚合酶系統(tǒng)。進一步地，可以應用在不同的發(fā)育階段被選擇性激活的啟動子(例如，球蛋白基因在胚胎和成人中被差異轉錄)。特別地，可以應用能夠由外源性因子如四環(huán)素、天然激素如來源于昆蟲的激素蛻皮素(或其合成的變體)或合成激素如RU486調節(jié)的啟動子。這些啟動子(和同樣可以提供給細胞的伴隨調節(jié)因子)在本領域中均有描述(參見，例如，Delort et al.，Human Gene Therapy 7，809-820(1996)；Clontech，CLONTECHniques，″Tet-Off.TMand Tet-On.TMGene Expression Systems and Cell Lines″，Volume XI，No.3，2-5(1996年7月))。
另一選擇是應用組織特異性啟動子(即，優(yōu)選地在特定組織中被激活并導致基因產(chǎn)物在其被活化的組織中表達的啟動子)，如白蛋白或al-抗胰蛋白酶的肝細胞特異性啟動子(Frain et al，Mol.Cell.Biol.10991-999(1990)；Ciliberto et al，Cell 41531-540(1985)；Pinkert et al.，Genes and Devel.，1，268-276(1987)；Kelsey et al，Genes and Devel.，1，161-171(1987))，在胰腺腺泡細胞中具有活性的彈性蛋白酶I基因調控區(qū)(例如，Swift et al.，Cell，38，639-646(1984)；MacDonald，Hepatology，7，425-515(1987))，在胰腺β細胞中具有活性的胰島素基因調控區(qū)(Hanahan，Nature，315，115-122(1985))，在睪丸、乳腺、淋巴和肥大細胞中具有活性的小鼠乳腺腫瘤病毒調控區(qū)(Leder et al.，Cell，45，485-495(1986))，在腦中的少突細胞中具有活性的髓磷脂堿蛋白基因調控區(qū)(Readhead et al.，Cell，48，703-712(1987))，和在下丘腦中具有活性的促性腺激素釋放激素基因調控區(qū)(Mason et al.，Science，234，1372-1378(1986))。類似地，腫瘤特異性啟動子諸如結腸癌的癌胚抗原(Schrewe et al.，Mol.CellBiol.102738-2748(1990))可以被用在載體中。根據(jù)本發(fā)明，可以通過誘變對任何啟動子進行改變，只要其具有所需的結合能力和啟動子強度。
如本領域技術人員容易得知的，寬范圍的非人動物可以被用于制備本發(fā)明的轉基因動物，包括嚙齒動物、兔、豬和類似動物。根據(jù)本發(fā)明，目前優(yōu)選的轉基因動物是嚙齒動物(例如，小鼠、大鼠和類似動物)，小鼠是特別優(yōu)選的。
D664A突變——其不影響被培養(yǎng)的細胞中的Aβ生成(參見Soriano，S.，Lu，D.C.，Chandra，S.，Pietrzik，C.U.和Koo，E.H.J Biol Chem 27629045-50(2001))，被導入人APP(hAPP)小基因(minigene)，所述基因攜帶瑞典(K670N，M671L)和印第安那(V717F)家族性AD突變，其位于PDGF β鏈啟動子的下游。將這些動物在C57BL/6背景下雜交5至10代，并與具有相似遺傳背景的PDAPP轉基因小鼠比較(J9和J20品系(參見Hsia et al和Mucke，supra)?？梢詰么嘶痉椒ㄖ苽涑霰姸噢D基因品系，包括PDAPP(D664A)B21、PDAPP(D664A)B36、PDAPP(D664A)B157、PDAPP(D664A)B159、PDAPP(D664A)B184、PDAPP(D664A)B190、PDAPP(D664A)B204、PDAPP(D664A)DB210、PDAPP(D664A)DB226、PDAPP(D664A)DB228、PDAPP(D664A)DB230、PDAPP(D664A)DB239、PDAPP(D664A)DB240、PDAPP(D664A)DB241、PDAPP(D664A)DB242、PDAPP(D664A)DB243、PDAPP(D664A)DB244、PDAPP(D664A)DB245、PDAPP(D664A)DB250、PDAPP(D664A)DB254、PDAPP(D664A)DB264和類似品系。
在最初產(chǎn)生的六個轉基因品系中，一個品系(PDAPP(D664A)B21)表現(xiàn)出與PDAPP J20品系均相似的APP表達、Aβ濃度和纖維Aβ斑塊數(shù)目(參見圖1A-1D)。另一個PDAPP(D664A)轉基因品系，PDAPP(D664A)B157表現(xiàn)出比PDAPPJ9品系適度降低的APP表達水平(參見圖1A)。選擇這些轉基因品系用于進一步研究。
為了評價Asp664的突變是否有效阻斷在體內對hAPP的C端切割，用抗體對3月齡的PDAPP和PDAPP(D664A)小鼠的腦切片進行免疫染色，所述抗體特異識別在Asp664處切割APP后產(chǎn)生的C端新表位(APPNeo；參見Galvan，V.et al.，J Neurochem 82283-94(2002))。雖然在PDAPP動物的海馬神經(jīng)元的細胞體和突起中檢測到強的APPNeo免疫反應性，但是來自PDAPP(D664A)動物的切片中存在的免疫反應性水平與在任一轉基因品系的非轉基因同窩動物中觀察到的免疫反應性水平無法區(qū)分(參見圖1E)。
AD患者的認知功能減退程度與海馬和前額葉皮層中的突觸前囊泡蛋白突觸泡蛋白(synaptophysin)的水平的變化密切相關(參見，例如，Terry，R.D.et al.，AnnNeurol 30572-80(1991))。低水平的突觸泡蛋白—推測其與突觸損傷相關—與AD的最早階段相關(參見，例如，Masliah，E.et al.，Neurology 56127-9(2001))。PDAPP小鼠在斑塊形成之前充分表現(xiàn)出降低數(shù)目的海馬突觸泡蛋白免疫反應性突觸前密度(參見，例如，Hsia，A.Y.et al.，Proc NatlAcad Sci USA 963228-33(1999))。為了確定D664A突變在hAPP轉基因小鼠的海馬中的突觸前元件的丟失中是否起作用，在8-10月齡的PDAPP、PDAPP(D664A)和對照小鼠中測定海馬突觸前密度、突觸密度和齒狀回體積，通過對“立體解剖(stereological dissector)”方法的修改來實施(參見實施例6和Hsia，A.Y.et al.，Proc Natl Acad Sci USA 963228-33 (1999))，因為這些參數(shù)代表了阿爾茨海默病中認知功能降低的關聯(lián)。出乎意料地，雖然與其非轉基因同窩動物相比，PDAPP小鼠表現(xiàn)出海馬突觸密度的顯著降低，但是B21小鼠并非如此(參見圖2A和2B)。另一個PDAPP(D664A)轉基因品系B157產(chǎn)生同樣的結果。
類似地，如近來所述(參見Redwine，J.M.，Kosofsky，B.，Jacobs，R.E.，Games，D.，Reilly，J.F.，Morrison，J.H.，Young，W.G.和Bloom，F(xiàn).E.，Proc Natl Acad Sci USA1001381-6(2003))，PDAPP小鼠表現(xiàn)出降低的齒狀回體積，特別是在分子層；然而，在B21小鼠中沒有觀察到顯著的丟失(參見圖2C)。
皮層體積的顯著降低是AD的基本神經(jīng)病理學特征之一。雖然不是所有的AD轉基因小鼠模型重現(xiàn)該疾病的此特定特征，已經(jīng)顯示，PDAPP小鼠在相對早期(3-4個月)表現(xiàn)出降低的齒狀回體積，特別是在分子層(參見，例如，Dodart，J.C.et al.，Neurobiol Dis 771-85(2000)和Redwine，J.M.et al.，Proc Natl Acad Sci USA1001381-6(2003))。因而，通過對尼式染色切片進行數(shù)字三維重建和通過人工卡瓦列里分析確定3月齡PDAPP、PDAPP(D664A)和對照動物的齒狀回體積是有意義的。在PDAPP小鼠的腦中觀察到明顯的齒狀回萎縮，但在PDAPP(D664A)小鼠中沒有見到，二者都是通過人工卡瓦列里分析(參見圖2B)以及數(shù)字3D重建(參見圖2C和2D)確定的。由卡瓦列里分析和數(shù)字三維重建得到的體積是高度相關的(r2＝0.72，p＜0.00001，n＝25)(參見圖5)。
考慮到APP轉基因小鼠中的突觸完整性，突觸傳遞的功能檢測是有意義的，因為突觸數(shù)目的組織學測定可能過高估計腦中存在的功能性突觸的數(shù)目。已顯示，PDAPP小鼠中突觸前結構的丟失伴隨有基礎突觸傳遞的損害(參見Hsia，A.Y.et al.，Proc Natl Acad Sci USA 963228-33(1999))。為了確定在PDAPP(D664A)小鼠的海馬中觀察到的突觸前密度的恢復是否相應于對突觸功能的拯救，對來自3-7月齡的PDAPP、PDAPP(D664A)和對照小鼠腦的急性海馬切片進行電生理記錄。應用細胞外記錄的興奮性突觸后電位(fEPSPs)來評價海馬CA3細胞和CA1細胞之間的基礎突觸傳遞的強度。與在其它轉基因APP品系中所報道的相似，在PDAPP小鼠中觀察到基礎突觸傳遞(輸入輸出比)降低約40％，這表明突觸傳遞明顯受損。與之對照，在PDAPP(D664A)和非轉基因同窩對照小鼠之間沒有觀察到突觸傳遞有明顯差異(參見圖3A和3B)。與觀察到的突觸前密度數(shù)目的丟失相一致，在攜帶D664A突變的動物中，不存在在PDAPP小鼠中明顯的電生理缺陷。此外，雙脈沖易化—其與遞質釋放的概率負相關—在被檢測的所有組之間無變化(參見圖3C)，這表明PDAPP(D664A)小鼠與PDAPP轉基因品系類似，在突觸前功能上沒有額外的缺陷。因此，很可能是PDAPP(D664A)小鼠中保留的突觸前元件代表了功能性突觸。
在患有AD的患者的海馬和在PDAPP小鼠的腦中，神經(jīng)發(fā)生增強(參見Jin，K.et al.，Proc Natl Acad Sci USA 101343-7(2004))。因此，在急性和慢性神經(jīng)疾病中，損傷誘導的神經(jīng)發(fā)生可能有助于腦修復。為了評價D664A突變對PDAPP誘導的海馬神經(jīng)發(fā)生的影響，應用溴脫氧尿苷(BrdU)標記12月齡對照、PDAPP和PDAPP(D664A)小鼠中齒狀回的顆粒下區(qū)(正常成年個體的神經(jīng)發(fā)生和AD誘導的神經(jīng)發(fā)生的主要部位)的增生細胞。在PDAPP小鼠中，BrdU標記細胞(它們中的大多數(shù)表達未成熟神經(jīng)元的標志物蛋白，雙皮質蛋白(doublecortin))的數(shù)目增加至對照水平的約兩倍，但是此效應被D664A突變破壞(參見圖4)。
總體而言，B21小鼠產(chǎn)生不能與PDAPP小鼠區(qū)分開來的Aβ和淀粉樣沉積物，但是它們不表現(xiàn)出見于PDAPP動物中的海馬突觸密度或齒狀回體積的特征性丟失。這些發(fā)現(xiàn)表明，胱天蛋白酶(或可能是非胱天蛋白酶或蛋白酶)對hAPP在Asp664處進行的切割使得出現(xiàn)hAPP轉基因小鼠中的突觸丟失和齒狀回體積降低。這些現(xiàn)象說明，這種小鼠AD模型中的海馬突觸丟失和齒狀回萎縮是由對APP在Asp664處進行的切割介導的，其或者獨立于Aβ沉積或者是在Aβ生成的下游(參見Lu et al.，″Amyloid β-protein toxicity is mediated by the formation of amyloid-βprotein precursor complexes″，Annals of Neurology，in press)。進一步地，結果表明，在阿爾茨海默病的表型的這些表現(xiàn)中，APP的胞質內結構域起到關鍵作用。
此外，本文中示出的結果表明，在胱天蛋白酶切割位點帶有突變Asp->Ala(D664A)—該突變防止在體內對hAPP在Asp664處進行切割—的APP轉基因小鼠繼續(xù)產(chǎn)生Aβ并表現(xiàn)出斑塊沉積，但是沒有出現(xiàn)表征PDAPP小鼠的表型的海馬突觸丟失或腦萎縮(PDAPP小鼠表現(xiàn)出突觸傳遞的大大降低)。用本發(fā)明轉基因小鼠進行的工作表明，在PDAPP(D664A)小鼠中，PDAPP小鼠的突觸傳遞損害被完全恢復。
這些結果表明，對APP的C端切割導致AD小鼠模型中觀察到的突觸損害和體積丟失，這與對APP的C端切割牽涉AD發(fā)病機理一致。更重要的是，本文中顯示的結果構成了遺傳試驗證據(jù)，其表明突觸丟失和海馬萎縮可以獨立于Aβ的產(chǎn)生和沉積。
對APP的C端部分的切割可能影響APP所涉及的幾種不同的細胞功能。本發(fā)明的轉基因動物提供了檢測影響突觸丟失并作為神經(jīng)變性疾病如AD的發(fā)病機理的早期階段的基礎的早期過程的獨特機會。與對疾病進程晚期丟失的神經(jīng)元網(wǎng)絡的替換相比，在AD早期階段突觸功能的恢復更直接地得到保證。本文提出的對PDAPP(D664A)小鼠的觀察結果與不和Aβ的產(chǎn)生或沉積直接相關的機理的存在相一致，所述機理對于小鼠的AD相關病理學是重要的，并且構成了用于藥物發(fā)現(xiàn)的新的潛在靶標。如本文所提供的對在AD早期階段起作用的機理的持續(xù)闡述，有助于對阻礙并潛在地終止或者甚至逆轉早期AD中出現(xiàn)的突觸退化的療法的開發(fā)。
由于基因型、表型和與生活史相關的因素的緣故，與人類特定病理狀態(tài)相關的標志物的鑒定被大大復雜化。在另一方而，雖然轉基因動物模型提供了可以對這些變量進行控制的適當?shù)脑囼烍w系，但是它們具有潛在的顯著缺陷，即，在發(fā)育期間作為轉基因表達的結果，潛在地出現(xiàn)生理反應或代償機制的活化。因此，轉基因動物和它們的非轉基因同窩動物的比較可以產(chǎn)生有關變化的信息，所述變化是由于轉基因本身的表達而不是由于模型動物的發(fā)病機理產(chǎn)生的。
通過防止對hAPP轉基因的C端進行切割，PDAPP小鼠中的AD相關表型的基本特征在本發(fā)明轉基因動物中被有效逆轉。由于PDAPP和PDAPP(D664A)小鼠共有許多遺傳相似性，即，1)它們從除A->C顛換之外相同的載體產(chǎn)生，2)它們共有相同的遺傳背景，和3)它們以類似的水平表達人APP轉基因，可以認為，在PDAPP和PDAPP(D664A)動物中，由于轉基因本身的表達而產(chǎn)生的變化將是類似的。因此，在不存在混淆基因型、表型或環(huán)境變量的情況下(如動物是完全同類系的，并可以容易地在受控的環(huán)境中飼養(yǎng)和居住)，相對于非轉基因同窩動物，比較在PDAPP小鼠中存在而在PDAPP(D664A)小鼠中不存在的變化(標志物)，使得能夠明確鑒定出與AD的進展相關的標志物，以及它們與由轉基因本身的表達所產(chǎn)生的那些標志物的區(qū)別。
來自PDAPP和PDAPP(D664A)品系的半合子轉基因動物可以被產(chǎn)生，用作試驗動物。具體地，可以產(chǎn)生同類系C57BL/6J背景的12只2月齡半合子轉基因PDAPP和PDAPP(D664A)動物，以及12只非轉基因同窩動物，從而產(chǎn)生匯合血清、腦提取物或其它感興趣器官的提取物。
隨后可以通過適當?shù)姆绞?，用上述動物產(chǎn)生樣品，用于蛋白質組學研究或基因組學研究。鑒定來自轉基因動物和非轉基因動物的樣品中存在的蛋白質或mRNAs和分析數(shù)據(jù)以確定哪些蛋白質在一個上述群體中獨特地存在、不存在、豐度增加或降低，可以用標準技術如，例如，質譜、DNA微陣列雜交技術和類似技術進行。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了鑒定可用于治療神經(jīng)變性疾病的化合物的方法，所述方法包括鑒定阻斷胱天蛋白酶切割β-淀粉樣前體蛋白(APP)以產(chǎn)生羧基端肽APP-C31的能力的化合物。
如本領域技術人員容易地知曉的，阻斷胱天蛋白酶切割β-淀粉樣前體蛋白(APP)產(chǎn)生羧基端肽APP-C31的能力的化合物可以用多種方法被鑒定，例如，通過在胱天蛋白酶存在的情況下使APP或APP樣蛋白質與測試化合物接觸，和監(jiān)測APP-P31的形成，其中胱天蛋白酶不能誘導APP-P31產(chǎn)生提示了可用于治療神經(jīng)變性疾病的化合物。
可選地，阻斷胱天蛋白酶切割β-淀粉樣前體蛋白(APP)產(chǎn)生羧基端肽APP-C31的能力的化合物可以這樣被鑒定在胱天蛋白酶存在的情況下使APP或APP樣蛋白(例如，APLP1或APLP2)與測試化合物接觸，并篩選以找到切割的證據(jù)，所述證據(jù)選自切割產(chǎn)物的易位(translocation)、細胞死亡的誘導、萎縮的誘導、和突觸丟失的誘導。APLP1和APLP2是APP蛋白家族的成員，統(tǒng)稱為“APP樣蛋白(APP-like proteins)”。然而，APP的γ和β-分泌酶切割所需的位點在APLP1或APLP2中并不是保守的。因此，這些分子不具有產(chǎn)生β-淀粉樣肽的能力。然而，在APLP1和APLP2中，使得能夠產(chǎn)生APP-C31的C端胱天蛋白酶切割位點是保守的。對于APLP1，P4-P1′位置將是VEVDP，對于APLP2，P4-P1′位置將是VEVDP，而在APP中，P4-P1′位置是VEVDA。這些序列，類似于APP中的那些序列，與前述的引發(fā)/頂點胱天蛋白酶(initiator/apical caspase)如胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9的胱天蛋白酶切割位點很好地配合。預測的APLP1-C31肽與APP-C31肽具有52％的同一性和77％的相似性，預測的APLP2-C31肽與APP-C31肽有71％的同一性和83％的相似性。
作為另一選擇，在損傷(例如，Aβ、缺血、熱休克、缺氧、葡萄糖剝奪、星形孢菌素和類似物)存在或不存在的情況下，表達APP、APLP1、APLP2或類似物的細胞可以被篩選，篩選阻斷APP-C31生成的化合物(其中的后者可以應用特異性檢測APP的羧基端切割產(chǎn)物的抗體進行分析，或者通過可選的方法如報告分子分析(reporter assay)、ELISA試驗和類似方法進行分析)。
隨后可以對上述篩選方法中鑒定出的化合物進行體內測試，例如，通過測試其在阿爾茨海默病動物模型(即，不帶有Asp664->Ala突變的相同的轉基因動物)中的效力和將其反應與本發(fā)明的Asp664->Ala突變轉基因動物的反應相比較。
候選化合物可以從寬范圍的來源得到，包括合成化合物或天然化合物文庫。例如，對于隨機和定向合成寬范圍的有機化合物和生物分子，包括表達隨機化的寡核苷酸和寡肽，許多方法是可以利用的?？蛇x地，細菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物文庫是可以利用的或者可以容易地被產(chǎn)生。此外，容易通過傳統(tǒng)的化學、物理和生物化學方法對天然或合成產(chǎn)生的文庫和化合物進行修飾，并且可以用它們產(chǎn)生組合文庫。已知的藥物學制劑可以經(jīng)歷定向或隨機化學修飾，如?；⑼榛?、酯化、酰胺化等，產(chǎn)生結構類似物。候選藥劑也發(fā)現(xiàn)于生物分子中，包括肽、糖、脂肪酸類、固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、結構類似物或其組合和類似物。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了治療神經(jīng)變性疾病的方法，所述方法包括，向需要的對象施用通過上述方法鑒定的有效量的一種或多種化合物。
如本文所用，“治療”是指抑制或阻止疾病、病癥或病理狀態(tài)的進展，和/或引起疾病、病癥或病理狀態(tài)減輕、緩解或復原。本領域技術人員將理解，可以用多種方法學和試驗評價疾病、病癥或病理狀態(tài)的進展，類似地，可以用多種方法學和試驗評價疾病、病癥或病理狀態(tài)的減輕、緩解或復原。
實質上，在病因學上與淀粉樣蛋白的形成和/或沉積相關的任何疾病都被考慮用于本發(fā)明的治療方法。如本文所用，“神經(jīng)變性疾病(neurodegenerativedisease)”是指病癥如阿爾茨海默病、系統(tǒng)性老年淀粉樣變性、朊病毒病(priondisease)、癢病、牛海綿狀腦病、克-雅病(Creutzfeldt-Jakob Disease)、格-施-沙綜合癥(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome)、II型糖尿病、成人發(fā)病糖尿病(adultonset diabetes)、胰島素瘤、淀粉樣蛋白A淀粉樣變、AL淀粉樣變、家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病(familial amyloid polyneuropathy)(葡萄牙型、日本型和瑞典型)、家族性轉甲蛋白淀粉樣變、家族性地中海熱、伴有蕁麻疹和耳聾的家族性淀粉樣神經(jīng)病(familial amyloid nephropathy with urticaria and deafness)(穆-韋綜合癥)、遺傳性非神經(jīng)系統(tǒng)淀粉樣變(hereditary non-neuropathic systemic amyloidosis)(家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病III)、芬蘭型家族性淀粉樣變、家族性淀粉樣心肌病(丹麥型)、孤立性心臟淀粉樣變(isolated cardiac amyloid)、孤立性動脈淀粉樣變、先天性(原發(fā)性)淀粉樣變、骨髓瘤或巨球蛋白血癥相關淀粉樣變、與舍格倫綜合癥相關的原發(fā)性局限性皮膚結節(jié)淀粉樣變、反應性(繼發(fā)性)淀粉樣變、伴有冰島型淀粉樣變的遺傳性腦出血、與長期血液透析相關的淀粉樣變、纖維蛋白原相關的遺傳性腎臟淀粉樣變、與甲狀腺髓樣癌相關的淀粉樣變、溶菌酶相關的遺傳性系統(tǒng)性淀粉樣變和類似疾病。
淀粉樣沉積物見于被診斷患有阿爾茨海默病的對象中，阿爾茨海默病是一種神經(jīng)變性疾病，特征為腦皮質、皮質下區(qū)和海馬的神經(jīng)細胞萎縮，以及斑塊、軸突營養(yǎng)障礙和神經(jīng)原纖維纏結的存在。在阿爾茨海默病中，營養(yǎng)障礙或異常的軸突生長、突觸丟失和神經(jīng)原纖維纏結形成與疾病的嚴重程度密切相關。營養(yǎng)障礙的神經(jīng)元在軸突的細胞質中特征性地含有豐富的電子致密的多層小體(multilaminar bodies)，并且具有突觸連接的中斷。營養(yǎng)障礙的神經(jīng)元包繞淀粉樣蛋白沉積物，從而形成遍布腦神經(jīng)纖維網(wǎng)以及腦血管壁的老年斑。用于治療阿爾茨海默病的本發(fā)明方法可以減輕或阻斷神經(jīng)細胞的萎縮，減輕或阻斷老年斑或神經(jīng)原纖維纏結的形成，以及類似作用，以至于疾病的進展被減慢或阻止。
淀粉樣沉積物也見于被診斷患有II型糖尿病的患者的郎格罕島中。沉積物含有淀粉樣蛋白，其源自稱作胰島淀粉樣多肽(IAPP)或胰淀素(amylin)的較大前體，在正常的動物中，其具有激素功能。IAPP由胰島β細胞產(chǎn)生，對肝臟和橫紋肌細胞攝取葡萄糖具有重要的作用。在具有人胰淀素的轉基因并用高脂肪飲食喂養(yǎng)的轉基因小鼠中，胰淀素的過量表達導致胰島淀粉樣沉積(參見Pathology，3rd ed.(1999)supra，p.1226)。本發(fā)明治療患有II型糖尿病患者的郎格罕島中的淀粉樣沉積物的方法可以減少或防止淀粉樣蛋白的形成，減少或防止淀粉樣蛋白沉積為淀粉樣沉積物和具有類似作用。
注意到有淀粉樣沉積物的又一疾病是朊病毒病，它是一種海綿狀腦病。朊病毒病是神經(jīng)變性疾病，臨床特征是進行性共濟失調和癡呆，病理學特征是海綿狀腦組織的空泡形成。淀粉樣沉積物與已知為庫魯病的至少一種朊病毒病相關。在庫魯病中，約70％的朊病毒蛋白在細胞外累積，形成斑塊，與之相比，正常朊病毒蛋白是被組成型表達的細胞表面糖蛋白(參見，Pathology，3.sup.rd ed.supra，pp.1492-1496)。本發(fā)明治療朊病毒病的方法可以減少或防止淀粉樣蛋白的產(chǎn)生，減少或防止淀粉樣斑塊的沉積，和具有類似作用。
注意到淀粉樣沉積物的又一疾病是淀粉樣蛋白A淀粉樣變性。淀粉樣蛋白A淀粉樣變性是指源自表面上不相關的病癥如慢性炎癥性疾病、腫瘤形成疾病和遺傳性疾病的淀粉樣變性。淀粉樣蛋白的沉積對基礎的疾病狀態(tài)而言是繼發(fā)性的。前體分子是血清淀粉樣蛋白A(SAA)，它是急性期反應物，在許多疾病中可以用作炎癥的替代標志物。本發(fā)明治療淀粉樣蛋白A淀粉樣變性的方法可以減少或防止淀粉樣蛋白的產(chǎn)生，減少或防止淀粉樣蛋白的前體產(chǎn)生，減少或防止產(chǎn)生活性淀粉樣蛋白所需的幾個步驟中的任一步驟，減少或防止淀粉樣斑塊的沉積，和具有類似作用。
注意到淀粉樣沉積物的又一疾病是家族性轉甲蛋白淀粉樣變，它是家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病(FAP)的最普遍形式。人淀粉樣病癥，家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病、家族性淀粉樣心肌病和老年系統(tǒng)性淀粉樣變是由不溶性轉甲蛋白(TTR)原纖維引起的，其沉積在外周神經(jīng)和心臟組織中。轉甲蛋白是同源四聚體血漿蛋白，參與甲狀腺素和視黃醛的轉運。最普通的產(chǎn)淀粉樣蛋白的TTR變體是V30M-TTR，而L55P-TTR是與FAP的最具有攻擊性形式有關的變體。本發(fā)明治療轉甲蛋白引起的淀粉樣變的方法可以減少或防止淀粉樣蛋白的產(chǎn)生，減少或防止前體生成淀粉樣蛋白，減少或防止產(chǎn)生活性淀粉樣蛋白所需的幾個步驟中的任一步驟，減少或防止淀粉樣斑塊的沉積，和具有類似作用。
注意到淀粉樣沉積物的又一疾病是AL淀粉樣變。AL淀粉樣變是與原發(fā)性免疫球蛋白產(chǎn)生疾病相關的一類疾病，所述原發(fā)性免疫球蛋白產(chǎn)生疾病包括原發(fā)性淀粉樣變、漿細胞體液疾病、免疫母細胞性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤和類似疾病。原發(fā)性系統(tǒng)性AL(淀粉樣蛋白輕鏈)淀粉樣變是漿細胞疾病，其中淀粉樣輕鏈蛋白的沉積引起進行性器官功能衰竭。原發(fā)性淀粉樣變的預后通常不佳，存活中間數(shù)是1-2年。在局灶性和系統(tǒng)性AL淀粉樣變中，前體蛋白都是免疫球蛋白輕鏈，其表現(xiàn)出相同方式的片段化和一級結構的改變。本發(fā)明治療AL淀粉樣蛋白引起的淀粉樣變的方法可以減少或防止淀粉樣蛋白的產(chǎn)生，減少或防止前體生成淀粉樣蛋白，減少或防止產(chǎn)生活性淀粉樣蛋白所需的幾個步驟中的任一步驟，減少或防止淀粉樣斑塊的沉積，和具有類似作用。
如本文所用，“施用(administering)”是指向對象提供治療有效量的化合物，其中應用經(jīng)口、舌下、靜脈內、皮下、經(jīng)皮、肌肉內、皮內、鞘內、硬膜外、眼內、顱內、吸入、經(jīng)直腸、陰道內和類似施用方式。也考慮以乳膏劑、洗劑、片劑、膠囊、丸劑、可分散粉末、顆粒、栓劑、糖漿、酏劑、錠劑、注射液、無菌水溶液或非水溶液、懸浮液或乳劑、貼劑以及類似劑型的形式施用?；钚猿煞挚梢院蜔o毒的藥學上可接受的載體混合，所述載體包括葡萄糖、乳糖、阿拉伯樹膠、明膠、甘露醇、淀粉糊、三硅酸鎂、云母、玉米淀粉、角蛋白、膠體硅石、馬鈴薯淀粉、尿素、葡聚糖和類似物質。
施用的優(yōu)選路徑將隨著臨床指征而變化。根據(jù)被治療的患者的狀態(tài)，劑量上的一些變化將必然發(fā)生，在任何情況下，醫(yī)生會決定個別患者的適當劑量。在眾多因素中，每單位劑量中的化合物的有效量取決于體重、生理情況和選擇的接種方案?；衔锏囊粋€單位劑量是指，每次施用事件中應用的化合物的重量，其中不包括載體重量(當應用載體時)。
靶向輸送系統(tǒng)如聚合物基質、脂質體和微球，可以增加需要治療劑的部位處的治療劑的有效濃度并降低治療劑的不需要的效應。隨著治療劑的更有效輸送，該藥劑的全身濃度得以降低，原因是可以施用較少量的治療劑同時產(chǎn)生相同或更好的治療效果。增加治療劑輸送效率的可適用方法典型地著重于將靶向部分(targeting moiety)連接到治療劑或連接到隨后加載有治療劑的載體。
通過應用載體如蛋白質、肽、多糖、合成聚合物、膠態(tài)顆粒(即，脂質體、囊或微團)、微乳劑、微球和納米顆粒，多種藥物輸送系統(tǒng)被設計出來。含有俘獲的藥學上有用藥劑的這些載體，意圖于獲得受控制的細胞特異性或組織特異性藥物釋放。
考慮用于本文的化合物可以以脂質體的形式施用。如本領域已知，脂質體通常從磷脂或其它脂類物質得到。脂質體通過分散在含水介質中的單層或多層水合液體結晶形成。能夠形成脂質體的任何無毒的、生理上可接受的和可代謝的液體都可以被應用。本文所述的化合物處于脂質體形式時，除了本文所述的化合物之外，可以含有穩(wěn)定劑、防腐劑、賦形劑和類似物質。優(yōu)選的脂類是磷脂和磷脂酰膽堿(卵磷脂)，無論是天然的和合成的。形成脂質體的方法是本領域已知的(參見，例如，Prescott，Ed.，Methods in Cell Biology，Volume XIV，Academic Press，NewYork，N.Y.，(1976)，p 33 et seq.) 可以用幾種輸送途徑避開血腦屏障將治療劑輸送到腦。這些途徑利用鞘內注射、手術植入(Ommaya，Cancer Drug Delivery，1169-178(1984)和美國專利5,222,982)、間質輸注(Bobo et al，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，912076-2080(1994))和類似途徑。這些策略通過直接施用于腦脊液(CSF)或腦實質(ECF)將藥劑輸送到CNS。
藥物通過腦脊液向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的輸送得以實現(xiàn)，例如，借助于被其發(fā)明者稱作“奧馬耶貯存物(Ommaya reservoir)”的硬膜下植入設備來實施。藥物被注射進該設備，隨后釋放到包繞腦的腦脊液中。它可以定向于隨后吸收藥物的暴露的腦組織的特定區(qū)域。此吸收受到限制，原因是藥物劑量不自由傳播。用改良的設備給予藥劑，通過該設備，貯存物(reservoir)被植入腹腔，注射的藥物通過腦脊液(從脊柱采取并回到脊柱)運輸?shù)侥X室空間。通過ω-3衍生，位點特異性生物分子復合物可以克服受限的吸收和治療劑穿過腦組織的運動。
改進藥劑向CNS的輸送的另一策略是增加藥劑通過血腦屏障的吸收(吸收和運輸)和細胞對治療劑的攝取(Broadwell，Acta Neuropathol.，79117-128(1989)；Pardridge et al，J.Pharmacol.Experim.Therapeutics，255893-899(1990)；Banks et al.，Progress in Brain Research，91139-148(1992)；Pardridge，F(xiàn)uel Homeostasis and theNervous System，ed.Vranic et al.，Plenum Press，New York，43-53(1991))。通過改進藥劑本身的滲透性或改變血腦屏障的特性，可以增強藥劑穿過血腦屏障向腦的通行。因此，通過化學修飾增加藥劑的脂溶性，和/或通過將藥劑偶聯(lián)到陽離子載體，或者通過將藥劑共價偶聯(lián)到能夠運輸藥劑穿過血腦屏障的肽載體，可以協(xié)助藥劑的通過。也已知肽轉運載體是血腦屏障滲透化合物(美國專利5,268,164)。可用于輸送到腦的具有親脂特性的位點特異性大分子描述于美國專利6,005,004中。
其它例子(美國專利4,701,521和美國專利4,847,240)描述了將藥劑共價結合到陽離子大分子載體的方法，所述載體以相對高的速率進入細胞。這些專利教導了，當生物分子被共價結合到陽離子樹脂時，細胞對該生物分子的細胞攝取增強。
美國專利4,046,722公開了與陽離子聚合物共價結合的抗癌藥，目的是將藥物導向帶有特定抗原的細胞。聚合物載體具有約5,000至500,000的分子量?？梢杂眠@種聚合物載體以靶向方式輸送本文所述的化合物。
涉及通過酸敏感中間體(也稱作間隔體)分子將藥劑共價結合到陽離子樹脂的進一步工作描述于美國專利4,631,190和美國專利5,144,011。各種間隔體分子如順烏頭酸，被共價連接到藥劑和聚合物載體。在酸性輕度增加時，如在細胞的溶酶體中可能發(fā)生的，它們控制藥劑從大分子載體釋放。藥物可以從分子偶聯(lián)物中被選擇性地水解并以其未修飾形式和活化形式被釋放到細胞中。分子偶聯(lián)物被轉運到溶酶體，在該處它們在比機體或細胞中的其它區(qū)室或流體實質上更加酸性的pH下，在溶酶體酶的作用下被代謝。溶酶體的pH值被顯示為約4.8，而在偶聯(lián)物消化的起始階段，pH可能低至3.8。
如本文所用，短語“治療有效量”在用于描述考慮用于本發(fā)明實踐的化合物時，是指足以提供足夠高的循環(huán)濃度以便為其接受者提供有益效果的化合物劑量。對于任何特定患者，具體的治療有效劑量水平將取決于許多因素，包括欲治療的病癥、病癥的嚴重程度、所應用的具體化合物的活性、施用路徑、具體化合物的清除率、治療持續(xù)時間、與具體化合物聯(lián)合應用或同時應用的藥物、年齡、體重、性別、飲食和患者的一般健康狀況，以及醫(yī)學領域和科學中公知的類似因素。劑量水平典型地落入約0.001至100mg/kg/日的范圍；優(yōu)選在約0.05至10mg/kg/日的范圍。
如本文所用，短語“接觸”是指將化合物提供給細胞或細胞靶標。接觸可以以固相、液相或氣相發(fā)生，是指在細胞外和細胞內發(fā)生的事件。本領域技術人員將知道，可以通過許多施用方式將化合物在體內提供給細胞，包括經(jīng)口、舌下、靜脈內、皮下、透皮、肌肉內、皮內、鞘內、硬膜、眼內、顱內、吸入、經(jīng)直腸、陰道內和類似的施用方式。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了治療神經(jīng)變性疾病的方法，所述方法包括，阻斷胱天蛋白酶切割β-淀粉樣前體蛋白(APP)和/或APP樣蛋白(例如，APLP1或APLP2)產(chǎn)生羧基端肽APP-C31的能力。
如本領域技術人員容易知道的，可以用多種方法阻斷蛋白酶切割APP和/或Aβ的能力，例如，通過抗蛋白酶抗體、基于蛋白酶編碼序列的反義核苷酸、肽、肽模擬物、核酶、干擾RNAs、蛋白酶拮抗劑、阻斷蛋白酶切割APP和/或Aβ的胞質內區(qū)域的能力的小分子和類似物質。
例如，通過施用與編碼多肽的mRNA結合并抑制該mRNA表達的反義分子，可以抑制本發(fā)明的突變APP的表達，包括過表達。可選地，可以用切割mRNA的核酶，以類似方式抑制表達。應用反義分子和核酶技術調控基因表達的一般方法，或用于以此方式表達外源基因的基因療法的一般方法，是本領域公知的。這些方法中的每一種方法利用系統(tǒng)，如載體，其編碼本發(fā)明的突變APP的反義分子或核酶轉錄物。
術語“核酶(ribozyme)”是指具有催化特性的一種或多種RNA的RNA結構。核酶通常表現(xiàn)出內切核酸酶、連接酶或聚合酶活性。核酶是介導許多RNA自我切割反應的結構性RNA分子。已經(jīng)鑒定出多種類型的反式作用核酶，包括“錘頭”型和“發(fā)夾”型，它們具有不同的二級結構。多種核酶已得到表征。參見，例如，美國專利5,246,921、5,225,347、5,225,337和5,149,796。已描述了包括具有催化活性的脫氧核糖(deoxyribo)和核糖寡核苷酸(ribooligonucleotides)的混合核酶。Perreault，et al，Nature，344565-567(1990)。
如本文所用，“反義分子(antisense)”是指核酸分子或它們的衍生物，其在細胞條件下，與編碼本發(fā)明的突變體APP的基因組DNA和/或細胞mRNA特異雜交，例如與其結合，以至于抑制該蛋白質的表達，例如，通過抑制轉錄和/或翻譯來實現(xiàn)。結合可以是通過常規(guī)的堿基對互補，或者例如，在與DNA雙鏈體結合的情況下，是通過雙螺旋的大溝中的特異性相互作用實現(xiàn)。
在一個方面，反義構建物是體外產(chǎn)生的核酸，在將其導入細胞時，其可以抑制基因表達，所述抑制是通過與APP或APP樣分子的mRNA和/或基因組序列雜交實現(xiàn)的，但是不限于此方式。
反義方法可以涉及設計與APP或APP樣mRNA互補的寡核苷酸(或是DNA或是RNA)。這些反義寡核苷酸將與APP或APP樣mRNA轉錄物結合并防止翻譯。
雖然優(yōu)選完全互補，但這不是必須的。如本文所指，與RNA的一部分“互補”的序列意味著具有能夠與該RNA雜交形成穩(wěn)定雙鏈體的足夠互補性的序列；在雙鏈反義核酸的情況下，可以測試雙鏈體DNA的一條單鏈，或可以分析三鏈體的形成。雜交的能力將取決于互補程度和反義核酸的長度。一般而言，雜交核酸越長，它可能含有的與RNA的堿基錯配越多，但仍然形成穩(wěn)定雙鏈體(或三鏈體，當情形可能如此時)。通過應用標準方法測定雜交復合物的熔點，本領域技術人員可以確定錯配的可容忍程度。
應用反義分子、核酶技術和RNAi技術調控基因表達的一般方法，或用于以此方式表達外源基因的基因治療方法的一般方法，是本領域公知的。這些方法中的每一種都利用系統(tǒng)如載體，其編碼反義分子或APP或APP樣多肽的核酶轉錄物。術語“RNAi”代表RNA干擾。在本領域中，此術語被理解為包括應用可以使基因沉默的RNA分子的技術。參見，例如，McManus，et al.Nature ReviewsGenetics 3737(2002)。在本申請中，術語“RNAi”包括分子如短干擾RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、小的短時RNA(stRNA)。一般而言，RNA干擾由雙鏈RNA與基因的相互作用而產(chǎn)生。
一般地，與信息的5’端互補的寡核苷酸，例如位于AUG起始密碼子上游并包括AUG起始密碼子的5’非翻譯序列，應該對抑制翻譯最為有效。然而，已經(jīng)顯示，與mRNAs的3’非翻譯序列互補的序列對抑制mRNAs的翻譯也是有效的。(Wagner，R.(1994)Nature 372333)。與mRNA編碼區(qū)互補的反義寡核苷酸是效率較低的翻譯抑制物，但是可以應用于本發(fā)明。不論是否被設計為與APP或APP樣多肽mRNA的5’、3’或編碼區(qū)雜交，反義核酸都應該是至少六個核苷酸的長度，并且優(yōu)選地是約100個以下，更優(yōu)選地是約50或30個核苷酸以下的長度。典型地，它們應該是10至25個核苷酸之間的長度。這樣的原則將告知實施者選擇適當?shù)墓押塑账?。在?yōu)選實施方案中，反義序列從這樣的寡核苷酸序列中選擇，所述寡核苷酸包括編碼APP或APP樣多肽的核酸序列中的約10-30個、更優(yōu)選地15-25個連續(xù)核苷酸堿基；由編碼APP或APP樣多肽的核酸序列中的約10-30個、更優(yōu)選地15-25個連續(xù)核苷酸堿基組成；或基本上由編碼APP或APP樣多肽的核酸序列中的約10-30個、更優(yōu)選地15-25個連續(xù)核苷酸堿基組成。
應用這樣的序列，可以設計出反義寡核苷酸。這種反義寡核苷酸將被施用于表達APP或APP樣多肽的細胞，并且靶RNA或蛋白質的水平與內部對照RNA或蛋白質的水平將被比較。用反義寡核苷酸得到的結果也將與用適當?shù)膶φ展押塑账岬玫降慕Y果相比較。優(yōu)選的對照寡核苷酸是與測試寡核苷酸的長度大約相同的寡核苷酸。使得靶RNA或蛋白質的水平降低的那些反義寡核苷酸將被選擇。
寡核苷酸可以是DNA或RNA或其嵌合混合物或衍生物或修飾形式，它們是單鏈或雙鏈的?？梢栽趬A基部分、糖部分或磷酸骨架處對寡核苷酸進行修飾，例如，以改進分子的穩(wěn)定性、雜交等。寡核苷酸可以包括其它附加基團如肽(例如，用于靶向于體內的宿主細胞受體)或協(xié)助轉運穿過細胞膜(參見，例如，Letsinger et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.866553-6556；Lemaitre et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci USA 84648-652；PCT公布號WO 88/09810，1988年12月15日公布)或血腦屏障(參見，例如，PCT公布號WO 89/10134，1988年4月25日公布)的藥劑，觸發(fā)雜交的切割劑(參見，例如，Krol et al.(1988)BioTechniques 6958-976)或嵌合劑(參見，例如，Zon(1988)Pharm.Res.5539-549)。為此，寡核苷酸可以與另一分子偶聯(lián)，例如，肽、雜交觸發(fā)交聯(lián)劑、轉運劑、雜交觸發(fā)切割劑等。
反義寡核苷酸可以包括至少一種修飾的堿基部分，所述部分選自諸如5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙?；奏ず?-(羧基羥基乙基)尿嘧啶。反義寡核苷酸也可以包括至少一種修飾的糖部分，選自但不限于阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。
在又一實施方案中，反義寡核苷酸包括至少一種修飾的磷酸骨架，選自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酰胺酯、氨基磷酸酯、磷酰二胺酯、甲基磷酸酯、和烷基磷酸三酯和formacetal或其類似物(也參見美國專利號5,176,996；5,264,564和5,256,775)。
在又一實施方案中，反義寡核苷酸是α-異頭寡核苷酸。α-異頭寡核苷酸和互補RNA形成特異雙鏈雜合體，其中，與通常的β單元相反，這些鏈彼此平行排列(Gautier et al.(1987)Nucl.Acids Res.156625-6641)。所述寡核苷酸是2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue et al.(1987)Nucl.Acids Res.156131-6148)或嵌合的RNA-DNA類似物(Inoue et al.(1987)FEBS Lett.215327-330)。
也適宜的是肽基核酸，其為多肽如聚絲氨酸、聚蘇氨酸等，包括含有多種氨基酸的共聚物，在側鏈部位取代有核酸(T、A、G、C、U)。這種聚合物鏈能夠以與天然DNA/RNA相同的方式通過互補堿基雜交?？蛇x地，本發(fā)明的反義構建物可以被輸送，例如，作為表達質粒或載體輸送，當在細胞中轉錄時，它們產(chǎn)生與編碼本發(fā)明的激酶多肽的細胞mRNA的至少一個獨特部分互補的RNA。
雖然可以應用與APP或APP樣多肽編碼區(qū)序列互補的反義核苷酸，但是最優(yōu)選與被轉錄的非翻譯區(qū)互補的那些核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了防止海馬突觸丟失的方法，所述方法包括阻斷胱天蛋白酶或其它蛋白酶切割β-淀粉樣前體蛋白(APP)和/或APP樣蛋白(例如，APLP1或APLP2)的能力。
如上所指出，蛋白酶切割APP和/或APP樣蛋白(例如，APLP1或APLP2)的能力可以通過多種方法被阻斷，例如，通過抗蛋白酶抗體、基于蛋白酶編碼序列的反義核苷酸、肽、肽模擬物、核酶、干擾RNAs、蛋白酶拮抗劑、阻斷蛋白酶切割APP和/或APP樣蛋白(例如，APLP1或APLP2)的胞質內區(qū)域的能力的小分子和類似物質。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了防止齒狀回萎縮的方法，所述方法包括阻斷胱天蛋白酶或其它蛋白酶切割β-淀粉樣前體蛋白(APP)和/或APP樣蛋白(例如，APLP1或APLP2)的能力。
如上所指出，蛋白酶切割APP和/或APP樣蛋白(例如，APLP1或APLP2)的能力可以通過多種方法被阻斷，例如，通過抗蛋白酶抗體、基于蛋白酶編碼序列的反義核苷酸、肽、肽模擬物、核酶、干擾RNAs、蛋白酶拮抗劑、阻斷蛋白酶切割APP和/或Aβ的胞質內區(qū)域的能力的小分子和類似物質。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了治療神經(jīng)變性疾病的基因治療方法，所述方法包括將突變導入β-淀粉樣前體蛋白(APP)以防止胱天蛋白酶介導的對其的切割。
事實上，進展導致了已展示出積極的初步結果的人類基因治療的實踐方法(綜述于Miller，Nature 357455-460，1992)?；蛑委煹幕局R描述于Mulligan(Science 260926-931，1993)。
因此，在一個實施方案中，含有突變APP編碼序列的表達載體被插入細胞中，使細胞離體生長，然后大量輸入患者。
根據(jù)本發(fā)明，基因治療可以包括使用靶向于神經(jīng)細胞的含有突變APPcDNA的腺病毒，通過植入基因工程細胞來系統(tǒng)性表達突變APP，用突變APP編碼病毒進行注射，將裸突變APP DNA注射入合適的組織，和類似程序。
可以用衍生自病毒如逆轉錄病毒、天花病毒、腺病毒、腺相關病毒、肝炎病毒、幾種RNA病毒或牛乳頭瘤病毒的表達載體，將編碼根據(jù)本發(fā)明的突變體APP的核苷酸序列(例如cDNA)輸送到靶細胞群(例如神經(jīng)細胞)?？梢杂帽绢I域技術人員公知的方法構建含有編碼序列的重組病毒載體(Maniatis et al.，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.，1989；Ausubel etal.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and WileyInterscience，N.Y.，1989)?？蛇x地，可以將編碼蛋白質序列的重組核酸分子用作裸DNA或用于重建系統(tǒng)中，例如，脂質體或其它脂類系統(tǒng)，用于輸送到靶細胞(例如，F(xiàn)elgner et al.，Nature 337387-8，1989)。存在將質粒DNA定向轉入細胞中的幾種其它方法，它們可用于人類基因治療，并涉及通過將質粒DNA復合到蛋白質，使DNA靶向于細胞上的受體(Miller，supra)。
簡單地通過微注射方法將微量DNA注射入細胞核，可以以最簡單的形式進行基因轉移(Capecchi，Cell 22479-88，1980)。一旦重組基因被導入細胞，它們可以被細胞正常的轉錄和翻譯機制識別，并且基因產(chǎn)物將被表達。其它方法也被嘗試將DNA導入更多的細胞中。這些方法包括轉染，其中DNA用磷酸鈣沉淀并通過胞吞作用被納入細胞(Chen et al.，MoI. Cell Biol.72745-52，1987)；電穿孔，其中細胞被暴露于高電壓脈沖下，以便在細胞膜中引入孔洞(Chu et al.，Nucleic AcidsRes.151311-26，1987)；脂轉染/脂質體融合，其中DNA被包裝在與靶細胞融合的親脂性載體中(Felgner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.847413-7417，1987)；和應用與小的射彈結合的DNA進行粒子轟擊(Yang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.879568-9572，1990)。將DNA導入細胞的另一方法是將DNA偶聯(lián)到經(jīng)化學修飾的蛋白質上。
也已經(jīng)顯示，腺病毒蛋白質能夠使胞內體(endosomes)變不穩(wěn)定并增強DNA的細胞攝取。將腺病毒與含DNA復合物的溶液混合，或者應用蛋白交聯(lián)劑將DNA與共價連接于腺病毒的聚賴氨酸結合，充分改進了重組基因的攝取和表達(Curiel et al.，Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.，6247-52，1992)。
如本文所用，“基因轉移”意味著將外源核酸分子導入細胞的過程?；蜣D移普遍地被進行，以便能夠表達由該基因編碼的特定產(chǎn)物。產(chǎn)物可以包括蛋白質、多肽、反義DNA或RNA、或酶促活性的RNA?；蜣D移可以在培養(yǎng)的細胞中進行，或通過直接給予動物而進行。一般地，基因轉移涉及核酸通過非特異性相互作用或受體介導的相互作用與靶細胞接觸，核酸通過膜或胞吞作用攝取進入細胞，和核酸從胞漿膜或胞內體釋放入細胞質的過程。此外，表達可能需要核酸移動進入細胞核并結合到合適的核因子以便轉錄。
如本文所用，“基因治療”是基因轉移的一種形式，被包括在本文所用的基因轉移的定義中，具體而言，是指在體內或體外進行基因轉移以從細胞表達治療產(chǎn)物。基因轉移可以離外對細胞實施，隨后將細胞移植到患者，或者可以將核酸或核酸-蛋白復合物直接施用于患者來實施。
在另一優(yōu)選實施方案中，提供了具有編碼突變體APP的核酸序列的載體，其中所述的核酸序列僅在特定組織中被表達。實現(xiàn)組織特異性基因表達的方法列舉在國際公布號WO 93/09236中，其在1992年11月3日提交并在1993年5月13日公布。
在上面列出的所有前述載體中，本發(fā)明的又一方面是，載體中包含的核酸序列可以包括對全部核酸序列或一些核酸序列的添加、缺失或修飾，如上所定義。
現(xiàn)在將參照下列非限制性實施例更加詳細地描述本發(fā)明。
實施例1PDAPP(D664A)突變的產(chǎn)生 將G至C的點突變引入帶有瑞典型和印地安那型突變的PDGF β鏈啟動子驅動的hAPP小基因(minigene)(參見Hsia et al，supra)，其將Asp664(APP695編號)變?yōu)锳la(PDAPP(D664A))。該突變通過測序和等位基因特異性擴增得以確認。
實施例2
轉基因小鼠的產(chǎn)生 如前所述進行PDAPP(D664A)轉基因的微注射，通過PCR鑒定轉基因創(chuàng)始物(transgenic founders)，并選擇用于本研究的PDAPP(D664)B21品系(參見Li，Y.，Carlson，E.，Murakami，K.，Copin，J.C.，Luche，R.，Chen，S.F.，Epstein，CJ.and Chan，P.H.，J Neurosci Methods 89，49-55(1999))，基本上如下進行。
將2ng/μl線性化的、不含載體序列的純化人PDAPP(D664A)轉基因DNA的溶液微注射入1天齡的B6D2F1/J卵的雄原核中，并在24小時后轉入假孕CD1代孕母體中。通過PCR對創(chuàng)始者進行鑒定，其中應用特異于hAPP轉基因的引物GGTGAGTTTGTAAGTGATGCC(SEQ ID NO1)，和TCTTCTTCTTCCACCTCAGC(SEQ ID NO2)，和特異于小鼠PKR基因的引物CAGGCCACTGGGAGGAAAAATG(SEQ ID NO3)，和ACCTTCTGTCATGTGGAGGTCC(SEQ ID NO4)。
用相同方法制備的其它轉基因品系，包括PDAPP(D664A)B36、PDAPP(D664A)B157、PDAPP(D664A)B159、PDAPP(D664A)B184、PDAPP(D664A)B190、PDAPP(D664A)B204、PDAPP(D664A)DB210、PDAPP(D664A)DB226、PDAPP(D664A)DB228、PDAPP(D664A)DB230、PDAPP(D664A)DB239、PDAPP(D664A)DB240、PDAPP(D664A)DB241、PDAPP(D664A)DB242、PDAPP(D664A)DB243、PDAPP(D664A)DB244、PDAPP(D664A)DB245、PDAPP(D664A)DB250、PDAPP(D664A)DB254、PDAPP(D664A)DB264和類似品系。
通過與C57BL/6J品種(Charles River Laboratories)雜合交配，轉基因品系得以維持。所有的轉基因動物就該轉基因而言是雜合的，應用非轉基因同窩動物作為對照。應用抗APP 5A3/1G7單克隆抗體，通過免疫沉淀隨后通過蛋白質印跡檢測腦勻漿中的人和小鼠APP(參見Soriano et al，supra)。
實施例3可溶性Aβ的檢測 腦中的Aβ水平是從CHAPS可溶性裂解物中測定的，其中應用識別Aβ肽的殘基1-12的26D6抗APP單克隆抗體，通過免疫沉淀隨后通過蛋白質印跡檢測。在N-二羥乙基甘氨酸-尿素SDS-PAGE凝膠上對免疫沉淀物進行分級分離，分離出Aβ40和Aβ42種類(參見Weggen，et al，Nature 414212-6(2001))。APP是從CHAPS腦裂解物的免疫印跡而來的，其中應用CT15，其為識別APP的C端的多克隆抗體。在沉積聚集的Aβ肽之前，所有的動物都是年齡匹配的，在3-4月齡之間。
實施例4
Aβ沉積物的定量 用如前述的3D6抗體對50微米厚的雜合PDAPP和PDAPP(D664A)B21小鼠的振蕩切片機腦切片進行染色(參見Wyss-Coray，T.，Masliah，E.，Mallory，M.，McConlogue，L.，Johnson-Wood，K.，Lin，C.and Mucke，L.，Nature 389603-6(1997)。鑒定總海馬Aβ斑塊，并由不知道品系和基因型的研究者計數(shù)。數(shù)據(jù)表示為均值+/-SD。
實施例5在體內在Asp664處對APP進行的切割 應用特異于在Asp664處切割APP所產(chǎn)生的新表位的抗體(參見Galvan etal.，J Neurochem 82283-94(2002))，證明了與對照組和PDAPP(D664A)相比，在PDAPP小鼠中的切割增加。
實施例6突觸前密度的定量 為了確定突觸前末梢的完整性，用α-突觸泡蛋白抗體(10μg/ml，Chemicon)對來自雜合雌性PDAPP和PDAPP(D664A)小鼠腦的50μm振蕩切片機切片進行染色，隨后用熒光素異硫氰酸酯偶聯(lián)的猴抗小鼠IgG(1∶400，Vector Laboratories)染色，用碘化丙啶進行復染，應用使用了100×物鏡和2.7×數(shù)字變焦的激光掃描共聚焦顯微鏡(Nikon PCM-2000)進行成像。CA1輻射層中的突觸泡蛋白免疫反應活性突觸前末梢的三維數(shù)值密度(表示為每mm3的目標數(shù))是通過對經(jīng)修改的立體解剖方法來測定的[參見Hsai，A.Y.et al.(1999)Proc.Nat.Acad.Sci.USA，963228-3233]。
對于每一動物，以2070 PMT增益獲得六個1024×1024像素的(45μm×45μm)的單色共聚焦圖像。以相同的x和y座標得到另外一組六個匹配的共聚焦圖像，但是是在獲得第一共聚焦圖像的平面之下0.9μm的平面(z＝-0.90μm)，以2100PMT增益獲得，以便用Simple PCI軟件(Compix，Inc.)對光漂白進行校正。為了減少由于每一區(qū)域中對應于神經(jīng)元突起的未染色區(qū)比例的變化在測定中帶來的可變性，從每對圖像的最亮區(qū)域收集兩個10μm×10μm的亞區(qū)域，避開突起所占據(jù)的區(qū)域。處于不同z座標的這對10μm×10μm的亞區(qū)域中的每一個圖像被偽色為紅色和綠色并疊加。用Photoshop對得到圖像的模糊處進行校正，用Simple PCI對兩個平面之間的被免疫標記的目標(黃色)的數(shù)目進行計數(shù)。對于每個對象，每只小鼠取六個系列的海馬切片，由隨機隔開的12個此類解剖者獲取目標數(shù)(避免解剖者之間的重疊)，取它們的平均值，并將其用于隨后的統(tǒng)計學分析(參見圖2B和2C)。
實施例7體積測定 借助于合適的圖譜，限定出海馬齒狀回(DG)和分子層(ML)(參見Paxinos，G.，F(xiàn)ranklin K.B.J.“The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates”Academic Press(2001)，San Diego)。應用Imaris3D(Bitplane AG，Switzerland)經(jīng)三維重建確定總海馬體積和亞區(qū)域的體積(參見圖2C)并用卡瓦列里分析確認(參見圖2B)。
為了用Imaris3D(Bitplane)和人工卡瓦列里分析確定體積，借助于合適的圖譜，畫出驟冷小鼠腦的40μm尼式染色切片的一分為四的系統(tǒng)隨機系列2×圖像中的每個海馬半球、齒狀回(DG)和分子層(ML)亞區(qū)域的邊界(對應于25只100天的雜合轉基因雄性或非轉基因雄性同窩動物)，分別在與傘部和胼胝體的灰質/白質邊界、在分子層和腔隙分子的邊界以及多形層與丘腦的邊界畫出[參見Paxinos，G.andFranklin，K.B.J.，(2001)Academic Press，San Diego，CA]。海馬下托被排除。在每一樣品中，最后的切片被定義為顯示有胼胝體纖維的連續(xù)束的最后切片。對于Imaris3D體積測定，用Align application(Bitplane)對切片進行比對，在需要時人工調整得到的系列切片。應用3.3μm×3.3μm×160μm的像素尺寸(voxel-size)進行所有隨后的3D重建和體積測定。為了應用卡瓦列里原理估計體積，將200μm的柵格覆蓋在樣品的每個切片的1280×1024像素圖像上，對樣品中的每個切片，計算每個海馬半球、齒狀回和分子層亞區(qū)內的柵格交叉數(shù)目。按照以前所述計算體積(參見Gonzalez-Lima，F(xiàn).，Berndt，J.D.，Valla，J.E.，Games，D.and Reiman，E.M.Neuroreport 12，2375-9(2001))。
卡瓦列里分析和Imaris 3D重建得到的體積是高度相關的(r2＝0.72，p＜0.00001，n＝25)。在品系或基因型之間沒有發(fā)現(xiàn)總體重或腦重量有明顯差異。對于所有的試驗，小鼠和腦組織樣品被給予代碼，至于品系和基因型研究者并不知情。數(shù)據(jù)表示為均值+/-SD。顯著性(p＜0.05)是通過學生t檢驗(假設方差相等)或皮爾遜相關系數(shù)檢驗，隨后通過回歸分析游程檢驗確定的。
實施例8體外切片電生理學 水平海馬切片(400μm)從3-7月齡的PDAPPJ20、PDAPP(D664A)B21和非轉基因同窩對照小鼠(J20小鼠被選擇用來與B21比較，因為它們表達相似水平的APP轉基因)制得。用標準方法制備切片(參見，例如，Contractor，A.et al.J Neurosci23422-9(2003))。簡言之，用異氟烷麻醉動物并斷頭。移走腦，在冰冷的蔗糖人造CSF(ACSF)下切片，所述人造腦脊液含有85mM NaCl、2.5mM KCl、1.25mMNaH2PO4、25mM NaHCO3、25mM葡萄糖、75mM蔗糖、0.5mM CaCl2和4mMMgCl2，并用還含有10μM D，L-APV和100μM犬尿喹啉酸的95％O2和5％CO2進行平衡。在記錄之前，在室溫下溫育切片至少1小時，在標準ACSF中進行，所述ACSF含有125mM NaCl、2.4mM KCl、1.2mM NaH2PO4、25mM NaHCO3、25mM葡萄糖、1mM CaCl2和2mM MgCl2。在記錄期間，用含有2mM CaCl2和1mM MgCl2的ACSF持續(xù)灌注切片。
用注滿細胞外液的玻璃記錄管(尖端電阻是2-3MOhm)，在海馬CA1區(qū)的輻射層記錄細胞外場電位(fEPSPs)。使用通有恒定電流的同心雙極電極記錄響應于Schaffer側支/聯(lián)合通路刺激的誘發(fā)fEPSPs。基礎突觸傳遞通過比較記錄的fEPSPs的輸入和輸出關聯(lián)而被測定(Hsia et al)；輸入為纖維群峰的峰幅度，輸出為fEPSP的起始斜率。對于每一動物，測定纖維群峰(FV)幅度和fEPSP反應的起始斜率，刺激范圍為5-800μA，對這兩種值繪制反應曲線。隨后通過用fEPSP的斜率除以FV 隔度(從沿著反應曲線上的線性部分的各點)并取得平均值，計算輸入輸出關聯(lián)。用40ms的刺激間間隔引發(fā)雙脈沖易化，比值測定為fEPSP(2)的峰值/fEPSP(1)的峰值。用單因素方差分析(ANOVA)并接著用Tukey post-hoc檢驗來分析結果。
實施例9神經(jīng)發(fā)生 將BrdU(50mg/kg)溶解在鹽水中并以8小時間隔每日兩次腹膜內給予，持續(xù)3日，1周后處死小鼠。用小鼠單克隆抗BrdU(Roche，2μg/ml)和生物素化的山羊抗小鼠IgG(Vector，1∶200)對腦切片染色，用二氨基聯(lián)苯胺和H2O2對染色顯色。在每一小鼠的間隔200μm的5-7、50-μm冠狀切片中，在不知內情的情況下計數(shù)齒狀回中的BrdU陽性細胞。在帶有Magnifire數(shù)字照相機的NikonE800顯微鏡上，在高倍率下對細胞進行計數(shù)，圖像顯示在計算機監(jiān)視器上。結果表示為每一切片的BrdU陽性細胞的平均數(shù)。
盡管參照一些優(yōu)選實施方案詳細描述了本發(fā)明，應該理解，其修改和變化包含在其描述和要求的精神和范圍內。
權利要求
1.非人轉基因動物，其包含編碼突變型人β淀粉樣前體蛋白(APP)或APP樣蛋白的核苷酸序列，其中所述突變型人APP或APP樣蛋白包括使得所述突變型人APP或APP樣蛋白對Asp664處的切割具有抵抗性的突變，并且其中編碼所述突變體APP或APP樣蛋白的所述核苷酸序列可操縱地與適當?shù)膯幼舆B接。
2.權利要求1所述的轉基因動物，其中在Asp664處的切割是胱天蛋白酶誘導的。
3.權利要求1所述的轉基因動物，其中所述突變型人APP或APP樣蛋白包括在殘基664處的突變。
4.權利要求3所述的轉基因動物，其中所述在殘基664處的突變將Asp改變?yōu)锳la、Glu或Gln。
5.權利要求1所述的轉基因動物，其中所述突變型人APP或APP樣蛋白包括鄰近殘基664的突變。
6.權利要求1所述的轉基因動物，其中所述啟動子是具有組成型活性的。
7.權利要求6所述的轉基因動物，其中所述啟動子選自肌動蛋白啟動子、PDGF-β啟動子、PrP(神經(jīng)元特異性)啟動子和神經(jīng)元特異性烯醇酶啟動子。
8.權利要求1所述的轉基因動物，其中所述啟動子是誘導型的。
9.權利要求8所述的轉基因動物，其中所述啟動子選自Tet-on、Tet-off、RU486誘導型啟動子系統(tǒng)和蛻皮素誘導型啟動子系統(tǒng)。
10.權利要求1所述的轉基因動物，其中所述動物選自嚙齒動物、兔和豬。
11.權利要求1所述的轉基因動物，其中所述動物是嚙齒動物。
12.權利要求1所述的轉基因動物，其中所述動物是小鼠。
13.治療神經(jīng)變性疾病的方法，所述方法包括阻斷蛋白酶切割β淀粉樣前體蛋白(APP)和/或β淀粉樣蛋白(Aβ)產(chǎn)生羧基端肽APP-C31的能力。
14.權利要求13的方法，其中所述蛋白酶切割APP和/或Aβ的能力是被抗蛋白酶抗體、基于蛋白酶編碼序列的反義核苷酸、肽、肽模擬物、核酶、干擾RNAs、蛋白酶拮抗劑、或阻斷蛋白酶切割APP和/或Aβ的胞質內區(qū)域的能力的小分子阻斷的。
15.防止海馬突觸丟失的方法，所述方法包括阻斷胱天蛋白酶切割β淀粉樣前體蛋白(APP)的能力。
16.防止齒狀回萎縮的方法，所述方法包括阻斷胱天蛋白酶切割β淀粉樣前體蛋白(APP)的能力。
17.鑒定用于治療神經(jīng)變性疾病的化合物的方法，所述方法包括鑒定阻斷蛋白酶切割β淀粉樣前體蛋白(APP)產(chǎn)生羧基端肽APP-C31的能力的化合物。
18.權利要求17所述的方法，其中阻斷胱天蛋白酶切割β淀粉樣前體蛋白(APP)產(chǎn)塵羧基端肽APP-C31的能力的化合物是通過在胱天蛋白酶存在的情況下使APP或APP樣蛋白與測試化合物接觸，和監(jiān)測APP-P31的形成而被鑒定的，其中胱天蛋白酶不能誘導APP-P31產(chǎn)生提示了用于治療神經(jīng)變性疾病的化合物。
19.權利要求17所述的方法，其中阻斷胱天蛋白酶切割β淀粉樣前體蛋白(APP)產(chǎn)生羧基端肽APP-C31的能力的化合物是通過在胱天蛋白酶存在的情況下使APP或APP樣蛋白與測試化合物接觸，和篩選切割證據(jù)而被鑒定的，所述證據(jù)選自切割產(chǎn)物的易位、細胞死亡的誘導、萎縮的誘導和突觸丟失的誘導。
20.用于治療神經(jīng)變性疾病的方法，所述方法包括向需要的對象施用有效量的通過權利要求17所述的方法鑒定出的化合物。
21.用于治療神經(jīng)變性疾病的基因治療方法，所述方法包括將突變導入β淀粉樣前體蛋白(APP)，以至于防止胱天蛋白酶介導的對APP的切割。
全文摘要
根據(jù)本發(fā)明，證明了在阿爾茨海默病的轉基因模型中，APP中經(jīng)選擇的突變例如Asp－＞Ala(D664A)突變(其防止在胱天蛋白酶切割位點處進行切割)防止海馬突觸丟失和齒狀回萎縮，雖然這些突變不干擾Aβ的生成或淀粉樣斑塊的形成。因此，鑒于這些發(fā)現(xiàn)，開發(fā)出了用于鑒定阻斷在APP的Asp664處的切割的藥劑的方法，包括用于這種目的的轉基因動物，以及應用它們治療神經(jīng)變性疾病的方法。
文檔編號A01K67/00GK1964720SQ200580018020
公開日2007年5月16日 申請日期2005年4月22日 優(yōu)先權日2004年4月23日
發(fā)明者D·E·布雷德森, V·加爾萬 申請人:巴克研究所