專利名稱：神經(jīng)元功能中的taj的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及神經(jīng)生物學(xué)、神經(jīng)病學(xué)和藥理學(xué)。更具體地，涉及通過給予TAJ拮抗劑來調(diào)節(jié)例如在CNS中的神經(jīng)元功能，例如調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長和/或存活，例如軸突再生和/或神經(jīng)突長出的方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)細(xì)胞功能受神經(jīng)元和在其直接環(huán)境中的其它細(xì)胞之間的接觸所影響(Rutishauser，et al.，1988，Physiol.Rev.688l9)。這些細(xì)胞包括在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的特化神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞，以及在周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)中的施萬細(xì)胞(Schwann cell)，其用髓磷脂覆蓋神經(jīng)元軸突(Lemke，1992，in An Introduction to Molecular Neurobiology，Z.Hall，Ed.，p.281，Sinauer)。
CNS神經(jīng)元具有損傷后的內(nèi)在再生能力，但是存在于髓磷脂中的抑制性蛋白抑制它們這樣做(Brittis et al.，2001，Neuron3011-14；Jones et al，2002，J.Neurosci.222792-2803；Grimpe et al，2002，J.Neurosci.223144-3160)。已經(jīng)表征了若干種在少突膠質(zhì)細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的髓磷脂抑制性蛋白。髓磷脂抑制性蛋白的實例包括NogoA(Chenet al.，Nature，2000，403，434-439；Grandpre et al.，Nature2000，403，439-444)、髓磷脂相關(guān)糖蛋白(MAG)(McKerracher et al.，1994，Neuron13805-811；Mukhopadhyay et al.，1994，Neuron13757-767)和少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(OMgp)(Mikol et al.，1988，J.Cell Biol.1061273-1279)。這些蛋白中的每一種已分別被證實為神經(jīng)元NgR1的配體(Wang et al.，Noture 2002，417，941-944；Grandpre et al.，Nature2000，403，439-444；Chen et al.，Nature，2000，403，434-439；Domeniconi et al.，Neuron2002，published online June28，2002)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明(部分地)基于如下發(fā)現(xiàn)，即在例如CNS中調(diào)節(jié)神經(jīng)元功能，例如調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長和/或存活，例如軸突再生和/或神經(jīng)突長出中涉及TNFR總科成員TAJ(也被稱為TRAIN、TROY、TRADE或TNFRSF19，參見EBY etal.，2000，J.Biolog.Chem.27515336-15342；Kojima et al.，2000，J.Biol.Chem27520742-20747)。雖然不受限于理論，但是認(rèn)為TAJ與Nogo受體(NgR1)/LNGO-1復(fù)合物有關(guān)以影響Rho活化，其調(diào)節(jié)髓磷脂對神經(jīng)突長出的抑制作用。因此，本發(fā)明的特征尤其在于利用調(diào)節(jié)TAJ以調(diào)節(jié)神經(jīng)生長(例如用于在例如CNS損傷或發(fā)炎后促進(jìn)神經(jīng)元再生)的試劑(例如，蛋白質(zhì)或多核苷酸試劑)的方法和組合物。
因此，在一方面，本發(fā)明的特征在于調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長和/或存活，例如調(diào)節(jié)軸突再生和/或神經(jīng)突長出的方法。該方法涉及將神經(jīng)元(如CNS神經(jīng)元)與有效量的調(diào)節(jié)TAJ復(fù)合物形成和/或信號傳導(dǎo)(signaling)的試劑進(jìn)行接觸。在一優(yōu)選具體實施方式
中，神經(jīng)元是CNS神經(jīng)元。所述接觸可在體外、來自體內(nèi)、或體內(nèi)地進(jìn)行。
在一個
具體實施例方式
中，所述試劑減少例如阻斷TAJ信號傳導(dǎo)和/或復(fù)合物形成(例如減少TAJ/NgR1和/或TAJ/LINGO-1復(fù)合物形成)，從而促進(jìn)神經(jīng)元的長出和/或存活，例如增加神經(jīng)元存活、神經(jīng)突長出、軸突再生、和/或減少髓磷脂誘導(dǎo)的神經(jīng)突生長的抑制。這樣的試劑在本文被稱為“TAJ拮抗劑”。示例性TAJ拮抗劑包括某些TAJ多肽和融合蛋白(例如，可溶性TAJ-Fc融合蛋白或顯性失活(例如非信號傳導(dǎo))TAJ多肽突變體)、抑制性抗-TAJ抗體(包括其抗原結(jié)合片段和同系物)、以及抑制性TAJ核酸例如反義寡核苷酸和RNAi核酸(例如，TAJ特異性siRNA)。TAJ信號傳導(dǎo)和/或復(fù)合物形成還可通過降低內(nèi)源性TAJ基因的表達(dá)水平，例如通過降低TAJ基因的轉(zhuǎn)錄來減少。在一個具體實施方式
中，TAJ基因的轉(zhuǎn)錄可通過以下方式來降低改變內(nèi)源性TAJ基因的調(diào)節(jié)序列，例如通過插入負(fù)調(diào)節(jié)序列(如用于轉(zhuǎn)錄阻遏物的DNA結(jié)合位點)、或通過去除正調(diào)節(jié)序列(如增強(qiáng)子或用于轉(zhuǎn)錄激活物的DNA結(jié)合位點)。
在一優(yōu)選具體實施方式
中，相比于基準(zhǔn)值例如對照，神經(jīng)元存活、神經(jīng)突長出、和/或軸突再生增加至少10％，優(yōu)選至少15％、20％、25％、30％、40％、50％或更多。
在另一
具體實施例方式
中，所述試劑增加TAJ信號傳導(dǎo)和/或TAJ復(fù)合物形成，從而降低神經(jīng)元存活、軸突再生、或神經(jīng)突長出。這樣的試劑在本文被稱為“TAJ激動劑”。這樣的試劑的實例包括全長TAJ多肽或其功能等同物，以及編碼TAJ的核酸。編碼TAJ的核酸可以是基因組序列或cDNA序列。除了TAJ編碼區(qū)(例如，全長編碼區(qū))外，核苷酸序列可包括啟動子序列，例如來自TAJ基因或第二個基因的啟動子序列；增強(qiáng)子序列；未翻譯的調(diào)節(jié)序列，例如5’未翻譯區(qū)(UTR)，例如來自TAJ基因或第二個基因的5’UTR，3’UTR，例如來自TAJ基因或第二個基因的3’UTR；聚腺苷酸化位點；隔離序列(insulator sequence)。在另一具體實施方式
中，TAJ蛋白的水平通過增加內(nèi)源性TAJ基因的表達(dá)水平，例如通過增加TAJ基因的轉(zhuǎn)錄而得以增加。在這樣的具體實施方式
中，TAJ基因的轉(zhuǎn)錄可通過以下方式增加改變內(nèi)源性TAJ基因的調(diào)節(jié)序列，例如通過插入正調(diào)節(jié)因子(如增強(qiáng)子或用于轉(zhuǎn)錄激活物的DNA結(jié)合位點)；缺失負(fù)調(diào)節(jié)因子(如用于轉(zhuǎn)錄阻遏物的DNA結(jié)合位點)和/或用另一基因的調(diào)節(jié)序列或因子替代內(nèi)源性調(diào)節(jié)序列或其中的因子，從而使得TAJ基因的編碼區(qū)可以更有效地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。
本文所描述的方法對于例如抑制CNS神經(jīng)元的生長圓錐萎陷(growth cone collapse)、促進(jìn)神經(jīng)元(例如，處于死亡危險的神經(jīng)元)的存活、促進(jìn)神經(jīng)突長出、促進(jìn)軸突再生、促進(jìn)在CNS失調(diào)或損傷位點處的髓鞘化、通過髓磷脂抑制性蛋白來降低軸突生長的抑制、以及治療哺乳動物中的CNS病癥(例如，治療CNS損傷或失調(diào)，例如治療與軸突損傷或橫切(橫纖維切斷，transection)相關(guān)的CNS病癥，如創(chuàng)傷性腦損傷和脊髓損傷)，或治療神經(jīng)變性病癥如多發(fā)性硬化(以及其它髓鞘化失調(diào)，例如，進(jìn)行性多發(fā)性腦白質(zhì)病(PML)、橋腦中央髓鞘溶解癥(CPM)、以及腦白質(zhì)腎上腺萎縮癥)、ALS、亨廷頓氏病(Huntington’s disease)、阿耳茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、糖尿病神經(jīng)病變、以及中風(fēng)。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于治療需要調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長的受治療者(患者，subject)(例如，哺乳動物，優(yōu)選人)，例如需要增加神經(jīng)元存活、神經(jīng)突長出、和/或軸突再生(優(yōu)選在CNS中)的受治療者的方法。該方法包括向受治療者以足以增加神經(jīng)元存活、神經(jīng)突長出、和/或軸突再生(例如減少髓磷脂或MAIF誘導(dǎo)的神經(jīng)突長出的抑制)的量給予減少TAJ信號傳導(dǎo)和/或減少TAJ復(fù)合物形成(例如減少TAJ/NgR1/LINGO-1復(fù)合物形成)的試劑。該試劑可以是例如抗TAJ抑制性抗體(或其抗原結(jié)合片段或同系物)、可溶性TAJ多肽例如可溶性TAJ融合蛋白(優(yōu)選TAJ-Fc融合蛋白)、TAJ反義核酸或RNAi分子。優(yōu)選的試劑是蛋白質(zhì)，例如可溶性TAJ-Fc融合蛋白，例如包括融合至人Ig Fc區(qū)的人TAJ的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白、或抑制性抗-TAJ抗體，優(yōu)選人源化或全人抗-TAJ抗體。
在一個
具體實施例方式
中，受治療者具有CNS神經(jīng)變性病癥如多發(fā)性硬化(或其它髓鞘化失調(diào)，例如進(jìn)行性多發(fā)性腦白質(zhì)病(PML)、橋腦中央髓鞘溶解癥(CPM)、以及腦白質(zhì)腎上腺萎縮癥)、ALS、亨廷頓氏癥、阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、糖尿病神經(jīng)病變。在另一具體實施方式
中，受治療者具有與軸突損傷或橫切相關(guān)的CNS損傷，如創(chuàng)傷性腦損傷、中風(fēng)、脊髓損傷、或視神經(jīng)損傷。在一些具體實施方式
中，所述試劑可在初始損傷后的短時間期內(nèi)，例如在損傷的72小時內(nèi)，優(yōu)選在48小時內(nèi)，更優(yōu)選在24小時內(nèi)加以給予。在這樣的具體實施方式
中，所述試劑可系統(tǒng)給予，但優(yōu)選在損傷部位處或附近局部給予。
在一個
具體實施例方式
中，所述方法可包括將所述試劑系統(tǒng)地給予至受治療者，例如通過靜脈內(nèi)、或肌內(nèi)途徑給予。在其它具體實施方式
中，所述試劑在損傷或失調(diào)部位處或附近局部地給予，例如鞘內(nèi)或硬膜外給予。
對于局部給藥，治療有效量的多肽通常為10μg/kg～10mg/kg，例如為10μg/kg～5mg/kg。對于系統(tǒng)給藥，治療有效量的多肽通常為1mg/kg～20mg/kg。
在一些
具體實施例方式
中，所述方法包括(a)提供經(jīng)遺傳改造以表達(dá)TAJ多肽的培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和(b)在CNS疾病、失調(diào)或損傷例如脊髓損傷位點處或附近將宿主細(xì)胞引入受治療者。培養(yǎng)的宿主細(xì)胞可以是自體同源或異源性的。在一個具體實施方式
中，該細(xì)胞已用編碼TAJ多肽的核酸加以轉(zhuǎn)染。該TAJ多肽可以是全長TAJ多肽。
在一些
具體實施例方式
中，所述方法包括在疾病、失調(diào)、或損傷部位處或附近給予受治療者足以減少由在損傷位點處或附近的神經(jīng)元軸突伸展的抑制的量的載體(例如病毒載體)的步驟，其中所述載體包含引起TAJ多肽表達(dá)的序列(例如編碼TAJ多肽的核苷酸序列)，以使TAJ多肽在受治療者體內(nèi)由該核苷酸序列表達(dá)。該載體可以是例如腺病毒載體、慢病毒載體、桿狀病毒載體、EB病毒載體(Epstein Barr viral vector)、乳多空病毒載體、牛痘病毒載體、單純皰疹病毒載體、或質(zhì)粒載體。該載體可以通過諸如局部給藥、眼內(nèi)給藥、非腸道給藥、胸內(nèi)給藥、硬膜下給藥或皮下給藥的路徑加以給予。
在以下
具體實施例方式
中，結(jié)合第二個(另一個，second)預(yù)防或治療試劑給予所述試劑，其中所述第二個預(yù)防或治療試劑例如為皮質(zhì)類固醇(皮質(zhì)甾類，corticosteroid)，例如甲潑尼龍(methylprednisolone)；止痛劑；抗生素；第二個生物治療劑，例如LINGO-1活性、p75活性、或Nogo受體(NgR)活性的調(diào)節(jié)物。在以下情況下，所述試劑可以結(jié)合至該第二個試劑。
在典型
具體實施例方式
中，所述試劑的給予是重復(fù)的，例如重復(fù)至少1、2、3、5、10、20次或更多次。在一個具體實施方式
中，該試劑在治療期間給予，包括至少每周一次地給予達(dá)至少8周。在其它具體實施方式
(例如，其中的受治療者已具有急性CNS損傷)中，所述試劑在治療期間進(jìn)行給予，包括在單個星期內(nèi)多次給予。
在一個
具體實施例方式
中，所述方法包括對受治療者或來自受治療者的生物樣品的參數(shù)進(jìn)行評價，該參數(shù)涉及神經(jīng)元功能，例如神經(jīng)元Rho活化、神經(jīng)元長出、脊髓功能和/或認(rèn)知功能。所述評價可在給藥之前和/或之后進(jìn)行。
在一些
具體實施例方式
中，所述試劑利用例如控釋裝置如生物相容性聚合物、微粒、或篩網(wǎng)通過控釋遞送至受治療者。所述裝置可減少降解并控制試劑的釋放。這樣的生物相容性控釋系統(tǒng)可在CNS傷口部位處或附近例如通過肌內(nèi)、皮下、靜脈注射或植入而給予至受治療者。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種篩選試劑的方法，其中所述試劑調(diào)節(jié)例如增加或降低神經(jīng)元存活，例如調(diào)節(jié)神經(jīng)突長出和/或軸突再生。該方法包括鑒定試劑，該試劑可減少TAJ的表達(dá)或水平和/或降低TAJ信號傳導(dǎo)或復(fù)合物形成(例如，TAJ/LINGO-1/NgR1復(fù)合物)的能力。該方法還可包括將試驗試劑對TAJ的作用與該試驗試劑促進(jìn)或增加神經(jīng)突長出的能力相關(guān)聯(lián)起來(例如，提供與所鑒定試劑或其應(yīng)用相關(guān)的打印材料或計算機(jī)可讀媒質(zhì))。相關(guān)聯(lián)意味著將降低TAJ的表達(dá)、活性或水平的試驗試劑鑒定為能夠促進(jìn)或增加神經(jīng)突長出(例如促進(jìn)軸突再生)的試劑。相關(guān)聯(lián)步驟可包括例如形成或提供降低TAJ的表達(dá)、活性或水平的試驗試劑鑒定為能夠促進(jìn)或增加神經(jīng)突長出的試劑的記錄(例如，打印或計算機(jī)可讀記錄，如實驗記錄或數(shù)據(jù)組或電子郵件)。該記錄可包括其它信息，如特異性試驗試劑鑒定器、日期、方法的操作者、或關(guān)于試驗試劑純化或生物活性的來源、結(jié)構(gòu)、方法。來源于該記錄的記錄或信息可用來例如將試驗試劑鑒定為用于藥學(xué)或醫(yī)療用途的化合物或備選試劑(例如，鉛化合物)。所鑒定的試劑可被鑒定為用于治療CNS病癥例如本文中所描述的CNS病癥的試劑或潛在試劑。通過這個方法鑒定的試劑例如化合物可用于例如調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長的治療(或治療開發(fā))中。
在一個
具體實施例方式
中，所述方法包括提供試驗試劑以及評價該試驗試劑是否結(jié)合TAJ或TAJ配體。在一個具體實施方式
中，該方法包括提供試驗試劑以及評價該試驗試劑是否影響TAJ結(jié)合LINGO-1和NgR1中的一種或兩種的能力。
在一個
具體實施例方式
中，所述方法包括提供試驗試劑以及評價該試驗試劑是否影響TAJ信號傳導(dǎo)例如調(diào)節(jié)神經(jīng)元中的Rho活化的能力。例如，可以利用Rho驅(qū)動報道分子系統(tǒng)來篩選影響TAJ信號傳導(dǎo)的試劑。
在另一
具體實施例方式
中，所述方法包括(a)提供細(xì)胞(例如本文所述的CNS細(xì)胞)、組織或攜帶外源性核酸的非人動物，該外源核酸包括TAJ的調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動子)，其可操作地連接至編碼報道多肽(reporter polypeptide)(例如基于光的，例如比色或熒光可檢測標(biāo)記物，例如熒光報道多肽，例如GFP、EGFP、BFP、RFP)的核苷酸序列；(b)評價試驗試劑調(diào)節(jié)該細(xì)胞、組織或非人動物中的報道多肽的活性的能力；以及(c)選擇增加或降低報道多肽的活性的試驗試劑分別作為抑制或促進(jìn)CNS神經(jīng)元生長的試劑。在一個具體實施方式
中，所述細(xì)胞或組織是神經(jīng)元。在另一具體實施方式
中，所述非人動物是攜帶核酸的轉(zhuǎn)基因動物，例如轉(zhuǎn)基因嚙齒動物，例如小鼠、大鼠或豚鼠。在另一具體實施方式
中，所述非人動物是斑馬魚(參見，例如，Hjorth，2002，Int J Dev Biol.46(4)609-19，用于在斑馬魚中的軸突生長試驗)、果蠅、秀麗隱桿線蟲(C.elegans)或其它攜帶該核酸的低級生物。在一個具體實施方式
中，所述細(xì)胞是CNS細(xì)胞，例如CG神經(jīng)元、DRG神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、或少突膠質(zhì)細(xì)胞。
在一些
具體實施例方式
中，所述評價包括將用于評價的值例如用于試驗試劑對TAJ的作用的值輸入到數(shù)據(jù)庫或其它記錄中。
在一個
具體實施例方式
中，所述方法包括兩個評價步驟，例如該方法包括在第一系統(tǒng)例如無細(xì)胞、細(xì)胞、或組織系統(tǒng)中評價試驗試劑的第一步驟，以及在第二系統(tǒng)例如第二細(xì)胞或組織系統(tǒng)中或在非人動物中評價試驗試劑的第二步驟。在其它具體實施方式
中，該方法包括在相同類型的系統(tǒng)中的兩個評價步驟，例如，在相同或不同的非人動物中的第一評價之后，在非人動物中再次評價該試劑。兩次評價可通過間隔任意長的時間例如數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年。在一個具體實施方式
中，試驗試劑首先對其與TAJ相互作用例如結(jié)合至TAJ的能力進(jìn)行評價，然后對其調(diào)節(jié)Rho活化和/或神經(jīng)突長出的能力進(jìn)行評價。
所述試驗試劑可以是粗產(chǎn)物或半純化提取物(例如有機(jī)提取物，例如動物或植物提取物)或分離的化合物，例如小分子、蛋白質(zhì)、脂或核酸。
在另一方面，本發(fā)明的特征在于轉(zhuǎn)基因的非人動物，例如轉(zhuǎn)基因非人嚙齒類動物，例如小鼠、大鼠或豚鼠，其基因組包含破壞TAJ基因的轉(zhuǎn)基因。在一個具體實施方式
中，非人動物(或來自該動物的細(xì)胞)表現(xiàn)出以下中的一種或多種減少的響應(yīng)于神經(jīng)突長出的抑制劑(例如髓磷脂和MAIF)的神經(jīng)突長出抑制；以及減少的響應(yīng)于神經(jīng)突長出的抑制劑的Rho激活。
盡管類似或等同于本文所述的方法和物質(zhì)可用于本發(fā)明的實施或測試，但是以下描述了優(yōu)選的方法和物質(zhì)。這些物質(zhì)、方法以及實施例僅僅是說明性的，而不用于限制。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點根據(jù)詳細(xì)描述和權(quán)利要求書將會更明顯。


圖1A-C示出了各種結(jié)合測定的結(jié)果。(A)為條形圖，示出了用于各種蛋白質(zhì)與可溶性NgR1(10μg/ml)結(jié)合的ELISA測定結(jié)果。(B)為一組柱狀圖，示出了AP-TAJ與表達(dá)指定蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞的結(jié)合。(C)為曲線圖，示出了用于AP-TAJ與NgR1表達(dá)的CHO細(xì)胞結(jié)合的ELISA測定結(jié)果。
圖2是一系列免疫沉淀實驗的蛋白質(zhì)印跡(Western blot)。各種指定蛋白的結(jié)合被共表達(dá)并且將細(xì)胞提取物與指定抗體(上圖抗-TAJ；下圖抗-LINGO-1)免疫沉淀。
圖3是曲線圖，示出了用于AP-TAJ與全長(sNgR1-432)和截短(sNgR1-344和sNgR1-310)NgR1結(jié)合的ELISA測定結(jié)果。
圖4是TAJ剔除的構(gòu)建體的圖解。
圖5A-D是一組示出了TAJ對神經(jīng)突長出的作用的柱狀圖和示圖。(A)置于髓磷脂涂布的載波片上的來自TAJ剔除和野生型小鼠的P8小腦顆粒神經(jīng)元(CGN)。(B)放置后1天，在缺少和存在TAJ的情況下，野生型CGN中的神經(jīng)突長出的檢測值。(C)在各自髓磷脂劑量響應(yīng)曲線中的來自TAJ野生型和剔除CGN的神經(jīng)突長度的檢測值。(D)在來源于聚-D-賴氨酸(PDL)和AP-Nogo66的基質(zhì)(如所指定的，在具有和沒有TAJ-Fc的情況下)中生長的出生后7天的大鼠的解離DRG神經(jīng)元中的神經(jīng)突長出(在體外24小時后)的檢測值。
圖6為示出了在取自跨越E14、E18、P0、P4、P8、P11、P23、以及成熟(E＝胚胎發(fā)育時間而P＝出生后的時間)的發(fā)育時間期的全大鼠腦均漿的TAJ表達(dá)的相對水平。
具體實施方式
在軸突損傷或橫切后，在周圍神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)中的神經(jīng)元能夠再生長并修復(fù)其軸突達(dá)到重新建立功能性連接的程度。相反，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的神經(jīng)元缺少這種恢復(fù)能力，并且負(fù)責(zé)抑制CNS再生的機(jī)制保留強(qiáng)烈研究的問題。重要地，CNS神經(jīng)元在PNS環(huán)境中再生長其軸突的所述能力表明，不存在CNS神經(jīng)元在損傷后再生的內(nèi)在無能。相反，看起來CNS軸突修復(fù)的抑制是神經(jīng)元過程和其局部CNS環(huán)境之間相互作用的結(jié)果。研究表明，對這些負(fù)相互作用的重要貢獻(xiàn)者是一組抑制性分子，其與髓磷脂有關(guān)，即髓磷脂相關(guān)糖蛋白(MAG)、Nogo以及少突膠質(zhì)細(xì)胞-髓磷脂糖蛋白(OMgp)。這些蛋白質(zhì)中的每一種已被證實為負(fù)影響生長錐體細(xì)胞伸展和軸突長出。
對Nogo、MAG、以及OMgp(集中地稱為髓磷脂相關(guān)抑制因子或MAIF)的進(jìn)一步研究表明，這些蛋白質(zhì)的長出抑制性信號通過普通多因子受體復(fù)合物轉(zhuǎn)導(dǎo)。至少三種不同的亞單位可參與MAIF受體復(fù)合物Nogo受體1(NgR1)、p75、以及LINGO-1。參見Foumier，A.E.，et al.Nature409341-346(2001)；Mi，S.，et al.Nat.Neurosci.7221-228(2O04)；和Wang，K.C.，et al.，Nature42074-78(2002)。雖然這三個分子結(jié)合可形成功能性MAIF受體，但是它們在其各自物理特性方面相互之間的高度不同。NgR1是富亮氨酸重復(fù)(LRR)總科分子的成員并且GPI連接至細(xì)胞表面。參見Foumier，A.E.，et al.Nature409341-346(2001)。P75是瘤壞死因子受體(TNFR)總科的成員，而最初鑒定為低親和力神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體，這是由于發(fā)現(xiàn)也在細(xì)胞死亡信號傳導(dǎo)方面起重要作用。參見Rabizadeh，S.and Bredesen，D.E.Cytokine Growth Facior Rev.14225-239(2003)。最新描述的MAIF受體復(fù)合物成員的LINGO-1也是LRR家族成員，但含有跨膜和能夠酪氨酸磷酸化和下游信號傳導(dǎo)的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。參見Mi，S.，et al.Nat.Neurosci.7221-228(2004)。
大量體外分析表明，這三個受體組分NgR1、p75以及LINGO-1中的每一個都有助于全部功能的MAIF受體復(fù)合物。然而，其它方面的證據(jù)表明，p75在更多生理條件下可能不會在軸突長出抑制中起那么重要的作用。在大腦皮層和脊髓神經(jīng)纖維束中，軸突對MAIF高度響應(yīng)，而大腦皮層和脊髓神經(jīng)元一般不表達(dá)顯著的p75水平。P75通過上行感覺神經(jīng)元來表達(dá)，而在這些神經(jīng)元中由基因剔除的P75喪失不能促進(jìn)這些軸突在脊髓損傷后再生。最后，將LINGO-1/NgR1結(jié)合(本文)與p75/NgR1相比，結(jié)合至NgR1的p75有相對較弱的親和力，其通過配體存在而顯著地被增加。參見，例如Copray，S.，etal.，J.Neuroimmunol.14841-53(2004)；Giehl，KM.，et al.，J.Neurosci.213492-3502(2001)；Mi，S.，et al. Nat.Neurosci.7221-228(2004)；Shao，Z.，et al.，Neuron45353-359(2004)；and Song，X.Y.，et al.，J.Neurosci.24542-546(2004)。
本文所述的方法和組合物涉及TAJ(TNF受體總科成員)在神經(jīng)元存活和/或生長例如在CNS中的神經(jīng)突長出中的作用。如本文所述，TAJ結(jié)合NgR1并且在多腦區(qū)的各種細(xì)胞類型中進(jìn)行表達(dá)。TAJ與NgR1和LINGO-1形成功能性MAIF受體復(fù)合物。培養(yǎng)自缺失TAJ表達(dá)的小鼠的神經(jīng)元，表現(xiàn)出減少的響應(yīng)于髓磷脂和MAIF的長出抑制。因此，TAJ參與MAIF受體復(fù)合物并且在介導(dǎo)MAIF抑制影響中起作用。因而，TAJ試劑如TAJ多肽(例如，可溶性TAJ多肽和融合蛋白)、抗-TAJ抗體、以及TAJ核酸(例如，編碼TAJ的核酸或反義TAJ核酸)可用來調(diào)節(jié)神經(jīng)突長出，例如用來治療各種CNS病癥，例如創(chuàng)傷性脊髓損傷、中風(fēng)、以及多發(fā)性硬化(MS)。
定義除非有其它定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所通常理解的相同含義。在相沖突的情況下，包括該定義的本申請受控。除非上下文另有要求，單數(shù)術(shù)語包括復(fù)數(shù)而復(fù)數(shù)術(shù)語包括單數(shù)。本文提及的所有出版物、專利以及其它參考文獻(xiàn)通過引用方式將其全部內(nèi)容結(jié)合于此作為參考，如同將每一個單個出版物或?qū)＠暾埦唧w和單個地引入一樣。
盡管類似或等同于本文所述的方法和物質(zhì)可用于本發(fā)明的實施或試驗，但是以下描述了合適的方法和物質(zhì)。這些物質(zhì)、方法以及實施例僅僅是說明性的，而不用于限制。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點根據(jù)詳細(xì)描述和權(quán)利要求書將會更明顯。
為了進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，使用了下面的術(shù)語和定義。
應(yīng)當(dāng)注意“一個”實體指的是一個或多個這樣的實體；例如“一個免疫球蛋白分子”應(yīng)理解為表示一個或多個免疫球蛋白分子。同樣地，術(shù)語“一個”、“一個或多個”以及“至少一個”在本文中可互換使用。
在整個本說明書和權(quán)利要求書中，詞語“包括”或其變形“包含”表示在所描述說明的方法、結(jié)構(gòu)、或組合物中含有任何所述整體或整體的組，但不排除任何其它整體或整體的組。
如本文所使用的，如在整個說明書和權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“由......組成”或其變形表示含有任何所述整體或整體的組，但沒有其它整體或整體的組可以加入到所描述說明的方法、結(jié)構(gòu)或組合物中。
如本文所使用的，如在整個說明書和權(quán)利要求書中使用的術(shù)語“基本上由......組成”或“大致由......組成”表示含有任何所述整體或整體的組，并且可選地含有非實質(zhì)上改變所描述說明的方法、結(jié)構(gòu)或組合物的基本形狀或新的性質(zhì)的任何所述整體或整體的組。
如本文所使用的，術(shù)語“多肽”用來涵蓋單數(shù)的“多肽”以及復(fù)數(shù)的“多肽”，并且指由通過酰胺鍵(也被稱為肽鍵)線性連接的單體(氨基酸)構(gòu)成的分子。術(shù)語“多肽”指兩個或多個氨基酸的任何一個鏈或多個鏈，而不是指產(chǎn)物的具體長度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白質(zhì)”、“氨基酸鏈”或任何其它用來指兩個或多個氨基酸鏈或多個鏈的術(shù)語都包括在“多肽”的定義范圍中，并且術(shù)語“多肽”可用這些術(shù)語中的任一個替換或互換使用。術(shù)語“多肽”也用來指在肽表達(dá)后的修飾產(chǎn)物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通過已知的保護(hù)/阻斷基團(tuán)的衍生化、蛋白水解切割、或通過非天然存在的氨基酸的修飾。多肽可以衍生自天然生物源或通過重組技術(shù)形成，但不必需翻譯自指定的核酸序列。其可以以任何方式形成，包括通過化學(xué)合成。
在本發(fā)明中，多肽可由通過肽鍵或經(jīng)修飾的肽鍵(即，肽同構(gòu)體)相互結(jié)合的氨基酸構(gòu)成，并且可以含有不同于20個基因編碼的氨基酸(例如，非天然存在的氨基酸)的氨基酸。本發(fā)明的多肽可以通過天然過程如翻譯后加工或通過本領(lǐng)域熟知的化學(xué)修飾技術(shù)進(jìn)行改性。這樣的修飾在基礎(chǔ)教科書中以及在更詳盡的專著以及大量研究文獻(xiàn)中都很好地描述了。修飾可發(fā)生在多肽中的任何地方，包括肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈、以及氨基或羧基末端。應(yīng)當(dāng)理解，相同類型的修飾可以以相同或不同程度地在給定多肽的若干位點處存在。同樣，給定多肽可以包含許多類型的修飾。多肽可以是例如由泛素化(遍在蛋白化)導(dǎo)致的支鏈化，并且它們可以是環(huán)狀的，同時具有或沒有支鏈化。環(huán)狀、支鏈化、以及支鏈化環(huán)狀多肽可由翻譯后天然過程產(chǎn)生或通過合成方法形成。修飾包括乙?；?、酰化、ADP核糖基化、酰胺化、黃素的共價連接、血紅素部分的共價連接、核苷酸或核苷酸衍生物的共價連接、脂或脂衍生物的共價連接、磷脂酰肌醇的共價連接、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、去甲基化、共價交聯(lián)的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸酯(鹽)的形成、甲?；?、γ-羧化、糖基化、GPI錨形體形成、羥基化、碘化、甲基化、十四烷基化、氧化、PEG化、蛋白水解處理、磷酸化、異戊二烯化、外消旋、硒化、硫化、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA介導(dǎo)的氨基酸插入蛋白質(zhì)如精氨?；?、以及泛素化。(參見，例如，Proteins-Structure And Molecular Properties，2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freernanand Company，New York(1993)；Posttranslational Covalent Modification of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，NewYork，pgs.1-12(1983)；Seifter et al.，MethEnzymol182626-646(1990)；Rattan et al.，Ann NY Acad Sci66348-62(1992).)。
本發(fā)明的多肽的大小可以為約3個或更多個、5個或更多個、10個或更多個、20個或更多個、25個或更多個、50個或更多個、75個或更多個、100個或更多個、200個或更多個、500個或更多個、1000個或更多個、或2000個或更多個氨基酸。多肽可以具有確定的三維結(jié)構(gòu)，盡管它們不必需具有這樣的結(jié)構(gòu)。具有確定的三維結(jié)構(gòu)的多肽稱為折疊的，并將不具有確定的三維結(jié)構(gòu)而是具有可采用大量不同構(gòu)造的多肽稱為未折疊的。如本文所使用的，術(shù)語糖蛋白指的是結(jié)合至至少一個糖部分的蛋白質(zhì)，該糖部分通過氨基酸殘基例如絲氨酸殘基或天冬酰胺殘基的含氧或含氮側(cè)鏈連接至該蛋白質(zhì)。
用“分離的”多肽或其片段、變異體、或衍生物來表示不在其天然環(huán)境中的多肽。不要求具體純化水平。例如，分離的肽可獲取自其本身或天然環(huán)境。認(rèn)為重組形成的多肽和在宿主細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)對于本發(fā)明來說是分離的，作為天然或重組多肽，其已被分離、分開、或部分地或基本上通過任何合適技術(shù)純化了。
在本發(fā)明中，“多肽片段”指的是較大多肽的短氨基酸序列。蛋白質(zhì)片段可以是“獨(dú)立的”，或包括在其片段形成一部分區(qū)的較大多肽內(nèi)。本發(fā)明的多肽片段的代表性實例包括在長度上例如包含約5個氨基酸、約10個氨基酸、約15個氨基酸、約20個氨基酸、約30個氨基酸、約40個氨基酸、約50個氨基酸、約60個氨基酸、約70個氨基酸、約80個氨基酸、約90個氨基酸、以及約100個氨基酸或更多個氨基酸。
當(dāng)提及本發(fā)明的多肽時，術(shù)語“片段”、“變異體”、“衍生物”以及“類似物”包括任何保持至少部分生物活性的多肽。如本文所述的多肽可以沒有限制地包括其中的片段、變異體、或衍生物分子，只要該多肽仍發(fā)揮其功能。本發(fā)明的NgR1多肽和多肽片段可以包括蛋白水解片段、缺失片段，尤其是當(dāng)遞送給動物時更易于到達(dá)作用位點的片段。多肽片段進(jìn)一步包括包含天然多肽的抗原或免疫原表位(包括線性以及三維表位)的多肽的任何部分。本發(fā)明的NgR1多肽和多肽片段可以包含變異區(qū)(包括上述的片段)，以及同樣具有由于氨基酸取代、缺失、或插入而改變的氨基酸序列的多肽。變異可以自然發(fā)生，如等位變異(allelic variant)。用“等位變異”來表示占據(jù)在生物體基因組上給出的座位的基因的可替換形式。GenesII，Lewin，B.，ed.，John Wiley&Sons，New York(1985)。非自然發(fā)生的變異可利用已知的基因突變技術(shù)來產(chǎn)生。本發(fā)明的NgR1多肽和多肽片段可以包含保守或非保守性氨基酸取代、缺失或插入。本發(fā)明的NgR1多肽和多肽片段還可包括衍生分子。變異多肽在本文中還可稱為“多肽類似物”。如本文所使用的，多肽或多肽片段的“衍生物”指的是具有通過功能性側(cè)基的反應(yīng)而化學(xué)衍生的一個或多個殘基的主題多肽。同樣作為“衍生物”包括的是含有二十個標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的一個或多個天然存在的氨基酸衍生物的那些多肽。例如，4-羥基脯氨酸可以是輔氨酸取代的；5-羥基賴氨酸可以是賴氨酸取代的；3-甲基組氨酸可以是組氨酸取代的；高絲氨酸可以是絲氨酸取代的；以及鳥氨酸可以是賴氨酸取代的。
如本文所使用的，術(shù)語“二硫鍵”包括在兩個硫原子之間形成的共價鍵。氨基酸半胱氨酸包含可與第二個硫醇基團(tuán)形成二硫鍵或橋的硫醇基團(tuán)。
如本文所使用的，“融合蛋白”意思是指包含通過肽鍵線性連接至第二個多肽的第一個多肽。該第一個多肽和第二個多肽可以是相同或不同的，并且它們可以是直接連接的或通過肽接頭(參見下文)進(jìn)行連接的。
術(shù)語“多核苷酸”用來涵蓋單數(shù)核酸以及復(fù)數(shù)核酸，并且指分離的核酸分子或構(gòu)建體，例如信使RNA(mRNA)或質(zhì)粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包括傳統(tǒng)磷酸二酯鍵或非傳統(tǒng)鍵(例如，如在肽核酸(PNA)中發(fā)現(xiàn)的酰胺鍵)。多核苷酸可含有全長cDNA序列的核苷酸序列，包括未翻譯的5’和3’序列、編碼序列、以及核酸序列的片段、表位、結(jié)構(gòu)域、和變異體。多核苷酸可由任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸(其可以是未修飾的RNA或DNA或經(jīng)修飾的RNA或DNA)組成。例如，多核苷酸可以由單鏈和雙鏈DNA、單鏈和雙鏈區(qū)的混合物的DNA、單鏈和雙鏈RNA、以及單鏈和雙鏈區(qū)的混合物的RNA、包含DNA和RNA(其可以是單鏈或更通常是雙鏈的，或單鏈和雙鏈區(qū)的混合物)的雜合分子所組成。另外，多核苷酸可以由包含RNA或DNA或RNA和DNA二者的三鏈區(qū)構(gòu)成。多核苷酸還可以含有一個或多個經(jīng)修飾的堿基或由于穩(wěn)定性或其它原因而修飾的DNA或RNA主鏈。“修飾的”堿基包括例如三苯甲基化的堿基和諸如肌苷的非常見堿基。可以對DNA和RNA進(jìn)行各種修飾；因此，“多核苷酸”包括化學(xué)、酶促或代謝地修飾的形式。
術(shù)語“核酸”指的是存在于多核苷酸的任何一個或多個核酸區(qū)段，例如DNA或RNA片段。用“分離的”核酸或多核苷酸來表示核酸分子DNA或RNA，其已從其天然環(huán)境中取出。例如，包含于載體的編碼本發(fā)明的TAJ多肽或多肽片段的重組多核苷酸被認(rèn)為對于本發(fā)明用途來說是分離的。分離的多核苷酸的其它實例包括保留在異源性宿主細(xì)胞中的重組多核苷酸或溶液中(部分或基本上)純化的多核苷酸。分離的RNA分子包括本發(fā)明的多核苷酸的體內(nèi)或體外RNA轉(zhuǎn)錄體。根據(jù)本發(fā)明的分離多核苷酸或核酸進(jìn)一步包括通過合成產(chǎn)生的這樣的分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括調(diào)節(jié)因子，如啟動子、核糖體結(jié)合位點、或轉(zhuǎn)錄終止子。
如本文所使用的，“編碼區(qū)”是一部分核酸，其由翻譯成氨基酸的密碼子組成。盡管“中止密碼子”(TAG、TGA、或TAA)沒有被翻譯成氨基酸，但是其可以被認(rèn)為是編碼區(qū)的部分，而任何側(cè)翼序列(側(cè)面序列)例如啟動子、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止子、內(nèi)含子等不是編碼區(qū)的部分。本發(fā)明的兩個或更多個編碼區(qū)可以存在于單個多核苷酸構(gòu)建體，例如在單個載體上，或存在于分開的多核苷酸構(gòu)建體，例如在分開(不同)的載體上。此外，任何載體可以包含單個編碼區(qū)，或可以包括兩個或更多個編碼區(qū)，例如單個載體可以單獨(dú)地編碼免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。另外，本發(fā)明的載體、多核苷酸、和核酸可以編碼異源編碼區(qū)，或者融合或者未融合至編碼本發(fā)明的TAJ多肽或多肽片段的核酸。異源編碼區(qū)包括但不限于特化因子或基序，如分泌信號肽或異源功能結(jié)構(gòu)域。
在某些具體實施方式
中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情況下，包含通常編碼多肽的核酸的多肽可以包括啟動子和/或其它轉(zhuǎn)錄或可操作地聯(lián)合一個或多個編碼區(qū)的翻譯控制因子?？刹僮髀?lián)合是用于基因產(chǎn)物例如多肽的編碼區(qū)以為了將基因產(chǎn)物的表達(dá)置于調(diào)節(jié)序列的影響或控制之下的方式聯(lián)合一個或多個調(diào)節(jié)序列。如果啟動子功能的誘導(dǎo)導(dǎo)致編碼希望基因產(chǎn)物的mRNA的轉(zhuǎn)錄并且如果在兩個DNA片段之間的鍵接的特性不會干擾表達(dá)調(diào)節(jié)序列指導(dǎo)基因產(chǎn)物表達(dá)的能力或干擾DNA模板被轉(zhuǎn)錄的能力，則兩個DNA片段(如多肽編碼區(qū)和與其相關(guān)的啟動子)是“可操作地聯(lián)合的”。因此，如果啟動子能夠影響核酸的轉(zhuǎn)錄則啟動子區(qū)將是可操作地聯(lián)合該編碼多肽的核酸。啟動子可以是實質(zhì)上指導(dǎo)僅在預(yù)定細(xì)胞中的DNA轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞特定啟動子。除了啟動子之外，其它轉(zhuǎn)錄控制因子例如增強(qiáng)子、操作子、阻遏物、以及轉(zhuǎn)錄終止信號能夠可操作地聯(lián)合多核苷酸以指導(dǎo)細(xì)胞特定轉(zhuǎn)錄。本文披露了合適的啟動子和其它轉(zhuǎn)錄控制區(qū)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知各種轉(zhuǎn)錄控制區(qū)。這包括但不限于在脊椎動物細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，如但不限于來源于細(xì)胞巨化病毒(立即早期啟動子，連接有內(nèi)含子-A)、猿猴病毒(早期啟動子)、以及逆轉(zhuǎn)錄酶病毒(如勞氏肉瘤病毒)。其它轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括來源于脊椎動物基因如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長素和兔β-球蛋白、以及能夠控制真核細(xì)胞中的基因表達(dá)的其它序列。其它合適的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括組織特異性啟動子和增強(qiáng)子以及淋巴因子誘導(dǎo)的啟動子(例如，可通過干擾素或白介素誘導(dǎo)的啟動子)。
類似地，各種翻譯控制因子對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是已知的。這包括但不限于核糖體結(jié)合位點、翻譯起始和終止密碼子、以及來源于小核糖核酸病毒(具體地，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點或IRES，也稱為CITE序列)。
在其它具體實施方式
中，本發(fā)明的多核苷酸例如是信使RNA(mRNA)形式的RNA。
本發(fā)明的多核苷酸和核酸編碼區(qū)可以聯(lián)合分泌或信號肽的其它編碼區(qū)，其指導(dǎo)由本發(fā)明的多核苷酸編碼的多肽的分泌。根據(jù)信號假設(shè)，由哺乳動物細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)具有信號肽或分泌前導(dǎo)序列，其是在已起動跨過天然內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的成長蛋白鏈的排出時從成熟蛋白質(zhì)切割的。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員注意到，由脊椎動物細(xì)胞分泌的多肽通常具有融合至該多肽的N-末端的信號肽，其為從完全或“全長”多肽切割以產(chǎn)生多肽的分泌或“成熟”形式。在某些具體實施方式
中，使用了天然信號肽例如免疫重鏈或輕鏈信號肽，或保持指導(dǎo)可操作地聯(lián)合它的多肽分泌的能力的序列的功能衍生物?？商鎿Q地，可以使用異源哺乳動物信號肽、或其功能衍生物。例如，可以用人組織血纖維蛋白溶酶原活化劑(TPA)或小鼠β-葡糖苷酸酶的前導(dǎo)序列取代野生型前導(dǎo)序列。
在某些具體實施方式
中，用于本文所披露方法中的試劑是“抗體”或“免疫球蛋白”分子，或其免疫特異性片段，例如天然存在的抗體或免疫球蛋白分子或經(jīng)改造的抗體分子或以類似于抗體分子的方式結(jié)合抗原的片段。如本文所使用的，術(shù)語“抗體”以其最寬含義使用，并涵蓋多克隆抗體以及單克隆抗體，包括全長抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、嵌合抗體、人源化抗體和全人抗體、以及這樣的抗體的片段，包括Fab、Fab’、F(ab’)2、和Fv片段、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體分子、以及從抗體片段形成的多特異性抗體，只要它們表現(xiàn)出所希望的抗原結(jié)合活性。單克隆抗體表示抗原的特征實質(zhì)上與同族抗體一樣，并且不被解釋為需要通過任何具體方法生產(chǎn)的抗體。
術(shù)語“ 抗體”和“免疫球蛋白”在本文可互換地使用?？贵w或免疫球蛋白至少包含重鏈的可變結(jié)構(gòu)域，并且通常至少包含重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域。在脊椎動物系統(tǒng)中的基本免疫球蛋白結(jié)構(gòu)相對較好被理解了。參見例如Harlow et al.，AntibodiesA Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)。
如以下即將更詳盡討論的，術(shù)語“免疫球蛋白”包含各個大類的可生化地區(qū)分的多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，重鏈分為其中具有部分亞類例如(γ1-γ4)的γ、μ、α、δ、ε類。正是這種鏈的特性將抗體的“類”分別確定為IgG、IgM、IgA IgG、或IgE。免疫球蛋白亞類(同種型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1被很好地表征并已知賦予功能特化。根據(jù)這里的披露內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可區(qū)分這些類和同種型中每一種的修飾型，因此屬于本發(fā)明的范圍。所有免疫球蛋白類清楚地屬于本發(fā)明的范圍，后面的討論一般針對免疫球蛋白分子的IgG類。關(guān)于IgG，其是標(biāo)準(zhǔn)免疫球蛋白分子，包括兩個相同的分子量約為23,000道爾頓的輕鏈多肽，以及兩個相同的分子量約為53,000-70,000道爾頓的重鏈多肽。這四個鏈通常通過二硫鍵結(jié)合成“Y”型，其中輕鏈托住在“Y”開口處開始并連續(xù)通過可變區(qū)的重鏈。
輕鏈和重鏈被劃分成結(jié)構(gòu)和功能同源區(qū)。術(shù)語“恒定”和“可變”是功能性使用的。在這方面，應(yīng)理解，輕鏈(VL)和重鏈(VH)部分的可變結(jié)構(gòu)域都決定抗原識別和特異性。相反地，輕鏈(CL)和重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域(CH1、CH2、或CH3)賦予重要的生物學(xué)性質(zhì)如分泌、經(jīng)胎盤的活動性、Fc受體結(jié)合、互補(bǔ)結(jié)合等性質(zhì)。按照慣例，恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的數(shù)量隨著它們變得更遠(yuǎn)離抗原結(jié)合位點或抗體的氨基末端而增加。N-末端部是可變區(qū)并且在C-末端部處是恒定區(qū)；CH3和CL結(jié)構(gòu)域?qū)嶋H上分別包含重鏈和輕鏈的羧基末端。
輕鏈分為κ或λ。每個重鏈類可以與κ輕鏈或λ輕鏈進(jìn)行結(jié)合。通常，輕鏈和重鏈相互共價連接，并且當(dāng)免疫球蛋白是通過雜種細(xì)胞、B細(xì)胞或經(jīng)遺傳改造的宿主細(xì)胞生成時，兩個重鏈的“尾”部通過共價二硫鍵或非共價鍵相互鍵接。在重鏈中，氨基酸序列從在Y構(gòu)型叉端處的N-末端延伸至在每個鏈底部處的C-末端。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，重鏈分為其中具有部分亞類例如(γ1-γ4)的γ、μ、α、δ、ε類。正是這種鏈的特性將抗體的“類”分別確定為IgG、IgM、IgA IgG、或IgE。免疫球蛋白亞類(同種型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1被很好地表征并已知賦予功能特化。根據(jù)這里的披露內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可辨別這些類和同種型中每一種的修飾型，因此屬于本發(fā)明的范圍。
如上所述，可變區(qū)允許抗體選擇性地識別并特異性地結(jié)合在抗原上的表位。即，抗體的VL結(jié)構(gòu)域和VH結(jié)構(gòu)域結(jié)合而形成確定三維抗原結(jié)合位點的可變區(qū)。這種四級抗體結(jié)構(gòu)形成在Y的每個臂端處存在的抗原結(jié)合位點。更具體地，抗原結(jié)合位點是由在VH和VL鏈中每一個上的三個互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)確定。在一些情形中，例如某些來源于羊駝(camelid)種或給予羊駝免疫球蛋白改造的免疫球蛋白分子(完全免疫球蛋白分子)，可以僅由重鏈而沒有輕鏈組成。參見例如Harners Casterman et al.，Nature363446 448(1993)。
在一個具體實施方式
中，本發(fā)明的抗原結(jié)合分子包含抗體分子的至少一個重鏈或輕鏈CDR。在另一具體實施方式
中，本發(fā)明的抗原結(jié)合分子包含來自一個或多個抗體分子的至少兩個CDR。在另一具體實施方式
中，本發(fā)明的抗原結(jié)合分子包含來自一個或多個抗體分子的至少三個CDR。在另一具體實施方式
中，本發(fā)明的抗原結(jié)合分子包含來自一個或多個抗體分子的至少四個CDR。在另一具體實施方式
中，本發(fā)明的抗原結(jié)合分子包含來自一個或多個抗體分子的至少五個CDR。在另一具體實施方式
中，本發(fā)明的抗原結(jié)合分子包含來自一個或多個抗體分子的至少六個CDR。包含至少一個可被包含于受治療者抗原結(jié)合分子的CDR的示例性抗體分子在本領(lǐng)域是已知的并且在本文描述了示例性分子。
用于本發(fā)明方法中的抗體或其免疫特異性片段包括但不限于多克隆抗體、單克隆抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、靈長源化抗體、或嵌合抗體，單鏈抗體、表位結(jié)合片段例如Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、Fv，單鏈Fv(scFv)、單鏈抗體、二硫鍵接的FV(sdFv)，包含VL或VH結(jié)構(gòu)域的片段，由Fab表達(dá)庫產(chǎn)生的片段，以及抗個體基因型(抗-Id)抗體(包括例如對于本文所披露的結(jié)合分子的抗-Id抗體)。ScFv分子在本領(lǐng)域是已知的并描述于例如在美國專利5,892,019中。本發(fā)明的免疫球蛋白或抗體分子可以是免疫球蛋白分子的任何型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、和IgY)、類(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類。
包括單鏈抗體的抗體片段可以單獨(dú)包含可變區(qū)或結(jié)合有下列全體或其一部分鉸鏈區(qū)、CH1、CH2、和CH3結(jié)構(gòu)域。同樣包括在本發(fā)明中的是也包含可變區(qū)與鉸鏈區(qū)、CH1、CH2、以及CH3結(jié)構(gòu)域的任何組合的抗原結(jié)合片段。用于本文披露的診斷和治療方法中的抗體或其免疫特異性片段可以來自包括鳥類和哺乳動物類的任何動物源。優(yōu)選地，該抗體是人、鼠、驢、兔、羊、豚鼠、駱駝、無峰駝、馬、或雞抗體。在另一具體實施方式
中，可變區(qū)可以是在源(例如鯊魚)中的condricthoid。如本文所使用的，“人”抗體包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗體并且包括分離自人免疫球蛋白文庫或分離自對于一種或多種人免疫球蛋白并且不表達(dá)內(nèi)源性免疫球蛋白的轉(zhuǎn)基因動物，如下文以及例如Kucherlapati等的美國專利第5,939,598號所述。
如本文所使用的，術(shù)語“重鏈部分”包括來源于免疫球蛋白重鏈的氨基酸序列。包含重鏈部分的多肽包含下列中的至少一個CH1結(jié)構(gòu)域、鉸鏈(例如上、中和/或下鉸鏈區(qū))結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域、CH3結(jié)構(gòu)域、或其變異體或片段。例如，用于本發(fā)明的結(jié)合多肽可以包括包含CH1結(jié)構(gòu)域的多肽鏈；包含CH1結(jié)構(gòu)域、至少一部分鉸鏈結(jié)構(gòu)域和CH2結(jié)構(gòu)域的多肽鏈；包含CH1結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的多肽鏈；包含CH1結(jié)構(gòu)域、至少一部分鉸鏈結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的多肽鏈；或包含CH1結(jié)構(gòu)域、至少一部分鉸鏈結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的多肽鏈。在另一具體實施方式
中，本發(fā)明的多肽包括包含CH3結(jié)構(gòu)域的多肽鏈。此外，用于本發(fā)明的結(jié)合多肽可以缺少至少一部分的CH2結(jié)構(gòu)域(例如CH2結(jié)構(gòu)域的全部或部分)。如上所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這些結(jié)構(gòu)域(例如重鏈部分)可以被修飾以使它們在來自天然存在的免疫球蛋白分子的氨基酸序列中發(fā)生變化。
在某些用于本文披露的治療方法中的TAJ拮抗劑抗體或其免疫特異性片段中，多聚體的一個多肽鏈的重鏈部分與在多聚體的另一多肽鏈上的重鏈部分相同?？商鎿Q地，用于本發(fā)明方法中的含有單體的重鏈部分是不同的。例如，每個單體可以包括不同的靶結(jié)合位點，例如形成雙特異性抗體。
用于本文披露的方法中的結(jié)合多肽的重鏈部分可以來源于不相同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重鏈部分可以包含來源于IgG1分子的CH1結(jié)構(gòu)域和來源于IgG3分子的鉸鏈區(qū)。在另一實施例中，重鏈部分可包括部分來源于IgG1分子和部分來源于IgG3分子的鉸鏈區(qū)。在另一實施例中，重鏈部分可包括部分來源于IgG1分子和部分來源于IgG4分子的嵌合鉸鏈。
如本文所使用的，術(shù)語“輕鏈部分”包括來源于免疫球蛋白輕鏈的氨基酸序列。優(yōu)選地，輕鏈部分包含VL或CL結(jié)構(gòu)域中的至少一個。
用于本文所披露的治療方法中的抗體或其免疫特異性片段可用作本文所述的TAJ的拮抗劑。例如，用于本發(fā)明方法中抗體可以用作拮抗劑，阻斷或抑制TAJ多肽的抑制活性。
編碼來源于免疫球蛋白(例如免疫球蛋白重鏈部分或輕鏈部分)的多肽的非天然變異體的分離核酸分子可通過將一種或多種核苷酸取代、插入或缺失引入到免疫球蛋白的核苷酸序列中，以使在所編碼的蛋白質(zhì)中引入一種或多種氨基酸取代、插入或缺失。可以通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如定位誘變和PCR介導(dǎo)誘變來引入突變。優(yōu)選地，在一個或多個非基本氨基酸殘基處形成保守性氨基酸取代。
本文披露的抗-TAJ抗體或其抗原結(jié)合片段、變異體、或衍生物可以根據(jù)抗原的表位例如它們識別或特異性結(jié)合的靶多肽(TAJ)進(jìn)行描述或說明。特異性地與抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用的靶多肽的部分是“表位”或“抗原決定基”。靶多肽可以包含單一表位，但通常包含至少兩個表位，并且取決于抗原的大小、構(gòu)造、和類型可包括任何數(shù)量的表位。此外，應(yīng)當(dāng)注意，在靶多肽上的“表位”可以是或包括非多肽因子，例如“表位”可以包括糖側(cè)鏈。
認(rèn)為用于抗體的肽或多肽表位的最小大小是約4或5個氨基酸。肽或多肽表位優(yōu)選含有至少7個、更優(yōu)選至少9個并且最優(yōu)選在至少約15至約30個之間的氨基酸。由于CDR可識別抗原表位或呈其三級形式的多肽，所以包含表位的氨基酸不需要是鄰接的，并且在一些情形中，甚至可以不在相同的肽鏈上。在本發(fā)明中，由本發(fā)明的抗-TAJ抗體識別的肽或多肽表位含有TAJ的至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、更優(yōu)選至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、或在約15至約30個之間的鄰接或非鄰接氨基酸，例如SEQ ID NO2。
用“特異性地結(jié)合”通常是指抗體通過其抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合至表位，并且該結(jié)合在抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和表位之間必需是部分互補(bǔ)的。根據(jù)這個定義，當(dāng)通過其抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域臂結(jié)合至該表位比其隨機(jī)結(jié)合至不相關(guān)表位更容易時，就說抗體“特異性地結(jié)合”至表位。在本文中使用術(shù)語“特異性”來定性通過其特定抗體結(jié)合至特定表位的相對親和力。例如，抗體“A”可以認(rèn)為對于給定表位比抗體“B”具有更高特異性，或者抗體“A”可以說成是結(jié)合至表位“C”比其對于相關(guān)表位“D”具有更高特異性。
用“ 優(yōu)先結(jié)合”是指抗體特異性結(jié)合至表位比其結(jié)合至相關(guān)、類似、同源、或類似表位更容易。因此，“優(yōu)先結(jié)合”至給定表位的抗體會比結(jié)合至相關(guān)表位更可能地結(jié)合至該給定表位，即使這樣的抗體與該相關(guān)表位交叉作用。
通過非限定性實施例，如果其結(jié)合所述第一表位具有的離解常數(shù)(KD)小于該抗體對于第二表位的KD，則可以認(rèn)為抗體優(yōu)先結(jié)合第一表位。在另一非限制性實施例中如果其結(jié)合第一表位具有的親和力比該抗體對于第二表位的KD要低至少一個數(shù)量級，則可以認(rèn)為抗體優(yōu)先結(jié)合第一抗原，。在另一非限制性實施例中，如果其結(jié)合第一表位具有的親和力比該抗體對于第二表位的KD要低至少兩個數(shù)量級，則可以認(rèn)為抗體優(yōu)先結(jié)合第一表位。
在另一非限制性實施例中，如果其結(jié)合第一表位具有的解離速率(off rate)(k(off))低于抗體對于第二表位的k(off)，則可以認(rèn)為抗體優(yōu)先結(jié)合第一表位。在另一非限制性實施例中，如果其結(jié)合第一表位具有的親和力低于該抗體對于第二表位的K(off)至少一個數(shù)量級，則可以認(rèn)為抗體優(yōu)先結(jié)合第一表位。在另一非限制性實施例中，如果其結(jié)合第一表位具有的親和力比該抗體對于第二抗體的k(off)要低至少兩個數(shù)量級，則可以認(rèn)為抗體優(yōu)先結(jié)合第一表位。
如果具有的解離速率(k(off))低于或等于5×10-2sec-1、10-2sec-1、5×10-3sec-1、10-3sec-1，則可以說本文所披露的抗體或其抗原結(jié)合片段、變異體、或衍生物結(jié)合了本文披露的靶多肽或其片段或變異體。更優(yōu)選地，如果具有的解離速率(k(off))低于或等于5×10-4sec-1、10-4sec-1、5×10-5sec-1、10-5sec-1、5×10-6sec-1、10-6sec-1、5×10-7sec-1、10-7sec-1，則可以說本發(fā)明的抗體結(jié)合了本文披露的靶多肽或其片段或變異體。
如果具有的結(jié)合速率(on rate)(k(on))高于或等于103M-1sec-1、5×103M-1sec-1、104M-1sec-1、5×104M-1sec-1，則可以說本文所披露的抗體或其抗原結(jié)合片段、變異體、或衍生物結(jié)合了本文披露的靶多肽或其片段或變異體。更優(yōu)選地，如果具有的結(jié)合速率(k(on))高于或等于105M-1sec-1、5×105M-1sec-1、106M-1sec-1、5×106M-1sec-1、107M-1sec-1，則可以說本發(fā)明的抗體結(jié)合了本文披露的靶多肽或其片段或變異體。
如果其優(yōu)先結(jié)合至該表位達(dá)到在某種程度上阻斷基準(zhǔn)抗體(參考抗體，reference antibody)結(jié)合至該表位，則可以說抗體競爭性抑制基準(zhǔn)抗體結(jié)合至給定表位。競爭性抑制可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法例如競爭ELISA測定來確定。可以說抗體競爭性抑制至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、或至少50％的基準(zhǔn)抗體結(jié)合至給定表位。
如本文所使用的，術(shù)語“親和力”指的是單個表位與免疫球蛋白分子的結(jié)合強(qiáng)度。參見例如Harlow et al.，AntibodiesA Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)at pages27-28。如本文所使用的，術(shù)語“親和強(qiáng)度(avidity)”指的是在免疫球蛋白和抗原的種群之間的復(fù)合物的總體穩(wěn)定性，即，免疫球蛋白混合物與抗原的功能性結(jié)合強(qiáng)度。參見例如Harlow at pages 29-34。親和力強(qiáng)度與在該種群中的單個免疫球蛋白分子與特異性表位的親和力有關(guān)，也與免疫球蛋白和抗原的化合價有關(guān)。例如，具有高度重復(fù)的表位結(jié)構(gòu)如聚合物的二價單克隆抗體和抗原之間的相互作用就是一種較高的親和力強(qiáng)度。
本發(fā)明的抗-TAJ抗體或其抗原結(jié)合片段、變異體或衍生物還可根據(jù)其交叉反應(yīng)性進(jìn)行描述或說明。如本文所使用的，術(shù)語“交叉反應(yīng)性”指的是對于一個抗原是特異性的抗體與第二個抗原反應(yīng)的能力、兩種不同抗原物質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)性的檢測值。因此，如果抗體結(jié)合不同于誘導(dǎo)其形成的表位，則該抗體是交叉反應(yīng)性的。交叉反應(yīng)性表位通常含有許多與誘導(dǎo)表位相同的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)特征，并且在一些情形下，實際上可以比原始的表位更適合。
例如，某些抗體具有一定程度的交叉反應(yīng)性，因為它們結(jié)合相關(guān)但不相同的表位，例如與基準(zhǔn)表位具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、至少50％的同一性(如利用本領(lǐng)域已知和本文所述的方法計算的)的表位。如果抗體不結(jié)合與基準(zhǔn)表位具有低于95％、低于90％、低于85％、低于80％、低于75％、低于70％、低于65％、低于60％、低于55％、低于50％的同一性(如利用本領(lǐng)域已知和本文所述的方法計算的)的表位，則可以說抗體具有很小或沒有交叉反應(yīng)性。如果抗體不結(jié)合該表位的任何其它類似物、直系同源物、或同系物，則可以認(rèn)為抗體對于某種表位是“高度特異性的”。
用于本文所披露治療方法中的抗體或其免疫特異性片段還可根據(jù)其結(jié)合至本發(fā)明多肽的親和力進(jìn)行描述或說明。優(yōu)選的結(jié)合親和力包括具有離解常數(shù)或Kd低于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M、或10-15M的那些親和力。
本發(fā)明的抗-TAJ抗體或其抗原結(jié)合片段、變異體或衍生物可以是“多特異性的”，例如雙特異性、三特異性或更多的多肽特異性，意思是其識別并同時結(jié)合至兩個或多個在一個或多個不同抗原(例如蛋白質(zhì))上存在的不同抗原。因此，抗-TAJ抗體是否是“單特異性”或“多特異性”的例如“雙特異性”的，指的是結(jié)合多肽與其反應(yīng)的不同表位的數(shù)目。多特異性抗體可以是對本文所述的靶多肽的不同表位是特異性的，或者是對靶多肽以及異源表位如異源性多肽或固體支撐材料是特異性的。
如本文所使用的，術(shù)語“化合價”指的是存在于抗-TAJ抗體、結(jié)合多肽或抗體中的可能結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的數(shù)量。每個結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性地結(jié)合一個表位。當(dāng)抗-TAJ抗體或結(jié)合多肽包含多余一個結(jié)合結(jié)構(gòu)域時，每個結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以特異性地結(jié)合相同表位，對于具有兩個結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體，稱為“二價單特異性”，或?qū)τ诓煌砦粊碚f，對于具有兩個結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗體，稱為“二價雙特異性的”。對于每個特異性，抗體也可以是雙特異性和二價的(稱為“雙特異性四價抗體”)。在另一具體實施方式
中，可制備四價微型抗體或結(jié)構(gòu)域缺失的抗體。
雙特異性二價抗體及其制備方法描述在例如美國專利第5,731,168；5,807,706；5,821,333；以及美國專利公開第2003/020734和200/0155537中，其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合于此作為參考。通常參見，PCT公開WO93/177l5；WO92/08802；WO91/00360；WO92/05793；Tutt et al.，J.Immunol.14760-69(1991)；U.S.Pat. Nos.4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；Kostelny et al，J.Immunol.1481547-1553(1992)。
如前所述，各種免疫球蛋白類的恒定區(qū)的亞單位和三維構(gòu)型是熟知的。如本文所使用的，術(shù)語“VH結(jié)構(gòu)域”包括免疫球蛋白重鏈的氨基末端可變結(jié)構(gòu)域，而術(shù)語“CH1結(jié)構(gòu)域”包括免疫球蛋白重鏈的第一(大多數(shù)為氨基末端)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。CH1結(jié)構(gòu)域鄰近VH結(jié)構(gòu)域并且是免疫球蛋白重鏈分子的鉸鏈區(qū)的氨基末端。
如本文所使用的，術(shù)語“CH2結(jié)構(gòu)域”包括例如利用傳統(tǒng)編碼方案(殘基244至360，Kabat編碼系統(tǒng)；和殘基231-340，EU編碼系統(tǒng)；參見Kabat EA et al.op.cit)從抗體的約殘基244延伸至殘基360的重鏈分子的部分。CH2結(jié)構(gòu)域是唯一的，因為其不是閉合地與另一結(jié)構(gòu)域進(jìn)行配對。而且，兩個N-連接的支鏈化糖鏈插入在完整的天然IgG分子的兩個CH2結(jié)構(gòu)域之間。也已有良好的文獻(xiàn)記載，CH3結(jié)構(gòu)域從CH2結(jié)構(gòu)域延伸至IgG分子的C-末端，并且包括大約108個殘基。
如本文所使用的，術(shù)語“鉸鏈區(qū)”包括結(jié)合CH1結(jié)構(gòu)域和CH2結(jié)構(gòu)域的重鏈分子的部分。這種鉸鏈區(qū)包含大約25個殘基并且是柔性的，因此允許兩個N-末端抗原結(jié)合區(qū)可以獨(dú)立地移動。鉸鏈區(qū)可被細(xì)分成單獨(dú)不同的結(jié)構(gòu)域上、中、和下鉸鏈結(jié)構(gòu)域(Roux etal.，J.Immunol.1614083(1998))。
如本文所使用的，術(shù)語“二硫鍵”包括在兩個硫原子之間形成的共價鍵。氨基酸半胱氨酸包含可與另一個硫醇基形成二硫鍵或橋的硫醇基。在大多數(shù)天然存在的IgG分子中，CH1和CL區(qū)通過二硫鍵連接并且兩個重鏈通過在對應(yīng)于利用Kabat編碼系統(tǒng)(位226或229，EU編碼系統(tǒng))的239和242位置處的兩個二硫鍵連接。
如本文所使用的，術(shù)語“嵌合抗體”意思是任何如下抗體，在該抗體中，免疫反應(yīng)性區(qū)或位點獲自或來源于第一物種，而恒定區(qū)(其可以是完整的、部分的或根據(jù)本發(fā)明修飾的)獲自第二物種。在優(yōu)選具體實施方式
中，靶結(jié)合區(qū)或位點來自非人源(例如小鼠或靈長類動物)，并且恒定區(qū)是人。
如本文所使用的，術(shù)語“經(jīng)改造的抗體”指的是這樣的抗體，在該抗體中，由一種或多種來自已知特異性的抗體的CDR至少部分取代，并且如有必要，通過部分構(gòu)架區(qū)取代或序列變化來改變其重鏈或輕鏈或二者中的可變區(qū)。盡管CDR可以是來源于相同類或甚至亞類的抗體，如構(gòu)架區(qū)來源于其的抗體，但是可以設(shè)想，CDR來源于不同類的抗體，并且優(yōu)選來源于來自不同物種的抗體。其中來自已知特異性的非人抗體的一個或多個“供體”CDR被嫁接到人重鏈或輕鏈構(gòu)架區(qū)的經(jīng)改造的抗體，在本文稱為“人源化抗體”?？梢圆槐赜脕碜怨w可變區(qū)的完全CDR替換全部CDR以將一個可變結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合能力轉(zhuǎn)移至另一個。而且，僅有必要轉(zhuǎn)移這些必需用來保持靶結(jié)合位點活性的殘基。在美國專利第5,585,089、5,693,761、5,693,762、以及6,180,370號中給出了解釋說明，這很好地屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍，或者通過實施常規(guī)實驗或通過試錯法試驗而可獲得功能性改造或人源化抗體。
如本文所使用的，術(shù)語“連接的”“融合的”或“融合”可相互使用。這些術(shù)語指的是兩個或多個因子或組分通過任何方法包括化學(xué)結(jié)合或重組方法結(jié)合在一起?！胺献x框的融合”指的是兩個或更多個開放讀框(ORF)的結(jié)合而以保持初始ORF的準(zhǔn)確閱讀框的方式形成連續(xù)更長的ORF。因此，所得到的重組融合蛋白是含有兩個或更多個對應(yīng)于由初始ORF編碼的多肽的區(qū)段(這些區(qū)段不是如通常天然結(jié)合的那樣)的單個蛋白。盡管該讀框在整個融合區(qū)段是這樣連續(xù)形成的，但是這些區(qū)段可以是物理或空間地由例如符合讀框的接頭序列所分開。
“接頭(連接物，linker)”序列是一系列的一個或多個分隔開在融合蛋白中的兩個多肽編碼區(qū)的氨基酸。通常的接頭包含至少5個氨基酸。其它的接頭包含至少10個或至少15個氨基酸。在某些具體實施方式
中，對肽接頭的氨基酸加以選擇以使接頭是親水性的。接頭(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(SEQ ID NO7)是優(yōu)選的接頭，其廣泛用于許多抗體，因其提供足夠的柔性。其它接頭包括Glu Ser Gly Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser(SEQ ID NO8)，Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr(SEQ ID NO9)，Glu Gly LysSer Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr Gln(SEQ ID NO10)，Glu Gly Lys Ser SerGly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp(SEQ ID NO11)，Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly LysSer Ser Glu Gly Lys Gly(SEQ ID NO12)，Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln LeuAla Gln Phe Arg Ser Leu Asp(SEQ ID NO13)，and Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser GluGlu Leu Ala Phe Arg Ser Leu Asp(SEQ ID NO14)。較短接頭的實例包括以上接頭的片段，并且較長接頭的實例包括以上接頭的組合、以上接頭的片段的組合、以及以上接頭與以上接頭的片段的組合。
如本文所使用的，術(shù)語“正確折疊的多肽”包括這樣的多肽(例如抗-TAJ抗體)，在其中，包含該多肽的所有功能性結(jié)構(gòu)域是不同活性的。如本文所使用的，術(shù)語“不正確折疊的多肽”包括這樣的多肽，在其中，多肽的功能性結(jié)構(gòu)域中的至少一個不是活性的。在一個具體實施方式
中，正確折疊的多肽包含通過至少一個二硫鍵連接的多肽鏈，而相反地，不正確折疊的多肽包含不是由至少一個二硫鍵連接的多肽鏈。
如本文所使用的，術(shù)語“經(jīng)改造的”包括通過合成方法(例如通過重組技術(shù)、體外肽合成、通過肽的酶促或化學(xué)連接，或這些技術(shù)的部分組合)的核酸或多肽分子的操作。
如本文所使用的，術(shù)語“表達(dá)”指的是基因通過其產(chǎn)生生化產(chǎn)品例如RNA和多肽的方法。該方法包括在細(xì)胞內(nèi)的基因的功能性存在的任何表現(xiàn)，包括但不限于基因剔除以及瞬間表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)。其包括但不限于將基因轉(zhuǎn)錄到信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)、小發(fā)夾RNA(shRNA)、小干擾RNA(siRNA)或任何其它RNA產(chǎn)物中，并將這樣的mRNA翻譯成多肽。如果最終希望的產(chǎn)物是生化產(chǎn)品，則表達(dá)包括該生化產(chǎn)品和任何前體的形成。
術(shù)語“RNA干擾”或“RNAi”指的是通過siRNA來抑制或降低基因表達(dá)。其是序列特異性、抑制動物和植物中轉(zhuǎn)錄后基因、通過siRNA起動的過程，該siRNA在其雙鏈區(qū)中與該抑制基因的序列是同源性的。該基因可以與微生物是內(nèi)源性或外源性的，存在于整合到染色體或存在于未整合到基因組的轉(zhuǎn)染載體中。該基因的表達(dá)完全或部分地被抑制。也可以認(rèn)為RNAi抑制靶RNA的功能；靶RNA的功能可以是完全或部分的。
如本文所使用的，術(shù)語“治療”指的是治療性和預(yù)防性或防止措施，其目的是防止或減緩(減輕)不希望的生理變化或失調(diào)，如多發(fā)性硬化的進(jìn)展。有用或希望的臨床結(jié)果包括但不限于不管是可檢測或不可檢測的病癥的減輕、疾病程度的減小、疾病的穩(wěn)定(即，沒有惡化)狀態(tài)、疾病進(jìn)展的延緩或減慢、疾病狀態(tài)的減輕或緩和、以及好轉(zhuǎn)(不管是部分或全部)。“治療”也可指當(dāng)相比于如果沒有接受治療的希望存活時的存活延長。需要治療的患者包括已患有該病癥或失調(diào)以及易于患病癥或失調(diào)或待防止病癥或失調(diào)的患者。
用“受治療者(受試者或患者，subject)”或“個體”或“動物”或“病人”或“哺乳動物”來指任何受治療者，尤其是哺乳動物受治療者，其需要預(yù)防、預(yù)后、或治療。哺乳動物受治療者包括但不限于人、家畜、農(nóng)畜、動物園動物、體育動物、寵物如狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛；靈長類動物如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科動物如狗、狐貍；貓科動物如貓、獅和虎；馬科動物如馬、驢、和斑馬；食品動物如奶牛、豬和綿羊；有蹄動物如鹿和長頸鹿；嚙齒動物如小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠等。在某些具體實施方式
中，哺乳動物是人患者。
如本文所使用的，短語如“受益于給予本發(fā)明的TAJ多肽或多肽片段的受治療者”和“需要治療的動物”包括受益于給予用于例如檢測(例如用于診斷程序)和/或用于治療，即利用本發(fā)明的TAJ多肽或多肽片段來減輕或防止疾病如MS的本發(fā)明的TAJ多肽或多肽片段的受治療者如哺乳動物受治療者。如本文更詳細(xì)描述的，多肽或多肽片段可以以未結(jié)合形式或可以結(jié)合例如藥物、前藥或同位素使用。
如本文所使用的，“治療有效量”指的是在劑量上和必要時間期內(nèi)有效用來獲得希望治療結(jié)果的量。治療結(jié)果可以是例如病癥減輕、延長存活、改進(jìn)活動性等。治療結(jié)果不必是“治愈性的”。
如本文所使用的，“預(yù)防有效量”指的是劑量在劑量上和必要時間期內(nèi)有效用來獲得希望預(yù)防結(jié)果的量。通常，由于預(yù)防劑量是在疾病前或疾病早期階段在受治療者中使用，所以預(yù)防有效量低于治療有效量。
TAJ(TROY)本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)在CNS中，TAJ信號傳導(dǎo)活性的某些調(diào)節(jié)劑可以影響神經(jīng)元存活和/或長出。
如本文所使用的，“TAJ多肽”是包括全長TAJ氨基酸序列或其功能片段或結(jié)構(gòu)域的多肽。TAJ多肽也可以可選地包括異源性(非TAJ)氨基酸序列。
天然存在的全長人TAJ多肽的長度為423個氨基酸、具有46kDa的計算摩爾質(zhì)量。下面示出了該人TAJ多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。這個人TAJ多肽是由SEQ ID NO1的cDNA編碼的。
1 MALKVLLEQE KTFFTLLVLL GYLSCKVTCE SGDCRQQEFR DRSGNCVPCN QCGPGMELSK61 ECGFGYGEDA QCVACRLERF KEDWGFQKCK PCLDCAVVNR FQKANCSATS DAICGDCLPG121FYRKTKLVGF QDMECVPCGD PPPPYEPHCA SKVNLVKIAS TASSPRDTAL AAVICSALAT181VLLALLILCV IYCKRQFMEK KPSWSLRSQD IQYNETELSC FDRPQLHEYA HPACCQCRRD241SVQTCGPVRL LPSMCCEEAC SPNPATLGCG VHSAASLQAR NAGPAGEMVP TFFGSLTQSI301CGEFSDAWPL MQNPMGGDNI SFCDSYPELT GEDIHSLNPE LESSTSLDSN SSQDLVGGAV361PVQSHSENFT AATDLSRYNN TLVESASTQD ALTMRSQLDQ ESGAVIHPAT QTSLQVRQRL421GSL參見例如Eby，M.T.，et al.，J.Biol.Chem.27515336-15342(2000)。
人TAJ的天然存在變異體是已知的例如由具有GenBank登錄號AB0040434(SEQ ID NO3)的cDNA編碼的GenBank登錄號BAB03269(SEQ ID NO4)、由具有GenBank登錄號AF246999(SEQ ID NO5)的cDNA編碼的GenBank登錄號AAK28396(SEQ ID NO6)。
其它天然存在的人TAJ多肽包括可替換的剪接形式。天然存在的TAJ多肽包括相同基因的可替換剪接形式。一種可替換剪接形式類似于SEQ ID NO2的氨基酸1至417。編碼這個剪接變異體的信使RNA具有唯一的5’UTR，而相比于SEQ ID NO2，不同之處在于3’末端區(qū)，其包括一部分編碼序列。相比于SEQ ID NO2，所得變異體具有不同的并且較短的C-末端。參見例如由具有GenBank登錄號BC047321(SEQ ID NO15)的cDNA編碼的GenBank登錄號AAH47321(SEQ ID NO16)。
其它相關(guān)序列包括在其它物種例如小鼠TRADE(GenBank登錄號AAK28397(SEQ ID NO18)，由GenBank登錄號AF247000(SEQ ID NO17)的cDNA編碼)中同系物。
SEQ ID NO2的人TAJ多肽包括信號肽序列、胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、以及胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。TAJ多肽的信號肽序列橫跨SEQ IDNO2的氨基酸1至約氨基酸25，胞外結(jié)構(gòu)域橫跨SEQ ID NO2的約氨基酸26至約氨基酸173。跨膜結(jié)構(gòu)域橫跨SEQ ID NO2的約氨基酸174至SEQ ID NO2的約氨基酸190，并且胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域橫跨SEQ ID NO2的約氨基酸191至氨基酸423。當(dāng)然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道預(yù)測的結(jié)構(gòu)域的末端是大約的。例如，信號肽序列可以包含SEQ ID NO2的氨基酸1至20、1至21、1至22、1至23、1至24、1至25、1至26、1至27、1至28、1至29、1至30。因此，人TAJ的胞外結(jié)構(gòu)域的N-末端將分別為在SEQ ID NO2的氨基酸21至氨基酸31處。表2列出了SEQ ID NO2的人TAJ多肽的近似結(jié)構(gòu)域和其它區(qū)。對于其它TAJ多肽的類似結(jié)構(gòu)域片段如本文所披露的那些片段可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易地推導(dǎo)出。
與TNF受體總科的其它成員一樣，TAJ的胞外結(jié)構(gòu)域的特征在于存在富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(“CRD”)。CRD是通常含有6個半胱氨酸殘基的假重復(fù)子。盡管不受限于理論，但是認(rèn)為CRD參與形成對于配體結(jié)合很重要的3個結(jié)構(gòu)域內(nèi)的二硫鍵。CRD還可含有少于6個半胱氨酸，形成不完全的富半胱氨酸基序。在給定受體中的CRD的數(shù)量從1至4變化。參見Banner et al.，Cell，1993，73431-445。
TNF家族受體具有功能性結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)，使得一個受體胞外結(jié)構(gòu)域由TNF受體結(jié)構(gòu)域(即，CRD)構(gòu)成(作為參考，參見Bodmer et al.，2002，TRENDS in Biochem.Sci.2719-26)。在一個具體實施方式
中，可溶性TAJ多肽包含一個或多個(例如1或2個)但不是所有的全長TAJ多肽的TNF受體結(jié)構(gòu)域。這樣的截短可溶性TAJ多肽包含足以形成用于NgR1和/或LINGO-1的相互作用位點的其TNF受體結(jié)構(gòu)域的亞組。
認(rèn)為SEQ ID NO2的TAJ多肽含有3個富半胱氨酸結(jié)構(gòu)域。兩個CRD結(jié)構(gòu)域在該區(qū)中具有6個半胱氨酸，而一個CRD僅具有4個半胱氨酸。因此，TAJ多肽含有兩個完整的TNF受體基序，本文中的CRD1和CRD2，以及一個不完整基序CRD3，其中C2和C6不存在。
這些結(jié)構(gòu)域的大約坐標(biāo)適于表2中。
表2

本發(fā)明的TAJ多肽可以進(jìn)一步包含下列多肽片段、基序、或結(jié)構(gòu)域中的一個或多個富絲氨酸/蘇氨酸/脯氨酸結(jié)構(gòu)域(例如SEQ IDNO2的約氨基酸137至約氨基酸168)、TAJ相關(guān)死亡因子結(jié)構(gòu)域(例如SEQ ID NO2的約氨基酸218至約氨基酸423)、N-連接糖基化位點(例如SEQ ID NO2的氨基酸105-108)、cAMP/cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(例如SEQ ID NO2的氨基酸200至203或SEQ ID NO2的殘基238至241)、蛋白激酶C磷酸化位點(例如SEQ ID NO2的氨基酸205至207)、干酪素激酶II磷酸化位點(例如SEQ ID NO2的氨基酸219至222和/或SEQ ID NO2的氨基酸325至328)、酪氨酸激酶磷酸化位點(例如SEQ ID NO2的氨基酸207至213)、N-十四烷基化位點(例如SEQ ID NO2的氨基酸215-220)、TRAF結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如SEQ ID NO2的氨基酸1-328，或可替換地，SEQ ID NO2的氨基酸218-328)、或NFkB激活信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(例如SEQ ID NO2的氨基酸1-368，或可替換地，在TAJ多肽的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的氨基酸)，參見Wood等的美國專利申請公開第2002/0068696A1號；還參見WO01/058954A3，通過引用將二者的全部內(nèi)容結(jié)合于此作為參考。
如本文其它地方詳細(xì)描述的，“可溶性TAJ多肽”是這樣的多肽，其包括缺少跨膜結(jié)構(gòu)域并且可選地缺少胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的全長TAJ多肽的片段。典型的可溶性TAJ多肽包括至少一部分的TAJ多肽的胞外結(jié)構(gòu)域。(人TAJ多肽的胞外結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO2的約氨基酸26至約氨基酸173，參見表2)。術(shù)語“約”用來表示本文所述的多肽結(jié)構(gòu)域或片段可以在大小上變化一個或多個氨基酸，取決于例如多肽的準(zhǔn)確序列或用來確定特定結(jié)構(gòu)域或片段的標(biāo)準(zhǔn)，例如可以是1、2、3、4、5、6個或更多個氨基酸。這樣的變異體對于本發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說已經(jīng)很好地理解。因此，在某些具體實施方式
中，可溶性的人TAJ多肽包括例如具有在SEQ ID NO2的氨基酸20和32之間的N-末端延伸至在SEQ ID NO2的氨基酸160和200之間的C-末端的多肽。在一個具體實施方式
中，可溶性的人TAJ多肽包括SEQ ID NO2的氨基酸26-173。“可溶性TAJ多肽”還包括融合蛋白，其中TAJ的可溶性片段融合至異源氨基酸序列如肽標(biāo)記物、AP、或免疫球蛋白例如IgG的Fc區(qū)。
人TAJ多肽不限于SEQ ID NO2。人TAJ多肽可包括至少90％、或至少95％、96％、98％、或99％和SEQ ID NO2或其胞外結(jié)構(gòu)域相同的序列。還包括的是包含SEQ ID NO2的TAJ多肽或其胞外結(jié)構(gòu)域具有多達(dá)15個氨基酸缺失、取代、或插入的TAJ多肽。這樣的多肽可易于對TAJ生物活性例如對影響神經(jīng)突長出或神經(jīng)元存活的能力進(jìn)行分析。
對于技術(shù)人員來說也是明顯的，SEQ ID NO2的功能性變異體(即具有相同功能)可通過例如形成殘基或序列的取代(例如形成保守性取代)或缺失末端或內(nèi)部殘基、或?qū)ι锘钚允遣恍枰男蛄屑右詷?gòu)建。大量關(guān)于什么殘基對于活性是關(guān)鍵或非關(guān)鍵的指導(dǎo)在人TAJ的殘基相比于鼠TAJ和其它TNFR家族成員是高度保守的知識中提供了(參見例如Eby et al.，2000，J.Biol.Chem.27515336-15342)。技術(shù)人員無需過度實驗在不影響生物功能的情況下可在SEQ IDNO2中形成保守性取代。在另一實施例中，技術(shù)人員無需過度實驗可在對于破壞TAJ功能例如對于產(chǎn)生顯性負(fù)性TAJ多肽是關(guān)鍵的殘基中形成非保守性區(qū)段，例如跨膜結(jié)構(gòu)域可通過通常疏水性氨基酸殘基(其包含具有親水性氨基酸殘基的功能性跨膜結(jié)構(gòu)域)的取代而失活。在另一實施例中，半胱氨酸殘基可缺失或用其它氨基酸替代以阻止通過復(fù)性的非必要分子內(nèi)二硫鍵形成。其它方法可以涉及氨基酸修飾以例如增強(qiáng)所選表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)。
利用拮抗劑TAJ的治療方法本發(fā)明的一個具體實施方式
提供了治療與缺少神經(jīng)突長出或神經(jīng)元細(xì)胞死亡有關(guān)的疾病、失調(diào)或損傷，如患有這樣的疾病的動物中的多發(fā)性硬化的方法，該方法包括、基本上由或由給予該動物有效量的TAJ拮抗劑組成，其中TAJ拮抗劑選自由可溶性TAJ多肽、抗-TAJ抗體和TAJ拮抗劑多肽組成的組。這樣TAJ拮抗劑進(jìn)一步包括任何以上拮抗劑分子的功能性片段、變異體或衍生物。
另外，本發(fā)明涉及用于促進(jìn)哺乳動物神經(jīng)突長出的方法，其包括、基本上由或由給予治療有效量的TAJ拮抗劑組成，其中TAJ拮抗劑選自由可溶性TAJ多肽、抗-TAJ抗體和TAJ拮抗劑多肽組成的組。這樣的TAJ拮抗劑進(jìn)一步包括任何上述拮抗劑分子的功能性片段、變異體、或衍生物。
也包含在本發(fā)明中的是促進(jìn)神經(jīng)突長出的方法，其包括、基本上由或由將神經(jīng)元與上述有效量的TAJ拮抗劑進(jìn)行接觸組成。另外，本發(fā)明提供了促進(jìn)神經(jīng)元存活的方法，包括、基本上由或由將神經(jīng)元與上述有效量的TAJ拮抗劑進(jìn)行接觸組成。
待用于本文披露的治療方法中的TAJ拮抗劑，例如可溶性TAJ多肽、抗-TAJ抗體和TAJ拮抗劑多肽或這樣的分子的片段、變異體或衍生物可加以制備并用作中止、減少、防止、或抑制TAJ負(fù)調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長或再生能力的治療劑。
在本發(fā)明的方法中，TAJ拮抗劑可通過直接將可溶性TAJ多肽、抗-TAJ抗體和TAJ拮抗劑多肽給予至患者?？商鎿Q地，TAJ拮抗劑可通過在體內(nèi)或體外表達(dá)特異性TAJ拮抗劑的表達(dá)載體進(jìn)行給予。
可通過本發(fā)明方法治療或減輕的疾病或失調(diào)包括與神經(jīng)元再生死亡或缺少有關(guān)的疾病、失調(diào)或損傷。這樣的疾病包括但不限于多發(fā)性硬化(MS)、進(jìn)行性多發(fā)性腦白質(zhì)病(PML)、腦脊髓炎(EPL)、橋腦中央髓鞘溶解癥(CPM)、以及腦白質(zhì)腎上腺萎縮癥、亞歷山大病、Pelizaeus Merzbacher病(PMZ)、球狀細(xì)胞腦白質(zhì)營養(yǎng)不良病(克臘比氏病)以及Wallerian變性。
可通過本發(fā)明方法治療或減輕的疾病或失調(diào)包括神經(jīng)變性疾病或失調(diào)。這樣疾病包括但不限于肌萎縮側(cè)索硬化、亨廷頓氏病、阿耳茨海默氏病、糖尿病神經(jīng)病變、帕金森氏病。
可通過本發(fā)明方法治療或減輕的其它疾病、失調(diào)或損傷的實例包括但不限于脊髓損傷、慢性骨髓病或頸椎病、創(chuàng)傷性腦損傷、運(yùn)動神經(jīng)元病、軸突損傷、挫傷、癱瘓、放射后損傷或化療的其它神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥、中風(fēng)、大陷窩、大脈管堵塞的介質(zhì)、白細(xì)胞組織增生(leukoariaosis)、急性缺血性視神經(jīng)病變、維生素E缺乏(單獨(dú)的缺乏綜合癥、AR、Bassen-Kornzweig綜合癥)、B12、B6(維生素B6糙皮病)、維生素B1、葉酸、煙酸缺乏、Marchiafava-Bignami綜合癥、異染性腦白質(zhì)病變、三叉神經(jīng)痛、顏面神經(jīng)麻痹、或需要神經(jīng)元再生、再髓鞘化或少突膠質(zhì)細(xì)胞存活或分化/增生的任何神經(jīng)系統(tǒng)損傷。
TAJ拮抗劑TAJ拮抗劑是阻斷或抑制TAJ信號傳導(dǎo)路徑從而抑制TAJ負(fù)調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長的能力的試劑。因此，TAJ拮抗劑增加、誘導(dǎo)、或促進(jìn)神經(jīng)元存活和/或神經(jīng)突長出。用于本文所披露方法中的TAJ拮抗劑包括但不限于可溶性TAJ多肽或其片段、變異體、或衍生物；抗-TAJ抗體或其抗原結(jié)合片段、變異體、或衍生物；以及TAJ拮抗劑多肽例如反義或RNAi多核苷酸。TAJ拮抗劑進(jìn)一步包括編碼任何以上列出的TAJ拮抗劑的多核苷酸。TAJ拮抗劑可單獨(dú)給予或結(jié)合本文列出的另一TAJ拮抗劑給予，或結(jié)合調(diào)節(jié)MAIF誘導(dǎo)的神經(jīng)突長出的任何其它治療劑，例如LINGO-1拮抗劑和/或Nogo受體拮抗劑給予。LINGO-1拮抗劑和Nogo受體拮抗劑描述于例如PCT
發(fā)明者米莎, 杰弗里·L·布朗寧 申請人:比奧根艾迪克Ma公司