專利名稱：增加癌細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞透過性肽以及這些肽運(yùn)載功能性貨物(cargo)從組織進(jìn)入細(xì)胞的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及抑制NF-κB活化的因子。
關(guān)于國家權(quán)利的陳述本發(fā)明部分由美國政府提供的資金(授予號CA99340，由國立衛(wèi)生研究所，國立癌癥研究所資助)而進(jìn)行的。因此，美國政府可以擁有本發(fā)明中的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
前列腺癌(PCA)是美國癌癥相關(guān)的死亡的第二主要起因。由于在雄激素-依賴性前列腺癌細(xì)胞中刺激程序性細(xì)胞死亡，雄激素切除術(shù)通常用作治療法。PCA細(xì)胞通常是雄激素-不依賴性的，并且有一些隨著時(shí)間變成雄激素-不依賴性的。在雄激素切除術(shù)治療過程中最終剩下了雄激素-不依賴性細(xì)胞，并且向雄激素-不依賴性狀態(tài)的進(jìn)展是患有前列腺癌的男性死亡的主要起因。雄激素-不依賴性腫瘤細(xì)胞更難被消滅，已經(jīng)表明其對許多抗癌藥物和腫瘤壞死因子α(TNF-α)治療法不敏感。雄激素-不依賴性RCA細(xì)胞與高劑量的化學(xué)治療藥物諸如順鉑和依托泊苷反應(yīng)，但是這些藥物本身具有不理想的系統(tǒng)性毒性水平。倘若水平足夠高足以影響顯著數(shù)目的腫瘤細(xì)胞，那么可能對患者構(gòu)成不可接受的威脅。
已經(jīng)證明雄激素-不依賴性前列腺癌細(xì)胞(例如PC-3和DU145)對TNF-α不敏感，而雄激素-敏感性前列腺癌細(xì)胞(例如LNCaP)是TNF-α敏感性的。在許多癌細(xì)胞中，對TNF-α和許多已知的化學(xué)治療劑的促凋亡作用的抗性與NF-κB的組成型活化相關(guān)。Muenchen等.，(Clin.Cancer Res.2000，61969-1977)證明用IκBα“超級抑制劑”(p6R-IκBS32A+S36A)抑制NF-κB使得先前對TNF-α作用不敏感的前列腺癌細(xì)胞變得敏感。在大多數(shù)細(xì)胞類型中，NF-κB以潛在的、沒有活性的形式組成型地存在于細(xì)胞質(zhì)中，它通過與IκB蛋白相互作用而保留在細(xì)胞質(zhì)中，所述IκB蛋白與NF-κB結(jié)合并且掩飾其核定位序列(NLS)。在一些細(xì)胞類型中，NF-κB被組成型地活化。NF-κB在細(xì)胞中的活化包括IκB的遍在蛋白化作用，以致它被26S蛋白酶體降解。去除IκB暴露了NLS，并且導(dǎo)致NF-κB向細(xì)胞核的移動，在這里它起作用保護(hù)細(xì)胞免受程序性細(xì)胞死亡。
NF-κB的組成型活化已經(jīng)在各種組織中得到報(bào)道，包括，例如，胸腺、胰腺、肝臟、膀胱、肺、腎和卵巢。成神經(jīng)細(xì)胞瘤、霍奇金淋巴瘤、急性淋巴母細(xì)胞白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病、伯基特淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤是與NF-κB的組成型活化相關(guān)的癌癥。還已經(jīng)證明對NF-κB核移動的抑制在使得多發(fā)性骨髓瘤對多柔比星的促凋亡作用敏感中具有某種作用(Mitsiades等，Blood，(June 2002)994079-4086)。因此，NF-κB活化成為提高癌癥治療的靶點(diǎn)。
對于癌癥治療，優(yōu)選地應(yīng)用靶點(diǎn)特異性藥劑，并且開發(fā)增加癌細(xì)胞的破壞而對正常細(xì)胞沒有類似影響的藥劑。特別需要的是用于對目前的治療模式表現(xiàn)出抗性并且因而具有增加的死亡率的那些癌癥的新型藥劑。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及包括大約6-大約50個(gè)殘基的細(xì)胞透過性(cell-permeable)肽的多肽，所述細(xì)胞透過性肽包括至少SEQ ID NO1的6個(gè)連續(xù)的殘基和NF-κB核定位序列。本發(fā)明還涉及包括大約11-大約50個(gè)殘基的細(xì)胞透過性肽的多肽，所述細(xì)胞透過性肽包括SEQ ID NO2的至少11個(gè)連續(xù)的殘基和NF-κB核定位序列。NF-κB的核定位序列(NLS)可以包括，例如，p50、p65或它們的功能等價(jià)物。本發(fā)明還提供在細(xì)胞中抑制NF-κB核易位的方法，其包括給細(xì)胞施用有效量的包括SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或其組合的肽。所述方法可以治療性地用于各種疾病狀態(tài)或代謝異常，其中特別是NF-κB核易位和NF-κB的組成型活化起顯著作用。
本發(fā)明還提供約6-約50個(gè)氨基酸的包括SEQ ID NO1的細(xì)胞透過性肽，和約11-約50個(gè)氨基酸的包括SEQ ID NO2的細(xì)胞透過性肽。所述細(xì)胞透過性肽可以合成，在細(xì)胞的或沒有細(xì)胞的DNA和RNA表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生，或者化學(xué)附著以便它與貨物分子功能性締合。例如，所述貨物分子可以是內(nèi)部細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)子、細(xì)胞-細(xì)胞信號傳導(dǎo)的誘導(dǎo)子、激素、寡核苷酸或其它活性劑。
本發(fā)明還提供用于與組成型NF-κB活化相關(guān)的癌癥的化學(xué)治療系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括治療有效量的包括SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或其組合的肽、以及在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的化學(xué)治療劑或放射性治療劑。化學(xué)治療劑可以包括，例如，TNFα、依托泊苷或順鉑。本發(fā)明還提供治療雄激素-不依賴性前列腺癌的方法，所述方法包括給需要其的受試者施用治療有效量的至少一種抑制癌細(xì)胞中NF-κB組成型活化的肽，與化學(xué)治療劑組合施用。所述至少一種肽可以包括，例如，SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SN50或其組合。
附圖簡述
圖1示例CB5005的設(shè)計(jì)和氨基酸序列(單字母氨基酸密碼)(SEQ IDNO4)，其為一種抑制NF-κB活化、誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡并且使得腫瘤細(xì)胞對抗癌藥物諸如順鉑和依托泊苷的破壞腫瘤細(xì)胞作用敏感的肽劑。CB5005(SEQ ID NO4)包含NF-κB p50蛋白的核定位序列(NLS)(斜體)以及新型的11-mer細(xì)胞透過性序列(CPS)(SEQ ID NO2)(下劃線)。CB5003(SEQ ID NO3)是只具有部分CPS(也用下劃線)的類似物肽。CB5002(SEQ ID NO5)包含突變的CPS并且因此不是細(xì)胞透過性的和功能性的。CB5007(SEQ ID NO6)是除了NF-κB p50 NLS中2個(gè)堿性殘基突變(KR-NG)外與CB5005對應(yīng)的對照肽。
圖2通過熒光顯微鏡分析示例CB5005(SEQ ID NO4)在DU145，PC3，LNCaP和N2a細(xì)胞中的細(xì)胞輸入。將在8孔腔式載玻片上的細(xì)胞用30μMCB5005(SEQ ID NO4)在37℃處理1小時(shí)。通過使用抗-肽抗體和FITC-標(biāo)記的抗兔抗體的直接免疫熒光檢測而檢測胞內(nèi)肽，并且通過熒光顯微鏡分析。
圖3a示例雄激素-不依賴性DU145細(xì)胞核提取物中的NF-κB p50蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析。將DU145細(xì)胞用CB5005(SEQ ID NO4)(30μM)，CB5003(SEQ ID NO3)(90μM)，CB5007(SEQ ID NO6)(30μM)或稀釋劑處理30min，之后用TNF-α(10ng/ml)或稀釋劑再處理1h。將等量的核提取物通過SDS-PAGE分離，并且將蛋白轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。使用抗-p50兔抗體和增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測NF-κB p50蛋白。圖3b示例雄激素-不依賴性DU145細(xì)胞的核提取物中NF-κB p50蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析。將DU145細(xì)胞用CB5005(SEQ ID NO4)(30μM)，CB5007(SEQ ID NO6)(30μM)或稀釋劑處理16h。不加入TNF-α。
圖4示例用膜聯(lián)蛋白V/PI染色的凋亡DU145細(xì)胞。在4孔腔式載玻片上的DU145細(xì)胞用CB5005(SEQ ID NO4)(30μM)或稀釋劑處理30min，然后用順鉑(5μg/ml)再處理5h。然后，將細(xì)胞用膜聯(lián)蛋白V/PI試劑盒按照制造者流程(BD-Pharmingen)的指導(dǎo)進(jìn)行處理，并且通過熒光顯微鏡檢驗(yàn)。熒光染色的細(xì)胞指示凋亡的細(xì)胞。
圖5使用TUNEL反應(yīng)試劑盒(Roche)示例凋亡DU145細(xì)胞，所述試劑盒優(yōu)選標(biāo)記在程序性細(xì)胞死亡過程中產(chǎn)生的DNA鏈裂口。將在8孔腔式載玻片上的DU145細(xì)胞用指定濃度的CB5005(SEQ ID NO4)或稀釋劑處理30min，然后用順鉑(5μg/ml)或稀釋劑再處理16h。箭頭指示在核仁中檢測的DNA分裂的深褐色區(qū)域，這是程序性細(xì)胞死亡的常見跡象。
圖6使用TUNEL反應(yīng)試劑盒(Roche)示例凋亡DU145細(xì)胞，所述試劑盒優(yōu)選標(biāo)記在程序性細(xì)胞死亡過程中產(chǎn)生的DNA鏈裂口。將在8孔腔式載玻片上的DU145細(xì)胞用指定濃度的CB5003(SEQ ID NO3)(40μM)、CB5002(SEQ ID NO5)(72μM)、CB5007(SEQ ID NO6)(30μM)或稀釋劑處理30min，然后用順鉑(5μg/ml)再處理16h。
圖7a示例用膜聯(lián)蛋白V/PI染色的DU145細(xì)胞的流式細(xì)胞分析。將DU145細(xì)胞用CB5005(SEQ ID NO4)(30μM)或稀釋劑處理30min，然后用順鉑(5μg/ml)或稀釋劑再處理21h。然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞。圖7b示例圖7a結(jié)果的柱狀圖。
圖8示例用膜聯(lián)蛋白V/PI染色的DU145細(xì)胞的流式細(xì)胞分析。將DU145細(xì)胞用CB5003(SEQ ID NO3)(72μM)、CB5002(72μM)或稀釋劑處理15min，然后用順鉑(5μg/ml)或稀釋劑再處理21h。然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞。
圖9示例用膜聯(lián)蛋白V/PI染色的DU145細(xì)胞的流式細(xì)胞分析。將DU145細(xì)胞指定濃度的CB5005(SEQ ID NO4)或稀釋劑處理30min，然后用TNF-α(10ng/ml)或稀釋劑再處理21h。然后通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞。
圖10a顯示在不存在CB5005(SEQ ID NO4)或CB5003(SEQ ID NO3)時(shí)順鉑在DU145細(xì)胞中誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，其從流式細(xì)胞分析的結(jié)果計(jì)算。實(shí)驗(yàn)條件與圖7相同。
圖10b示例并且比較通過單獨(dú)的順鉑。單獨(dú)的CB5005(SEQ ID NO4)以及順鉑和CB5005(SEQ ID NO4)共同處理在DU145細(xì)胞中誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，其從流式細(xì)胞分析的結(jié)果計(jì)算。
圖11顯示在不存在CB5005(SEQ ID NO4)時(shí)依托泊苷在DU145細(xì)胞中誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，其從流式細(xì)胞分析的結(jié)果計(jì)算。將DU145細(xì)胞用CB5005(SEQ ID NO4)(30μM)或稀釋劑處理30min，然后用指定濃度的依托泊苷再處理21h。然后，通過流式細(xì)胞術(shù)分析用膜聯(lián)蛋白V/PI染色的細(xì)胞。
圖12a顯示不比較在不存在CB5005(SEQ ID NO4)時(shí)依托泊苷在PC3細(xì)胞和LNCaP細(xì)胞中誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，其從流式細(xì)胞分析的結(jié)果計(jì)算。將PC3細(xì)胞或LNCaP細(xì)胞用CB5005(SEQ ID NO4)(30μM)或稀釋劑處理30min，然后用5μg/ml的依托泊苷再處理21h。然后，通過流式細(xì)胞術(shù)分析用膜聯(lián)蛋白V/PI染色的細(xì)胞。
圖12b示例用CB5005(SEQ ID NO4)處理的不同細(xì)胞系的細(xì)胞毒性研究。將生長在96孔平板中的DU145、PC3、LNCaP或N2a細(xì)胞一式四份用不同濃度的肽在37℃處理24h。使用MTS比色檢測(Promega)1h并且使用Bio-Tek MicroplateAutoreader EL 309在490nm處讀數(shù)而確定細(xì)胞毒性。數(shù)據(jù)表示為三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。在DU145和PC3細(xì)胞中肽-未處理的和處理的樣品(30μM)之間觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＜0.05)，而在LNCaP和N2a細(xì)胞中沒有觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。
圖13示例CB5005(SEQ ID NO4)在PC3細(xì)胞中增強(qiáng)依托泊苷誘導(dǎo)的胱天蛋白酶-3活性的作用。將PC3細(xì)胞用CB5005(SEQ ID NO4)(30μM)或稀釋劑處理30min，然后用5μg/ml的依托泊苷再處理16h。使用Asp-Glu-Val-Asp氨基甲基香豆素(DEVD-AMC)作底物，通過熒光分光光度法胱天蛋白酶-3定量檢測試劑盒測定細(xì)胞裂解物中的胱天蛋白酶-3活性。將樣品在380nm處激發(fā)，并且在CytofluorTM2300讀數(shù)儀(Millipore，Bedford，MA)中在460nm處讀數(shù)。通過從樣品熒光中減去空白熒光(只有緩沖液加底物)而計(jì)算相對熒光。結(jié)果表示為三次不同實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。(*顯示與只用依托泊苷處理的細(xì)胞顯著不同(p＜0.05)的值)。
圖14使用TUNEL反應(yīng)試劑盒(Roche)示例凋亡DU145細(xì)胞，所述反應(yīng)試劑盒優(yōu)選標(biāo)記在程序性細(xì)胞死亡過程中產(chǎn)生的DNA鏈裂口。將在8孔腔式載玻片上的DU145細(xì)胞用指定濃度的CB5005(SEQ ID NO4)或SN50(包括信號肽序列和NF-κB核定位序列的肽，在Lin等美國專利號5,807,746中所述)或稀釋劑處理30min，然后用順鉑(5μg/ml)或稀釋劑再處理16h。深褐色區(qū)域顯示在核仁中檢測到的DNA分裂，這是程序性細(xì)胞死亡的常見跡象。
圖15顯示在不存在或存在CB5005(SEQ ID NO4)或SN50時(shí)順鉑在DU145細(xì)胞中誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，其從流式細(xì)胞分析的結(jié)果計(jì)算。將DU145細(xì)胞用CB5005(SEQ ID NO4)(18uM)、SN50(18μM)或稀釋劑處理30min，然后用5μg/ml的順鉑再處理21h。然后，通過流式細(xì)胞術(shù)分析用膜聯(lián)蛋白V/PI染色的DU145細(xì)胞。
圖16示例并且比較熒光顯微鏡分析再DU145細(xì)胞中的CB5005(SEQID NO4)和SN50的細(xì)胞輸入。將在8孔腔式載玻片上的DU145細(xì)胞用稀釋劑、30μM的CB5005(SEQ ID NO4)或SN50在37℃處理1h。使用抗肽抗體和FITC-標(biāo)記的抗兔抗體，通過間接免疫熒光檢測而檢測作為綠色染色的胞內(nèi)肽，并且通過熒光顯微鏡進(jìn)行分析。
詳述本發(fā)明人設(shè)計(jì)了新型細(xì)胞透過性肽(CPS)，其可以功能性附著到NF-κB活化或核定位抑制劑上以破壞雄激素-不依賴性前列腺腫瘤細(xì)胞(癌細(xì)胞)。當(dāng)被遞送到細(xì)胞時(shí)，并且運(yùn)載包括NF-κB活化抑制劑的貨物肽時(shí)，相比由已知的NF-κB活化抑制劑諸如SN50提供的抑制，這種CPS提供增加的NF-κB活化抑制。本發(fā)明提供可以單獨(dú)施用、或者與化學(xué)治療劑組合施用增加對腫瘤細(xì)胞的毀壞而抑制NF-κB的抗凋亡作用的肽。
本發(fā)明還提供新型肽的使用方法，所述新型肽誘導(dǎo)癌細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡，并且使得腫瘤細(xì)胞對化學(xué)治療藥物諸如順鉑和依托泊苷的殺細(xì)胞作用敏感。這樣的肽可以抑制細(xì)胞中的抗凋亡機(jī)制，或者促進(jìn)細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡，并且通?？梢园s6-約50個(gè)氨基酸的肽，其包括SEQ IDNO1(Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala)、SEQ ID NO2(Lys-Leu-Lys-Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala)、SEQ ID NO3、SEQ IDNO4或它們的組合。本發(fā)明提供新型的治療劑，其用于治療雄激素-不敏感性前列腺癌，以及組成型NF-κB活化在其中誘導(dǎo)細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡抗性或抑制程序性細(xì)胞死亡的各種癌癥類型。
本發(fā)明的肽和本發(fā)明方法中所用的肽可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)肽合成方法而制備。肽還可以是使用表達(dá)載體產(chǎn)生，所述表達(dá)載體具有編碼選擇的肽的核苷酸序列，其可操作地連接到適當(dāng)?shù)膯幼印⒔K止子和其它功能性序列諸如編碼純化標(biāo)記的序列上，以促進(jìn)所述肽的表達(dá)和純化?！翱刹僮鞯亍被颉肮δ苄缘亍边B接意指，CPS與其貨物肽連接，以致CPS可以指導(dǎo)CPS/貨物肽(例如CPS/NLS)輸入到細(xì)胞中，并且所述貨物肽可以起到影響細(xì)胞代謝諸如細(xì)胞信號傳導(dǎo)的功能。例如，CPS和貨物肽可以通過一個(gè)或多個(gè)肽鍵連接。CPS可以緊接在貨物肽的C端或N端，可以使用多于1個(gè)CPS，可以使用多于1個(gè)貨物肽，和/或CPS和貨物肽氨基酸序列可以通過在CPS和貨物肽之間區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)氨基酸而分開。CPS/貨物肽可以包括C端或N端或者兩端的其它氨基酸。
當(dāng)用于本文時(shí)，“化學(xué)治療”劑是在細(xì)胞中刺激程序性細(xì)胞死亡的化學(xué)試劑，通常(但不是總是)對癌癥或腫瘤細(xì)胞比對正常細(xì)胞具有更大的作用。許多化學(xué)治療劑是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。癌癥治療領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的刺激癌細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡的藥劑還包括放射性治療劑。本發(fā)明的肽也可以用于增加放射性治療劑的作用，并且提供協(xié)同作用，以促進(jìn)癌細(xì)胞的毀滅。
細(xì)胞透過性，“能夠輸入的”信號肽序列以及膜易位序列促進(jìn)附著的肽和蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中。先前已經(jīng)描述了一些這種類型的序列，包括卡波西成纖維細(xì)胞生長因子信號序列的疏水區(qū)，所述卡波西成纖維細(xì)胞生長因子與p50的核定位序列(NLS)融合產(chǎn)生稱為SN50的肽(U.S.Patent No.5,807,746)。本發(fā)明人在這里提供由本發(fā)明人設(shè)計(jì)的賦予附著的肽或蛋白提高的細(xì)胞透過性的新型序列。當(dāng)在相似的施用條件下與SN50的活性比較時(shí)，將NF-κB p50或功能性副本與本文所述的細(xì)胞透過性序列(CPS)可操作地連接，產(chǎn)生具有提高活性的肽。本發(fā)明人證明包括Lys-Leu-Lys-Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala(SEQ ID No.2)的序列比一種最廣泛應(yīng)用的NF-κB活化的細(xì)胞透過性抑制劑SN50更有效地促進(jìn)p50NLS的細(xì)胞輸入。當(dāng)與在這些細(xì)胞中引發(fā)凋亡途徑的化學(xué)治療劑組合施用時(shí)，本發(fā)明人生產(chǎn)的CPS/p50 NLS(SEQ ID NO3)肽提供有效的雄激素-不依賴性前列腺癌細(xì)胞的細(xì)胞殺傷。CPS/p50 NLS(SEQ ID NO4)肽不但當(dāng)與至少一種化學(xué)治療劑或放射性治療劑施用時(shí)提供協(xié)同的促凋亡作用，而且當(dāng)不與化學(xué)治療劑或放射性治療劑一起施用時(shí)也提供促凋亡和治療作用。
當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“CPS”包括所述肽的變體或生物活性片段、以及可以在公開序列的N端或C端(或兩端)含有其它氨基酸的肽、它們的衍生物、變體或功能性副本。例如，“功能性副本”可以包括肽核酸(PNA)。肽的“變體”與公開的CPS肽序列不完全相同。依據(jù)本發(fā)明的內(nèi)容，變體可以通過插入、刪除或取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變氨基酸序列而獲得?？梢孕揎椆_的肽的氨基酸序列，例如，通過取代產(chǎn)生具有基本上相同或改善的性質(zhì)的肽。取代可以是保守取代?！氨Ｊ厝〈笔怯镁哂性跇O性/非極性性質(zhì)、電荷或大小上相似的側(cè)鏈的另一種氨基酸取代氨基酸。20種基本氨基酸可以分成具有非極性側(cè)鏈的(丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)，不帶電荷極性側(cè)鏈的(甲硫氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)，酸性側(cè)鏈的(天冬氨酸和谷氨酸)以及堿性側(cè)鏈的(賴氨酸、精氨酸和組氨酸)。保守取代可以包括，例如，Asp取代成Glu，Asn或Gln；His取代成Lys，Arg或Phe；Asn取代成Gln，Asp或Glu；Leu取代成Ile或Val；以及Ser取代成Cys，Thr或Gly。丙氨酸通常用于進(jìn)行保守取代。
對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員，變體肽可以通過在肽結(jié)構(gòu)中的一個(gè)或多個(gè)位置用第一個(gè)氨基酸取代第二個(gè)氨基酸以影響生物活性而獲得。例如，氨基酸取代可以包括導(dǎo)致增加的生物活性的多肽構(gòu)象變化。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以基于氨基酸的親水性指數(shù)(hydrophilicityindex)或親水指數(shù)(hydropathic index)在氨基酸序列中進(jìn)行取代。
本發(fā)明的變體肽同相應(yīng)的天然核酸分子的或包括SEQ ID NO 1，SEQID NO 2，SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 4的多肽的氨基酸序列有低于100％，但是至少約50％，并且優(yōu)選地至少約80％-約90％的氨基酸序列同源性或相同性。因此，變體CPS肽的氨基酸序列基本上符合公開的氨基酸序列。當(dāng)用于本文時(shí)，“基本上符合”是指這樣的多肽序列，其引發(fā)同由公開的CPS產(chǎn)生的生物活性相似的生物活性，這樣的活性是公開的CPS肽的活性的至少約70％-大于公開的CPS肽的活性的100％。
公開的CPS的變體可以包括在相應(yīng)的CPS中不存在的氨基酸殘基，或者相對于相應(yīng)的CPS可以包括刪除。與相應(yīng)的CPS相比，變體還可以是剪截的“片段”，即，只是某些公開的CPSs的部分氨基酸序列。
核因子κB(NF-κB)在雄激素-不敏感性PCA細(xì)胞中被組成型地活化，活化通過在組織中釋放TNF-α而增加。NF-κB以及它調(diào)控的基因似乎負(fù)責(zé)在人PCA細(xì)胞中誘導(dǎo)抗程序性細(xì)胞死亡作用。NF-κB核易位可以通過施用本發(fā)明的CPS/p50 NLS(SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，或其組合)肽干擾NF-κB-調(diào)控的抗凋亡機(jī)制而得到抑制。當(dāng)與刺激程序性細(xì)胞死亡的化學(xué)治療劑組合施用時(shí)，本發(fā)明的CPS/p50 NLS(SEQ ID NO3)肽阻滯NF-κB活化以及隨后的程序性細(xì)胞死亡的抑制，并且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的殺傷。當(dāng)單獨(dú)施用或者與誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的化學(xué)治療劑組合施用時(shí)，SEQ ID NO4所述的CPS/NLS也阻滯NF-κB對程序性細(xì)胞死亡的抑制，并且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的破壞。
包括SEQ ID NO4的肽可以單獨(dú)施用，不存在任何化學(xué)治療劑，來提供治療作用。“單獨(dú)”意欲表示所述肽作為主要的治療劑提供，沒有具有顯著促凋亡治療作用的其它藥劑。應(yīng)該理解本發(fā)明的肽或者本發(fā)明方法所用的肽可以與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當(dāng)?shù)乃巹┮黄鹛峁T如例如賦形劑、稀釋劑、溶劑、鹽溶液以及具有其它理想的治療作用的試劑諸如抗生素和減輕疼痛劑。
本發(fā)明的細(xì)胞透過性序列(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)還可以用來遞送各種其它肽、核酸以及其它用于研究或治療應(yīng)用的有機(jī)化合物?？梢允褂帽景l(fā)明方法遞送到細(xì)胞內(nèi)部的其它肽包括，但不限于，包括酶分解位點(diǎn)、磷酸化位點(diǎn)、蛋白-蛋白相互作用區(qū)域以及胞內(nèi)蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)的肽。CPS還可以用來遞送包括在細(xì)胞內(nèi)部作用以促進(jìn)生長、分化或其它細(xì)胞功能的蛋白功能區(qū)域的肽。
本發(fā)明的CPS/p50 NLS還可以用于包括出于減少炎癥或疼痛目的而抑制NF-κB核定位的許多其它的治療中。例如，已經(jīng)提議NF-κB抑制作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)治療干預(yù)的靶點(diǎn)。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，滑膜變成有侵入性的、腫瘤樣結(jié)構(gòu)(關(guān)節(jié)翳)，并且通常認(rèn)為程序性細(xì)胞死亡的消弱性調(diào)控是一種病因因素。在RA的動物模型中，動脈內(nèi)施用NF-κB誘餌在治療過的關(guān)節(jié)中以及在對側(cè)未治療的關(guān)節(jié)中防止鏈球菌細(xì)胞壁-誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的復(fù)發(fā)。已經(jīng)表明，脊髓NF-κB活化誘導(dǎo)COX-2上調(diào)和誘導(dǎo)炎性疼痛超敏性。炎性疼痛超敏性在急性和慢性疼痛病況中起作用。本發(fā)明的CPS/p50 NLS可以提供到受傷、手術(shù)、外傷和炎癥位點(diǎn)，以降低COX-2上調(diào)和疼痛超敏性。肽可以注射到動脈內(nèi)空間，或者可以通過來自儲蓄庫泵的導(dǎo)管而提供，所述泵位于體內(nèi)或體外。持續(xù)或者改進(jìn)釋放的組合物可以通過注射或泵而提供，或者可以結(jié)合到移植基質(zhì)中或者結(jié)合在炎癥位點(diǎn)附近。
已經(jīng)報(bào)道，NF-κB的抑制對移植組織或細(xì)胞諸如胰島細(xì)胞具有保護(hù)性作用。因此，具有CPS/p50 NLS序列與移植組織組合提供的本發(fā)明的肽提供了一種促進(jìn)細(xì)胞存活的方法。
已經(jīng)表明，通過過量表達(dá)IκBα或剪截的p65而抑制NF-κB活化減少了炎性反應(yīng)，并且保護(hù)器官免受異種移植的傷害。已經(jīng)提議抑制NF-κB活化有效地防止與局部缺血/再灌注、心臟病發(fā)作和中風(fēng)相關(guān)的組織損傷。
本發(fā)明還針對在細(xì)胞中諸如PCA細(xì)胞中抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白的誘導(dǎo)的和/或組成型活化的方法，例如，通過包括上文所述的功能性連接到NLS上的CPS的多肽進(jìn)行。本發(fā)明的方法提供了將NF-κB p50 NLS引入到人前列腺癌細(xì)胞內(nèi)部而抑制內(nèi)源NF-κB的核易位和活化的方法。所述方法包括向患者細(xì)胞內(nèi)部施用治療有效量的肽，其與治療有效量的至少一種化學(xué)治療劑組合施用，所述肽包括可操作地連接到促進(jìn)NF-κB核定位序列轉(zhuǎn)運(yùn)的肽上的NF-κB核定位序列或其功能片段。包括NF-κB核定位序列和促進(jìn)NF-κB NLS轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)部的肽的肽，可以包括，例如，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4或其組合。促進(jìn)NF-κB核定位序列轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)部的肽可以包括，例如，SEQ ID NO1，SEQ ID NO2或其組合。CPS/NF-κB NLS肽可以在施用至少一種化學(xué)治療劑之前、同時(shí)或之后而施用，并且施用的時(shí)間選擇可以取決于所選的施用途徑。
CPS/p50 NLS NF-κB抑制劑，或包括本發(fā)明所述的功能性連接到NF-κB核定位的抑制劑上的CPS的肽，諸如CB5003(SEQ ID NO3)，還可以用于具有相似的抗凋亡機(jī)制的癌細(xì)胞。在本發(fā)明中，本發(fā)明人表明，用CB5005(SEQ ID NO4)同時(shí)治療PCA細(xì)胞極大地減少了誘導(dǎo)人PCA細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡所需要的順鉑或依托泊苷的濃度，并且顯著地增加了所述化學(xué)治療劑的功效。此外，當(dāng)不存在其它化學(xué)治療劑以其自身用作化學(xué)治療劑時(shí)，CB5005(SEQ ID NO4)也可以在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡。
因此，本發(fā)明還提供了化學(xué)治療試劑盒或系統(tǒng)，所述化學(xué)治療試劑盒或系統(tǒng)包括治療有效量的至少一種肽試劑(其抑制NF-κB的抗凋亡作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞毀滅)或試劑組合，其包括與至少一種在腫瘤細(xì)胞中引發(fā)凋亡途徑的化學(xué)治療劑一起提供的至少一種肽試劑。這些可以以混合形式或以獨(dú)立的等分形式提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的試劑盒或系統(tǒng)包括CPS/p50 NLS或相似的肽，諸如例如，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4或其組合，以及至少一種化學(xué)治療劑。例如，化學(xué)治療劑可以包括TNF-α、順鉑、依托泊苷、或者當(dāng)施用給需要化學(xué)治療的患者特別是在診斷患有雄激素-不依賴性前列腺癌的患者中刺激程序性細(xì)胞死亡的其它藥劑。例如，CPS/p50 NLS肽可以包括SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸序列，或者賦予與其可操作地連接的肽的膜透過性的各種序列。這樣的序列還可以包括，例如，卡波西成纖維細(xì)胞生長因子的信號序列或在美國專利No.6,780,843中所述的膜易位序列。
根據(jù)本文所含的內(nèi)容，本發(fā)明提供的肽劑的治療有效量可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定，并且可以依據(jù)用來確定劑量水平的常見因素而不同，諸如年齡和重量，以及在給處方使用肽劑和化學(xué)治療劑組合的具體個(gè)體中依據(jù)腫瘤大小、腫瘤數(shù)目和腫瘤位置而不同。施用可以通過標(biāo)準(zhǔn)途徑進(jìn)行，諸如靜脈內(nèi)施用、腹膜內(nèi)施用、移植持續(xù)不變釋放的基質(zhì)、裝置或組合物、或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方式。
持續(xù)不變的釋放、改進(jìn)的釋放、或可控釋放組合物或裝置先前已經(jīng)描述過，并且可以為本發(fā)明所述的肽劑提供施用。例如，體內(nèi)泵可以用來施用所述肽劑，以及與所述肽劑組合施用的化學(xué)治療劑。也可以使用外部泵，特別是當(dāng)這樣的泵可操作地與用于將肽劑遞送到患者循環(huán)系統(tǒng)或患者組織的靶點(diǎn)位點(diǎn)的導(dǎo)管相連時(shí)。對于位于或者在皮膚表面附近的腫瘤，還可以應(yīng)用透皮遞送?？梢允褂帽疚乃龅碾牡撵o脈內(nèi)施用或者用于本文所述方法的肽的靜脈內(nèi)施用?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)針頭/注射器注射肽組合物。例如，注射可以皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)提供。
本發(fā)明的CPS的增加的膜透過性還提供了遞送活性劑(其包括，例如肽、蛋白、DNA、RNA、反義寡核苷酸、核酶、或它們的組合)通過一個(gè)或多個(gè)組織以輔助藥物遞送的更有效的藥劑。在美國專利號6,780,846(Elan Corporation，PLC)中描述了應(yīng)用膜易位肽提供藥物遞送系統(tǒng)的應(yīng)用。藥物組合物諸如肽、蛋白、激素、止痛劑、螯合劑、細(xì)胞內(nèi)代謝的調(diào)控劑、細(xì)胞-細(xì)胞信號傳導(dǎo)的調(diào)控劑等可以通過附著到本發(fā)明的CPS上而提供。附著可以通過下列各項(xiàng)實(shí)現(xiàn)合成CPS/活性劑貨物組合分子，將貨物分子化學(xué)附著到CPS上，在細(xì)胞的或沒有細(xì)胞的重組DNA表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)CPS/活性劑貨物組合物分子，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法。CPS/活性劑分子可以與本領(lǐng)域先前所述的各種試劑組合或者通過其遞送，諸如例如，微粒、微球(nanospheres)、脂質(zhì)體、微球體(microspheres)、膠囊、乳劑和/或微團(tuán)。通常包括肽或目標(biāo)生物體DNA序列，激素諸如例如胰島素、生長素、雌二醇和睪酮，化學(xué)治療劑，抗高血壓劑以及其它活性劑的疫苗，可以通過包括本發(fā)明的CPS的藥物遞送系統(tǒng)遞送。遞送途徑可以包括靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、口服、鼻腔(例如通過滴入或吸入)、局部或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方式。例如，包括本發(fā)明的CPS/活性劑分子的組合物可以進(jìn)行局部施用，以輔助皮膚癌、皮膚疾病、燒傷和慢性創(chuàng)傷的治療。
本發(fā)明將通過下述非限制性實(shí)例的方式進(jìn)一步描述。
實(shí)施例設(shè)計(jì)并合成CPS功能性肽肽通過常規(guī)固相肽合成方法(Celtek Bioscience，Nashville，TN)合成。應(yīng)用基于Fmoc化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)合成流程。合成后，將未加工的肽從固體支持物上切下，并且通過C18反相HPLC純化。通過分析性HPLC分析和質(zhì)譜分析特征性描述純化的肽。
對于生物檢測，在作為稀釋劑的PBS(2mg/ml)或DMSO(30mg/ml)中制備肽儲液。DMSO在培養(yǎng)基中的終濃度不超過0.1％。
將NF-κB p50蛋白的核定位序列(NLS)用作功能性貨物，并且將細(xì)胞-透過性序列(CPS)用作載體。合成CPS/NLS的合成肽，以使CPS位于NLS的N端(
圖1)。對于多肽CB5003(SEQ ID NO3)，具有包括CPS的SEQ IDNO1。對于多肽CB5005(SEQ ID NO4)，具有包括CPS的SEQ ID NO2。CB5002(SEQ ID NO5)包含位于NLS N端的突變的、非功能性的CPS。CB5007(SEQ ID NO6)含有位于CPS C端的突變的、非功能性的NLS。
細(xì)胞系人前列腺癌DU145和LNCaP細(xì)胞系獲得于美國典型培養(yǎng)物收藏中心(ATCC，Rockville，MD)。人前列腺癌PC3細(xì)胞系由Huntington MedicalResearch Institutes，Pasadena，CA的Dr.Lawrence Jones友好饋贈。所有3種細(xì)胞系都保持在補(bǔ)充了10％胎牛血清、50單位/ml青霉素、50μg/ml鏈霉素和1mM丙酮酸鈉的RPMI 1640中。對于LNCaP細(xì)胞，還補(bǔ)充了10mMHEPES和4.5g/L葡萄糖。N2a成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞系由University of SouthernMississippi，Hattiesburg，Mississippi USA的Dr.Yuan Luo友好饋贈。N2a細(xì)胞保持在補(bǔ)充了5％胎牛血清的50％DMEM/50％Opti-MEM中。細(xì)胞系在37℃5％CO2濕潤的氛圍中生長。
用于檢測肽細(xì)胞輸入的間接免疫熒光檢測將DU145細(xì)胞在8孔腔式載玻片(Nunc，Naperville，IL)上生長到80％匯合。然后，將這些細(xì)胞在37℃與稀釋劑或在沒有血清的RPMI中的不同濃度的肽溫育1h。將細(xì)胞用冰冷的PBS洗滌3次，以去除細(xì)胞外的肽，并且然后用在PBS中的3.5％低聚甲醛溶液在4℃固定20min。將固定的細(xì)胞用冰冷的PBS洗滌3次，并且用0.25％Triton X-100處理10min。然后，將洗滌的細(xì)胞與在PBS中的抗肽IgG一起溫育1h。用PBS洗滌3次，每次洗滌5min，之后，使用FITC-標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Pierce，Rockford，IL)在溫育1h后，隨后檢測胞內(nèi)肽(通過肽-抗體復(fù)合物)。將具有染色細(xì)胞的蓋玻片封固在Poly/Mount(Polysciences，Warrington，PA)中，并且使用100×油浸鏡頭用Microstar IV(Reichard，Buffalo，NY)進(jìn)行分析。使用Pixera數(shù)碼相機(jī)分析彩色成像，并且以JPG格式保存。對于在其它細(xì)胞系包括PC3、LNCaP和成神經(jīng)細(xì)胞瘤N2a細(xì)胞中確定肽的細(xì)胞輸入，也應(yīng)用了相同的檢測法。
CB5005(SEQ ID NO4)肽的細(xì)胞輸入通過熒光顯微鏡分析檢測免疫熒光檢測中的熒光信號，而檢驗(yàn)CB5005(SEQ ID NO4)，CB5003(SEQ ID NO3)，CB5002(SEQ ID NO5)，和CB5007(SEQ ID NO6)肽在不同細(xì)胞系中的細(xì)胞內(nèi)輸入活性。如在圖2中所示，CB5005(SEQ ID NO4)對于檢測的所有細(xì)胞系包括DU145和PC3癌細(xì)胞、雄激素-依賴性LNCaP癌細(xì)胞和成神經(jīng)細(xì)胞瘤N2a細(xì)胞都是細(xì)胞-透過性的。
CB5005(SEQ ID NO4)的細(xì)胞輸入也是濃度-依賴性的。然而，CB5003(SEQ ID NO3)表現(xiàn)出弱得多的輸入活性，而CB5002在這種細(xì)胞輸入檢測中是沒有活性的。由于這兩種肽共有相同的CPS，所以CB5007表現(xiàn)出同CB5005(SEQ ID NO4)相似的輸入活性。
這種間接的免疫熒光檢測還用來定量肽的細(xì)胞輸入。簡要地，將在96孔平板上生長的細(xì)胞用肽處理不同的時(shí)間階段，然后使用上文所述的抗肽抗體和FITC-標(biāo)記的抗兔抗體進(jìn)行間接的免疫熒光檢測。然后，將細(xì)胞用10％SDS裂解，并且通過CytofluorTM2300讀數(shù)儀(Millipore)在485/560nm處定量可溶細(xì)胞溶液中的熒光。熒光讀數(shù)通過從肽-未處理樣品的背景讀數(shù)中減去所述熒光而計(jì)算。數(shù)據(jù)表示為在一式四份樣品中進(jìn)行的3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。通過使用這種定量法，研究輸入的CB5005肽(SEQ IDNO4)的動力學(xué)。觀察到時(shí)間-依賴型熒光累積(628.00±75.60(1h)，737.33±37.10(4h)，和1,042±58.40(20h))，這表明CB5005肽(SEQ ID NO4)在胞內(nèi)區(qū)室中的相對穩(wěn)定性，CB5005肽由抗肽抗體識別。
核提取物的蛋白質(zhì)印跡分析將PCA細(xì)胞在60-mm盤中生長至70-80％匯合。將細(xì)胞與不同濃度的肽在37℃溫育30min，然后在37℃用TNF-α(10ng/ml)再處理1h，如指示那樣，或者只與肽一起溫育16個(gè)小時(shí)。處理后，將細(xì)胞用冰冷的PBS洗滌，并且在冰上在500ml緩沖液A(10mM HEPES，pH7.9，10mM KCl，0.1mMEDTA，0.1mM EGTA，0.4％乙基苯基聚乙二醇，1mM DTT，0.5mM PMSF和1mg/ml每種亮肽素、抑肽酶、胃酶抑素、抑糜蛋白酶素和止痛劑)中裂解10min。通過高速離心而沉淀核，并且將核用500ml緩沖液A洗滌。然后，將核重懸在40ml緩沖液B(20mM HEPES，pH7.9，400mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM DTT，1mM PMSF和1mg/ml每種亮肽素、抑肽酶、胃酶抑素、抑糜蛋白酶素和止痛劑)中。使用Pierce BCA蛋白檢測法確定核提取物的蛋白濃度，并且使用緩沖液B使得樣品間濃度相等。
將等量的蛋白在2x SDS樣品上樣緩沖液中在100℃熱處理5分鐘，并且通過10％SDS聚丙烯酰胺電泳分離。將蛋白轉(zhuǎn)移到硝基纖維素紙上。用在TBS(10mM Tris-HCl，pH7.6，70mM NaCl和0.05％Tween 20)中的5％脫脂奶粉封閉30分鐘后，通過使用抗-p50 IgG抗體(1∶5000)，(Upstate，LakePlacid，NY)而檢測核NFκB p50。通過使用制造者流程中所述的ECL蛋白質(zhì)印跡系統(tǒng)(Pierce，Rockford，IL)，用辣根過氧化物酶-偶聯(lián)的二級抗體顯現(xiàn)一級抗體。
抑制NF-κB核易位和在人前列腺癌細(xì)胞中的活化DU145是一種表現(xiàn)組成型NF-κB活化的雄激素-不依賴性前列腺癌細(xì)胞系，所述NF-κB活化可以通過TNF-α處理而進(jìn)一步增強(qiáng)。一種雄激素-依賴性細(xì)胞系LNCaP沒有表現(xiàn)出組成型NF-κB活化，但是NF-κB活化可以由TNF-α處理而刺激。NF-κB活化通常導(dǎo)致其快速地輸入到核內(nèi)。因此，在核提取物中的NF-κB蛋白質(zhì)印跡分析用來評估NF-κB活化的程度。相對于對照，在DU145(圖3a)和LNCaP兩種細(xì)胞中，功能性連接到NF-κB p50NLS上的CB5005(SEQ ID NO4)和CB5003(SEQ ID NO3)抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB核易位。具有突變NLS的對照肽CB5007(SEQ ID NO6)在每種細(xì)胞系中都沒有抑制作用。CB5005(SEQ ID NO4)也抑制NF-κB的組成型活化(圖3b)。
通過使用特異的NF-κB p50抗體進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)而測定NF-κB與編碼κB識別位點(diǎn)的雙鏈寡核苷酸的結(jié)合，而量化這些肽對前列腺癌細(xì)胞中NF-κB功能性活性的抑制作用。相對于肽-未處理的細(xì)胞，來自肽-預(yù)處理DU145細(xì)胞的核提取物表現(xiàn)出顯著更低的NF-κB結(jié)合活性，這證實(shí)這些肽在DU145細(xì)胞中抑制TNF-α誘導(dǎo)的和組成型NF-κB核易位。
熒光顯微鏡將DU145細(xì)胞在4孔腔式載玻片上生長到70-80％匯合。然后，在37℃，將細(xì)胞用CB5005肽(SEQ ID NO4)(30μM)或稀釋劑處理30min，然后用順鉑(5μg/ml)再處理5h。處理后，將細(xì)胞用結(jié)合緩沖液洗滌，并且按照制造者流程(BD Biosciences，San Diego，CA)建議的那樣，在室溫下在暗處在含有膜聯(lián)蛋白V-FITC和碘化丙錠(PI)的結(jié)合緩沖液中重懸15min。將腔式載玻片在Poly/mount(Polysciences，Warrington，PA)中封固，并且使用×100油浸鏡頭用熒光顯微鏡(Microstar IV，Reichard，Buffalo，NY)進(jìn)行分析。彩色成像用Pixera數(shù)碼相機(jī)分析，并且以JPG格式保存。
TUNEL檢測將DU145細(xì)胞在8孔腔式載玻片上生長到70-80％匯合。然后將細(xì)胞用不同濃度的肽或稀釋劑在37℃溫育30min，然后用順鉑(5μg/ml)或稀釋劑再處理16h。將細(xì)胞在空氣中干燥，并且在室溫下在4％低聚甲醛中固定1h。然后用PBS洗滌細(xì)胞，并且在冰上用滲透性溶液(0.1％Triton X-100，在0.1％檸檬酸鈉中)滲透2min。按照制造者的用法指導(dǎo)使用TUNEL方法“原位細(xì)胞死亡檢測”(Roche，Indianapolis，IN)，檢測程序性細(xì)胞死亡。在×40放大下，通過使用抗熒光素抗體綴合的POD(過氧化物酶)，在光學(xué)顯微鏡(Microstar IV，Reichard，Buffalo，NY)下，顯現(xiàn)由于程序性細(xì)胞死亡引起的熒光-標(biāo)記的DNA鏈裂口。成像使用Pixera數(shù)碼相機(jī)進(jìn)行分析。
流式細(xì)胞分析將PCA細(xì)胞在60-mm盤上生長至50-60％匯合。將這些細(xì)胞用不同濃度的肽在37℃溫育30min，然后用TNF-α(10ng/ml)、順鉑(2-30μg/ml)、依托泊苷(2-20μg/ml)或稀釋劑在37℃再溫育21h。通過它們結(jié)合膜聯(lián)蛋白V的能力而測定在凋亡細(xì)胞上暴露的磷脂酰絲氨酸。具體地，將細(xì)胞通過胰蛋白酶消化收集。將胰蛋白酶化的細(xì)胞、培養(yǎng)基和PBS洗液組合在一起，并且通過離心收集細(xì)胞。將收集的細(xì)胞用結(jié)合緩沖液洗滌，并且按照制造者流程(BD Biosciences，San Diego，CA)所建議那樣，在室溫在暗處在70ml含有膜聯(lián)蛋白V-FITC和PI的結(jié)合緩沖液中重懸15min。染色的細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。對于每種樣品測定最少20,000個(gè)事件。
CB5005 (SEQ ID NO4)肽對誘導(dǎo)雄激素-不依賴性PCA細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡以及化學(xué)治療劑殺傷這些癌細(xì)胞的敏感性和增強(qiáng)性的作用CB5005(SEQ ID NO4)肽劑與順鉑一起用來處理雄激素-不依賴性DU145細(xì)胞。在不存在CB5005(SEQ ID NO4)時(shí)，順鉑(5μg/ml)在誘導(dǎo)DU145的程序性細(xì)胞死亡中無效，這通過基于膜聯(lián)蛋白V/PI的熒光顯微鏡分析而確定(圖4)，其中程序性細(xì)胞死亡的早期階段可以通過從凋亡細(xì)胞內(nèi)部釋放的在細(xì)胞膜外部的膜聯(lián)蛋白V-FITC-結(jié)合的磷脂酰絲氨酸(PS)而檢測。然而，當(dāng)DU145細(xì)胞用CB5005(SEQ ID NO4)肽和順鉑共同處理時(shí)，誘導(dǎo)了程序性細(xì)胞死亡，這通過強(qiáng)烈的膜聯(lián)蛋白V-FITC染色而證明(圖4)。CB5005(SEQ ID NO4)的這種協(xié)同活性得到不同的程序性細(xì)胞死亡檢測——TUNEL檢測的證實(shí)，TUNEL檢測優(yōu)先標(biāo)記在程序性細(xì)胞死亡過程中產(chǎn)生的DNA鏈裂口(圖5)。CB5005(SEQ ID NO4)的這種敏化活性是濃度依賴性的，在20μM濃度達(dá)到最大(圖5)。有趣地，用單獨(dú)的CB5005(SEQID NO4)處理細(xì)胞也誘導(dǎo)了低水平的程序性細(xì)胞死亡，這表明組成型NF-κB活化負(fù)責(zé)維持DU145腫瘤細(xì)胞的生長(圖5)。CB5003(SEQ ID NO3)，但不是CB5002(SEQ ID NO5)也不是CB5007(SEQ ID NO6)，也是有活性的，盡管與CB5005(SEQ ID NO4)相比是低得多的水平(圖6)。這些結(jié)果綜合起來表明CB5005(SEQ ID NO4)是一種能夠使得雄激素-不依賴性前列腺癌DU145細(xì)胞對抗癌藥物的殺傷性敏感的有效藥劑。
CB5005(SEQ ID NO4)使得晚期前列腺癌DU145細(xì)胞對順鉑殺傷性敏感的能力通過流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞的膜聯(lián)蛋白V/PI標(biāo)記水平而定量。將DU145細(xì)胞用單獨(dú)的順鉑、單獨(dú)的CB5005 (SEQ ID NO4)處理，或者用CB5005(SEQ ID NO4)和順鉑共同處理(圖7)。盡管順鉑處理(5μg/ml)是無效的，并且CB5005(SEQ ID NO4)處理(30μM)是部分有效的，但是這兩種藥劑的共同處理顯著地誘導(dǎo)了DU145癌細(xì)胞中的程序性細(xì)胞死亡(圖7)。此外，CB5003(SEQ ID NO3)是有活性的，但是與CB5005(SEQ IDNO4)相比活性在小得多的程度上(圖8)。CB5002(SEQ ID NO5)，一種CB5003(SEQ ID NO3)的對照肽，在這些基于程序性細(xì)胞死亡的實(shí)驗(yàn)中沒有表現(xiàn)出顯著的作用(圖8)。最后，CB5005(SEQ ID NO4)還能夠使得DU145細(xì)胞對TNFα誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡敏感(圖9)。
CB5005 (SEQ ID NO4)或CB5003(SEQ ID NO3)在增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡中的協(xié)同活性是濃度依賴性的(
圖10a)。與只用順鉑處理的那些癌細(xì)胞相比，在CB5005(SEQ ID NO4)/順鉑的情形中，30μMCB5005 (SEQ ID NO4)的共同處理在DU145細(xì)胞中刺激了大約15倍增加的程序性細(xì)胞死亡。當(dāng)順鉑劑量從5μg/ml減少到2μg/ml時(shí)，CB5005(SEQID NO4)肽的這種協(xié)同活性沒有很大地改變(
圖10b)。有趣地，單獨(dú)的CB5005(SEQ ID NO4)處理(無順鉑)在刺激這些腫瘤細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡中也是相當(dāng)有活性的(
圖10b)。
使用依托泊苷，晚期PCA細(xì)胞對其表現(xiàn)出抗性的另一種抗癌藥物，觀察到甚至更大的CB5005(SEQ ID NO4)協(xié)同活性(
圖11)。通過對用依托泊苷(2μg/ml)和CB5005(SEQ ID NO4)(30μM)共同處理21h的DU145細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析，檢測到高百分?jǐn)?shù)的凋亡細(xì)胞(幾乎達(dá)60％)(
圖11)。
綜合來看，這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)清楚地證明，與高劑量(20-30μg/ml)單獨(dú)使用這些抗癌藥物處理相比，用CB5005(SEQ ID NO4)和順鉑或依托泊苷(2μg/ml)共同處理DU145細(xì)胞在誘導(dǎo)PCA細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡中有效得多。
體外細(xì)胞毒性檢測將LNCaP，DU145，PC3或成神經(jīng)細(xì)胞瘤N2a細(xì)胞在96孔平板上生長至60％匯合。在總體積為100μl無血清的RPMI中在37℃一式四份進(jìn)行用不同濃度的肽處理24h。然后洗滌所述細(xì)胞，并且在37℃用100μl含有20μlCellTiter 96 AQueous Solution試劑(Promega，Madison，WI)的無RPMI的酚紅溫育1h。使用微量平板自動讀數(shù)儀EL 309(Bio-Tek Instruments，Winooski，VT)讀取490nm處的每個(gè)孔的吸收。所述吸收直接反映了活細(xì)胞數(shù)目。從所有數(shù)據(jù)中減去空白。然后，使用Prism軟件(GraphPad SoftwareInc.，San Diego，CA)分析所述數(shù)據(jù)，并且將其表示為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SE。通過單向ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，并且如果p＜0.05認(rèn)為是顯著的。
CB5005’s(SEQ ID NO4)對雄激素-不依賴性PCA細(xì)胞協(xié)同活性的特異性為了確定CB5005(SEQ ID NO4)誘導(dǎo)PCA細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的活性是否對雄激素-不依賴性細(xì)胞特異，本發(fā)明人檢驗(yàn)了這種肽對雄激素-依賴性LNCaP細(xì)胞的作用，所述LNCaP細(xì)胞不表現(xiàn)組成型NF-κB活化。如在
圖12a中所示，CB5005(SEQ ID NO4)使得雄激素-不依賴性PC3細(xì)胞對依托泊苷-誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡敏感，但是沒有使得雄激素-依賴性LNCaP細(xì)胞對依托泊苷的促凋亡作用敏感。MTS細(xì)胞毒性檢測的結(jié)果也表明，CB5005(SEQ ID NO4)對于LNCaP細(xì)胞是沒有毒性的(
圖12b)。此外，所述結(jié)果表明，CB5005肽(SEQ ID NO4)處理沒有導(dǎo)致對成神經(jīng)細(xì)胞瘤N2a細(xì)胞的毒性(
圖12b)。綜合看來，所述結(jié)果表明，CB5005的促凋亡活性是針對特征在于組成型NF-κB活化的雄激素-不依賴性前列腺癌細(xì)胞特異的。
熒光分光光度法胱天蛋白酶3定量將PC3細(xì)胞在60-mm盤上生長至90％匯合。然后，將細(xì)胞在37℃用CB5005(SEQ ID NO4)處理30min，之后用依托泊苷(5μg/ml)或稀釋劑處理16h。處理后，將細(xì)胞通過胰蛋白酶消化而收集。將胰蛋白酶化的細(xì)胞、培養(yǎng)基和PBS組合在一起，并且通過離心收集細(xì)胞。將收集的細(xì)胞在冰上在胱天蛋白酶3緩沖液(20mM Tris-HCl，pH7.2，150mM NaCl，1％Triton X-100，1mM DTT)中裂解30min。將等量的蛋白在室溫下用2×胱天蛋白酶反應(yīng)緩沖液(100mM HEPES，pH7.5，10％蔗糖，0.1％CHAPS，0.2％BSA，新鮮添加10mM二硫蘇糖醇和作為底物的50μM Asp-Glu-Val-Asp氨基甲基香豆素(DEVD-AMC))溫育。樣品在380nm處激發(fā)，并且在Cytofluor2300(Millipore，Bedford，MA)中在460nm處讀取。相對熒光通過從樣品熒光中減去空白熒光(只有緩沖液加上底物)而計(jì)算。
數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM。通過斯氏t檢驗(yàn)而進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，并且如果p＜0.05認(rèn)為是顯著的。
胱天蛋白酶-3參與CB5005-誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡當(dāng)用CB5005(SEQ ID NO4)和依托泊苷處理時(shí)，PC3細(xì)胞中，胱天蛋白酶-3活性升高了(
圖13)，這表明CB5005(SEQ ID NO4)在PCA細(xì)胞中的促凋亡作用包括效應(yīng)子胱天蛋白酶-3的作用。
在增強(qiáng)由細(xì)胞毒性藥劑誘導(dǎo)的PCA細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡方面，CB5005(SEQ ID NO4)比SN50更有效。
SN50，一種目前用于許多科學(xué)研究的商購26-mer肽，已經(jīng)在許多類型的細(xì)胞中表現(xiàn)出抑制NF-κB核易位的功效。在程序性細(xì)胞死亡檢測中，諸如TUNEL檢測(其優(yōu)先標(biāo)記在程序性細(xì)胞死亡過程中產(chǎn)生的DNA鏈裂口)和流式細(xì)胞術(shù)分析(其定量地測定膜聯(lián)蛋白V/PI標(biāo)記的凋亡細(xì)胞的水平，如
圖15所示)，本發(fā)明人逐一進(jìn)行了CB5005肽(SEQ ID NO4)與SN50的比較。在這兩種檢測中，在促進(jìn)順鉑-誘導(dǎo)的雄激素-不敏感PCA細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡中，CB5005(SEQ ID NO4)表現(xiàn)出比SN50顯著更強(qiáng)的活性。
CB5005(SEQ ID NO4)表現(xiàn)出比SN50更高的細(xì)胞輸入活性為了確定CB5005肽(SEQ ID NO4)在PCA細(xì)胞中更高的凋亡活性是否至少部分是由于它的更高的細(xì)胞膜-易位活性，在使用間接免疫熒光檢測的細(xì)胞輸入研究中，本發(fā)明人逐一進(jìn)行了CB5005肽(SEQ ID NO4)與公知的細(xì)胞透過性SN50肽的比較。如在
圖16中所示，CB5005(SEQ ID NO4)表現(xiàn)出比SN50肽顯著更高的輸入活性。
序列表<110>切爾泰克生物科學(xué)有限公司林耀忠克勞迪亞布杜<120>增加癌細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的組合物和方法Cells<130>CB001<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>6<212>PRT<213>合成的肽<220>
<221>肽<222>(1)..(6)<400>1Leu Ala Leu Ala Leu Ala1 5<210>2<211>11<212>PRT<213>合成的肽<220>
<221>肽<222>(1)..(11)<400>2Lys Leu Lys Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala1 5 10<210>3<211>16<212>PRT<213>合成的肽<220>
<221>肽<222>(1)..(16)<400>3Leu Ala Leu Ala Leu Ala Val Gln Arg Lys Arg Gln Lys Leu Met Pro1 5 10 15
CB001<210>47<211>21<212>PRT<213>合成的肽<220>
<221>肽<222>(1)..(21)<400>4Lys Leu Lys Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Val Gln Arg Lys Arg1 5 10 15Gln Lys Leu Met Pro20<210>5<211>16<212>PRT<213>合成的肽<220>
<221>肽<222>(1)..(16)<400>5Leu Ala Leu Leu Ala Pro Val Gln Arg Lys Arg Gln Lys Leu Met Pro1 5 10 15<210>6<211>21<212>PRT<213>合成的肽<220>
<221>肽<222>(1)..(21)<400>6Lys Leu Lys Leu Ala Leu Ala Leu Ala Leu Ala Val Gln Arg Asn Gly1 5 10 15Gln Lys Leu Met Pro20
權(quán)利要求
1.一種多肽，其包括a)大約6-大約50個(gè)殘基的細(xì)胞透過性肽，其包括至少SEQ ID NO1的6個(gè)連續(xù)殘基，和b)NF-κB核定位序列。
2.權(quán)利要求1的多肽，其中所述NF-κB核定位序列包括NF-κB p50。
3.一種多肽，其包括a)大約11-大約50個(gè)殘基的細(xì)胞透過性肽，其包括至少SEQ ID NO2的11個(gè)連續(xù)殘基，和b)NF-κB核定位序列。
4.權(quán)利要求2的多肽，其中所述NF-κB核定位序列包括NF-κB p50。
5.一種大約11-大約50個(gè)氨基酸的細(xì)胞透過性肽，其包括SEQ ID NO2。
6.一種大約11-大約50個(gè)氨基酸的細(xì)胞透過性肽，其包括SEQ ID NO1。
7.一種抑制細(xì)胞中NF-κB核易位的方法，其包括給細(xì)胞施用有效量的包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4或其組合的肽。
8.一種用于與組成型NF-κB活化相關(guān)的癌癥的治療系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括治療有效量的a)包括SEQ ID NO3，SEQ ID NO4或其組合的肽，和b)在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的化學(xué)治療劑。
9.權(quán)利要求8的化學(xué)治療系統(tǒng)，其中所述化學(xué)治療劑包括依托泊苷或順鉑。
10.一種用于治療雄激素-不依賴性前列腺癌的方法，所述方法包括給需要其的受試者施用治療有效量的至少一種抑制癌細(xì)胞中NF-κB組成型活化的肽，與化學(xué)治療劑一起施用。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述至少一種肽包括SEQ ID NO3，SEQ IDNO4，SN50或它們的組合。
全文摘要
本發(fā)明提供在癌細(xì)胞中抑制抗凋亡過程促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡的細(xì)胞透過性肽和肽劑，以及提供治療性癌癥治療的方法。組合物可以與常規(guī)化學(xué)治療劑組合遞送，以提供顯著增加所述化學(xué)治療劑破壞癌細(xì)胞的功效的協(xié)同作用。本發(fā)明還提供用于癌癥治療的試劑盒或系統(tǒng)，其包括至少一種抑制NF－κB抗凋亡作用的肽劑，和至少一種刺激細(xì)胞凋亡途徑的化學(xué)治療劑。
文檔編號A01N37/18GK101090730SQ200580038257
公開日2007年12月19日 申請日期2005年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月9日
發(fā)明者林耀忠, 克勞迪亞·布杜 申請人:切爾泰克生物科學(xué)有限公司