專利名稱：乳癌的生物標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的生物標(biāo)記及生物標(biāo)記的組合，該等生物標(biāo)記及組合是對(duì)于鑒定患者乳癌的狀態(tài)是有用的。明確言之，本發(fā)明的生物標(biāo)記是對(duì)將受試者的樣品分類成乳癌或非乳癌。
背景技術(shù)：
根據(jù)美國國家癌癥研究所(NCI)的發(fā)病資料和美國國家衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)中心(NCHS)的致死資料，美國癌癥協(xié)會(huì)估計(jì)，2002年在美國的婦女之中乳癌是最普遍被診斷出的癌癥種類。預(yù)計(jì)在所有婦女之中占所有新癌癥病例的百分之31(203，500)，且將有39,600人死于這種疾病。JemalA，Thomas A，Murray T，Thun M.Cancer Statistics，2002.CA CancerJ Clin.2002；5223-47。以癥狀前的篩選(presymptomaticscreening)，在當(dāng)癌癥在仍具相當(dāng)?shù)闹斡鷿摿Φ脑缙陔A段偵查出癌癥，可大幅地減少與乳癌相關(guān)的死亡率。不幸地，只有大約50％乳癌在診斷時(shí)被定位。美國國家癌癥研究所癌癥信息數(shù)據(jù)庫(Cancer Net PDQCancer Information Summaries)?！叭榘┖Y檢(Screening for breastcancer)″的專題論文。http://cancer net.nci.nih.gov/pdq.html(2001年1月更新)。盡管乳房攝影(mammography)對(duì)40歲及以上的婦女是可行且推薦使用的例行性篩檢方法，乳房攝影在于降低整個(gè)人口因罹患乳癌致死率的效能仍有待研究。K.Antman等人，JAMA.1999；2811470-2。目前，已被研究用于乳癌檢測的血清腫瘤標(biāo)記仍然缺乏足以適用于在大量人口癌病變的早期檢測的敏感性及專一性。FDA認(rèn)可的腫瘤標(biāo)記譬如CA15.3及CA27.29，僅推薦于晚期乳癌或復(fù)發(fā)的治療追蹤之用。D.W.Chan等人，J Clin.Oncology。1997；152322-2328。新的生物標(biāo)記能個(gè)別地使用或與現(xiàn)有的模態(tài)(modality)組合使用，以針對(duì)乳癌進(jìn)行符合成本效益的篩選仍是迫切地需要。

發(fā)明內(nèi)容
在一方面，本發(fā)明提供在受試體鑒定乳癌狀態(tài)(qualify breastcancer)的方法，該方法包含受試體中的生物樣品至少利用一種生物標(biāo)記測量，于此處至少一種生物標(biāo)記從下列的生物標(biāo)記群組中挑選出來包括ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-Ib)、C3a-desArgΔ8，及C3a-desArg，且與乳癌相關(guān)狀態(tài)測量相關(guān)。在一具體實(shí)例，方法包含測量以下各者ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC 1b)、C3a-desArgΔ8，及C3a-desArg。在其它具體實(shí)例，方法更進(jìn)一步的包含測量CA15-3。
在一個(gè)具體實(shí)例，至少一種生物標(biāo)記是由SELDI探針的吸附物表面上捕捉生物標(biāo)記測得且該所捕捉的生物標(biāo)記是通過激光解吸離子化質(zhì)譜分析技術(shù)(laser desorption-ionization mass spectrometry)所檢測。在另外的具體實(shí)例，至少一種生物標(biāo)記由免疫測定所測量的，例如，使用對(duì)于至少一種生物標(biāo)記有專一性的抗體。在優(yōu)選的具體實(shí)例，至少一種生物標(biāo)記是使用除了質(zhì)譜之外的方法檢測。在另一優(yōu)選的具體實(shí)例，樣品是血清。在又一優(yōu)選的具體實(shí)例中，關(guān)聯(lián)性的聯(lián)系是由軟件分類算法所執(zhí)行。
在一個(gè)具體實(shí)例中，乳癌狀態(tài)是選自乳癌或非乳癌。在另一具體實(shí)例，乳癌狀態(tài)是選自非浸潤性乳癌或浸潤性乳癌。
在進(jìn)一步的具體實(shí)例，本方法包含根據(jù)乳癌狀態(tài)來管理受試者的治療。
在優(yōu)選的具體實(shí)例，吸附物是IMAC-Ni吸附物。在另一優(yōu)選的具體實(shí)例，吸附物是生物專一性的吸附物(例如，抗體)。
在另一具體實(shí)例，如果測量與乳癌有關(guān)，則本方法可進(jìn)一步包含管理受試者的治療，其包括對(duì)該受試者投藥化學(xué)治療劑或?qū)υ撌茉囌哌M(jìn)行輻射。在又另一具體實(shí)例中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包含在受試者的治療管理之后測量至少一種生物標(biāo)記并聯(lián)系該等測量與疾病進(jìn)程的關(guān)聯(lián)性。
在另一具體實(shí)例中，本發(fā)明的方法包含在得自受試者的樣品中測量至少一種生物標(biāo)記，其中至少一種生物標(biāo)記是選自由下列生物標(biāo)記所組成的組群ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8，和C3a-desArg。在一個(gè)具體實(shí)例中，本方法包含測量以下各個(gè)生物標(biāo)記IITIH4片段1(BC-1)、IITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8，及C3a-desArg。在另一具體實(shí)例，本方法更進(jìn)一步包含測量CA15-3。
在一個(gè)具體實(shí)例，生物標(biāo)記是由SELDI探針的吸附物表面上捕捉生物標(biāo)記測得且該所捕捉的生物標(biāo)記是通過激光解吸離子化質(zhì)譜分析技術(shù)所檢測。在優(yōu)選的具體實(shí)例，樣品是血清。在其它的具體實(shí)例中，吸附物是IMAC-Ni吸附物。在優(yōu)選的具體實(shí)例中，吸附是生物專一性的吸附物(例如，抗體)。
在另一具體實(shí)例中，本發(fā)明提供的試劑盒包括其上附接有至少一種捕捉劑的固態(tài)支持體，其中該捕捉試劑結(jié)合至少一種得自第一群組的生物標(biāo)記，第一組群由下列者所組成ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8，及C3a-desArg；及使用固態(tài)支持體以檢測至少一種生物標(biāo)記的說明書。在一個(gè)具體實(shí)例，本試劑盒包括使用該固態(tài)支持體檢測選自由下列者所組成的組群的生物標(biāo)記的說明書ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8或C3a-desArg。在另一具體實(shí)例，本試劑盒提供使用固態(tài)支持體以檢測CA15-3的說明書。
在一個(gè)具體實(shí)例，本試劑盒所提供包含捕捉試劑的固態(tài)支持體為SELDI探針。在其它的具體實(shí)例中，該捕捉試劑是抗體。
在其它的具體實(shí)例，本試劑盒進(jìn)一步的包含含有至少一種下列生物標(biāo)記的容器ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8，及C3a-desArg。在其它的具體實(shí)例，本試劑盒進(jìn)一步包含IMAC-Ni層析吸附物。
在另一具體實(shí)例中，本發(fā)明提供的試劑盒包括其上附接有至少一種捕捉劑的固態(tài)支持體，其中該捕捉試劑結(jié)合至少一種選自由下列生物標(biāo)記所組成的組群ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8，及C3a-desArg；及含有至少一種生物標(biāo)記的容器。在一個(gè)具體實(shí)例中，容器含有下列各個(gè)生物標(biāo)記ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8，及C3a-desArg。在又一具體實(shí)例，該容器含有CA15-3。
在一個(gè)具體實(shí)例中，包含捕捉試劑的固態(tài)支撐體為SELDI探針。在又一具體實(shí)例中，本試劑盒包含IMAC-Ni層析吸附物。
在另一具體實(shí)例中，本發(fā)明提供一種軟件產(chǎn)品包含存取歸因于樣品的數(shù)據(jù)的程序代碼，所述的數(shù)據(jù)包括在樣品中的至少一種生物標(biāo)記的測量結(jié)果，該生物標(biāo)記是選自由下列生物標(biāo)記所組成的組群ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8，及C3a-desArg；以及運(yùn)算分類算法的程序代碼，所述的分類算法以測量結(jié)果的函數(shù)來分類乳癌的狀態(tài)。在另一具體實(shí)例，所述分類算法以選自下列生物標(biāo)記的測量結(jié)果的函數(shù)來分類乳癌的狀態(tài)ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8，及C3a-desArg。在另一具體實(shí)例中，所述分類算法以下列各個(gè)生物標(biāo)記的測量結(jié)果的函數(shù)來分類乳癌的狀態(tài)ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8，及C3a-desArg。在另一具體實(shí)例中，所述分類算法以CA15-3的測量結(jié)果的函數(shù)來分類乳癌的狀態(tài)。
在另一具體實(shí)例中，本發(fā)明提供選自由下列各者所組成組群的生物標(biāo)記的純化的生物標(biāo)記ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8，及C3a-desArg。
在另一具體實(shí)例，本發(fā)明提供一種包括通過質(zhì)譜或免疫測定來檢測下列生物標(biāo)記的方法ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8，及C3a-desArg。
在另一具體實(shí)例，本發(fā)明提供一種包括向受試者傳遞診斷的方法，所述的診斷是關(guān)于由得自該受試者的樣品中的生物標(biāo)記的相關(guān)性所判定的乳癌狀態(tài)，其中所述的生物標(biāo)記是選自下列者所組成的組群ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8或C3a-desArg 2。在另一具體實(shí)例中，該診斷是通過計(jì)算機(jī)形成的媒介來向受試者傳遞。
在另一具體實(shí)例，本發(fā)明提供一種鑒定與選自由下列者所組成組群的生物標(biāo)記相互作用的化合物的方法ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8或C3a-desArg，其中所述的方法包括將生物標(biāo)記與試驗(yàn)化合物接觸；以及判定該試驗(yàn)化合物與該生物標(biāo)記是否有相互作用。
在另一具體實(shí)例中，本發(fā)明提供一種在細(xì)胞中調(diào)節(jié)選自下列者所組成組群的生物標(biāo)記的濃度的方法ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8或C3a-desArg，其中所述的方法包括將所述的細(xì)胞與試驗(yàn)化合物接觸，其中所述的試驗(yàn)化合物避免ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)或C3a-desArgΔ8的斷裂。
在另一具體實(shí)例中，本發(fā)明提供一種治療受試者病癥的方法，其中所述的方法包括對(duì)該受試者給予治療有效量的化合物，其中所述的化合物避免ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)或C3a-desArgΔ8的斷裂。在優(yōu)選的具體實(shí)例中，該病癥是乳癌。

圖1A至1N分別表示標(biāo)記I至XIV的質(zhì)譜。在彼等圖標(biāo)中，具體指明的標(biāo)記的質(zhì)譜峰于所描繪出的頻譜中以箭頭標(biāo)示。圖標(biāo)標(biāo)示是在每個(gè)所指稱的頻譜圖之上。
圖2顯示代表性的質(zhì)譜峰是由在IMAC-Ni2+芯片上所保留住的血清蛋白通過SELDI分析所獲得。上半部區(qū)域顯示頻譜圖；下半?yún)^(qū)域顯示M/Z(與質(zhì)量相關(guān)的速度)介于4,000至10,000之間同一頻譜的假膠體圖。
圖3顯示在數(shù)據(jù)變化減少(reduction)與等化(equalization)上的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。
圖4A至4B顯示第0至I期乳癌(較深的方形)對(duì)非癌癥(白色方形)的三維UMSA組成圖。
圖4A顯示使用UMSA所推導(dǎo)的所有147個(gè)峰的線性組合的描繪結(jié)果。
圖4B顯示使用UMSA所推導(dǎo)的3個(gè)所選擇的峰的線性組合的描繪結(jié)果。
圖5是顯示十五個(gè)峰的圖表，該圖表有最前的平均值排序和最小值排序標(biāo)準(zhǔn)差，該標(biāo)準(zhǔn)差是由ProPeak Bootstrap Analysis。在7.0處的水平線是將同一程序用到隨機(jī)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)組計(jì)算而得的最小值排序標(biāo)準(zhǔn)差，所述之?dāng)?shù)據(jù)組是模擬原始數(shù)據(jù)的分布情形。
圖6A至6B是顯示基于對(duì)第0至I期乳癌與非癌癥控制組的分離的貢獻(xiàn)所選取的峰的相對(duì)顯著度分?jǐn)?shù)的絕對(duì)值的圖標(biāo)。
圖6A顯示從ProPeak Bootstrap Analysis挑選出15個(gè)峰的結(jié)果且其排序標(biāo)準(zhǔn)差小于7.0。
圖6B是顯示從第6A圖中選出最高4個(gè)峰再評(píng)估分?jǐn)?shù)的圖標(biāo)。
圖7是圖表顯示對(duì)BC1、BC2、BC3的接收者操作特征(ROC)曲線分析及邏輯回歸衍生的綜合指數(shù)。p值從各個(gè)生物標(biāo)記的AUC(曲線下面積)間比較而來，其綜合指數(shù)列于此圖中。
圖8A至8B是顯示橫跨所有診斷群組(包括癌癥患者的臨床階段)中所選擇的生物標(biāo)記(群)的分布的散點(diǎn)圖。
圖8A是顯示單獨(dú)由BC3所獲得的結(jié)果的散點(diǎn)圖。
圖8B是顯示使用BC1、BC2和BC3由邏輯回歸所衍生的綜合指數(shù)的結(jié)果的散點(diǎn)圖。
圖9顯示三張2維的散點(diǎn)圖，該散點(diǎn)圖是描述所有病患樣品的分布。
圖10顯示標(biāo)記BC-2(C3a-desArgΔ8)的分布。
圖11顯示標(biāo)記BC-3(C3a-desArg)的分布。
圖12顯示藉由抗C3a抗體對(duì)標(biāo)記BC-2(C3a-desArgΔ8)及BC-3(C3a-desArg)的捕捉。
圖13顯示藉由抗C3a抗體對(duì)標(biāo)記BC-2(C3a-desArgΔ8)的捕捉。
圖14顯示藉由抗C3a抗體對(duì)標(biāo)記BC-3(C3a-desArg)的捕捉。
圖15顯示標(biāo)記BC-1b(ITIH4片段1b)的分布。
圖16顯示在乳癌樣品中各種ITIH4片段的鑒定。
圖17顯示標(biāo)記BC-1b(ITIH4片段1b)，BC-2(C3a-desArgΔ8)，及BC-3(C3a-desArg)的接收者操作特征曲線。
圖18顯示用于BC-3標(biāo)記純化及鑒定的步驟流程。
圖19顯示標(biāo)記BC-3(C3a-desArg)的胺基酸序列(SEQ ID.NO1)。
具體實(shí)施方式1.前言生物標(biāo)記是在取自一種表現(xiàn)型狀態(tài)(例如，具有疾病)的樣品中的有機(jī)生物分子，在前述狀態(tài)中的該有機(jī)生物分子當(dāng)與另一種表現(xiàn)型狀態(tài)(例如，不具有疾病)比較時(shí)其存在是有差別的。若在不同組群中的生物分子的平均表現(xiàn)程度或中值表現(xiàn)程度經(jīng)計(jì)算是達(dá)統(tǒng)計(jì)顯著者，則該生物標(biāo)記在不同表現(xiàn)型狀態(tài)間的存在是有差別的。判斷是否達(dá)統(tǒng)計(jì)上顯著所用的普遍試驗(yàn)包括，在其它試驗(yàn)中，為t-測試、ANOVA、Kruskal-Wallis、Wilcoxon、Mann-Whitney及勝算比(odds ratio)。生物標(biāo)記，單獨(dú)或在組合中，提供屬于一種表現(xiàn)型狀態(tài)或另一種表現(xiàn)型狀態(tài)的受試者的相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)的測量。所以，生物標(biāo)記作為疾病(診斷)、藥物(治療檢驗(yàn)，theranostics)的治療效果及藥物毒性的標(biāo)記是有用的。
2.乳癌的生物標(biāo)記2.1生物標(biāo)記本發(fā)明提供多肽為基礎(chǔ)的生物標(biāo)記，在有乳癌的受試體，尤其，在有早期乳癌相對(duì)于正常(非乳癌)的受試體，該生物標(biāo)記的存在是有差別的。藉由質(zhì)譜技術(shù)所決定的質(zhì)荷比，藉由生物標(biāo)記在飛行時(shí)間質(zhì)譜(time-of-flight mass spectrometry)的峰形狀及其對(duì)吸附物表面的結(jié)合特征來描述該生物標(biāo)記的特征。這些特征提供一種確定特定所檢驗(yàn)的生物分子是否為本發(fā)明的生物標(biāo)記的方法。這些特征代表該等生物分子的內(nèi)生性特征且在區(qū)辨該等生物分子的方式中此些特征并不發(fā)生限制。在一方面，本發(fā)明以單離型式提供此些生物標(biāo)記。
使用ProteinChip數(shù)組(得自Ciphergen Biosystems，Inc.(Fremont，CA)(″Ciphergen″))以SELDI技術(shù)來尋找前述之生物標(biāo)記。血清樣品是從診斷有乳癌的受試者所搜集，包括乳管內(nèi)原位癌(ductalcarcinoma in situ)(DCIS)及浸潤性乳癌、診斷為正常的受試體，以及自具有良性乳房疾病之受試體所搜集。樣品藉由IMAC-Ni(Immobilized Metal Affinity Capture)層析技術(shù)分離。將經(jīng)分離的樣品用在SELDI生物芯片且在樣品中的多肽頻譜是在Ciphergen PBSII質(zhì)譜儀藉由時(shí)間飛行質(zhì)譜所產(chǎn)生。所獲得的頻譜接著由得自CiphergenBiosystem，Inc.的Ciphergen ExpresstmData Manager Software以Biomarker Wizard與Biomarker Pattern Software分析。各個(gè)群組的質(zhì)譜都接受散點(diǎn)圖分析。使用Mann-Whithey測試分析用來比較乳癌與控制組的散點(diǎn)圖中的各蛋白質(zhì)叢集，且選擇在二個(gè)群組之間顯著不同的蛋白質(zhì)(p＜0.001)。此方法在實(shí)施例部分有更詳細(xì)的描述。
與SELDI評(píng)估并行，我們確認(rèn)了該等標(biāo)記的其中三個(gè)的蛋白質(zhì)鑒定。
具有大約4.3KD的質(zhì)荷比(m/z)的BC-1鑒定出為人類α間(inter-alpha)胰蛋白酶抑制劑的片段(″fragment 1″)，重鏈H4(指″ITIH4″、″IAIH4，或″PK-120″)。亦鑒定出BC-1另一型式，標(biāo)示″BC-1b″或″ITIH4片段1b″。ITIH4片段1b具有大約4.6KD的質(zhì)荷比(m/z)。ITIH4片段1與2兩者都含有由抗ITIH4抗體所辨認(rèn)的抗原決定位(epitope)，該抗原決定位存在于與卵巢癌相關(guān)的生物標(biāo)記。
具有質(zhì)荷比(m/z)8.1KD的BC-2是C3a-desArg的截短型(指稱為C3a-desArg-8.1或C3a-desArgΔ8)。C3a-desArgΔ8的胺基酸序列是SVQLTEKRMDKVGKYPKELRKCCEDGMRENPMRFSCQRRTRFISLGEACKKVFLDCCNYITELRRQHA(SEQ ID NO2)。此型的理論質(zhì)量為8132道耳吞，且預(yù)期的pI值是9.38。
具有質(zhì)荷比(m/z)8.9KD的BC-3鑒定出為C3a-desArg。C3a-desArg的胺基酸序列是SVQLTEKRMDKVGKYPKELRKCCEDGMRENPMRFSCQRRTRFISLGEACKKVFLDCCNYITELRRQHARASHLGLA，如前述SEQ ID NO1所提出。C3a-desArg的預(yù)期分子量為8923道耳吞，與量得的質(zhì)量8926道耳吞一致，且其預(yù)期的pI值是9.54，與其在pH9.0時(shí)無法與陰離子交換樹脂結(jié)合的現(xiàn)象相符。
所發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)記呈現(xiàn)于表1。表中的「蛋白質(zhì)芯片數(shù)組」字段指的是其中發(fā)現(xiàn)有生物標(biāo)記的層析分離、有前述生物標(biāo)記所鍵結(jié)于其上的生物芯片的類型與洗滌條件，如在實(shí)施例中所指示。
本發(fā)明的生物標(biāo)記由其質(zhì)譜儀所判定的質(zhì)荷比描述其特征。在表1中的字母M之后提供各個(gè)生物標(biāo)記的質(zhì)荷比。由此，例如M4283具有4283的測量質(zhì)荷比。質(zhì)荷比是在Ciphergen Biosystems，Inc.PBS II質(zhì)譜儀上自質(zhì)譜技術(shù)所辨定。此儀器的質(zhì)量精準(zhǔn)度大約+/-百分之0.15。另外，儀器的質(zhì)量分辨率大約400至1000m/dm，m是質(zhì)量及dm是在0.5峰高度時(shí)的質(zhì)譜峰寬。該生物標(biāo)記的質(zhì)荷比是利用BiomarkerWizardtm軟件(Ciphergen Biosystems，Inc.)所判定。BiomarkerWizard藉由將得自所有頻譜分析同一峰的質(zhì)荷比叢集，將質(zhì)荷比歸屬于某生物標(biāo)記，該頻譜是由PBSII所測得，取在該叢集中質(zhì)荷比的最大值及最小值，將之除以2。因此，所提供的質(zhì)量反射了規(guī)格(specification)。
本發(fā)明的生物標(biāo)記進(jìn)一步由飛行時(shí)間質(zhì)譜中該等生物標(biāo)記的頻譜峰形狀描述其特征。質(zhì)譜顯示的峰所代表的生物標(biāo)記呈現(xiàn)在第1圖。
本發(fā)明的生物標(biāo)記進(jìn)一步藉由他們?cè)趯游霰砻娴慕Y(jié)合性質(zhì)描述其特征。大多數(shù)的生物標(biāo)記以PBS洗滌之后仍與金屬螯合吸附物(例如，CiphergeNIMAC-Ni ProteinChip數(shù)組)結(jié)合。
該等生物標(biāo)記進(jìn)一步的特征描述可于WO 03/076896國際公布發(fā)現(xiàn)，其全文以參考文獻(xiàn)方式并入本文中。
本發(fā)明某些生物標(biāo)記的鑒定已經(jīng)過檢驗(yàn)并列示于表1。該檢驗(yàn)所使用的方法已在前面的實(shí)施例部分?jǐn)⑹?。?duì)于其鑒定已經(jīng)過檢驗(yàn)的生物標(biāo)記，所述生物標(biāo)記的存在可藉由在此技藝中已知的其它方法檢驗(yàn)。
因?yàn)楸景l(fā)明的生物標(biāo)記是由質(zhì)荷比、結(jié)合性質(zhì)及頻譜形狀描述其特征，該等生物標(biāo)記可藉由質(zhì)譜技術(shù)所檢驗(yàn)而不需得知其個(gè)別的鑒定結(jié)果。然而，如果需要，其鑒定尚未檢驗(yàn)的生物標(biāo)記可藉由，例如，其多肽的胺基酸序列來檢驗(yàn)。例如，生物標(biāo)記可由數(shù)種酵素，諸如胰蛋白酶或V8蛋白酶，來做肽圖分析，且該消化片段的分子量可用于搜尋數(shù)據(jù)庫找出與由各種酵素所產(chǎn)生的消化片段分子量吻合的序列?；蛘?，蛋白質(zhì)生物標(biāo)記可使用串行式(tandem)MS技術(shù)定序。在此種方法中，蛋白質(zhì)是藉由，例如膠體電泳法單離。切出含有生物標(biāo)記的條帶，并使切下的蛋白質(zhì)接受蛋白酶消化。各別的蛋白質(zhì)片段由第一質(zhì)譜分離。該片段接著接受由碰撞所誘導(dǎo)的冷卻，該冷卻分割勝肽并產(chǎn)生多肽階梯(polypeptide ladder)。多肽階梯接著藉由串行式MS的第二質(zhì)譜儀分析。多肽階梯成員質(zhì)量的差異鑒定出序列中的胺基酸。整體蛋白質(zhì)可由此方式定序，或序列片段可接受數(shù)據(jù)庫探勘以鑒定候選蛋白質(zhì)。
生物標(biāo)記檢驗(yàn)所用的優(yōu)選生物來源是尿。但是，在其它的具體實(shí)例，該等生物標(biāo)記可在血清中檢驗(yàn)。
本發(fā)明的生物標(biāo)記是生物分子。因此，本發(fā)明以單離型式提供此些生物分子。該生物標(biāo)記可自生物流體中單離，譬如尿或血清。該生物標(biāo)記基于其質(zhì)量與結(jié)合特征可由任何于此技藝中已知的方法單離。例如，包含生物分子的樣品可能施以層析餾分法，如本文所描述，并接受進(jìn)一步的分離，例如，丙烯醯胺膠體電泳法。生物標(biāo)記鑒定的知識(shí)亦允許藉由免疫親和層析法將生物標(biāo)記單離。
2.2.生物標(biāo)記修飾型的使用已發(fā)現(xiàn)樣品中的蛋白質(zhì)通常以許多不同的型式存在，該等型式的特征為其質(zhì)量是可檢測到其差異者。這些型式可能是由前轉(zhuǎn)譯修飾和后轉(zhuǎn)譯修飾其一所導(dǎo)致，或兩者共同導(dǎo)致。前轉(zhuǎn)譯修飾型式包括對(duì)偶變異(allelic variant)、切割變異(slice variance)及RNA編輯型式(RNA editing form)。后轉(zhuǎn)譯修飾的型式包括由蛋白質(zhì)水解切割(proteolytic cleavage；例如，母蛋白質(zhì)(parent protein)的片段)、醣化，磷酸化、脂化、氧化、甲基化，半胱胺酸化(cystinylation)、磺酸化及乙醯化。蛋白質(zhì)的收集在本文稱為「蛋白質(zhì)叢集」，所述的蛋白質(zhì)包括特定的蛋白質(zhì)及該蛋白質(zhì)的所有修飾型。除了特定的蛋白質(zhì)本身以外，特定蛋白質(zhì)的所有修飾型的收集在本文稱之為「修飾的蛋白質(zhì)叢集」。亦可使用本發(fā)明任一生物標(biāo)記的修飾型(包括標(biāo)志ITIH4片段1、ITIH4片段1b、C3a-desArgΔ8，和/或C3a-desArg之任一者)，該生物標(biāo)記的本身亦為生物標(biāo)記。在某些情況中，該等修飾型也許展示出較本文中所提出的特定型式在診斷上有更佳的辨別能力。
生物標(biāo)記的修飾型式包括標(biāo)記ITIH4片段1、ITIH4片段1b、C3a-desArgΔ8，及/或C3a-desArg之任一者，所述修飾型可藉由任何方法學(xué)做初期檢驗(yàn)并將修飾型的生物標(biāo)記與生物標(biāo)記本身區(qū)分開來。初期檢測優(yōu)選的方法包含第一次捕捉前述的生物標(biāo)記及生物標(biāo)記的修飾型，例如，以生物專一性的捕捉試劑捕捉，然后藉由質(zhì)譜技術(shù)檢驗(yàn)所捕捉到的蛋白質(zhì)。更具體地說，蛋白質(zhì)是使用生物專一性捕捉試劑捕捉蛋白質(zhì)，諸如辨認(rèn)生物標(biāo)記及其修飾型的抗體、適體(aptamers)或配體(Affibodies)。此方法亦導(dǎo)致蛋白質(zhì)作用劑(proteininteractor)的捕捉，蛋白質(zhì)作用劑是結(jié)合至蛋白質(zhì)或者由抗體所辨認(rèn)以及起本身可為生物標(biāo)記。優(yōu)選地，生物專一性捕捉試劑結(jié)合至固相。然后，被捕捉到的蛋白質(zhì)可由SELDI質(zhì)譜技術(shù)或?qū)⒃摰鹊鞍踪|(zhì)自該捕捉劑溶析而檢驗(yàn)，并將藉由傳統(tǒng)MALDI或藉由SELDI檢驗(yàn)經(jīng)過溶析的蛋白質(zhì)。質(zhì)譜儀的使用是特別有吸引力的，因?yàn)樗苫谫|(zhì)量分辨與定量蛋白質(zhì)的修飾型而不需要標(biāo)記。
優(yōu)選地，生物專一性捕捉試劑結(jié)合至固相，諸如珠子、平板、膜或芯片。生物分子(諸如，抗體)耦合至固相的方法，在此技藝中已為咸知。該等方法可使用，例如雙功能連接劑，或可衍生有反應(yīng)性基團(tuán)(諸如環(huán)氧化物或咪唑(imidizole))的固相，所述之反應(yīng)性基團(tuán)以接觸方式與分子結(jié)合?？共煌繕?biāo)蛋白質(zhì)的生物專一性捕捉試劑可于同一處混合，或該等試劑可在物理性或可尋址的位置(physical oraddressable location)附著至固相。例如可在多個(gè)管柱裝載有衍生物的珠子，而各個(gè)管柱能捕捉一個(gè)蛋白質(zhì)叢集。另外，可在單一管柱裝填衍生有抗各種蛋白質(zhì)叢集的捕捉試劑，由此可在單一處捕捉所有的分析物。因此，以衍生有抗體的珠子為基礎(chǔ)的技術(shù)，諸如Luminex(Austin，TX)的xMAP技術(shù)可用于檢驗(yàn)蛋白質(zhì)叢集。然而，為了能區(qū)分叢集中的成員，生物專一性捕捉試劑必須專一性的針對(duì)該等成員。
在又另一具體實(shí)例中，生物芯片的表面可衍生有抗蛋白質(zhì)叢集的捕捉試劑，所述捕捉試劑是在同一位置或在物理上相異且可定位的位置。在不同可定位位置捕捉不同的叢群的一個(gè)好處是分析是較為簡單的。
在鑒定蛋白質(zhì)的修飾型并聯(lián)系其與有興趣的臨床參數(shù)的關(guān)聯(lián)性之后，在本發(fā)明的任一方法中該等修飾型可作為生物標(biāo)記之用。這時(shí)，該等修飾型的檢驗(yàn)可藉由任一專一性的檢驗(yàn)方法學(xué)來完成，該等方法學(xué)包括接著進(jìn)行質(zhì)譜的親和力捕捉，或?qū)Ｒ恍缘蒯槍?duì)修飾型的傳統(tǒng)免疫測定。免疫測定需要生物專一性的捕捉試劑，諸如，抗體，以捕捉該等分析物。此外，如果該等測定必須設(shè)計(jì)為專一性地區(qū)辨蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的修飾型式。這可藉由利用，例如，三明治測定來達(dá)成，在三明治測定中一種抗體捕捉超過一種的修飾型而第二種抗體，也就是區(qū)別性標(biāo)記的抗體，專一性地與各種修飾型結(jié)合，并提供對(duì)各種修飾形區(qū)辨性的檢驗(yàn)?？贵w可由以生物分子造成免疫反應(yīng)的動(dòng)物產(chǎn)生。本發(fā)明所考量的傳統(tǒng)免疫測定包括，例如，三明治免疫測定(包括ELISA或以螢光為基礎(chǔ)的免疫測定，以及其它酵素免疫測定。
3.針對(duì)乳癌的生物標(biāo)記檢驗(yàn)本發(fā)明的生物標(biāo)記可由任一適當(dāng)?shù)姆椒z驗(yàn)。為達(dá)此目的可使用的檢測方法的范例包括光學(xué)方法、電化學(xué)方法(電位測定及電流測定技術(shù)，voltametry and amperometry technique)、原子力顯微鏡，及無線射頻方法，例如，多極共振波譜。光學(xué)方法的例子，除了共軛焦和非共軛焦顯微鏡之外，是螢光、冷光、化學(xué)冷光、吸收度、反射度，透光度，及雙折射或折射率的檢驗(yàn)(例如，表面電漿共振、橢偏儀、共振鏡法(resonant mirror method)、光柵耦合波導(dǎo)法或干涉儀)。
在一個(gè)具體實(shí)例中，樣品是以生物芯片的方法分析。生物芯片一般包含固態(tài)基體且具有大致平坦的表面，捕捉試劑(亦稱吸附物或親和力試劑)附著于其上。通常，生物芯片的表面包括多個(gè)可尋址的位置，各個(gè)位置都有捕捉試劑結(jié)合于其上。
蛋白質(zhì)生物芯片是改造為捕捉多肽的生物芯片。許多蛋白質(zhì)生物芯片已描述于此技藝中。此些蛋白質(zhì)生物芯片包括，例如，由CiphergenBiosystems，Inc.(Fremont，CA)、Packard BioScience Company(Meriden，CT)、Zyomyx(Hayward，CA)、Phylos(Lexington，MA)及Biacore(Uppsala，Sweden)生產(chǎn)的蛋白生物芯片。該等蛋白質(zhì)生物芯片的例子描述在以下專利或已公開的專利申請(qǐng)案中美國專利案第6,225,047號(hào)；PCT國際公開第WO 99/51773號(hào)；美國專利第6,329,209號(hào)、PCT國際公開第WO 00/56934號(hào)及美國專利第5,242,828號(hào)。
3.1.由質(zhì)譜儀檢驗(yàn)在優(yōu)選的具體實(shí)例中，本發(fā)明的生物標(biāo)記是由質(zhì)譜技術(shù)所檢驗(yàn)，且是藉由使用質(zhì)譜技術(shù)以檢驗(yàn)氣象離子的方法。質(zhì)譜儀的例子是飛行時(shí)間、磁性區(qū)段、四極過濾器、離子阱、離子回旋共振、靜電區(qū)段分析儀及其混合。
在進(jìn)一步優(yōu)選的方法中，質(zhì)譜儀是激光解析/游離質(zhì)譜儀。在激光解析/游離質(zhì)譜儀，分析物放置在質(zhì)譜儀探針的表面，調(diào)整裝置使質(zhì)譜儀的探針接口能夠運(yùn)作并使分析物存在于使之離子化并使之引入至質(zhì)譜的離子化能量。激光解析質(zhì)譜儀利用激光能量以將分析物自表面解析并將所解析的分析物揮發(fā)以及離子化而使其對(duì)質(zhì)譜儀的離子光學(xué)是可用的，所述的激光能量典型得自紫外線激光，但亦得自紅外線。
3.1.1 SELDI本發(fā)明所用的優(yōu)選質(zhì)譜測定技術(shù)是「表面增強(qiáng)激光解析與離子化」或「SELDI」如描述于，例如在美國專利第5,719,060和第6,225,047號(hào)，兩案均為頒與Hutchens和Yip者。這指的是解析/游離氣相離子頻譜(例如，質(zhì)譜儀)方法，在該等方法中分析物(本文，是指一種或多種生物標(biāo)記)在SELDI質(zhì)譜儀探針的表面被捕捉。SELDI有數(shù)種版本。
SELDI的一個(gè)版本叫做「親和性捕捉質(zhì)譜技術(shù)」。這亦叫做「表面增強(qiáng)的親和性捕捉」或「SEAC」。這個(gè)版本涉及探針的使用，所述的探針其表面具有材料，而所述的探針表面通過該材料與分析物之間的非共價(jià)親和力互相作用(吸附力)而捕捉分析物。該材料可有變化地稱為「吸附物」、「捕捉試劑」、「親和試劑」或「結(jié)合部分」。當(dāng)具有「吸附物表面」時(shí)，該等探針可稱為「親和性捕捉探針」。該捕捉試劑可為能夠鍵結(jié)分析物的任何材料。該等捕捉試劑可直接附著于所選的表面的基體，或附著于可能具有反應(yīng)性表面的基體，所述的反應(yīng)性表面帶有能夠鍵結(jié)捕捉試劑的反應(yīng)性部分，例如，通過形成共價(jià)鍵或配位共價(jià)鍵的反應(yīng)。環(huán)氧化物和碳基二咪唑(carbodiimidizole)是對(duì)于共價(jià)鍵結(jié)多肽捕捉試劑(諸如抗體或細(xì)胞受器)有用的反應(yīng)部分。氮基乙酸及亞胺二乙酸是有用的反應(yīng)部份體，其功能是作為鉗合劑與金屬離子結(jié)合，而該金屬離子是與含有勝肽的組胺酸有非共價(jià)互相反應(yīng)者。吸附物一般分類為層析吸附物與生物專一性吸附物。
「層析吸附物」指的是典型用在層析法的吸附性材料。層析吸附物包括，例如，離子交換材料、金屬螯合劑(例如，氮基乙酸或亞胺二乙酸)、固定的的金屬螯合物、疏水性互相反應(yīng)吸附物、親水性互相反應(yīng)吸附物、染料、簡單的生物分子(例如，核苷酸類、胺基酸類、簡單的糖類及脂肪酸類)及混合模式的吸附物(例如，疏水性吸引/靜電排斥吸附物)。
「生物專一性吸附物」指的是包含生物分子，例如，核酸分子(例如，適體)、多肽、多醣體、脂質(zhì)、膽固醇或前述的共軛物(例如，醣蛋白、脂蛋白、醣酯、核酸(例如，DNA)-蛋白質(zhì)共軛)的吸附物。在某些例子中，該生物專一性吸附物可為大分子結(jié)構(gòu)，諸如，多重蛋白復(fù)合體、生物膜或病毒。生物專一性吸附物例子是抗體、受體蛋白質(zhì)及核酸。生物專一性吸附物較于層析吸附物對(duì)標(biāo)的分析物有較高的專一性。于SELDI所用的吸附物更進(jìn)一步的例子可見于美國專利第6,225,047號(hào)?！干镞x擇性吸附物」指的是以至少10-8M的親和力與分析物結(jié)合的吸附物。
由Ciphergen Biosystems，Inc.所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)生物芯片，該芯片包含于可尋址位置附著有層析或生物專一性吸附劑的表面。Ciphergen ProteinChip數(shù)組包括NP20(親水性)；H4及H50(疏水性)；SAX-2、Q-10及LSAX-30(陰離子交換)；WCX-2、CM-10和LWCX-30(陽離子交換)；IMAC-3、IMAC-30和IMAC 40(金屬螯合物)；及PS-10、PS-20(具有碳基咪唑與環(huán)氧化物的反應(yīng)性表面)和PG-20(通過碳基咪唑偶合的蛋白質(zhì)G)。疏水性蛋白質(zhì)芯片數(shù)組具有異丙基或壬基苯氧基-聚(乙二醇)甲基丙烯酸酯官能。陰離子交換蛋白質(zhì)芯片數(shù)組具有四級(jí)銨官能。陽離子交換蛋白質(zhì)芯片數(shù)組具有羧酸酯官能。固定的金屬螯合蛋白質(zhì)芯片數(shù)組具有藉由螯合作用吸附過渡金屬離子(諸如，銅、鎳、鋅，及鎵)的氮基乙酸官能。預(yù)先活化的蛋白質(zhì)芯片數(shù)組具有可與在蛋白質(zhì)上的基團(tuán)行共價(jià)鍵結(jié)反應(yīng)的碳基咪唑或環(huán)氧化物官能基。
此等生物芯片進(jìn)一步的描述在美國專利案6,579,719號(hào)(Hutchens和Yip，″Retentate Chromatograpy″，June 17 2003)；PCT國際公開案第WO 00/66265號(hào)(Rich等人，″Probes for a Gas Phase IonSpectrometer″，November 9 2000)；美國專利第6,555,813號(hào)(Beecher等人，″Sample Holder with Hydrophobic Coating for Gas Phase MassSpectrometer″，Apri l29，2003)；美國專利申請(qǐng)案第US.2003 0032043A1號(hào)(Pohl和Papanu，″Latex Based Adsorbent Chip″，July 16 2002)；以及PCT國際公開案第WO 03/040700號(hào)(Um等人，″HydrophobicSurface Chip″，May 15 2003)；美國專利申請(qǐng)案第US2003/0218130 A1號(hào)(Boschetti等人，″Biochips With Polysaccharide-BasedHydrogels″，April 14，2003)及美國專利申請(qǐng)案第60/448,467號(hào)標(biāo)題″Photocrosslinked Hydrogel Surface Coatings″(Huang等人，于February 21，2003提出)。
一般而言，具有吸收物表面的探針與樣品接觸一段足以容許生物標(biāo)記或可能出現(xiàn)樣品中的生物標(biāo)記與該吸收物結(jié)合的期間。在反應(yīng)期間之后，洗滌受質(zhì)以移除未結(jié)合的物質(zhì)。任何適當(dāng)?shù)南礈烊芤憾伎墒褂?；?yōu)選地，利用水性溶液?？山逵烧{(diào)整洗滌的嚴(yán)格度(stringency)來操作鍵結(jié)留存的分子的范圍。洗滌溶液的溶析特征可能取決于，例如pH、離子強(qiáng)度、疏水性、亂度函數(shù)(chaotropism)的程度、清潔劑強(qiáng)度，及溫度。除非探針具有SEAC和SEND性質(zhì)兩者(如于本文中所述)，否則能量吸收分子是以鍵結(jié)的生物標(biāo)記施用至該基體。
該與受質(zhì)結(jié)合的生物標(biāo)記是在氣相離子頻譜儀(諸如飛行時(shí)間質(zhì)譜儀)中檢驗(yàn)。生物標(biāo)記由離子化來源(諸如，激光)而離子化，所產(chǎn)生的離子由離子光學(xué)組件所收集，然后以質(zhì)量分析儀將通過的離子加以分散以及分析。探測器接著將所檢驗(yàn)的離子轉(zhuǎn)換的信息成質(zhì)荷比。生物標(biāo)記的檢驗(yàn)典型牽涉信號(hào)強(qiáng)度的檢驗(yàn)。因此，生物標(biāo)記的質(zhì)與量都是可測得的。
SELDI另一版本是表面增強(qiáng)均勻解析(SEND)，該版本牽涉包含使用以化學(xué)鍵結(jié)至探針表面(「SEND」探針)的能量吸收分子的探針。字詞「能量吸收分子」(EAM)意思是分子能夠從激光解析/離子化來源吸收能量因而有助于其所接觸的分析物解析并離子化的分子。EAM的范疇包括在MALDI所用的分子，通常稱為「基質(zhì)(matrix)」，其示例有肉桂酸衍生物、芥子酸(sinapinic acid，SPA)、氰-羥基-肉桂酸(CHCA)及二羥基苯甲酸、阿魏酸，及羥基苯乙酮衍生物。在某些具體實(shí)例中，能量吸收分子并入直鏈型或交聯(lián)聚合物，例如，聚甲基丙烯酸酯。例如，其組成可為α-氰-4-甲基丙烯醯基氧基肉桂酸與丙烯酸酯的共聚物。在另一具體實(shí)例中，其組成可為α-氰-4-甲基丙烯醯基氧基肉桂酸、丙烯酸酯與3-(三-乙氧基)硅烷基丙基甲基丙烯酸酯的共聚物。在另一具體實(shí)例中，其組成可為α-氰-4-甲基丙烯醯基肉桂酸與甲基丙烯酸十八酯(「C18 SEND」)的共聚物。SEND進(jìn)一步描述于美國專利案第6,124,137號(hào)及PCT國際公開案第WO 03/64594號(hào)(Kitagawa，″Monomers And Polymers Having Energy AbsorbingMoieties Of Use In Desorption/Ionization Of Analytes″，August7，2003)。
SEAC/SEND是捕捉試劑與能量吸收分子皆附著于樣品所出現(xiàn)的表面的SELDI版本。因此SEAC/SEND探針不需施加外來基質(zhì)即容許通過親和力捕捉及離子化/解析作用來捕捉分析物。C18 SEND生物芯片是包含C18部分的SEAC/SEND版本，所述的部分的功能是作為捕捉試劑，且CHCA部分的功能是作為能量吸收部分。
另一個(gè)的SELDI版本，稱為表面增強(qiáng)光不穩(wěn)定性附接與釋放(Surface-Enhanced-Phtolabile Attachment and Release，SEPAR)，涉及使用附著于可與分析物共價(jià)鍵結(jié)的表面的部分，接著在暴露至光之后透過打斷在該部份中的光不穩(wěn)定性鍵結(jié)而釋放該分析物，例如，暴露至激光光(參見美國專利第5,719,060號(hào))。依據(jù)本發(fā)明，SEPAR及其它SELDI的型式是經(jīng)輕易的調(diào)整以檢驗(yàn)生物標(biāo)記或生物標(biāo)記的態(tài)(profile)。
3.1.2.其它質(zhì)譜方法在其它質(zhì)譜方法中，該等生物標(biāo)記可首先在層析樹脂被捕捉，該等層析樹脂具有鍵結(jié)生物標(biāo)記的層析特性。在此范例中，可包括各樣方法。例如，在陽離子交換樹脂(諸如，CM Ceramic HyperD F樹脂)上可捕捉生物標(biāo)記、洗滌樹脂，溶析該生物標(biāo)記并由MALDI檢測?；蛘?，此方法可在施用至陽離子交換樹脂之前先在陰離子交換樹脂上進(jìn)行樣品的餾分?；蛘?，可在陰離子交換樹脂上餾分并直接由MALDI檢驗(yàn)。在又另一方法中，在包含與生物標(biāo)記結(jié)合的抗體的免疫層析樹脂上捕捉生物標(biāo)記、洗滌樹脂以移除未結(jié)合的物質(zhì)、從該樹脂溶析生物標(biāo)記并由MALDI或由SELDI檢驗(yàn)所溶析的生物標(biāo)記。
3.1.3.數(shù)據(jù)分析飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)分析物進(jìn)行分析產(chǎn)生飛行時(shí)間頻譜。最終所分析的飛行時(shí)間頻譜典型不代表來自對(duì)樣品的離子化能量的信號(hào)而是來自多個(gè)脈沖信號(hào)的總和。這減少了噪聲并增加了動(dòng)態(tài)范圍。該等飛行時(shí)間的數(shù)據(jù)是經(jīng)過數(shù)據(jù)處理的。在Ciphergen’s ProteinChip軟件，數(shù)據(jù)處理典型包括TOF對(duì)M/Z的轉(zhuǎn)換以產(chǎn)生質(zhì)譜，基線扣除以去掉儀器補(bǔ)償以及高頻率噪聲過濾以降低高頻率噪聲。
藉由生物標(biāo)記的解析與檢驗(yàn)所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可使用可編程數(shù)字計(jì)算機(jī)加以分析。該計(jì)算機(jī)程序分析數(shù)據(jù)以指出所檢驗(yàn)到的生物標(biāo)記的數(shù)目，以及任選地指出信號(hào)的強(qiáng)度以及所檢驗(yàn)到的各個(gè)生物標(biāo)記的量定分子量。數(shù)據(jù)分析可包括下列步驟量定生物標(biāo)記的信號(hào)強(qiáng)度并移除自預(yù)先量定的統(tǒng)計(jì)學(xué)分布偏離的數(shù)據(jù)。例如，藉由相對(duì)于一些參考值所計(jì)算的每個(gè)峰高，可將所觀察到的峰常態(tài)化。所述參考值可為由儀器以及化學(xué)劑(諸如，在標(biāo)度中設(shè)為0的能量吸收分子)所產(chǎn)生的噪聲。
計(jì)算機(jī)可將所得的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成各種不同行是來顯示。可顯示成標(biāo)準(zhǔn)頻譜，但在一種有用的形式中，僅自頻譜圖(view)中保留峰高度以及質(zhì)量信息，產(chǎn)生清楚的影像并使有差不多分子重的生物標(biāo)記輕易的被看到。在另一有用的形式中，比較兩種或多種頻譜，合適的強(qiáng)調(diào)出獨(dú)有的生物標(biāo)記，以及在樣品之間上調(diào)或下調(diào)的生物標(biāo)記。使用該等形式中之任一者，可輕易的量定某個(gè)生物標(biāo)記是否出現(xiàn)在樣品中。
分析一般涉及包含在代表得自分析物的信號(hào)的頻譜中峰的鑒定。峰的選擇可用肉眼進(jìn)行，但軟件是可得的，如Ciphergen’sProteinChip軟件裝的其中一部分，其可使峰的檢驗(yàn)自動(dòng)化。一般而言，所述軟件是藉由鑒定具有信噪比超過所選的閥值的信號(hào)以及在峰信號(hào)的中心標(biāo)記峰的質(zhì)量而發(fā)揮功能。在一種有用的應(yīng)用中，比較許多頻譜以鑒定呈現(xiàn)一些所選的百分比是相同的質(zhì)譜的峰。該等軟件的一個(gè)版本將在多種頻譜中所定義的質(zhì)量范圍內(nèi)所出現(xiàn)的所有峰都加以叢集，并將質(zhì)量(M/Z)歸于接近質(zhì)量叢集的中央點(diǎn)的所有峰。
根據(jù)本發(fā)明，用來分析數(shù)據(jù)的軟件可包括應(yīng)用算法以分析信號(hào)藉以判定該信號(hào)是否代表在與生物標(biāo)記相應(yīng)的該信號(hào)中的峰。該軟件亦可使關(guān)于所觀察到的生物標(biāo)記的數(shù)據(jù)接受分類樹或ANN分析，以判定生物標(biāo)記峰或生物標(biāo)記峰的組合是否出現(xiàn)，而該等生物標(biāo)記峰或其組合的出現(xiàn)在試驗(yàn)時(shí)該特定的臨床參數(shù)的狀態(tài)。該數(shù)據(jù)的分析可能是直接或者間接自該樣品的質(zhì)譜分析對(duì)所獲得的各種參數(shù)「定調(diào)(keyed)」。該等參數(shù)包括，但不限于，一個(gè)或多個(gè)峰的出現(xiàn)、一個(gè)或多個(gè)峰的高度的對(duì)數(shù)，以及峰高度數(shù)據(jù)的其它算數(shù)操作。
3.1.4.乳癌的生物標(biāo)記的SELDI檢測所用的一般流程本發(fā)明生物標(biāo)記的檢驗(yàn)的優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)步驟如下。所要測試的生物樣品，例如，血清或尿，在SELDI分析之前優(yōu)選地接受預(yù)餾分(pre-fractionation)。此步驟使樣品簡單化并增進(jìn)敏感性。預(yù)餾分的優(yōu)選方法涉及將樣品與陰離子交換層析材料接觸，諸如Q HyperD(BioSepra，SA)。該鍵結(jié)的材料接著使用緩沖液在pH9，pH7，pH5及pH4進(jìn)行逐步pH溶析(stepwise pH elution)。(參見例1-緩沖列表)(其中的生物標(biāo)記已經(jīng)過溶析的片段亦列示在表1)。收集含有該等生物標(biāo)記的各種片段。
所要測試的樣品(優(yōu)選地經(jīng)預(yù)餾分)接著與包含陽離子交換吸附物(WCX蛋白質(zhì)芯片數(shù)組(Ciphergen Biosystems，Inc.)為優(yōu)選)或與IMAC吸附物(IMAC3蛋白質(zhì)芯片數(shù)組(Ciphergen Biosystems，Inc.)為優(yōu)選)的親和力捕捉探針接觸，再次列示于表1中。該探針用緩沖液洗滌，該緩沖亦在將為鍵結(jié)的分子洗除時(shí)仍保留該生物標(biāo)記。對(duì)各種生物標(biāo)記適當(dāng)?shù)南磩┦窃诒?中所指出的緩沖液。由激光解析/離子化質(zhì)譜技術(shù)檢驗(yàn)該等生物標(biāo)記。
另外，如果辨認(rèn)生物標(biāo)記的抗體是可得的，例如在ITIH4或C3a-desArg的例子中，該等抗體可附著于探針的表面上，如預(yù)活化的PS10或PS20蛋白質(zhì)數(shù)組(Ciphergen Biosystems，Inc.)。這些抗體可將生物標(biāo)記從樣品捕捉至探針表面。然后生物標(biāo)記可由，例如，激光解析/離子化質(zhì)譜技術(shù)所檢驗(yàn)。
3.2.由免疫測定在另一具體實(shí)例中，本發(fā)明的生物標(biāo)記可由免疫測定來測量。免疫測定需要生物專一性捕捉試劑，諸如抗體，以捕捉生物標(biāo)記?？贵w可藉由在此技藝中所咸知的方法制造，例如，藉由以生物標(biāo)記造成免疫反應(yīng)的動(dòng)物所制造?；谏飿?biāo)記的鍵結(jié)特征，可將生物標(biāo)記自樣品中單離。另外，如果多肽生物標(biāo)記的胺基酸序列已知，可合成該等多肽并以在此技藝中所咸知的方法產(chǎn)生抗體。
本發(fā)明所考慮使用的傳統(tǒng)免疫測定包括，例如，三明治免疫測定(其包括ELISA或螢光為基礎(chǔ)的免疫測定)，以及其它酵素免疫測定。在該SELDI為基礎(chǔ)的免疫測定中，該生物標(biāo)記的生物專一性捕捉試劑附著于MS探針，諸如預(yù)活化的蛋白質(zhì)芯片數(shù)組，的表面。該等生物標(biāo)記接著在該生物芯片上通過此等試劑專一性地捕捉，接著所捕捉到的生物標(biāo)記藉由質(zhì)譜技術(shù)檢驗(yàn)。
4受試體乳癌狀態(tài)的量定4.1單一標(biāo)記本發(fā)明的生物標(biāo)記可用在診斷測試以估計(jì)受試體的乳癌狀態(tài)，例如，診斷早期的乳癌。字詞「乳癌狀態(tài)」包括疾病的任何可區(qū)辨表現(xiàn)，包括非疾病。例如，疾病狀態(tài)包括，而不加限制，有疾病或沒有疾病(例如，乳癌相對(duì)于非乳癌)、發(fā)展成疾病的風(fēng)險(xiǎn)、疾病的狀態(tài)(例如，非浸潤性或早期乳癌相對(duì)于浸潤性或轉(zhuǎn)移性的乳癌)、疾病的進(jìn)展(例如，隨時(shí)間的疾病進(jìn)展或疾病緩解)以及疾病治療的效能或反應(yīng)。基于此狀態(tài)，也許需要進(jìn)一步的程序，包括額外的診斷試驗(yàn)或治療程序或療法。
正確地預(yù)測狀態(tài)(status)的診斷測試的能力一般以該測定的敏感性、該測定的專一性或接受者操作特征(ROC)曲線下面積來測量。敏感性是真陽性的百分比，真陽性是由測試預(yù)測為陽性，而專一性是真陰性的百分比，真陰性是由測試預(yù)測為陰性。ROC曲線以1-專一性的函數(shù)提供測試的敏感性。ROC曲線下的面積越大，該測試得預(yù)測值就越高。其它對(duì)測試的效用有用的測量是陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值。陽性預(yù)測值是測試為陽性的實(shí)際陽性的百分比。陰性預(yù)測值是測試為陰性的實(shí)際陰性的百分比。
本發(fā)明的生物標(biāo)記顯示出在不同的乳癌狀態(tài)有至少p≤0.05、p≤10-2、p≤10-3、p≤10-4或p≤10-5的統(tǒng)計(jì)差異。單獨(dú)使用或以組合使用該等生物標(biāo)記的診斷測試顯示出至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％及大約100％的敏感性及專一性。
在表1中所列的各個(gè)生物標(biāo)記是有差異地存在于乳癌中，且，因此，各個(gè)生物標(biāo)記對(duì)乳癌狀態(tài)的測定都是有用的。該方法包含，首先，在受試體的樣品中使用在本文中所述的方法(例如，在SELDI生物芯片上捕捉并接著以質(zhì)譜技術(shù)檢驗(yàn))測量所選擇的生物標(biāo)記，接著，其次，以區(qū)辨陽性乳癌狀態(tài)與陰性乳癌狀態(tài)的診斷量或截切值(cut-off)來比較其測量結(jié)果。診斷量代表生物標(biāo)記所量得的量，受試體由所量得的量在該等量之上或之下，藉以分類為具有特定的乳癌狀態(tài)。例如，如果與正常相較在乳癌期間生物標(biāo)記是上調(diào)的，則高過診斷截切值的測量量提供罹患乳癌的診斷?；蛘撸绻容^在乳癌期間生物標(biāo)記是下調(diào)的，則低于診斷截切值的測量量提供罹患乳癌的診斷。如在此技藝中所咸知者，藉由調(diào)整在測定中所用的特定診斷的截切值，可取決于診斷者的偏好來增加診斷分析的敏感性或?qū)Ｒ恍浴Ｌ囟ǖ脑\斷截切值是可被測定的，例如，如在本文中是藉由測量得自于有不同乳癌狀態(tài)的受試者的有統(tǒng)計(jì)意義的數(shù)量的生物標(biāo)記的量，并劃分出適合診斷者所欲程度的專一性與敏感度的截切值。
4.2.標(biāo)記的組合當(dāng)各別的生物標(biāo)記都是有用的診斷性生物標(biāo)記時(shí)，發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記的組合比單獨(dú)一個(gè)生物標(biāo)記可提供特定狀態(tài)的更大的預(yù)測值。特別是，在樣品中檢驗(yàn)多種生物標(biāo)記可增加測試的敏感性和/或?qū)Ｒ恍浴?br> 4.3.測定發(fā)展成疾病的風(fēng)險(xiǎn)在一個(gè)具體實(shí)例中，本發(fā)明提供在受試體測定發(fā)展成疾病的風(fēng)險(xiǎn)的方法。生物標(biāo)記的量或型態(tài)(pattern)是各種風(fēng)險(xiǎn)狀態(tài)(例如，高、中或低)的特征。發(fā)展成疾病的風(fēng)險(xiǎn)是藉由測量相關(guān)的生物標(biāo)記或生物標(biāo)記群所測定，接著或者使該(等)生物標(biāo)記接受分類算法，或者將之與參考量和/或型態(tài)比較，所述的參考量和/或型態(tài)是與特定的風(fēng)險(xiǎn)程度式有關(guān)的。
4.4.測定疾病的狀態(tài)在一個(gè)具體實(shí)例中，本發(fā)明提供量定受試體的疾病狀態(tài)的方法。疾病的各期具有生物標(biāo)記的特征量或一組生物標(biāo)記(型態(tài))的相關(guān)量。疾病的狀態(tài)是藉由測量相關(guān)的生物標(biāo)記或生物標(biāo)記(群)所量定，接著或者使該(等)生物標(biāo)記接受分類算法，或者將之與參考量和/或型態(tài)比較，所述的參考量和/或型態(tài)是與特定的風(fēng)險(xiǎn)程度式有關(guān)的。例如，生物標(biāo)記ITIH4片段1、ITIH4片段1b、C3a-desArgΔ8，和/或C3a-desArg的檢驗(yàn)可用以區(qū)辨在早期(非浸潤性)與浸潤性乳癌。
4.5.疾病進(jìn)程(進(jìn)展/緩解)的量定在一個(gè)具體實(shí)例中，本發(fā)明提供量定受試者疾病進(jìn)程的方法。疾病進(jìn)程指的是疾病狀態(tài)隨時(shí)間的變化，包括疾病進(jìn)展(惡化)及疾病緩解(改善)。生物標(biāo)記的量或相對(duì)量(例如，型態(tài))隨時(shí)間改變。例如，生物標(biāo)記ITIH4片段1、ITIH4片段1b、C3a-desArgΔ8，和/或C3a-desArg在疾病中減少了。所以，該等標(biāo)記朝向有疾病的或向無疾病隨時(shí)間變化的趨勢(shì)，或者是增加的或是減少的，表示了疾病的進(jìn)程。因此，此方法涉及在至少兩個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)測量受試者的一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)記，例如，在第一時(shí)間及第二時(shí)間，并比較其量的變化，如果有的話。相似的，此方法對(duì)量定對(duì)治療的反應(yīng)是有用的。如果治療是有效的，則生物標(biāo)記將趨向于正常，如果治療是無效的，生物標(biāo)記將趨向于表示有疾病。
4.6.受試者管理在定出乳癌狀態(tài)的方法的某些具體實(shí)例中，該方法進(jìn)一步包含基于其狀態(tài)來管理受試者的治療。該等管理包括在量定乳癌狀態(tài)之后，內(nèi)科醫(yī)師或臨床醫(yī)師所采取的行動(dòng)。例如，如果內(nèi)科醫(yī)師做出乳癌的診斷，則可能接著進(jìn)行特定的治療療程，諸如化學(xué)治療或輻射的處方或投與。或者，非乳癌或量性乳房疾病的診斷可能接著進(jìn)行進(jìn)一步的測試以判定患者所可能罹患的具體疾病。此外，如果診斷測試所給的乳癌狀態(tài)結(jié)果是不確定的，可能要做進(jìn)一步的測試。
本發(fā)明的額外具體實(shí)例是關(guān)于傳遞檢定的結(jié)果或診斷或檢定的結(jié)果與診斷兩者給，例如，技術(shù)人員、內(nèi)科醫(yī)師或患者。在某些具體實(shí)例中，將使用計(jì)算機(jī)傳送檢定結(jié)果或診斷或兩者給有興趣的當(dāng)事人，例如，內(nèi)科醫(yī)師及他們的患者。在一些具體實(shí)例中，執(zhí)行檢定或分析該檢定結(jié)果所在的國家或轄區(qū)與傳遞該結(jié)果或診斷的國家或轄區(qū)是不同的。
在本發(fā)明的優(yōu)選的具體實(shí)例中，基于任何在表1中的生物標(biāo)記在試驗(yàn)受試者有出現(xiàn)或沒有出現(xiàn)而下的診斷是在該診斷獲得后盡快傳遞給受試者?？捎墒茉囌叩闹委熱t(yī)師傳遞該診斷?；蛘?，可藉由電子郵件寄送診斷給試驗(yàn)受試者或以電話傳遞給該受試者?？墒褂糜?jì)算機(jī)以藉由電子郵件或電話來傳遞診斷。在某些具體實(shí)例中，含有診斷測試結(jié)果的訊息可使用計(jì)算機(jī)硬件與軟件的組合來自動(dòng)地產(chǎn)生并傳遞給該受試者，該等組合對(duì)于電信領(lǐng)域中具通常技藝者是熟悉的。健康照護(hù)導(dǎo)向的通訊系統(tǒng)的一個(gè)例子描述于美國專利案第6,283,761號(hào)中；然而，本發(fā)明不限于利用特定的通信系統(tǒng)的方法。在本發(fā)明方法的某些具體實(shí)例中，該等方法步驟中的所有或一些，包括檢定樣品、診斷疾病，及傳遞檢定結(jié)果或診斷，可能在分別(外國的)的轄區(qū)所執(zhí)行。
5.定義乳癌狀態(tài)所用的分類算法的產(chǎn)生在一些具體實(shí)例中，衍生自頻譜的數(shù)據(jù)可接著用來「訓(xùn)練」分類模式，所述的頻譜(例如，質(zhì)譜或飛行時(shí)間頻譜)是使用樣品(諸如「已知樣品」)所產(chǎn)生?！敢阎獦悠贰故且呀?jīng)預(yù)先分類的樣品。自頻譜衍生且用來形成分類模型的數(shù)據(jù)可稱為「訓(xùn)練數(shù)據(jù)組」。一旦經(jīng)過訓(xùn)練，該分類模型可辨認(rèn)自頻譜所衍生的數(shù)據(jù)的模式，而該頻譜是使用未知樣品所產(chǎn)生的。該分類模型接著可將未知的樣品分類到類別中。這是對(duì)于，例如，預(yù)測特定生物樣品是否與某些生物情況有關(guān)(例如，罹病的相對(duì)于非罹病的)有用。
用以形成該分類模型的訓(xùn)練數(shù)據(jù)組可能包含原始數(shù)據(jù)或預(yù)先處理的數(shù)據(jù)。在一些具體實(shí)例中，原始數(shù)據(jù)可從時(shí)間飛行頻譜或質(zhì)譜直接獲得，且接著任選地如前文所述「預(yù)先處理」。
分類模型可使用任合適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)分類(或「學(xué)習(xí)」)方法形成，該方法基于在該數(shù)據(jù)中所出現(xiàn)的客觀參數(shù)嘗試將數(shù)據(jù)體分離歸類。分類方法或許是監(jiān)督或無監(jiān)督的。監(jiān)督的和無監(jiān)督的分類過程的例子描述在Jain，″Statistical Pattern RecognitionA Review″，IEEETransactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence，Vol.22，No.1，January 2000，其教示以參考文獻(xiàn)方式并入。
在監(jiān)督的分類法中，含有已知類別例子的訓(xùn)練數(shù)據(jù)是呈現(xiàn)至學(xué)習(xí)機(jī)制，該機(jī)制學(xué)習(xí)一組或多組定義各個(gè)已知種類的關(guān)系。新的數(shù)據(jù)可能接著用在該學(xué)習(xí)機(jī)制，該學(xué)習(xí)機(jī)制接著使用已習(xí)得的關(guān)系將新數(shù)據(jù)分類。監(jiān)督的分類過程的例子包括線性回歸過程(例如，多重線性回歸(MLR)、部份最小平方(PLS)回歸以及主成分回歸(PCR))、二元判定樹(例如，遞歸分割程序(諸如CART-分類及回歸樹))、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(諸如反向傳播網(wǎng)絡(luò))、區(qū)別分析(例如，貝式(Bayesian)分類器或費(fèi)雪(Fischer)分析)、邏輯分類器，及支撐向量分類器(支撐向量機(jī))。
優(yōu)選的監(jiān)督分類法是遞歸分割程序。遞歸分割程序使用遞歸分割樹來分類衍生自未知樣品的頻譜。關(guān)于遞歸分割程序的進(jìn)一步細(xì)節(jié)提供于美國專利申請(qǐng)案第2002 0138208 A1號(hào)，頒與Paulse等人，″Methodfor analyzing mass spectra″。
在另一具體實(shí)例中，可使用無監(jiān)督學(xué)習(xí)方法形成。無監(jiān)督分類法嘗試基于訓(xùn)練數(shù)據(jù)組中的相似性來學(xué)習(xí)分類，而不需要預(yù)先分類訓(xùn)練數(shù)據(jù)組所衍生的頻譜。無監(jiān)督學(xué)習(xí)方法包括叢集分析。叢集分析嘗試劃分?jǐn)?shù)據(jù)成「叢集」或群組，該叢集或群組理想上應(yīng)具有彼此非常相似的成員，且與其它叢集中的成員應(yīng)該是非常不相似的。相似性是使用一些距離度規(guī)(distance metric)測量，該距離度規(guī)測量數(shù)據(jù)項(xiàng)之間的距離，且叢集間共同的數(shù)據(jù)項(xiàng)彼此是更為靠近的。叢集的技術(shù)包括MacQueen的K-means算法和Kohonen’的自組織映像(Self-OrganizingMap)算法。
聲稱用于分類生物信息的學(xué)習(xí)算法，描述于例如，PCT國際公開案第WO 01/31580號(hào)(Barnhill等人，″Methods and devices foridentifying patterns in biological systems and methods of usethereof″)、美國專利申請(qǐng)案第2002 0193950 A1號(hào)(Gavin等人，″Method or analyzing mass spectra″)、美國專利申請(qǐng)案第20030004402 A1號(hào)(Hitt等人，″Process for discriminating betweenbiological states based on hidden patterns from biologicaldata″)，及美國專利專利案第2003 0055615 A1號(hào)(Zhang and Zhang，″Systems and methods for processing biological expressiondata″)。
該分類模型可在任何適合的數(shù)字計(jì)算機(jī)上形成及使用。適合的數(shù)字計(jì)算機(jī)包括使用任何標(biāo)準(zhǔn)或特化的操作系統(tǒng)，諸如，Unix，WindowsTM或LinuxTM為基礎(chǔ)的操作系統(tǒng)的微型、小型，或大型計(jì)算機(jī)。所用的數(shù)字計(jì)算機(jī)可能是與用來創(chuàng)造感興趣的頻譜的質(zhì)譜儀在實(shí)體上是分離的，或是所述計(jì)算機(jī)可與質(zhì)譜儀結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)例的該訓(xùn)練數(shù)據(jù)組及該分類模型可藉由計(jì)算機(jī)程序碼實(shí)體化，所述的程序代碼是由數(shù)字計(jì)算機(jī)執(zhí)行或使用。該計(jì)算機(jī)程序碼可儲(chǔ)存在任何適合的計(jì)算機(jī)可讀取媒介，包括光盤或磁盤、卡、帶等，且可寫入在任何適當(dāng)?shù)挠?jì)算機(jī)程序語言，包括C、C++、visual basic等。
前述的學(xué)習(xí)算法對(duì)發(fā)展已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)記的分類算法，或?qū)ふ胰榘┑男律飿?biāo)記都是有用的。分類算法，依序藉由提供單獨(dú)使用或組合使用的生物標(biāo)記的診斷值(例如，截切點(diǎn))以形成診斷的基礎(chǔ)。
6.乳癌的生物標(biāo)記檢驗(yàn)所用的試劑盒在其它方面，本發(fā)明提供鑒定乳癌狀態(tài)的試劑組，此套組是根據(jù)本發(fā)明用來檢驗(yàn)生物標(biāo)記。在一個(gè)具體實(shí)例中，本套組包含固態(tài)支持物，諸如芯片、微滴定板或有捕捉試劑附著于其上的珠子或樹脂，其中該捕捉試劑與本發(fā)明的生物標(biāo)記結(jié)合。因此，例如本發(fā)明的套組可包含SELDI所用的質(zhì)譜探針，諸如ProteinChip數(shù)組。在生物專一性捕捉試劑的情形中，此試劑盒可包含具有反應(yīng)表面的固態(tài)支持物，以及包含生物專一性捕捉試劑的容器。
本試劑盒亦可包含洗滌溶液或洗滌溶液的制作說明，其中捕捉試劑與洗滌溶液的組合允許捕捉在固態(tài)支持物上的升物標(biāo)記或生物標(biāo)記群以進(jìn)行接下來的檢驗(yàn)，接下來的檢驗(yàn)是藉由，例如，質(zhì)譜儀所進(jìn)行。該試劑組可能包括更多類型的吸附物，其各個(gè)存在于不同的固態(tài)支持物上。
在進(jìn)一步的具體實(shí)例中，此等套組可包含適當(dāng)操作參數(shù)的說明書，該說明書是呈卷標(biāo)或分離的插頁的形式。例如，此說明說可能告知消費(fèi)者關(guān)于如何收集樣品、如何洗滌探針或所要檢驗(yàn)的特定的生物標(biāo)記。
在又一具體實(shí)例中，此試劑組可包括含有一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)記樣品的容器，來當(dāng)作校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)品。
7.將生物標(biāo)記用在乳癌的篩選檢定以及治療乳癌的方法本發(fā)明的方法具有其它的應(yīng)用。例如該等生物標(biāo)記可用于篩選在活體內(nèi)或活體外調(diào)節(jié)該等生物標(biāo)記的表達(dá)的化合物，該等化合物接著對(duì)治療或預(yù)防病患的乳癌可能是有用的。在其它的實(shí)施例，該等生物標(biāo)記可用在監(jiān)控對(duì)乳癌的治療的反應(yīng)。在又另一實(shí)施例中，該等生物標(biāo)記可用在遺傳研究中以量定受試體是否處在發(fā)展成乳癌的風(fēng)險(xiǎn)中。
所以，例如，本發(fā)明的試劑組可包括具有疏水功能的固態(tài)基體，諸如蛋白質(zhì)芯片(例如，Ciphergen H50 ProteinChip數(shù)組，例如，ProteinChip數(shù)組)以及洗滌該基體所用的醋酸鈉緩沖液，以及提供在芯片上測量本發(fā)明的生物標(biāo)記以及使用前述測量結(jié)果來診斷乳癌的說明書。
適于治療性測試的化合物可藉由鑒定與列示于表1中的一種或多種生物標(biāo)記互相作用的化合物而做初步的篩選。經(jīng)由實(shí)施例的方法，篩選可能包括將列示在表1中的生物標(biāo)記進(jìn)行重組表達(dá)、純化生物標(biāo)記以及將生物標(biāo)記貼附至基體。測試化合物接著與基體接觸，典型地是在水性環(huán)境中，且測試化合物與生物標(biāo)記間的互相作用是，例如，藉由測量溶析速率而測量，溶析速率是鹽濃度的函數(shù)?？杀嬲J(rèn)出某些蛋白質(zhì)并切割表1中的一個(gè)或多個(gè)生物標(biāo)記，在此情況可藉由在標(biāo)準(zhǔn)檢定(例如，藉由所述蛋白質(zhì)的膠體電泳)中監(jiān)控一種或多種生物標(biāo)記的消化而檢驗(yàn)蛋白質(zhì)。
在相關(guān)的具體實(shí)例中，可測量測試化合物對(duì)一個(gè)或多個(gè)TableI中的生物標(biāo)記活性的抑制能力。在此技藝中具通常技術(shù)者將會(huì)辨認(rèn)測量特定生物標(biāo)記活性所用的技術(shù)是與該等生物標(biāo)記的功能與性質(zhì)是非常相關(guān)的。例如，可能拿來檢定的生物標(biāo)記的酵素活性提供可得的適當(dāng)受質(zhì)并提供可輕易測量的反應(yīng)產(chǎn)物的出現(xiàn)。有力的治療性測試化合物對(duì)抑制或增強(qiáng)所給定的生物標(biāo)記的能力可藉由在有試驗(yàn)化合物存在下或沒有所述化合物存在下測量催化的速率而量定?？蓽y量測試化合物干擾其中一個(gè)表1的生物標(biāo)記的非酵素性(例如，結(jié)構(gòu)性)功能或活性的能力。例如，包括其中一個(gè)表1的生物標(biāo)記的多重蛋白質(zhì)復(fù)合體的自組裝可藉由光譜儀在有測試化合物或沒有測試化合物存在下監(jiān)控?；蛘?，如果該生物標(biāo)記是轉(zhuǎn)錄的非酵素性增強(qiáng)劑，干擾該等生物標(biāo)記的能力以增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的測試化合物可藉由在活體內(nèi)或活體外有該測試化合物或沒有該化合物存在下測量與生物標(biāo)記相關(guān)的轉(zhuǎn)錄的程度而鑒定。
能夠調(diào)節(jié)表1的任何生物標(biāo)記的試驗(yàn)化合物可投與給罹患乳癌或其它癌癥或處于有發(fā)展成所述癌癥的風(fēng)險(xiǎn)的患者。例如，如果特定的生物標(biāo)記在活體內(nèi)預(yù)防乳癌的蛋白質(zhì)的堆積，則投與增加該特定生物標(biāo)記的活性的測試化合物可能在患者中減少乳癌的風(fēng)險(xiǎn)。相反地，如果該生物標(biāo)記是，至少部分是，癌癥發(fā)病的原因，則減少該特定生物標(biāo)記的活性的測試化合物的投與，可能在患者中減少乳癌的風(fēng)險(xiǎn)。
在另外一方面，本發(fā)明提供鑒定對(duì)治療疾病有用的化合物的方法，該等疾病，例如，與ITIH4片段1、ITIH4片段1b、C3a-desArgΔ8，和/或C3a-desArg修飾型的量增加有關(guān)的乳癌。例如，在一個(gè)具體實(shí)例中，可在細(xì)胞萃取物或表達(dá)數(shù)據(jù)庫中篩選出催化全長的ITIH4或C3a-desArg切割形成截短型的化合物。
在此等篩選測定的一個(gè)具體實(shí)例中，可藉由將螢光物質(zhì)(fluorophore)貼附至該生物標(biāo)記來檢驗(yàn)該等生物標(biāo)記的切割，當(dāng)該等生物標(biāo)記是未經(jīng)切割時(shí)螢光物質(zhì)維持不發(fā)光(quench)的狀態(tài)，但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)經(jīng)過切割則螢光物質(zhì)發(fā)出螢光(fluoresce)。或者，修飾全長的生物標(biāo)記使得藉于某些不可切割的胺基酸之間的醯胺鍵可用來選擇性的鍵結(jié)或「捕集(trap)」在活體內(nèi)在該位置切割全長的生物標(biāo)記的細(xì)胞蛋白酶。篩選以及鑒定蛋白酶以及其標(biāo)的的方法在科學(xué)文獻(xiàn)中是有完整記載的，例如，記載于Lopez-Ottin等人的文章中。(Nature Reviews，3509-519(2002))。
在又另外具體實(shí)例中，本發(fā)明提供治療或減少疾病(例如，乳癌)進(jìn)展或可能性的方法，該方法與截短的ITIH4或C3a-desArg的量增加有關(guān)。例如，在鑒定出一個(gè)或多個(gè)切割全長的生物標(biāo)記的蛋白質(zhì)之后，可在組合數(shù)據(jù)庫(Combinatorial Library)中篩選出抑制所辨識(shí)的蛋白質(zhì)的切割活性的化合物。在化學(xué)數(shù)據(jù)庫中篩選該等化合物的方法在此技藝中是咸知的。見，例如，Lopez-Otin等人(2002)。另外，抑制化合物可基于ITIH4或C3a-desArg的結(jié)構(gòu)明智地設(shè)計(jì)。
在臨床標(biāo)準(zhǔn)(level)，篩選化合物包括從在受試體暴露至測試化合物之前或之后自測試化合物獲得樣品?？蓽y量并分析在樣品中表1中所列的一種或多種生物標(biāo)記的量以量定在暴露至測試化合物之后該生物標(biāo)記的量是否有改變?？山逵?，如本文所描述，以質(zhì)譜來分析樣品，或藉由在此技藝中具通常技術(shù)者所知的任何適當(dāng)手段來分析。例如，列示于表1中的一種或多種生物標(biāo)記的量可使用輻射-或螢光-標(biāo)定的專一性與該等生物標(biāo)記結(jié)合的抗體藉由西方墨點(diǎn)法來測量?；蛘?，可測量編碼一種或多種生物標(biāo)記的Mrna的量的改變并聯(lián)系該等改變量與所給定的測試化合物對(duì)受試體的投與間的關(guān)系。在進(jìn)一步的具體實(shí)例中，在一種或多種生物標(biāo)記的達(dá)量中的改變可使用活體外方法與材料來測量。例如，表達(dá)或能夠表達(dá)一種或多種表1的生物標(biāo)記的人類組織培養(yǎng)細(xì)胞可與測試化合物接觸。經(jīng)以測試化合物治療的受試體將例行性地檢查任何由于該等治療所造成的生理效應(yīng)。尤其，評(píng)估該測試化合物對(duì)在受試體減少其罹病可能性的能力?；蛘撸绻麑⒃摐y試化合物投與至先前診斷有乳癌的受試者，則將篩選該等測試化合物對(duì)減緩或停止該疾病進(jìn)程的能力。
8.實(shí)施例在以下實(shí)施例中，使用以下的材料與方法。
樣品回溯(restrospective)血清樣品是根據(jù)約翰斯霍普金斯臨床研究聯(lián)合委員會(huì)認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)流程自約翰霍普金斯臨床化學(xué)血清庫所獲得。在此研究中一共包括169個(gè)試樣。癌癥群組包括了得自不同臨床階段的乳癌患者(第0期(n＝4)、第I期(n＝38)、第II期(n＝37)及第III期(n＝24))的103個(gè)血清樣品所組成。診斷是經(jīng)過病理確認(rèn)的且試樣是在治療之前獲得的。這些患者其中六位的年齡信息無法得知。其余的96名患者的年齡中位數(shù)為56歲，范圍是34至87歲。非癌癥的控制組包括得自25名良性乳房疾病(BN)患者與41名健康婦女(HC)的血清。其中21名健康婦女的確切年齡無法得知。其余的20名健康婦女的年齡中位數(shù)為45歲，范圍是自39至57歲。良性狀態(tài)組的年齡中位數(shù)為48歲，范圍在自21至78歲之間。所有的樣品被存放在-80℃直到要使用時(shí)。
蛋白質(zhì)芯片分析對(duì)20μl的各個(gè)血清樣品添加8M尿素30μl、pH7.4的1％CHAP于PBS。該混合物是在4℃攪拌15分鐘并以1∶40稀釋在PBS中。根據(jù)制造商(Ciphergen Biosystems，Inc.，CA)的說明書將固定的金屬親和力捕捉芯片(IMAC3)以50mM的NiSO4活化。50μl的稀釋樣品使用96孔的生物處理器(Ciphergen Biosystems，Inc.，CA)施加于蛋白質(zhì)芯片數(shù)組的各個(gè)點(diǎn)上。于室溫中60分鐘于平板振蕩器上結(jié)合之后，該數(shù)組以100μl的PBS洗滌5分鐘進(jìn)行二次，之后再以100μl的去離子水快速清洗。在風(fēng)干之后，在50％乙腈、0.5％三氟乙酸中制備的飽和芥子酸(SPA)溶液0.5μl對(duì)各個(gè)點(diǎn)施加二次。鍵結(jié)至螯合金屬的蛋白質(zhì)(通過組胺酸、色胺酸、半胱胺酸或經(jīng)磷酸化的胺基酸)在PBS-II質(zhì)量讀取器上檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)是以240的強(qiáng)度以及8的檢驗(yàn)器敏感度以平均80的激光發(fā)射(laser shot)所收集。再現(xiàn)性是使用二個(gè)代表性的血清樣品估計(jì)，一個(gè)得自健康控制組而另一個(gè)得自癌癥患者。在二個(gè)生物處理器中各有一個(gè)IMAC-Ni芯片，將每種血清樣本點(diǎn)在所述芯片上總共8個(gè)的餌(bait)表面上。
生物信息學(xué)及生物統(tǒng)計(jì)學(xué)選擇具有M/Z介于2K及150K之間的合格質(zhì)量峰(S/N＞5，叢集量窗口定在(cluster mass window at)0.3％)并使用ProteinChip軟件3.0(Ciphergen Biosystems，Inc.，CA)將峰強(qiáng)度對(duì)總離子流(totalion current)做常態(tài)化。進(jìn)一步的預(yù)處理步驟包括對(duì)峰強(qiáng)度數(shù)據(jù)做對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，這是為了在感興趣的頻譜(M/Z 2kD至150kD)的整個(gè)范圍間獲得數(shù)據(jù)變異數(shù)(data variance)更一致性的量。
軟件包ProPeak(3Z Informatics，SC)用來計(jì)算以及排序每個(gè)個(gè)別的峰對(duì)將二個(gè)診斷組做最適分離的貢獻(xiàn)程度。ProPeak執(zhí)行UnifiedMaximum Separability Analysis(UMSA)算法的線性版本，該算法最初是報(bào)導(dǎo)作微數(shù)組數(shù)據(jù)分析之用。Z.Zhang等人，ApplyingClassification Separability Analysis to Microarray Data，in Proc.of Critical Assessment of Techniques for Microarray DataAnalysis(CAMDA100)，Kluwer Academic Publishers，2001。UMSA算法的主要特征是將數(shù)據(jù)分布信息并入至結(jié)構(gòu)風(fēng)險(xiǎn)最小化學(xué)習(xí)算法(structural risk minimization-learning algorithrm，Vapnik VN，Statistical Learning Theory，John Wiley&Sons，Inc.，New York，199814)以確認(rèn)出將二組數(shù)據(jù)作最佳分離所依循的方向。此方向代表原始變量的線性組合(加權(quán)總和)。與在該等組合中每個(gè)變量有關(guān)的加權(quán)測量了所述變量對(duì)朝向前述兩類數(shù)據(jù)的分離的方向的貢獻(xiàn)程度。
ProPeak基于分析模塊提供三個(gè)UMSA。第一個(gè)是組成分析模塊，該模塊將各個(gè)試樣以個(gè)別的點(diǎn)投射到三維組成空間。該組成(軸)是原始頻譜峰強(qiáng)度的線性組合。該軸所對(duì)應(yīng)的方向是當(dāng)循著該方向時(shí)兩組預(yù)設(shè)數(shù)據(jù)組群可達(dá)到最大可分離度。介于兩組群數(shù)據(jù)間的分離可在交互式3D顯示中檢視。第二個(gè)模塊是逐步選擇法(Stepwise Selection)，該模塊是使用向后逐步選擇程序以UMSA計(jì)算各個(gè)峰的顯著度分?jǐn)?shù)，并根據(jù)各峰對(duì)數(shù)據(jù)的兩組預(yù)設(shè)組群的聚集貢獻(xiàn)度。正向或負(fù)向得分表示對(duì)應(yīng)的罹病組質(zhì)量峰的表達(dá)程度是相對(duì)提高或下降，而該得分的絕對(duì)值代表該項(xiàng)得分對(duì)數(shù)據(jù)分離的相對(duì)重要性。為了避免在數(shù)據(jù)中僅基于無關(guān)的贗像的選擇，ProPeak的第三個(gè)模塊，也就是(靴帶法)BootStrap，使用靴帶程序重復(fù)UMSA數(shù)次，每次隨機(jī)地自量個(gè)組群遺漏固定百分比的樣品。對(duì)中位數(shù)及平均值進(jìn)行排序并估計(jì)每個(gè)峰相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差。有潛力的生物標(biāo)記應(yīng)該是中值和平均值排序最高且標(biāo)準(zhǔn)差排序最小的峰。當(dāng)作建立客觀選擇標(biāo)準(zhǔn)的方法，同樣的靴帶程序亦可用至隨機(jī)的數(shù)據(jù)，其中逐一的峰是模擬真實(shí)數(shù)據(jù)的分布。得自真實(shí)數(shù)據(jù)的結(jié)果與得自模擬數(shù)據(jù)者比較以建立在標(biāo)準(zhǔn)差排序上統(tǒng)計(jì)適當(dāng)?shù)慕厍兄祦磉x擇具有一致性表現(xiàn)的峰。
實(shí)施例1鑒定在早期檢測乳癌的生物標(biāo)記為了鑒定出在早期檢測乳癌的潛力生物標(biāo)記，得自第0至1期乳癌患者的試樣的蛋白質(zhì)圖譜(profile)與得自非乳癌控制組者相比較。前述數(shù)據(jù)的分析是使用ProPeak中的全部三個(gè)模塊以多次重復(fù)來執(zhí)行。通過此等重復(fù)過程，原本的全頻譜被削減成質(zhì)量峰的小型子集，該子集在兩個(gè)所選診斷組群間的最適分離中一致展現(xiàn)高程度的顯著度。
一旦小屏(small panel)的生物標(biāo)記被選取，使用得自第II和第III期癌癥患者的數(shù)據(jù)獨(dú)立的測試該等生物標(biāo)記對(duì)檢驗(yàn)乳癌的能力。使用多變相邏輯回歸分析衍生出基于整個(gè)數(shù)據(jù)組的綜合指數(shù)。評(píng)估包括得自二-樣品t試驗(yàn)(two-sample t-test)的p值的敘述性統(tǒng)計(jì)。接著對(duì)所選的生物標(biāo)記集該總和指數(shù)進(jìn)行接受者操作特征(ROC)曲線分析。使用靴帶程序來評(píng)估表現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)，諸如綜合指數(shù)的敏感性和專一性。Efron B和Tibshirani R.Bootstrap Methods for Standard Errors，Confidence Intervals，and Other Measures of StatisticalAccuracy。Statistical Science。1986；154-75。在此程序中，通過隨機(jī)重取樣(re-sampling)將所有患者的數(shù)據(jù)分成訓(xùn)練組以及試驗(yàn)組，訓(xùn)練組通過邏輯回歸除以綜合指數(shù)，而試驗(yàn)組則是用來計(jì)算敏感度以及專一性。重復(fù)數(shù)次重取樣。得自該等重復(fù)性的程序最后集合以形成對(duì)敏感度以及專一性的靴帶評(píng)估。
實(shí)施例2峰檢驗(yàn)以及數(shù)據(jù)預(yù)處理在IMAC-Ni2+芯片上所保留的血清蛋白質(zhì)在PBS-II質(zhì)量讀取器上分析。選取共計(jì)147個(gè)合于M/Z大于2KD的質(zhì)量峰(S/N＞5，叢集質(zhì)量窗口定在0.3％)。排除小于2KD的M/Z的峰以除去來自基質(zhì)的干擾。由使用多合一的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品(Ciphergen Biosystems，Inc.，CA)藉由外在校正達(dá)到0.1％的質(zhì)量精準(zhǔn)度。自該等分析而獲得的代表性頻譜顯示在第2圖。把對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換用于峰強(qiáng)度數(shù)值。在第3圖中的圖標(biāo)說明方差減少以及通過對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換所進(jìn)行的等化。
實(shí)施例3生物標(biāo)記的選擇是基于早期癌癥與非癌癥控制組為了鑒定具有早期檢驗(yàn)乳癌潛力的生物標(biāo)記，以早期癌癥作為陽性族群(第0至1期，n＝42)且以非癌癥控制組(HC+BN，n＝66)作為陰性族群進(jìn)行UMSA。使用所有147個(gè)質(zhì)量峰的UMSA衍生線性組合對(duì)兩組群間的可分離度進(jìn)行首度試驗(yàn)。當(dāng)比較整個(gè)蛋白質(zhì)圖譜時(shí)，區(qū)分出早期癌癥和非癌癥組群。第4A圖在UMSA組成的3D空間描繪早期癌癥(較淺)對(duì)于非癌癥(較深)。
為了選擇表現(xiàn)一致良好的生物標(biāo)記，使用ProPeak靴帶模塊重復(fù)地應(yīng)用UMSA達(dá)總計(jì)100次，且每次均有30％的遺漏率。同樣的程序亦應(yīng)用于模擬隨機(jī)數(shù)據(jù)組。衍生自該模擬數(shù)據(jù)的最小的標(biāo)準(zhǔn)差是7。在實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中，15個(gè)質(zhì)量峰的標(biāo)準(zhǔn)差小于所述值。選取該質(zhì)量峰的子集作為進(jìn)一步分析的候選生物標(biāo)記。他們的平均排序及對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差繪制于第4圖。
為了進(jìn)一步在此候選生物標(biāo)記減少的組中排列峰，使用ProPeak的逐步選擇模塊。該15個(gè)峰的相對(duì)顯著分?jǐn)?shù)的絕對(duì)值(見表5)以遞減次序繪制于第8A圖，該圖顯示介于二個(gè)群組數(shù)據(jù)之間的主要可分性是由前六個(gè)峰所貢獻(xiàn)。在這些六個(gè)峰之中，四個(gè)是獨(dú)一的(unique)。其它兩個(gè)經(jīng)使用蛋白質(zhì)芯片軟件3.0鑒定為該等獨(dú)一的峰其中2個(gè)的二價(jià)型式。該等峰的二價(jià)和一價(jià)形式的鑒定提示了在區(qū)辨該等所選的兩個(gè)診斷組群中的重要性。移除二價(jià)型式，再次使用逐步選擇法將該等四個(gè)獨(dú)一的峰重組并加以評(píng)估。重新計(jì)算的相對(duì)顯著得分繪制在第6B圖。最后選擇得分最高的3個(gè)峰為乳癌檢驗(yàn)的潛力生物標(biāo)記，標(biāo)示為BC1、BC2和BC3。BC1顯示為下調(diào)(負(fù)向得分)而BC2和BC3顯示為上調(diào)(正向得分)。使用所述3個(gè)生物標(biāo)記的第0期至第I期乳癌對(duì)非乳癌控制組的3D圖顯示在第4B圖中。
實(shí)施例4所選生物標(biāo)記的評(píng)估所述三個(gè)生物標(biāo)記的敘述性統(tǒng)計(jì)列于表2。第7圖顯示得自ROC分析的結(jié)果。在此三個(gè)生物標(biāo)記之中，BC3展現(xiàn)最強(qiáng)的單一診斷力。BC3在跨越各診斷群組間(包括癌癥患者的臨床階段)的分布繪制于第8A圖。單獨(dú)使用BC3在0.8的截切值以區(qū)別該等診斷組的敏感性及專一性列于表3A。
對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換峰強(qiáng)度的估計(jì)CV值為BC1為6％、BC2為7％，以及BC3為13％(數(shù)據(jù)無顯示)。在此三個(gè)生物標(biāo)記之中，BC3具有最大的CV值13％。相較而言，BC3的平均值在癌癥患者幾乎是90％，在非癌癥控制組的平均值之上(根據(jù)表2數(shù)據(jù)計(jì)算)。
表2 BC1、BC2和BC3的敘述性統(tǒng)計(jì)，及其衍生自綜合指數(shù)的邏輯回歸。所有3個(gè)生物標(biāo)記以及該綜合指數(shù)在非癌癥控制組與第0至I期之間的差異，和非癌癥控制組與第II至III期之間的差異，都達(dá)統(tǒng)計(jì)顯著(p＜0.000001)。
實(shí)施例5三個(gè)所選的生物標(biāo)記的組合使用第9圖在所有對(duì)偶比對(duì)的生物標(biāo)記組合中比較在所有臨床階段的癌癥患者對(duì)非癌癥控制組的分布。基于此等觀察，使用多變量邏輯回歸將3個(gè)所選的生物標(biāo)記合并以形成單值的綜合指數(shù)。該綜合指數(shù)的敘述性統(tǒng)計(jì)附于表2。跨越各診斷群的綜合指數(shù)的分布描繪在第8B圖。該綜合指數(shù)的ROC曲線分析提供相較于得自個(gè)別生物標(biāo)記的AUC(第7圖)要大上許多的AUC。
使用靴帶交叉驗(yàn)證以評(píng)估綜合指數(shù)的診斷表現(xiàn)(20次；在每次測試中，70％的樣品隨機(jī)地選取為綜合指數(shù)離差(composite indexderivation)而剩余的30％做為測試)。所估計(jì)的敏感度與專一性列于表3B。
亦評(píng)估該等三個(gè)有潛力的生物標(biāo)記關(guān)于pT(腫瘤大小)以及pN(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)種類的量。并未觀察到顯著的相關(guān)性。
表3A BC3的診斷表現(xiàn)
表3B 衍生自使用BC1、BC2、BC3的邏輯回歸所衍生的綜合指數(shù)的經(jīng)拔靴法所估計(jì)的診斷表現(xiàn)
實(shí)施例6使用ProteinChip數(shù)組及SELDI質(zhì)譜儀藉由血清蛋白質(zhì)體分析來原位檢驗(yàn)乳癌分析有乳癌以及沒有乳癌的婦女的169個(gè)血清樣品的蛋白質(zhì)圖譜，鑒定一系列3個(gè)蛋白質(zhì)(8.9KD、8.1KD、4.3KD)，所述的三個(gè)生物標(biāo)記組合使用可高敏感度(第0至III期，93％)且專一性地(健康控制組+良性，91％)檢驗(yàn)乳癌。在此三個(gè)標(biāo)記之中，8.9KD的蛋白質(zhì)表現(xiàn)的最好。達(dá)到85％的敏感度，以及91％的專一性。
乳管(ductal)及小葉(lobular)原位癌(DCIS及LCIS)是非浸潤性乳癌的最早期型式(第0期)。幾乎100％在乳癌早期診斷出的婦女都是可治愈的。為了驗(yàn)證這些標(biāo)記對(duì)乳癌早期檢驗(yàn)的功效，使用由聯(lián)合機(jī)構(gòu)所收集的血清來評(píng)估前述3個(gè)所鑒定出來的生物標(biāo)記的表現(xiàn)。采樣對(duì)象包括了由17名帶有DCIS的婦女，1名LCIS，8名良性乳房疾病者，以及40名年齡大致上配對(duì)的健康控制組(45至65歲)。在如前所述的同樣實(shí)驗(yàn)條件下，使用IMAC-Ni(固定的金屬親合力捕捉)蛋白質(zhì)芯片數(shù)組產(chǎn)生三重復(fù)的蛋白質(zhì)圖譜。在不同診斷組群間使用二樣品t試驗(yàn)來比較所述三個(gè)蛋白質(zhì)的對(duì)數(shù)相關(guān)強(qiáng)度。在所述三種生物標(biāo)記中的二個(gè)(8.9KD及8.1KD)的表達(dá)模式與先前的結(jié)果是一致的。此二個(gè)生物標(biāo)記的p值與ROC曲線下面積總結(jié)于表四中。
表4統(tǒng)計(jì)分析的總結(jié)
DCIS，乳管原位癌；LCIS，小葉原位癌；HC，健康控制組；BN，良性下列各引用亦以參考文獻(xiàn)并入本文。
1.Jemal A，Thomas A，Murray T，Thun M.Cancer statistics，2002.CA Cancer J Clin.2002；5223-47.
2.National Cancer Institute.Cancer Net PDQ CancerInformation Summaries.Monographs on″Screening for breastcancer.″http://cancer net.nci.nih.gov/pdq.html(UpdatedJanuary 2001).
3.Antman K，Shea S.Screening mammography under age 50.JAMA.1999；2811470-2.
4.Chan DW，Beveridge RA，Muss H，F(xiàn)ritsche HA，HortobagyiG，Theriault R，等人.Use of Truquant BR Radioimmunoassay forearly detection of breast cancer recurrence in patients withstage II and stage III disease，J Clin.Oncology.1997；152322-2328.
5.Karas M，Hillenkamp F.Laser desorption ionization ofproteins with molecular masses exceeding 10,000道耳吞.AnalChem.1988；602299-2301.
6.Hutchens TW，Yip TT.New desorption strategies for themass spectrometric analysis of micfomolecules.Rapid Commun.Mass Spectrom.1993；7576-80.
7.Merchant M，Weinberger SR.Recent advancements insurface-enhanced laser desorption/ionization-time offlight-mass spectrometry.Electrophoresis.2000；211 164-67.
8.Wright Jr GL，Cazares LH，Leung S-M，Nasim S，Adam B-L，Yip T-T，等人.ProteinChipsurface enhanced laserdesorption/ionization(SELDI)mass spectrometrya novelprotein biochip technology for detection of prostate cancerbiomarkers in complex protein mixtures.Prostate Cancer ProstateDis.1999；2264-76.
9.Hlavaty JJ，Partin AW，Kusinitz F，Shue MJ，Stieg M，Bennett K，Briggman JV.Mass spectroscopy as a discovery toolfor identifying serum markers for prostate cancer.Clin.Chem.[Abstract].2001；471924-26.
10.Paweletz CP，Trock B，Pennanen M，Tsangaris T，MagnantC，Liotta LA，等人.Proteomic patterns of nipple aspirate fluidsobtained by SELDI-TOFpotential for new biomarkers to aid inthe diagnosis of breast cancer.Dis Markers.2001；17301-7.
11.Vlahou A，Schellhammer PF，Medrinos S，Patel K，KondylisFI，Gong L，等人.Development of a novel proteomic approach forthe detection of transitional cell carcinoma of the bladder inurine.Am J Pathol.2001；1581491-502.
12.Patricoin EF III，Ardekani AM，Hitt BA，Levine PJ，F(xiàn)usaroVA，Steinberg SM，等人.Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer.The Lancet.2002；359572-577.
13.Zhang Z，Page G，Zhang H.Applying ClassificationSeparability Analysis to Microarray Data，in Proc.of CriticalAssessment of Techniques for Microarray Data Analysis(CAMDA’00)，Kluwer Academic Publishers，2001.
14.Vapnik VN，Statistical Learning Theory，John Wiley&Sons，Inc.，New York，1998.
15.Efron B and Tibshirani R.Bootstrap Methods for StandardErrors，Confidence Intervals，and Other Measures of StatisticalAccuracy.Statistical Science.1986；154-75.
8.2.實(shí)施例7.生物標(biāo)記BC-1、BC-2，及BC-3的鑒定材料與方法患者的樣品選取并回顧地分析得自176名婦女的血清樣品。這些血清是從2000年至2002年由意大利的國家癌癥中心所收集并且存放在-30℃直到要使用時(shí)。所有婦女都在收集血清之前提供知情同意，血清的收集是作為IRB(內(nèi)部調(diào)節(jié)委員會(huì))所認(rèn)可的研究之用。癌癥群組包括32例的DCIS(36至80歲，平均值56歲)以及61例的浸潤性乳癌(47例的乳管浸潤，9例的小葉浸潤以及5例有乳管和小葉混合)(24至84歲，平均值＝56歲)。診斷是經(jīng)病理證實(shí)的，且試樣是在治療之前所獲得。癌癥患者額外的臨床信息包括ER/PR狀態(tài)、Elston等級(jí)、腫瘤大小及淋巴結(jié)狀態(tài)(僅在浸潤性案例)?？刂平M包括患有各種良性乳房疾病的37名婦女，包括13例非典型者(18至77歲，平均值44歲)，及46明年齡大致配對(duì)的健康婦女(44至68歲，平均值＝52歲)。
SELDI蛋白質(zhì)圖譜使用IMAC-Ni(固定的金屬親和力捕捉)芯片數(shù)組在如前所述的相同結(jié)合以及洗滌條件下產(chǎn)生蛋白質(zhì)圖譜。簡而言之，我們添加了9M的尿素45ml、2％CHAPS、50mM Tris-HCl、pH9的各個(gè)血清樣品30ml。該混合物是在4℃攪拌15分鐘并以pH7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)進(jìn)行1∶40稀釋。根據(jù)制作商的說明書(Ciphergen Biosystems，CA)，IMAC3芯片數(shù)組以5.0mM NiSO4活化。50ml經(jīng)稀釋的樣品藉由使用96孔的生物處理器(Ciphergen Biosystems，CA)施加于蛋白質(zhì)芯片數(shù)組上的各個(gè)點(diǎn)。在平臺(tái)振動(dòng)器上于室溫結(jié)合60分鐘之后，該數(shù)組以100ml的PBS洗滌二次，每次各5分鐘，隨后以100ml的dH2O快速的沖洗二次。在風(fēng)干以后，在50％乙腈中制備0.5ml的飽和芥子酸(SPA)，對(duì)每個(gè)點(diǎn)施加兩次0.5％的三氟乙酸。所有步驟都使用Biomek 2000工作站自動(dòng)化。試樣在芯片數(shù)組上的配置是隨機(jī)的。各個(gè)試樣在三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中重復(fù)處理和分析。結(jié)合至芯片表面上的蛋白質(zhì)以PBS-II蛋白質(zhì)芯片讀取器(Ciphergen Biosystems，CA)檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)平均由80發(fā)激光以240的強(qiáng)度及8的探測器敏感度收集。
生物信息學(xué)及生物統(tǒng)計(jì)學(xué)在本研究中所用的數(shù)據(jù)分析過程包括以下步驟(a)峰檢驗(yàn)。使用ProteinChip軟件3.0(Ciphergen Biosystems，CA)收集并評(píng)估原始頻譜。每組196個(gè)試樣(包括176個(gè)研究血清和20個(gè)品質(zhì)控制血清(quality control sera(得自Serologicals Corp，GA的匯集人類血清)))匯編、減去基線并使用多合一蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品(Ciphergen Biosystem，CA)做外部校正。具有質(zhì)荷比(m/z)介于2K及150K之間的合格質(zhì)量峰(目視檢驗(yàn))是手動(dòng)選取。將峰強(qiáng)度常態(tài)化至具有同樣外部系數(shù)的總離子流，其m/z介于2.0kD及150kD之間，并將該等數(shù)據(jù)匯出至Excel窗體。
(b)再現(xiàn)性的評(píng)估復(fù)制的再現(xiàn)性是由計(jì)算每對(duì)復(fù)制相關(guān)性并如字匯集的人類血清中計(jì)算來計(jì)算所述三個(gè)報(bào)導(dǎo)的峰的CV。如果沒有觀察到系統(tǒng)性的偏見，對(duì)在復(fù)制中所鑒定出的峰強(qiáng)度取平均且接著作對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。
(c)標(biāo)記評(píng)估。二樣品t測試及接收者操作特征(ROC)曲線分析(在MATLAB中執(zhí)行內(nèi)部軟件，6.0版)執(zhí)行所選生物標(biāo)記的評(píng)估。
蛋白質(zhì)鑒定根據(jù)個(gè)別的生物化學(xué)特性使用一系列的蛋白質(zhì)分離程序(包括陰離子交換、尺寸排斥(size exclusion)，及反相層析法)進(jìn)行蛋白質(zhì)純化，再接著SDS-PAGE分離。為了監(jiān)控純化程序，健康控制組樣品與癌癥樣品平行處理。在各次重復(fù)(iteration)期間，在蛋白質(zhì)芯片數(shù)組上解析新片段的圖譜以監(jiān)控感興趣的生物分子有否出現(xiàn)。含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的膠體條帶藉由所洗脫的蛋白質(zhì)的芯片分析而鑒定，并以ASP-N消化。在PBSII蛋白質(zhì)芯片讀取器上得到勝肽指紋圖譜。使用該蛋白質(zhì)分解片段的質(zhì)量以ProFound算法搜尋數(shù)據(jù)庫。為了確認(rèn)，含有蛋白質(zhì)水解片段的NP20數(shù)組的分析是使用配備有蛋白質(zhì)芯片數(shù)組接口(Ciphergen)的PE SciexQstar(Concord，Canada)藉由碰撞引致的解離(collision-induced dissociation)來進(jìn)行。使用UCSFProteinProspector MS-Tag程序進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。
CA15-3CA15-3的值是使用IRMA-mat CA 15-3測定(Byk-SangtecDiagnostica Dietzenbach-Germany)。
由SELDI評(píng)估BC-1、BC-2及BC-3
總計(jì)71個(gè)峰叢集手動(dòng)選擇在2KD至150KD的質(zhì)量區(qū)域者。三個(gè)獨(dú)立的SELDI實(shí)驗(yàn)的再現(xiàn)性是利用相關(guān)分析來評(píng)估。在復(fù)制之間的相關(guān)系數(shù)(r)是0.885(復(fù)制1對(duì)于2)，0.893(復(fù)制1對(duì)于3)及0.865(復(fù)制2對(duì)于3)。既然介于復(fù)制對(duì)之間沒有鑒定出系統(tǒng)偏差，在各個(gè)M/Z值的平均峰強(qiáng)度用于更進(jìn)一步的分析。BC-1(4.3KD)、BC-2(8.1KD)及BC-3(8.9KD)的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換峰強(qiáng)度的預(yù)估CV分別為0.172、0.117，及0.156。
為達(dá)比較的目的，顯示在兩組數(shù)據(jù)的BC-1、BC-2及BC-3。與我們之前的結(jié)果一致，在癌癥中BC-2及BC-3的程度是上升的，包括DCIS(第10及11圖)。然而，之前在癌癥中發(fā)現(xiàn)的程度是很低的BC-1，在目前數(shù)據(jù)中的癌癥組群是上升的。因此BC-1表現(xiàn)是不穩(wěn)定的。
實(shí)施例3.蛋白質(zhì)鑒定與SELDI評(píng)估平行，我們量定所述三個(gè)標(biāo)記的蛋白質(zhì)鑒定。
m/z為4.3KD的BC-1，鑒定出來是人類的α間胰蛋白酶抑制劑的片段，重鏈H4(在本文中亦稱為″ITIH4″、″IAIH4，或″PK-120″)。
m/z為8.1KD的BC-2，是C3a-desArg的截短型(在本文中亦稱為C3a-desArg-8.1或C3a-desArgΔ8)。C3a-desArgΔ8的胺基酸序列是SVQLTEKRMDKVGKYPKELRKCCEDGMRENPMRFSCQRRTRFISLGEACKKVFLDCCNYITELRRQHA(SEQ ID NO2)。這個(gè)型式的理論分子量為8132道耳吞，且預(yù)計(jì)pI值是9.38。
m/z為8.9KD的BC-3，經(jīng)鑒定為C3a-desArg。蛋白質(zhì)鑒定的程序和結(jié)果顯示在圖18至19。C3a-desArg的胺基酸序列是SVQLTEKRMDKVGKYPKELRKCCEDGMRENPMRFSCQRRTRFISLGEACKKVFLDCCNYITELRRQHARASHLGLA，如SEQ ID NO1所提出。它的預(yù)計(jì)分子量是8923道耳吞，與測量的質(zhì)量8926道耳吞一致，且預(yù)計(jì)的pI值是9.54，與在pH9.0時(shí)它不能與陰離子交換樹脂結(jié)合的結(jié)果是一致的。
BC-2及BC-3的鑒定進(jìn)一步的使用單株抗體拮抗C3a藉由免疫捕捉證實(shí)(圖12)。同樣地，BC-1是由抗ITIH4抗體所捕捉。
使用在芯片上的免疫分析獨(dú)立地確認(rèn)BC-2及BC-3隨機(jī)地選取血清樣品中的小型子群(10例正常、9例良性，10例DCIS以及10例浸潤性者)做為使用抗C3a抗體的IP下拉(IP pull down)實(shí)驗(yàn)之用。在癌癥與非癌癥群組中被捕捉的C3a-desArg和C3a-desArg-8.1的分布與SELDI結(jié)果(圖13和14)是一致的。
4.6KD的ITIH4片段(ITIH4片段1b；BC-1b)在兩群中與在癌癥中的下調(diào)一致。
ITIH4經(jīng)劇烈的處理(heavily processed)，且在血清中觀察到數(shù)個(gè)IHIH4片段。為了調(diào)查BC-1分布的不一致是否由于不穩(wěn)定性導(dǎo)致，我們亦評(píng)估全長ITIH4的分布，以及各種的處理中的產(chǎn)品。
發(fā)現(xiàn)4.6KD的片段在兩群中都是在癌癥中下調(diào)，如在第15圖所描繪的散點(diǎn)圖顯示。蛋白質(zhì)鑒定的構(gòu)形顯示在第16圖。
評(píng)估生物標(biāo)記和CA15-3的診斷表現(xiàn)雖然僅推薦作為晚期乳癌的治療或復(fù)發(fā)的監(jiān)控，CA15-3及CA27.29是由食品藥物管理局所批準(zhǔn)測驗(yàn)乳癌的二個(gè)主要所用的血清腫瘤標(biāo)記試驗(yàn){Chan DW，2001#46}。為了調(diào)查CA15-3在本研究群中是否具有任何區(qū)辨能力，我們使用IRMA-mat CA 15-3(Byk-Sangtec DiagnosticaDietzenbach -Germany)測量血清CA15-3的量。在176個(gè)所試驗(yàn)的研究血清中，使用30unit/ml為截切值僅5個(gè)(均得自浸潤性癌癥患者)測試結(jié)果為正向。在健康控制組、良性、DCIS及浸潤性癌癥組群(數(shù)據(jù)未顯示)并未觀察到顯著的不同。CA15-3在乳癌的檢驗(yàn)是效果不佳的。就ROC分析而論所評(píng)估的三個(gè)生物標(biāo)記的診斷表現(xiàn)呈現(xiàn)在第17圖。在確認(rèn)數(shù)據(jù)中BC-2、BC3、4.6在曲線下的面積分別是0.65、0.70，及0.68。
咸理解本文所述的實(shí)施例和具體實(shí)例僅為了達(dá)到說明的目的，按照該等實(shí)施例所做的各種調(diào)整或改變將是在此技藝中具通常技術(shù)之人所能聯(lián)想且包括在本文的精神、本申請(qǐng)案的范圍以及所附的權(quán)力要求范圍中。本文所引用的所有出版品、專利，以及專利申請(qǐng)案為所有目的都以參考文獻(xiàn)方式全文并入至本文中。
高通量的蛋白質(zhì)表現(xiàn)的測量的技術(shù)發(fā)展使得有可能大規(guī)模的比較臨床試樣的蛋白質(zhì)表現(xiàn)模式。然而，在大量生物變化性出現(xiàn)中篩選出真正與特定疾病進(jìn)程有關(guān)的新的診斷性標(biāo)記，以及由預(yù)分析性(pre-analytical)和分析性變因所造成的數(shù)據(jù)偏差，仍然是具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。
在先前的研究中，我們使用SELDI及PoteinChip數(shù)組分析169個(gè)患有乳癌或沒有乳癌的患者的血清蛋白樣品圖譜。使用ProPeak選取具有對(duì)患有乳癌與沒有乳癌群最適分離有顯著貢獻(xiàn)的蛋白質(zhì)/勝肽，ProPeak是發(fā)展作為DNA數(shù)組及蛋白質(zhì)數(shù)組數(shù)據(jù)分析的內(nèi)部軟件包{Zhang，2001#176}。為了避免選取其高分辨能力純粹是偶然由在數(shù)據(jù)中與疾病進(jìn)程無關(guān)的贗影所造成的錯(cuò)誤標(biāo)記，在我們的數(shù)據(jù)分析中采取數(shù)個(gè)步驟。首先，ProPeak拔靴模塊在多次操作下引入隨機(jī)擾動(dòng)(random perturbation)并使用經(jīng)平均的峰排序以提供峰區(qū)辨能力更可靠的估計(jì)值{Efron，1986#178}。其次，為了在峰的標(biāo)準(zhǔn)差排序上建立對(duì)其表現(xiàn)不認(rèn)為是純粹偶發(fā)的截切值的上界，應(yīng)用同樣的拔靴程序以隨機(jī)產(chǎn)生模擬真實(shí)數(shù)據(jù)的分布的數(shù)據(jù)組。得自「模擬的峰」的標(biāo)準(zhǔn)差排序的最小值表示由于隨機(jī)的機(jī)會(huì)所可能達(dá)到的峰的一致的程度。該最小值是用作為減少原始的147個(gè)峰的截切值，所述的減少是為了將其表現(xiàn)應(yīng)最不可能是由于在數(shù)據(jù)內(nèi)的贗影所造成的15個(gè)排列最前的峰形成子集。所述的3個(gè)最顯著的區(qū)辨者，也就是BC-1、BC-2和BC-3在該經(jīng)縮減的頻譜峰組中使用向后逐步選擇法進(jìn)一步選取。盡管我們采取數(shù)個(gè)步驟以減少由分析性變因所造成的錯(cuò)誤標(biāo)記，但既然本研究并不具有完全獨(dú)立的試驗(yàn)組，所述3個(gè)標(biāo)記的正確性仍是有限的。該所選取的標(biāo)記的區(qū)辨力可能仍與特定預(yù)分析偏差有關(guān)，諸如在收集程序中或不同診斷組群儲(chǔ)存條件中的差異。為針對(duì)此議題，以及評(píng)估所述標(biāo)記對(duì)檢驗(yàn)乳癌的早期型式，我們使用由合作機(jī)構(gòu)所獨(dú)立收集的DCIS血清對(duì)該等標(biāo)記進(jìn)行試驗(yàn)。盡管我們不可排除在兩組中都有同樣的預(yù)分析偏差出現(xiàn)，但這個(gè)機(jī)會(huì)應(yīng)該是非常低的。
總結(jié)來說，我們使用由獨(dú)立來源所收集的血清評(píng)估3個(gè)血清生物標(biāo)記對(duì)乳癌早期檢測的表現(xiàn)。雖然有數(shù)屏的生物標(biāo)記已報(bào)導(dǎo)為針對(duì)各種疾病的檢測，其使用SELDI及ProteinChip數(shù)組{Adam，2002#171；Adam，2003#22；Clarke，2003#116；Koopmann，2004#78；Li，2002#137；Paweletz，2001#36；Petricoin，2002#170；Rosty，2002#143；Vlahou，2003#48；Vlahou，2001#174；Vlahou 2003#90}{Li，2004#346}，這到目前為止是第一個(gè)使用獨(dú)立測試組的確認(rèn)性研究(validation study)。然而目前確認(rèn)為乳癌的血清腫瘤標(biāo)記諸如CA15-3在乳癌的早期檢測仍然效果不彰，此評(píng)的生物標(biāo)記具有區(qū)辨早期乳癌對(duì)健康控制組的潛能。
權(quán)利要求
1.一種鑒定受試者乳癌狀態(tài)的方法，包括(a)測量得自該受試者的生物樣本的至少一個(gè)生物標(biāo)記，其中至少一個(gè)生物標(biāo)記是選自表1的生物標(biāo)記所組成的組群；以及(b)聯(lián)系該測量結(jié)果和乳癌狀態(tài)的關(guān)聯(lián)性。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中至少一個(gè)生物標(biāo)記是選自由下列者所組成的組群ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8或C3a-desArg。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，包括測量以下各者ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8或C3a-desArg。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，進(jìn)一步包括量測CA15-3。
5.如權(quán)利要求1、2或3中任一權(quán)利要求所述的方法，其中該至少一個(gè)生物標(biāo)記是通過捕捉在SELDI探針的吸附物表面上的生物標(biāo)記，且通過激光解吸離子化質(zhì)譜分析技術(shù)檢測該捕捉的生物標(biāo)記而測量。
6.如權(quán)利要求1、2或3中任一權(quán)利要求所述的方法，其中至少一種生物標(biāo)記是以免疫測定所測量的。
7.如權(quán)利要求6中所述的方法，其中至少一個(gè)生物標(biāo)記是使用對(duì)至少一個(gè)生物標(biāo)記有專一性的抗體所檢測。
8.如權(quán)利要求1、2或3中任一權(quán)利要求所述的方法，其中至少一個(gè)生物標(biāo)記是使用除了質(zhì)譜以外的方法所檢測。
9.如權(quán)利要求1、2或3中任一權(quán)利要求所述的方法，其中的樣本是血清。
10.如權(quán)利要求1、2或3中任一權(quán)利要求所述的方法，其中該關(guān)聯(lián)是由分類算法軟件所執(zhí)行。
11.如權(quán)利要求1、2或3中任一權(quán)利要求所述的方法，其中的乳癌狀態(tài)是選自乳癌或非乳癌。
12.如權(quán)利要求1、2或3中任一權(quán)利要求所述的方法，其中的乳癌狀態(tài)是選自非浸潤性乳癌或浸潤性乳癌。
13.如權(quán)利要求1、2或3中任一權(quán)利要求所述的方法，進(jìn)一步包括(c)基于受試者的狀態(tài)來進(jìn)行受試者的治療。
14.如權(quán)利要求5所述的方法，其中該吸附物是IMAC-Ni吸附物。
15.如權(quán)利要求5所述的方法，其中該吸附物是生物專一性吸附物。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中該生物專一性吸附物包括抗體。
17.如權(quán)利要求11所述的方法，其中如果該測量結(jié)果與乳癌有關(guān)聯(lián)，則對(duì)該受試者進(jìn)行的治療包括對(duì)該受試者投予化學(xué)治療藥劑或?qū)υ撌茉囌哌M(jìn)行輻射。
18.如權(quán)利要求11所述的方法，進(jìn)一步包括(d)在受試者的進(jìn)行治療之后測量至少一個(gè)生物標(biāo)記，并將該測量結(jié)果和疾病進(jìn)程關(guān)聯(lián)。
19.一種包括在得自受試者的樣本測量至少一種生物標(biāo)記的方法，其中至少一種生物標(biāo)記是選自由表1的生物標(biāo)記所組成的組群。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中至少一種生物標(biāo)記是選自由下列者所組成的組群ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8或C3a-desArg。
21.一種如權(quán)利要求19所述的方法，包括測量以下生物標(biāo)記各者ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8或C3a-desArg。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，進(jìn)一步包括測量CA15-3。
23.如權(quán)利要求19、20或21中任一權(quán)利要求所述的方法，其中該生物標(biāo)記是通過捕捉在SELDI探針的吸附物表面上的生物標(biāo)記，且通過激光解吸離子化質(zhì)譜分析技術(shù)檢測所捕捉的生物標(biāo)記而測量。
24.如權(quán)利要求19、20或21中任一權(quán)利要求所述的方法，其中的樣本是血清。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其中該吸附物是IMAC-Ni吸附物。
26.如權(quán)利要求23所述的方法，其中該吸附物是生物專一性吸附物。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中該吸附物包括抗體。
28.一種試劑盒，包括(a)一個(gè)固態(tài)支持體，包括至少一種附連于其上的捕捉試劑，其中該捕捉試劑鍵結(jié)至由表1的生物標(biāo)記所組成的第一組群的至少一個(gè)生物標(biāo)記；以及(b)使用該固態(tài)支持體以檢測表1的生物標(biāo)記的說明書。
29.如權(quán)利要求28所述的試劑盒，包括使用該固態(tài)支持體檢測選自由下列者所組成的組群的生物標(biāo)記的說明書ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8或C3a-desArg。
30.如權(quán)利要求28所述的試劑盒，包括使用該固態(tài)支持體檢測下列生物標(biāo)記的各者的說明書ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8或C3a-desArg。
31.如權(quán)利要求30所述的試劑盒，進(jìn)一步包括使用該固態(tài)支持體以檢測CA15-3的說明書。
32.如權(quán)利要求28、29或30中任一權(quán)利要求所述的試劑盒，其中包括捕捉試劑的該固態(tài)支持體是SELDI探針。
33.如權(quán)利要求28、29或30中任一權(quán)利要求所述的試劑盒，其中該捕捉試劑是抗體。
34.如權(quán)利要求28、29或30中任一權(quán)利要求所述的試劑盒，額外包括(c)包含至少一種表1的生物標(biāo)記的容器。
35.如權(quán)利要求28、29或30中任一權(quán)利要求所述的試劑盒，額外包括(c)IMAC-Ni層析法吸收物。
36.一種試劑盒，包括(a)一個(gè)固態(tài)支持體，包括至少一種附連于其上的捕捉試劑，其中該捕捉試劑鍵結(jié)至由表1的生物標(biāo)記所組成的第一組群的至少一個(gè)生物標(biāo)記；以及(b)含有至少一個(gè)該生物標(biāo)記的容器。
37.如權(quán)利要求36所述的試劑盒，其中該容器含有選自由下列者所組成的組群的至少一種生物標(biāo)記ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8或C3a-desArg。
38.如權(quán)利要求36所述的試劑盒，其中該容器含有下列各個(gè)生物標(biāo)記ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8或C3a-desArg。
39.如權(quán)利要求38所述的試劑盒，其中該容器進(jìn)一步包含CA15-3。
40.如權(quán)利要求36、37或38中任一權(quán)利要求所述的試劑盒，其中包括捕捉試劑的該固態(tài)支持體是SELDI探針。
41.如權(quán)利要求36、37或38中任一權(quán)利要求所述的試劑盒，額外包括(c)IMAC-Ni層析法吸收物。
42.如權(quán)利要求36、37或38中任一權(quán)利要求所述的試劑盒，其中該捕捉試劑是IMAC-Ni吸收物。
43.一種軟件產(chǎn)品，包括(a)存取歸因于樣本的數(shù)據(jù)的程序代碼，所述的數(shù)據(jù)包括在樣本中的至少一種生物標(biāo)記的測量結(jié)果，該生物標(biāo)記是選自由表1的生物標(biāo)記所組成的組群；以及(b)運(yùn)算分類算法的程序代碼，所述的分類算法以測量結(jié)果的函數(shù)來分類乳癌的狀態(tài)。
44.一種如權(quán)利要求43所述的軟件產(chǎn)品，其中的分類算法以選自由下列者所組成組群的生物標(biāo)記的測量結(jié)果的函數(shù)來分類乳癌的狀態(tài)ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8或C3a-desArg。
45.一種如權(quán)利要求43所述的軟件產(chǎn)品，其中的分類算法以下列各個(gè)生物標(biāo)記的測量結(jié)果的函數(shù)來分類乳癌的狀態(tài)ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8或C3a-desArg。
46.一種如權(quán)利要求45所述的軟件產(chǎn)品，其中該分類算法進(jìn)一步以CA15-3測量結(jié)果的函數(shù)來分類乳癌的狀態(tài)。
47.一種選自表1的生物標(biāo)記的純化的生物分子。
48.一種包括通過質(zhì)譜或免疫測定來檢測表1的生物標(biāo)記的方法。
49.一種包括向受試者傳遞診斷的方法，所述的診斷是關(guān)于由得自該受試者的樣本中的生物標(biāo)記的相關(guān)性所判定的乳癌狀態(tài)，其中所述的生物標(biāo)記是選自下列者所組成的組群ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8或C3a-desArg2。
50.一種如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述的診斷是通過計(jì)算機(jī)形成的媒介來向受試者傳遞。
51.一種確認(rèn)與選自由下列者所組成組群的生物標(biāo)記相互作用的化合物的方法ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8或C3a-desArg，其中所述的方法包括(a)將生物標(biāo)記與試驗(yàn)化合物接觸；以及(b)判定該試驗(yàn)化合物與該生物標(biāo)記是否有相互作用。
52.一種在細(xì)胞中調(diào)節(jié)選自下列者所組成組群的生物標(biāo)記的濃度的方法ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)、C3a-desArgΔ8或C3a-desArg，其中所述的方法包括(a)將所述的細(xì)胞與試驗(yàn)化合物接觸，其中所述的試驗(yàn)化合物避免ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)或C3a-desArgΔ8的斷裂。
53.一種治療受試者狀態(tài)的方法，其中所述的方法包括對(duì)該受試者給予治療有效量的化合物，其中所述的化合物避免ITIH4片段1(BC-1)、ITIH4片段1b(BC-1b)或C3a-desArgΔ8的斷裂。
54.一種如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述的狀態(tài)是乳癌。
全文摘要
本發(fā)明提供以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的生物標(biāo)記及生物標(biāo)記的組合，該等生物標(biāo)記及組合是對(duì)于鑒定患者乳癌的狀態(tài)是有用的。明確言之，本發(fā)明的生物標(biāo)記是對(duì)將受試者的樣品分類成乳癌或非乳癌之癌癥。該等生物標(biāo)記可用SELDI質(zhì)譜技術(shù)檢測。
文檔編號(hào)A01N37/18GK101087889SQ200580039464
公開日2007年12月12日 申請(qǐng)日期2005年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月17日
發(fā)明者J·李, C·N·懷特, Z·張, D·W·尚, E·T·馮, X－Y·孟 申請(qǐng)人:約翰·霍普金斯大學(xué), 賽弗吉生物系統(tǒng)公司