專利名稱：Mhc－ⅱ轉(zhuǎn)基因動物耐受性的研究方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于測試蛋白質(zhì)變體的免疫原性的體內(nèi)系統(tǒng)。特別地，本發(fā)明涉及使用人類II類MHC分子轉(zhuǎn)基因小鼠的方法，其中使該小鼠對特定蛋白質(zhì)耐受并然后使用所述特定蛋白質(zhì)的變體測試免疫原性的誘導(dǎo)。另外，本發(fā)明涉及用于從蛋白質(zhì)變體庫中選擇免疫原性降低的蛋白質(zhì)的體內(nèi)系統(tǒng)，藉此被耐受化的(tolerised)人類MHC轉(zhuǎn)基因小鼠被注射結(jié)合有不同變異蛋白質(zhì)的文庫細(xì)胞系或顆粒，藉此結(jié)合有具有比文庫中其他蛋白質(zhì)更低免疫原性的變異蛋白的特定細(xì)胞系或顆粒在體內(nèi)被選擇。
目前用于測試候選藥物蛋白在人類中潛在免疫原性的方法是有限的，主要因?yàn)榉侨祟愇锓N具有不同于人類的MHC(主要組織相容性抗原)分子并因此在測試動物中對注入蛋白的免疫應(yīng)答不反映在人類中對相同蛋白質(zhì)的預(yù)期免疫應(yīng)答。因此，使用人類細(xì)胞或具有人類MHC的細(xì)胞來測試蛋白質(zhì)免疫原性是重要的。一種特別有價值的方法是使用人類血液樣品在T細(xì)胞增殖測定中測試蛋白質(zhì)。然而，該方法檢測T細(xì)胞在體外對受試蛋白質(zhì)的應(yīng)答并且迄今還沒有產(chǎn)生如體內(nèi)發(fā)生的抗體生成的體外免疫原性方法得到證明。替代方法可以利用使用人類T和B細(xì)胞重建的小鼠或轉(zhuǎn)基因小鼠，其中家居(resident)小鼠MHC和在一些情況中的T細(xì)胞受體分子已經(jīng)被它們的人類對應(yīng)物所取代。然而，這些方法可能不會形成人類中免疫原性的準(zhǔn)確預(yù)測，因?yàn)樗鼈儧]有考慮耐受性，特別是人類免疫系統(tǒng)對正常人類蛋白的耐受性。例如，人類MHC轉(zhuǎn)基因小鼠將依然預(yù)期產(chǎn)生(mount)對抗所注射的人類蛋白的免疫應(yīng)答，因?yàn)樗鲂∈髮⒉荒褪苓@樣的人類蛋白。因此需要改進(jìn)的方法以促進(jìn)蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)變體的體內(nèi)免疫原性的測試，其考慮了在物種中對蛋白質(zhì)的正常耐受性。
因此，本發(fā)明的第一個方面提供了用于測試從哺乳動物抗原衍生的變異抗原在所述哺乳動物II類MHC分子的非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物中的免疫原性的方法，其中所述非人類哺乳動物不是所述哺乳動物抗原的來源，所述方法包括(a)通過與所述哺乳動物抗原的接觸使所述轉(zhuǎn)基因哺乳動物對所述哺乳動物抗原是耐受的；(b)將所述轉(zhuǎn)基因哺乳動物與所述變異抗原相接觸；和(c)檢測所述變異抗原在所述轉(zhuǎn)基因哺乳動物中的免疫原性。
本發(fā)明提供了用于測試蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)變體的免疫原性的新型體內(nèi)系統(tǒng)。如這里所討論的，變異抗原衍生于哺乳動物抗原。變異抗原可以包括具有增加、缺失或取代的或者通過化學(xué)方法衍生的蛋白質(zhì)或多肽序列。所述抗原不是來源于在該方法中使用的非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物。
特別地，本發(fā)明涉及使用允許展示人類T細(xì)胞表位的人類II類MHC分子轉(zhuǎn)基因小鼠并測試小鼠背景中人類蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)變體的潛在免疫原性的方法。
在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，通過注射低濃度(例如，相當(dāng)于人類血清和/或其他組織中發(fā)現(xiàn)的生理量)蛋白質(zhì)在表達(dá)人類II類MHC(HLA-tg)種系的新生小鼠中誘導(dǎo)對人類蛋白的耐受性。蛋白質(zhì)優(yōu)選地是單體的并于免疫“惰性”緩沖液(如鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS))中靜脈注入。在這類系統(tǒng)中，誘導(dǎo)耐受性的劑量頻率將根據(jù)耐受性被誘導(dǎo)針對的蛋白質(zhì)而不同。例如，正常以高血清濃度存在的蛋白質(zhì)最可能需要比那些正常以低生理濃度發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)更頻繁地被注入以誘導(dǎo)耐受性。
優(yōu)選地，未成熟小鼠(例如新生小鼠)將被使用以保證耐受化(tolerising)蛋白質(zhì)存在于T細(xì)胞發(fā)育并因此誘導(dǎo)中心耐受的過程中。典型地，年齡不超過6周的小鼠將被反復(fù)注入，其中來自胸腺的成熟CD4+和CD8+T細(xì)胞的生成減少(正常成人期)。具有針對受試蛋白質(zhì)或受試變異蛋白的不變異形式的已建立的耐受性，被耐受化的小鼠然后將被注射受試蛋白或蛋白變體并隨后被檢測對抗受試蛋白或蛋白變體的免疫原性。在具有完整的免疫球蛋白基因的小鼠中，免疫原性可以通過針對受試蛋白或蛋白變體的抗體的生成而被檢測。或者，與免疫原性有關(guān)的其他測定法可以被采用，如使用來自被耐受化的HLA-tg小鼠的外周血液、脾或派伊爾氏斑(Peyer′s Patch)來檢測受試蛋白-特異性T或B細(xì)胞應(yīng)答的測定法。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，通過對表達(dá)人類轉(zhuǎn)基因(關(guān)于感興趣的蛋白質(zhì))的小鼠回交人類HLA-tg小鼠而在小鼠中誘導(dǎo)耐受性。例如，表達(dá)人類IgG的人類HLA-tg小鼠能夠被產(chǎn)生，其對人類IgG是耐受的。當(dāng)人類IgG不是以這樣的方式表達(dá)，如允許可變(V)區(qū)體細(xì)胞突變(somaticmutation)、易位或重排，或者通過類轉(zhuǎn)換(class switching)的恒定(C)區(qū)改變，那么這些小鼠將對所表達(dá)的特定的人類IgG序列是耐受的但對某些人類V區(qū)體細(xì)胞突變、易位或重排或者通過類轉(zhuǎn)換的C區(qū)改變不是耐受的。當(dāng)人類IgG以這樣的方式表達(dá)，如允許V區(qū)體細(xì)胞突變、易位或重排或者C區(qū)類轉(zhuǎn)換，那么這些小鼠將不僅對含有特定種系的V和C區(qū)序列的特定人類IgG是耐受的而且對已經(jīng)經(jīng)歷親和力成熟并對任一抗原特異的人類IgG也是耐受的。
在這些條件下，可能生成表達(dá)內(nèi)源性人類II類MHC的轉(zhuǎn)基因小鼠并且能夠獲得在人類II類MHC背景中的中心耐受所針對的人類蛋白。被整合入小鼠基因組的人類轉(zhuǎn)基因(編碼感興趣的人類蛋白)的拷貝數(shù)或者所述轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率(由不同因素決定，如轉(zhuǎn)錄和翻譯效率以及所述小鼠基因組內(nèi)轉(zhuǎn)基因的定位)將決定所表達(dá)的蛋白質(zhì)的量并可以是不同的以產(chǎn)生具有不同的人類轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的小鼠以便只有表達(dá)“生理量”的轉(zhuǎn)基因的小鼠被選擇用于回交至HLA-tg小鼠。
使用注射或轉(zhuǎn)基因方法之一來誘導(dǎo)HLA-tg小鼠中對人類蛋白的耐受性，優(yōu)選地使用表達(dá)單個人類II類MHC等位基因的小鼠。因此，上述方法被采用以在各自表達(dá)單個II類MHC異型(allotype)的一組小鼠中誘導(dǎo)耐受性。多個HLA-tg小鼠將被選擇以便獲得人類II類MHC異型的如所需比例一樣大的總體覆蓋度。應(yīng)該理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)，其他方法可以被采用以使HLA-tg小鼠對感興趣的特定蛋白或蛋白變體是耐受的，包括誘導(dǎo)對特定蛋白耐受的特定白細(xì)胞的方法，刪除對特定蛋白有反應(yīng)性的特定白細(xì)胞的方法和在免疫系統(tǒng)暴露于特定蛋白或變體過程中調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)以便誘導(dǎo)耐受性的方法。還應(yīng)該理解，如果可能，不表達(dá)特定受試蛋白或蛋白變體的小鼠同系物的小鼠將優(yōu)選用于本發(fā)明以避免這些小鼠對受試蛋白或蛋白變體的任何固有的耐受性。
應(yīng)該理解，根據(jù)本發(fā)明上面實(shí)施方案的被耐受化的HLA-tg小鼠能夠以多種方式被用于測試特定蛋白或蛋白變體的免疫原性或者用于根據(jù)免疫原性分級一組蛋白變體。在對特定蛋白耐受化的小鼠中，能夠測試對所述蛋白的變體的免疫原性，所述變體包括蛋白質(zhì)中具有氨基酸改變的變體、具有氨基酸修飾((如脫酰胺或糖基化)差異、組成差異、物理差異(如聚集差異)或其他任何可能導(dǎo)致免疫原性的差異的變體。特別地，可以通過將感興趣的蛋白質(zhì)以漸增的濃度注入被耐受化的小鼠來確定高和延長的劑量(dosing)的后果。還可以考察與注入途徑有關(guān)的免疫原性，其中蛋白質(zhì)可以在被耐受化的小鼠中的不同部位注入并評估作為結(jié)果的免疫原性。應(yīng)該理解，被耐受化的小鼠中的免疫原性的分析可以通過多種方法進(jìn)行，包括在注射針對抗體的受試蛋白質(zhì)或蛋白變體后測試來自小鼠的血液樣品或其他組織樣品(如派伊爾氏斑，脾)(如通過ELISA、RIPA、FACS和表面等離子體共振)；測試T細(xì)胞增殖或活化；測試蛋白反應(yīng)性T細(xì)胞的生成，例如通過特定的肽-MHC復(fù)合體的結(jié)合；通過檢測細(xì)胞因子生成、增殖、細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)、Ca2+流量、PCR或DNA指紋印跡來測試T或B細(xì)胞；測試特異性免疫反應(yīng)性B或T細(xì)胞的出現(xiàn)；或者通過測試免疫原性的其他任何方法。應(yīng)該理解，具有完整功能性免疫球蛋白基因的被耐受化的小鼠中的免疫原性的分析可以通過單個受試蛋白的注射和經(jīng)由抗體生成的免疫原性的測定來進(jìn)行，例如通過測定與注射的受試蛋白結(jié)合的抗體的形成，或者通過注射受試蛋白或蛋白變體的混合物，例如通過測試為響應(yīng)注射的混合物而形成的用于結(jié)合所述混合物中特定蛋白或蛋白變體的抗體(例如通過在單個受試蛋白或蛋白變體的陣列上免疫印跡；或者通過分離來自被注射小鼠的抗體或抗體序列并測定這些抗體用于結(jié)合單個受試蛋白或蛋白變體的特異性)。
本發(fā)明將特別適合于不同人類(或人源化的)單克隆抗體或其片段的免疫測試，藉此HLA-tg小鼠被耐受化人類單克隆抗體序列，并藉此這樣的小鼠然后能夠與在可變區(qū)具有體細(xì)胞突變(或其他非種系(non-germ-line)突變、易位或重排)的人類抗體關(guān)聯(lián)的可變區(qū)突變反應(yīng)。在這些例子中，具有缺失的或非表達(dá)性內(nèi)源性小鼠免疫球蛋白基因的小鼠將是優(yōu)選的。像這樣，本發(fā)明將特別適合于人類或人源化單克隆抗體文庫或組(panels)的比較性的免疫原性測試，以識別那些沒有或具有低水平免疫原性的抗體。特別地，本發(fā)明用于測試被注入相同小鼠中的不同人類(或人源化的)單克隆抗體或其片段的混合物并用于測定(例如通過免疫印跡)混合物中單個抗體免疫原性的裝置特別適合于快速分析大的抗體文庫。對于展示在顆粒(如噬菌體、細(xì)胞或其他顆粒)上的抗體，本發(fā)明優(yōu)選地(但非必須地)包括抗體文庫直接注射在展示顆粒上，其中小鼠對注射的顆粒是耐受的。
作為本發(fā)明的擴(kuò)展，應(yīng)該理解，額外轉(zhuǎn)基因感興趣的蛋白質(zhì)或蛋白變體的HLA-tg小鼠能夠被用于產(chǎn)生具有耐受性的蛋白變體，所述耐受性的產(chǎn)生與特異性HLA背景(如人類HLA)有關(guān)。例如，當(dāng)人類IgG種系以允許隨后的V區(qū)體細(xì)胞突變、易位或重排或C區(qū)類轉(zhuǎn)換的方式表達(dá)時，人類單克隆抗體能夠隨人類HLA背景的抗原的注射而被生成。然后，在這些小鼠中表達(dá)的人類HLA背景中，小鼠對已經(jīng)經(jīng)歷親和力成熟的人類IgG是耐受的并對任一抗原是特異性的。然后這可以降低這樣的預(yù)期在這種人類HLA-tg小鼠中產(chǎn)生的人類抗體將在人類中是非免疫原性的。
應(yīng)該理解，對感興趣的蛋白或蛋白變體耐受或轉(zhuǎn)基因的HLA-tg小鼠能夠被用于涉及人類藥物生成和測試的多種免疫原性篩選應(yīng)用。例如，除了檢測蛋白變體的免疫原性之外，這種HLA-tg小鼠能夠用來繪制感興趣的蛋白質(zhì)或蛋白變體中的免疫原性區(qū)或免疫原性序列。特別地，感興趣的蛋白或蛋白變體的肽掃描部分或所有序列能夠通過直接注射入HLA-tg小鼠中和隨后的免疫原性測定而被測試，例如通過來自血清或組織隔離群(isolates)的T細(xì)胞增殖的測定。以該方式，這種HLA-tg小鼠將特別有用于繪制蛋白質(zhì)或蛋白變體的序列中的T細(xì)胞表位。然后這類T細(xì)胞表位序列能夠在蛋白或蛋白變體中被修飾以在蛋白質(zhì)或蛋白變體作為用于人的潛在藥物的使用之前清除所述表位。
應(yīng)該理解，對感興趣的蛋白或蛋白變體耐受或轉(zhuǎn)基因的HLA-tg小鼠能夠以多種方式被使用來測試感興趣的蛋白或蛋白變體的免疫原性，所述測試在以不同劑量、不同組分、不同時間點(diǎn)的注射和反復(fù)劑量之后進(jìn)行，所述感興趣的蛋白或蛋白變體來自不同制備批次，包括生產(chǎn)批次和含有不論是共同注射的還是存在于HLA-tg小鼠中的不同試劑，如感染性疾病試劑、各種其他細(xì)胞、其他藥物、化學(xué)/環(huán)境試劑，以及在免疫妥協(xié)的或經(jīng)受各種攻擊、損傷或疾病的HLA-tg小鼠中。
在本發(fā)明進(jìn)一步的擴(kuò)展中，被感興趣的蛋白質(zhì)耐受化的HLA-tg小鼠被用來直接從變體蛋白文庫中選擇那些與文庫其他成員相比具有低免疫原性的蛋白質(zhì)。在這種選擇中，HLA-tg小鼠對特定蛋白或蛋白變體的免疫原性應(yīng)答直接導(dǎo)致針對所述蛋白或蛋白變體的選擇，以便其他低免疫原性的蛋白被富集或識別。例如，由免疫原性蛋白或蛋白變體誘導(dǎo)的抗體直接結(jié)合所述免疫原性蛋白或蛋白變體，作為針對該變體的選擇基礎(chǔ)。幾種方法已經(jīng)被用來實(shí)現(xiàn)這種選擇。例如，來自注射了變體蛋白文庫的HLA-tg小鼠的血清免疫球蛋白可以被用來從所述文庫中預(yù)吸收(例如，通過免疫沉淀或免疫層析)免疫原性蛋白變體而留下較少免疫原性或無免疫原性的變體，其可以在蛋白質(zhì)分子水平(例如通過基于質(zhì)譜的序列測定或指紋印跡)被識別或者通過與變體連接的顆粒，例如肽序列標(biāo)簽、核酸序列或用于在文庫中識別特定蛋白變體的任何其他分子代碼。其他體外方法能夠被用來識別具有低免疫原性的變體，如這類變體只被捕獲至固相上的方法，其中沒有小鼠抗體出現(xiàn)來干擾蛋白變體上的特定捕獲位點(diǎn)。例如，在人類IgG文庫的例子中，固相抗原制備可以被用來捕獲抗體，其中沒有小鼠免疫球蛋白已經(jīng)結(jié)合至人類IgG上的抗原結(jié)合位點(diǎn)。
作為從文庫中選擇具有低免疫原性的變體蛋白的體外方法的替代，體內(nèi)選擇方法可以被使用，其中較小免疫原性的或無免疫原性的變體在體內(nèi)被選擇。體內(nèi)選擇是經(jīng)由在被耐受化的HLA-tg小鼠中誘導(dǎo)的抗體，從循環(huán)或所述小鼠內(nèi)注射的小室中結(jié)合并清除特定變體或者通過直接殺滅或吞食表達(dá)這種變體的活細(xì)胞或與這種變體結(jié)合的顆粒，例如經(jīng)由表面IgG的骨髓瘤細(xì)胞或者經(jīng)由ADCC(抗體依賴的細(xì)胞毒作用)或CDC(補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用)的活噬菌體，或者通過抗體依賴的吞飲與特定變體連接的惰性顆粒。在基本方法中，HLA-tg小鼠被注射所述蛋白變體文庫(例如，靜脈內(nèi)注射)并在所選擇的時間點(diǎn)分析哪個蛋白變體依然未被宿主免疫球蛋白清除。該分析的進(jìn)行可以例如通過在所選擇的時間點(diǎn)純化蛋白變體文庫成員并識別在體內(nèi)選擇之后富集于文庫內(nèi)的變體?；蛘?，當(dāng)?shù)鞍鬃凅w與核酸連接時(例如，在活細(xì)胞內(nèi)，如骨髓瘤或是噬菌體)，所述分析的進(jìn)行可以通過與富集的蛋白變體連接的基因的直接擴(kuò)增和DNA測序或者在選擇之前和之后的DNA指紋印跡來識別由所述選擇所富集的指紋中的條帶，這種條帶然后提供了所富集的蛋白變體的識別。當(dāng)?shù)鞍鬃凅w在活細(xì)胞或顆粒上選擇并且這種細(xì)胞或顆粒本身誘導(dǎo)免疫原性的情況下，HLA-tg小鼠可以被耐受化這種細(xì)胞或顆粒，例如通過注射或進(jìn)一步添加至轉(zhuǎn)基因背景，或者通過其他用于避免在蛋白變體選擇過程中的這類細(xì)胞和顆粒的干擾的方法。
本發(fā)明的一個例子是由活細(xì)胞生成的抗體變體的體內(nèi)選擇，藉此一部分活細(xì)胞(如表達(dá)人類IgG的小鼠骨髓瘤(例如雜交瘤)細(xì)胞文庫或展示抗體V區(qū)的噬菌體細(xì)胞)被注射入被耐受化的HLA-tg小鼠中。這些小鼠將生成針對任何由經(jīng)注射的骨髓瘤細(xì)胞或噬菌體所生成的免疫原性人類IgG的抗體，并且這些抗體將結(jié)合表面IgG，從而抑制細(xì)胞生長/噬菌體感染力或者導(dǎo)致這些細(xì)胞或噬菌體的毀滅(通過ADCC、CDC或細(xì)胞內(nèi)吞作用)。以這樣的方式，被耐受化的HLA-tg小鼠將選擇對抗生成免疫原性抗體的骨髓瘤細(xì)胞或噬菌體并且生成具有低或無免疫原性的抗體的細(xì)胞/噬菌體將從注射的群體中被富集。然后，這種生成具有低或無免疫原性的想要的抗體的細(xì)胞/噬菌體可以被回收，例如通過回收并培養(yǎng)富集的骨髓瘤細(xì)胞，通過使用抗Ig染色的細(xì)胞分選的使用來分選抗體生成細(xì)胞，或者通過細(xì)菌的周期感染擴(kuò)增選擇的噬菌體。或者，對于非永生化的(non-immortalised)哺乳動物細(xì)胞，如B細(xì)胞，標(biāo)準(zhǔn)的永生化和克隆程序可以被使用，如包括EBV轉(zhuǎn)化或細(xì)胞融合或其他在克隆之前永生化的方法，或者核酸擴(kuò)增方法(如PCR)可以被使用來從選擇的抗體中分離V區(qū)基因。另外，在被耐受化的HLA-tg小鼠中的選擇之前和之后的B細(xì)胞群的比較性分析可以被用來識別富集的B細(xì)胞譜系或特定抗體的富集，例如通過比較性PCR、比較性DNA指紋印跡或比較性的質(zhì)譜方法，如LC-MS。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，本發(fā)明用于測試蛋白質(zhì)和蛋白變體的免疫原性的方法有很多變形，但是這些變形應(yīng)該被認(rèn)為在本發(fā)明范圍之內(nèi)，其利用對特定蛋白或蛋白變體耐受化的HLA-tg小鼠作為背景來測定蛋白質(zhì)的免疫原性或者來選擇具有低或無免疫原性的蛋白質(zhì)或比較和分級基于免疫原性的不同蛋白質(zhì)。還應(yīng)該理解，對特定蛋白耐受化的HLA-tg小鼠是新穎的，尤其是具有除了人類HLA轉(zhuǎn)基因外的一個或多個人類蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。特別地，優(yōu)選地編碼盡可能多的人類重鏈和輕鏈可變區(qū)免疫球蛋白基因座的具有額外的人類IgG轉(zhuǎn)基因的人類HLA-tg小鼠是新穎的，并特別有用于治療性單克隆抗體的免疫原性測試或治療性抗體從選擇變體中的體內(nèi)選擇。還應(yīng)該理解，本發(fā)明特別應(yīng)用于生成作為藥物或體內(nèi)診斷試劑用于人類的蛋白質(zhì)，藉此人類HLA-tg小鼠將被使用并且具有很少或沒有免疫原性的蛋白質(zhì)被選擇，使用與人類中存在的相同HLA背景并使用在人類中預(yù)期的類似水平的耐受性(如果有)。應(yīng)該理解，在本發(fā)明中，不同于小鼠的生物體可以被使用，其中人類HLA分子可以通過轉(zhuǎn)基因或者通過其他如人類抗原展示細(xì)胞的注射的方法來提供。還應(yīng)該理解，為不同于人類藥物中的目的(例如對于動物藥物)，不同于人類的HLA背景也可以被使用，具有誘導(dǎo)的針對所使用物種的蛋白質(zhì)的耐受性。應(yīng)該理解，耐受化的HLA-tg動物也能夠在本發(fā)明范圍內(nèi)被使用并使用所述方法中的一些來選擇具有高免疫原性的蛋白或蛋白變體用于疫苗中的使用。
本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)該理解，本發(fā)明通過廣泛的體外或體內(nèi)測試或分離方法來選擇低免疫原性蛋白質(zhì)和蛋白變體的方法有很多變形，但是這些變形應(yīng)該被認(rèn)為在本發(fā)明范圍之內(nèi)，其使用對特定蛋白或蛋白變體耐受化的HLA-tg小鼠作為背景用于這樣的選擇。還應(yīng)該理解，通過被耐受化的HLA-tg小鼠的蛋白質(zhì)或蛋白變體的分析或選擇將通常需要一個范圍的背景HLA異型中的平行分析或選擇，一般通過一組具有不同異型的HLA基因型的轉(zhuǎn)基因小鼠。對于在人類中應(yīng)用的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)變體的選擇，代表至少50％人類群體的MHC異型范圍是想要的，以避免在過少的異型上選擇蛋白質(zhì)，一旦所述蛋白質(zhì)被注射入具有其他亞型的人類其可能導(dǎo)致免疫原性，所述其他亞型在被用于分析或選擇的小鼠中是不存在的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)該理解，本發(fā)明不應(yīng)該被限制在轉(zhuǎn)基因小鼠的使用，而可以包括被賦予轉(zhuǎn)基因人類II類MHC并以相同方式被使用來測定蛋白變體的免疫原性或選擇具有低免疫原性的蛋白變體的其他動物。還應(yīng)該理解，本發(fā)明不應(yīng)該被限制于蛋白質(zhì)并可以應(yīng)用于非蛋白質(zhì)變體的免疫原性的測定或應(yīng)用于選擇具有低免疫原性的非蛋白質(zhì)變體，如有機(jī)化學(xué)物質(zhì)、無機(jī)化學(xué)物質(zhì)、變應(yīng)原、化妝品、環(huán)境污染物、傳染劑和糧食。還應(yīng)該理解，本發(fā)明可以被用于人用疫苗的開發(fā)和測試，例如測定在人類疫苗中使用的有效的T細(xì)胞表位，篩選有效的亞基或DNA疫苗，為人類中預(yù)期的效果來測試不同疫苗組成和給藥途徑，和測試用于預(yù)防疾病因子(如傳染疾病、癌癥和炎癥)或誘導(dǎo)對抗疾病因子(如傳染疾病、癌癥和炎癥)的免疫應(yīng)答的潛在疫苗，藉此在測試潛在疫苗之前在小鼠(或其他動物)中引入或誘導(dǎo)這類疾病。還應(yīng)該理解，除了人類II類MHC之外，本發(fā)明的HLA-tg轉(zhuǎn)基因動物可以是關(guān)于其他的人類免疫系統(tǒng)的分子的單個組分或它們的組合的轉(zhuǎn)基因，如T細(xì)胞受體、I類MHC、CD4、CD8和其他細(xì)胞因子或受體，在各自情況中引入人類免疫系統(tǒng)的其他組分，為模仿與人類免疫相關(guān)的一個范圍的不同分子事件。以相同的方式，本發(fā)明的動物能夠被植入一種或多種人類免疫系統(tǒng)的細(xì)胞以促進(jìn)針對受試蛋白或非蛋白的人類免疫應(yīng)答。
下述實(shí)施例被提供以描述本發(fā)明并不應(yīng)該被理解為本發(fā)明范圍的限制；實(shí)施例1.免疫原性/非免疫原性的受試抗體的生成。
被選擇用于該研究的免疫原性受試抗體是已知為Remicade(Le等人，US6277969)的嵌合的抗TNFα抗體，具有來自小鼠cA2抗體的可變區(qū)(下文稱為“Remicade”)。使用的其他受試抗體是已知為Herceptin(Carter等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，vol 89(1992)p4285，US5821337)(下文Herceptin)人源化的抗HER2抗體。使用的非免疫原性的對照抗體是整合了人類Vh3-53和VκO12種系序列的Herceptin衍生物(下文“GLH”＝Herceptin種系(germline Herceptin))。
使用現(xiàn)有技術(shù)公知的方法和適當(dāng)?shù)墓?yīng)商關(guān)于這些方法中使用的酶和抗體的使用說明來進(jìn)行重組DNA和抗體技術(shù)。常規(guī)方法的來源包括Molecular Cloning，A Laboratory Manual，3rd edition，vols 1-3，eds.Sambrook和Russel(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press；Current Protocols inMolecular Biology，ed.Ausubel，John Wiley和Sons；和Antibodies，ALaboratory Manual，eds.Harlow和Lane(1988)，Cold Spring Harbor。對于每條鏈，使用8個長度為30-60個氨基酸的編碼完整人類VH和VL序列的寡核苷酸生成對應(yīng)于Remicade、Herceptin和GLH抗體V區(qū)的序列。分開的VH和VL寡核苷酸首先被磷酸化，以等摩爾比例混合，在熱循環(huán)儀中加熱至94℃持續(xù)5分鐘，隨后冷卻至65℃并在65℃下保持2分鐘。然后在45℃下繼續(xù)保持2分鐘，35℃下保持2分鐘，25℃下保持2分鐘和4℃下保持30分鐘。然后使用T4DNA連接酶(Life Technologies，Paisley，UK)14℃下連接寡核苷酸，持續(xù)18小時。
向各VH和VL寡核苷酸混合物中加入附加的編碼包括Kozak序列、先導(dǎo)信號肽序列和先導(dǎo)內(nèi)含子的5′側(cè)翼序列和包括剪接位點(diǎn)和內(nèi)含子序列的3′側(cè)翼序列的寡核苷酸并如上退火。生成的VH和VL表達(dá)框作為HindIII-BamHI片段被克隆入質(zhì)粒載體pUC19并確認(rèn)完整的DNA序列。這些被轉(zhuǎn)入表達(dá)載體pSVgpt和pSVhyg(Orlandi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86(1989)3833-3837)，所述載體分別包括人類IgG1或人類κ恒定區(qū)和哺乳動物中用于選擇的標(biāo)記。
用于抗體表達(dá)的宿主細(xì)胞系是NS0，一種生成非免疫球蛋白的小鼠骨髓瘤，獲自歐洲動物細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(European Collection of AnimalCell Cultures)，Porton，UK(ECACC編號85110503)。重鏈和輕鏈表達(dá)載體通過電穿孔被共轉(zhuǎn)移入NS0細(xì)胞。表達(dá)gpt基因的克隆在添加了10％胎牛血清、0.8μg/ml麥考酚酸和250μg/ml黃嘌呤的達(dá)爾伯克氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基(DMEM)中被選擇。通過針對人類IgG的ELISA篩選用于生成人類抗體的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆。使用Prosep-A(Millipore，Watford，UK)純化抗體并通過針對人類IgGκ(Pharmacia Biotech，St Albans，UK)的ELISA測定濃度。純化的Remicade、Herceptin和GLH抗體在兩個測定中被測試結(jié)合，一個在標(biāo)準(zhǔn)ELISA中使用人源化的人類TNFα(在WO 03/042247 A2中描述)，另一個使用由4D5所描述的HER2+人類乳腺腫瘤細(xì)胞系SK-BR-3的增殖的抑制(Hudziak等人，Mol.Cell.Biol.，(March 1989)p1165-1172)。Remicade抗體表明了預(yù)期的在ELISA測定中與人類TNFα的結(jié)合但沒有SK-BR-3的抑制。Herceptin沒有結(jié)合人類TNFα而同時表現(xiàn)了SK-BR-3細(xì)胞增殖的抑制。GLH抗體既沒有顯示與人類TNFα的結(jié)合也沒有顯示SK-BR-3細(xì)胞的抑制。
實(shí)施例2.缺乏小鼠免疫球蛋白表達(dá)的人類HLA轉(zhuǎn)基因小鼠。
缺乏小鼠II類MHC的人類HLA-DR1轉(zhuǎn)基因小鼠(Altmann，D.M.等人，J Exp Med 181(1995)867-875)獲自Imperial College，London UK。這些小鼠與獲自Babraham Institute，Cambridge UK的缺乏免疫球蛋白重鏈(CΔ-/-)的小鼠雜交(Bruggeman，EP0438474B 1)并選擇具有想要的人類HLA-DR1+/+、小鼠II-/-類MHC和小鼠IgCΔ-/-基因型的小鼠(下文“huDR+/IgCΔ-/-小鼠”)。這些hu DR+/IgCΔ-/-小鼠然后與缺乏免疫球蛋白輕鏈的小鼠(λ/κ-/-，Babraham Institute)進(jìn)一步雜交并選擇具有想要的人類HLA-DR1+/+、小鼠II-/-類MHC、小鼠Ig CΔ-/-和小鼠λ/κ-/-基因型的小鼠(下文“hu DR+/IgCΔ-/-λ/κ-小鼠”)。
實(shí)施例3.新生期耐受的誘導(dǎo)。
Remicade、Herceptin和GLH抗體在PBS中被透析并稀釋至500μg/ml并在4℃下20,000g離心15分鐘。50μl單個抗體的耐受化劑量被腹膜內(nèi)注射入出生30小時內(nèi)(＝第0天)的新生的hu DR+/IgCΔ-/-小鼠。對照小鼠被注射50μl PBS。然后5μg劑量的Remicade、Herceptin和GLH抗體與5μg KLH對照一起在總200MPL+TDM乳劑(RAS-Ribi佐劑，產(chǎn)品代碼R-700，Corixa Corp，Hamilton，MT，USA)中在第10、16和24天被皮下注射。在第32天，小鼠被處死用于T細(xì)胞增殖測定。紅細(xì)胞清除的Ficoll-純化的脾細(xì)胞被制備并以5×106細(xì)胞與抗體或KLH脈沖的γ-輻射的LPS-胚細(xì)胞一起培養(yǎng)于T25搖瓶中，如Loirat，D.等人，J Immunol.，165(2000)4748-4755所描述的。在培養(yǎng)7天后，細(xì)胞以5×106細(xì)胞/孔和抗體或KLH脈沖的輻射的LPS-胚細(xì)胞一起鋪板于平底96孔微量培養(yǎng)板中并在完全RPMI+3％FCS中培養(yǎng)另外72小時。使用1μCi/孔的3H-胸腺嘧啶脈沖細(xì)胞最后16小時并使用TOMTEC收集器(PE Applied Biosystems，Warrington，UK)收集至濾紙上。在微差頻計數(shù)器(PE Applied Biosystems)上測定放射活性并且結(jié)果表示為關(guān)于抗體或KLH治療vs PBS對照的cpm的刺激指數(shù)(SI)。
這些結(jié)果顯示對于使用Remicade、Herceptin和GLH抗體耐受化并然后分別用相同抗體佐劑攻擊的動物無顯著性SI＞2。然而，10只被純化的多克隆人類IgGT(huIgG)耐受化并然后用Remicade抗體攻擊的動物有5只被觀察到T細(xì)胞應(yīng)答(SI＞2)。相反，用GLH攻擊后的10只huIgG耐受小鼠中只有1只檢測到了應(yīng)答(SI＞2)，而對于用Herceptin耐受化的動物在用GLH攻擊后沒有檢測到應(yīng)答(SI＞2)。分別耐受huIgG或GLH的10只小鼠中有3或1只中，Herceptin誘導(dǎo)了應(yīng)答。所有小鼠對佐劑中的KLH強(qiáng)烈應(yīng)答，導(dǎo)致90％的小鼠中強(qiáng)烈的KLH特異性應(yīng)答。這些結(jié)果說明了在huDR+/IgCΔ-/-小鼠中對單個Remicade、Herceptin和和GLH抗體的新生期耐受的成功誘導(dǎo)，以致使用相同抗體的攻擊沒能誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖反應(yīng)。
這些結(jié)果說明在耐受huIgG的小鼠中誘導(dǎo)了對免疫原性Remicade抗體的顯著的T細(xì)胞應(yīng)答。Herceptin(30％應(yīng)答率)表現(xiàn)為比Remicade(50％應(yīng)答率)小的免疫原性，而GLH沒能在huIgG或Herceptin耐受小鼠中誘導(dǎo)應(yīng)答。該實(shí)施例描述了本發(fā)明在使用人類HLA-DR轉(zhuǎn)基因小鼠中的主要部分，所述轉(zhuǎn)基因小鼠被賦予與人類對人類免疫球蛋白的耐受相當(dāng)?shù)膶μ囟庖咔虻鞍椎哪褪苄?。然后這種轉(zhuǎn)基因小鼠能夠被用來測試各種單克隆抗體在對特定免疫球蛋白耐受化的轉(zhuǎn)基因的人類HLA-DR小鼠中對免疫原性的誘導(dǎo)，作為在人類中測試這種抗體的替代。該實(shí)施例顯示，在人類中具有顯著免疫原性的Remicade抗體在這種轉(zhuǎn)基因的耐受化的人類HLA-DR小鼠中誘導(dǎo)了顯著的免疫原性。在其他后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，人類球蛋白制劑被用來如實(shí)施例3中耐受化hu DR+/IgCΔ-/-小鼠并然后這些小鼠用Remicade、Herceptin和GLH抗體攻擊。結(jié)果顯示，由于具有對單個抗體的耐受性，Remicade注射在＞30％的小鼠中導(dǎo)致SI＞2，而Herceptin和GLH在任何動物中顯示沒有SI＞2。
實(shí)施例4.人類Ig轉(zhuǎn)基因小鼠的生成轉(zhuǎn)人類IgM/κ基因的小鼠(四特征小鼠，Nicolson等人，J Immunol.，163(1999)6898-6906)與hu DR+/IgCΔ-/-λκ-小鼠(實(shí)施例2)雜交并選擇具有想要的人類IgM/κ、人類HLA-DR1+/+、小鼠II-/-類MHC、小鼠IgCΔ-/-和小鼠λ/κ-/-基因型的小鼠(下文“hu IgCΔ-/-κ小鼠”)。
實(shí)施例5.人類Ig轉(zhuǎn)基因小鼠中的免疫原性的測試使用與針對VH的D1.7/J4和針對Vκ的Jκ4結(jié)合的人類VH1-2和Vκ4.1種系基因生成用于在hu IgM/κ小鼠中的免疫原性測試的對照抗體(下文“VH1-2/Vκ4.1”抗體)。如實(shí)施例1中生成重組人類IgG1/κ抗體并且該抗體和來自實(shí)施例1的Remicade抗體都經(jīng)受胃蛋白酶消化以生成用于注射的二聚Fab2片段。在消化之前，抗體在0.2M醋酸鈉緩沖液(pH4.0)中透析并然后被調(diào)至2mg/ml。20μg/ml的胃蛋白酶(Sigma，Poole，Dorset UK)被加入等體積的0.2M醋酸鈉緩沖液(pH4.0)并在37℃下保溫6小時。加入2MTrizma基質(zhì)(Sigma)以調(diào)節(jié)至pH7并且使用凝膠電泳來檢查消化?？贵w消化液在PBS中透析過夜并然后被應(yīng)用至兩個連續(xù)的Sephadex 75柱(Pharmacia)以分離Fab2片段。
使用CFA中的50μg VH1-2/Vκ4.1或Remicade Fab2片段免疫Hu IgM/κ小鼠并在4、8和12周各用IFA中的50ug Fab2片段加強(qiáng)免疫。通過使用PBS中的5μg/ml VH1-2/Vκ4.1、Remicade Fab2片段或全GLH抗體的對照(實(shí)施例1)涂布PVC微滴定板37℃過夜來測試人類IgM/κ抗體的生成。血清樣品稀釋于PBS，然后5％雞血清和0.5％Tween-20于板孔中在室溫下保持1小時，洗滌后，抗人類IgM Fc-HRP(Pharmacia)被加入同樣的緩沖液持續(xù)1小時，隨后加入ABTS(Sigma)持續(xù)30分鐘并在OD415nm下檢測。該實(shí)驗(yàn)證明了在用Remicade Fab2免疫的動物中誘導(dǎo)了強(qiáng)滴定度的特異性針對Remicade Fab2片段的IgM抗體但在用VH1-2/Vκ4.1 Fab2免疫的小鼠中沒有誘導(dǎo)抗VH1-2/Vκ4.1抗體，因而說明了小鼠中具有人類免疫球蛋白/人類HLA-DR背景的Remicade的免疫原性。該實(shí)施例描述了在使用轉(zhuǎn)人類HLA-DR和人類免疫球蛋白基因的小鼠中的本發(fā)明的主要部分，所述轉(zhuǎn)基因小鼠具有與人類對一個范圍的人類免疫球蛋白可變區(qū)序列的耐受性相當(dāng)?shù)膶σ粋€范圍的免疫球蛋白可變區(qū)序列的耐受性。然后這種轉(zhuǎn)基因小鼠能夠被用來測試各種用于誘導(dǎo)免疫原性的單克隆抗體，作為在人類中測試這種抗體的替代。該實(shí)施例顯示，Remicade抗體在這種轉(zhuǎn)人類HLA-DR/Ig+基因的小鼠中誘導(dǎo)了顯著的免疫原性，相當(dāng)于在人類的發(fā)現(xiàn)，即針對Remicade的免疫原性在顯著比例的免疫活性的患者中被誘導(dǎo)。
實(shí)施例6.人類Ig轉(zhuǎn)基因小鼠中的抗體選擇。
在PBS中的VH1-2/Vκ4.1和Remicade Fab2片段(來自實(shí)施例5)的100mg樣品被靜脈內(nèi)共注射或單獨(dú)注射入hu IgM/κ小鼠。在初始劑量后10天和20天后進(jìn)行重復(fù)注射。最后劑量后2小時，分析小鼠血清中VH1-2/Vκ4.1或Remicade Fab2片段的存在或不存在。收集的血清在4℃下20,000g離心15分鐘然后在PBS中透析過夜。然后Fab2片段如實(shí)施例5所述使用Sephadex 75純化并作為稀釋組如實(shí)施例1所述使用抗人類Fab-HRP(Pharmacia)檢測與人類TNFα的結(jié)合。結(jié)果顯示，對于用VH1-2/Vκ4.1和Remicade Fab2片段共注射的小鼠，回收的Fab2在所有受試小鼠中＞95％的組成為VH1-2/Vκ4.1。這些結(jié)果表明，與較小免疫原性的VH1-2/Vκ4.1相比，更大免疫原性的Remicade Fab2片段已經(jīng)從血液系統(tǒng)中被清除。該效果可能是由于具有Remicade Fab2片段的免疫復(fù)合體的形成，其促進(jìn)比VH1-2/Vκ4.1更快速的清除。該實(shí)施例描述了被耐受化的HLA-tg從具有其他誘導(dǎo)顯著免疫原性的抗體的混合物中選擇具有低免疫原性的抗體的能力。
權(quán)利要求
1.一種用于測試從哺乳動物抗原衍生的變異抗原在所述哺乳動物II類MHC分子的轉(zhuǎn)基因非人類哺乳動物中的免疫原性的方法，其中所述非人類哺乳動物不是所述哺乳動物抗原的來源，所述方法包括(a)通過與所述哺乳動物抗原的接觸使所述轉(zhuǎn)基因哺乳動物對所述哺乳動物抗原是耐受的；和(b)將所述轉(zhuǎn)基因哺乳動物與所述變異抗原接觸；和(c)檢測所述變異抗原在所述轉(zhuǎn)基因哺乳動物中的免疫原性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中與所述哺乳動物抗原的接觸是通過一種或多種編碼所述哺乳動物抗原的轉(zhuǎn)基因?qū)胨鲛D(zhuǎn)基因哺乳動物來實(shí)現(xiàn)的，其中所述一種或多種轉(zhuǎn)基因的表達(dá)使所述轉(zhuǎn)基因哺乳動物對與所述哺乳動物抗原的進(jìn)一步接觸是耐受的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述抗原是可溶性蛋白質(zhì)并且其中所述轉(zhuǎn)基因哺乳動物與所述蛋白質(zhì)接觸以誘導(dǎo)耐受性并然后用所述蛋白質(zhì)的一種或多種變體攻擊。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述抗原是單克隆抗體并且其中所述轉(zhuǎn)基因哺乳動物與可溶性單體抗體接觸以誘導(dǎo)耐受性并然后用所述單克隆抗體的一種或多種變體攻擊。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述抗原是哺乳動物的多克隆抗體制劑并且其中所述轉(zhuǎn)基因哺乳動物與所述可溶性多克隆抗體接觸以誘導(dǎo)耐受性并然后用一種或多種單克隆抗體攻擊。
6.如權(quán)利要求3-5任一項所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)是以佐劑或者是不溶的或固定化的形式。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述抗原是非蛋白質(zhì)分子并且其中所述轉(zhuǎn)基因哺乳動物與所述非蛋白質(zhì)分子接觸以誘導(dǎo)耐受性并然后用所述非蛋白質(zhì)分子的一種或多種變體攻擊。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述變異的非蛋白質(zhì)分子是以佐劑或者是不溶的或固定化的形式。
9.如權(quán)利要求1-8任一項所述的方法，其中所述非人類哺乳動物是嚙齒類動物。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述嚙齒類動物是小鼠并且所述哺乳動物的II類MHC分子是人類的，例如人類HLA-DR.轉(zhuǎn)基因小鼠。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因小鼠是與所述抗原接觸不超過6周但優(yōu)選地在出生后32小時內(nèi)以誘導(dǎo)對所述抗原的耐受性的新生小鼠。
12.如權(quán)利要求9-11任一項所述的方法，其中所述哺乳動物抗原是人類抗原。
13.如權(quán)利要求9-11任一項所述的方法，其中所述哺乳動物抗原是非人類抗原。
14.根據(jù)權(quán)利要求10-13任一項所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因小鼠被修飾以刪除表達(dá)所述抗原或所述抗原的變體的任何小鼠基因或致使其失活。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因小鼠被修飾以刪除小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因或致使其失活，然后在用受試單克隆或多克隆抗體攻擊并檢測其免疫原性之前使所述小鼠對人類免疫球蛋白是耐受的。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因小鼠被修飾以刪除小鼠蛋白基因或致使其失活，并然后在用一種或多種變異的非小鼠蛋白質(zhì)攻擊和檢測其免疫原性之前使所述小鼠對非小鼠蛋白是耐受的。
17.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因小鼠編碼人類免疫球蛋白的重鏈和輕鏈并且其中所述轉(zhuǎn)基因小鼠隨后與一種或多種受試單克隆抗體或多克隆抗體接觸。
18.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因小鼠編碼一種或多種人類蛋白質(zhì)并且其中所述轉(zhuǎn)基因小鼠隨后與一種或多種變異的人類蛋白質(zhì)接觸。
19.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因編碼一種或多種人類蛋白質(zhì)并且其中所述轉(zhuǎn)基因小鼠隨后與一種或多種變異的人類蛋白質(zhì)接觸。
20.根據(jù)權(quán)利要求10-17任一項所述的方法，其中使用來自所述轉(zhuǎn)基因哺乳動物的血清來檢測免疫原性以測試針對所述受試單克隆或多克隆抗體或受試蛋白質(zhì)的抗體的誘導(dǎo)。
21.根據(jù)權(quán)利要求10-17任一項所述的方法，其中使用利用小鼠血液或組織樣品作為小鼠T細(xì)胞來源的T細(xì)胞增殖或T細(xì)胞活化測定法來檢測免疫原性。
22.根據(jù)權(quán)利要求10-17任一項所述的方法，其中人類免疫原性的檢測是通過測試蛋白反應(yīng)性T細(xì)胞的生成，例如通過特異性的肽-MHC復(fù)合體的結(jié)合；經(jīng)由檢測細(xì)胞因子的生成、增殖、細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)、Ca2+流量、PCR或DNA指紋印跡的T或B細(xì)胞的測試；或測試特異性免疫反應(yīng)性B或T細(xì)胞的出現(xiàn)。
23.一種用于測試從人類抗原衍生的變異抗原在人類HLA-DR轉(zhuǎn)基因小鼠中的免疫原性的方法，所述方法包括；(a)通過與所述人類抗原的接觸使所述轉(zhuǎn)基因小鼠對所述人類抗原是耐受的；(b)將所述轉(zhuǎn)基因小鼠與所述變異抗原接觸；和(c)檢測所述變異抗原在所述轉(zhuǎn)基因小鼠中的免疫原性。
24.一種用于測試從非人類抗原衍生的變異抗原在人類HLA-DR轉(zhuǎn)基因小鼠中的免疫原性的方法，所述方法包括(a)通過與所述非人類抗原的接觸使所述轉(zhuǎn)基因小鼠對所述非人類抗原是耐受的；(b)將所述轉(zhuǎn)基因小鼠與所述變異的非人類抗原接觸；和(c)檢測所述變異的非人類抗原在所述轉(zhuǎn)基因小鼠中的免疫原性。
25.如權(quán)利要求1-24任一項所述的方法在測試變異抗原文庫免疫原性中的用途。
26.如權(quán)利要求25所述的用途，其中所述變異抗原是人類抗原。
27.如權(quán)利要求26所述的用途，其中所述人類抗原是蛋白質(zhì)。
28.如權(quán)利要求25所述的用途，其中所述變異抗原是非人類抗原。
29.如權(quán)利要求28所述的用途，其中所述非人類抗原是蛋白質(zhì)。
30.如權(quán)利要求27所述的用途，其中所述蛋白質(zhì)是抗體或抗體片段文庫。
31.一種用于在人類HLA-DR轉(zhuǎn)基因小鼠中選擇從人類抗原衍生的一種或多種變異抗原的方法，所述方法包括(a)通過與所述人類抗原的接觸使所述轉(zhuǎn)基因小鼠對所述人類抗原是耐受的；(b)將所述轉(zhuǎn)基因小鼠與兩種或多種變異人類抗原的混合物接觸；和(c)通過所述轉(zhuǎn)基因小鼠中不同水平的免疫原性直接從所述混合物中選擇單個變異人類抗原。
32.如權(quán)利要求31所述的用途，其中所述變異人類抗原被直接選擇，通過測試被誘導(dǎo)的針對注射的變異人類抗原混合物的抗體以測定針對單個變異人類抗原的所述被誘導(dǎo)的抗體或者通過使用被誘導(dǎo)的針對所述混合物的抗體預(yù)吸收所述變異人類抗原混合物。
33.如權(quán)利要求31所述的用途，其中所述注射的變異人類抗原被連接至顆粒并且所述顆粒被用來識別單個變體。
34.如權(quán)利要求31所述的用途，其中所述注射的變異人類抗原被連接至活細(xì)胞并且所述活細(xì)胞被用來識別單個變體。
35.如權(quán)利要求31-34所述的用途，其中所述一種或多種變異抗原衍生于非人類抗原。
36.如權(quán)利要求31-34所述的用途，其中所述一種或多種變異抗原衍生于抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了測試變異抗原的免疫原性的新穎方法。特別地，提供了基于使用轉(zhuǎn)基因動物的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因動物被耐受化(tolerised)針對特定抗原和然后暴露于所述抗原的變體并測定免疫應(yīng)答。在一個實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因動物是人類II類MHC分子的轉(zhuǎn)基因小鼠并且變異抗體庫的免疫原性被測試。
文檔編號A01K67/027GK101060776SQ200580039918
公開日2007年10月24日 申請日期2005年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月23日
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