專利名稱：貯存紅細(xì)胞的組合物和方法
貯存紅細(xì)力包的組合物和方法John R. Hess Tibor J. Greenwalt關(guān)于聯(lián)邦贊助的研究或發(fā)展的聲明 本工作的一部分在美國軍隊(duì)合約DAMD 17-95-C- 5029下進(jìn)行，美 國政府在此可以享有所有者權(quán)益。發(fā)明背景本發(fā)明主要涉及與貯存紅細(xì)胞(RBCs)有關(guān)的組合物和方法。特別涉 及改進(jìn)RBC貯存的組合物和方法以及其應(yīng)用。貯存和保存紅細(xì)胞(RB C s)用于其后再灌注到患者體內(nèi)的能力是一 種相對新近的作為現(xiàn)代外科實(shí)踐先驅(qū)的科技發(fā)展。這種保存在科學(xué)上是 棘手的，而且實(shí)現(xiàn)長期J)]i存并得到高質(zhì)量的再灌注用紅細(xì)胞的步驟也已 經(jīng)越來越多。 一旦從捐贈(zèng)人處收集到紅細(xì)胞，它們便開始死亡因?yàn)樗鼈?會凝結(jié)、饑餓、失去ATP、 2,3-DPG、膜表面積和完整性，以及血色素 (Hb)。 Rous & Turner在1916年以及Robertson在1917年首先成功示范 了全血的貯存。后來，檸檬酸葡萄糖(ACD, 1943),其含有作為抗凝劑的 檸檬酸鹽和作為被紅細(xì)胞利用的唯一養(yǎng)料右旋糖，以及檸檬酸鹽磷酸鹽 右旋糖溶液(CPD, 1957)，其中加入了磷酸鹽作為代謝來源并用于膜固 定， 一皮認(rèn)可用于貯存全血21天。含有腺噪呤的CPD(CPDA-I, 1979)隨后 被引入并能將被貯存的全血和濃縮RBCs(packed RBCs)的貯存期延長至 5周。最初，貯存組合物被設(shè)計(jì)為酸性的以防止葡萄糖在最后生產(chǎn)步驟中 的熱消毒期間被焦糖化。在20世紀(jì)50年代，腺嘌呤一皮發(fā)現(xiàn)能作為添加 劑并代替脫氨化引起的腺噤呤損失。在20世紀(jì)70年代，為了血小板和 生產(chǎn)血漿衍生物，開始期望從收集的全血中除去血漿。然而，這會導(dǎo)致 所得"濃縮RBC ( packed RBC)"的回收率下降。為了防止這種情況發(fā)生，開發(fā)了本領(lǐng)域已知的作為添加溶液(AS)的 組合物以補(bǔ)償容量、營養(yǎng)素和其它有用的RBC穩(wěn)定劑。有必要對用于 保護(hù)從全血中分離后紅細(xì)胞(RBCs)的添加溶液組合物進(jìn)行特別調(diào)整以
使其符合RBCs的需要。1981年開發(fā)了特定的添加溶液將RBC的貯存 期延長到6周。然而，貯存在這個(gè)溶液中的紅細(xì)胞(RBCs)在約6周后卻 出現(xiàn)了穩(wěn)定的退化，因?yàn)樵谠俟嘧⒌饺斯w后24小時(shí)的循環(huán)中存活的 這種細(xì)胞有75%都被確定是沒用的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在連續(xù)的冷凍貯存期間， 葡萄糖以漸減的速率被消耗，因?yàn)榇x廢物，即乳酸和氫離子的濃度在 增加。這種葡萄糖代謝速率的下降導(dǎo)致三磷酸腺苷(ATP)耗損，這在細(xì) 胞重返循環(huán)時(shí)與RBCs的復(fù)原(recovery)直接相關(guān)。設(shè)計(jì)了添加溶液例 如Adsol.RTM (AS-I)、 Nutricel RTM (AS陽3)、 Optisol RTM (AS-5)和 ErythroSol RTM用于下延長在1 - 6。C下RBCs的貯存期。最近在美國 批準(zhǔn)的所有這些ASs, AS-I、 AS-3和AS-5，都包含鹽水、腺。票呤、葡萄 糖和一些檸檬酸鹽和/或甘露糖醇作為"膜保護(hù)劑"。AS-3還包含磷酸 二氫鈉。每個(gè)美國批準(zhǔn)的ASs都符合貯存RBC6周的許可要求，但是不 能貯存7周。目前批準(zhǔn)的RBC添加溶液組合物已經(jīng)在知曉RBC貯存損 傷(在此定義為RBCs貯存中對存活和/或功能限制的總和)是一種細(xì) 胞凋亡過程前就被開發(fā)了 。目前幾乎所有的收集全血都一皮制成組份，RBC部分以濃縮RBCs的 形式被貯存。為了將血引入到添加溶液系統(tǒng)中，我們通過冷凍將RBCs 濃縮，除去血漿以-使RBCs占80%的體積，然后無菌地加入100ml添加 溶液。所得懸液的RBC體積部分約占55%。貯存在一般FDA-認(rèn)可的添 加溶液中的RBCs僅能被貯存6周，有24小時(shí)的體內(nèi)可接受復(fù)原。為了增加在貯存一段時(shí)間后再灌注到患者體內(nèi)RBCs的體內(nèi)可接受 復(fù)原時(shí)間，已經(jīng)試圖改進(jìn)了添加溶液和貯存方法。在"紅細(xì)胞保存的研 究-7。改進(jìn)的磷酸4妄添加溶液的體內(nèi)和體外研究，，中，Greenwalt等， Vox. Sang. 65:87-94 (1993),作者確定，實(shí)'驗(yàn)性添加溶液(指定為EAS-2),其含有(mM): 20NH4C1、 30Na2HPO4、 2腺。票呤、110右旋糖、55 甘露糖醇，在pH 7.15下形成，能用于延長人RBCs的貯存期限，從目 前5-6周的標(biāo)準(zhǔn)到增加到8-9周的改進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)。然而，貯存在EAS-2中 的濃縮RBCs不能直接注入而需要用在輸注前經(jīng)洗滌步驟除去上清液， 因?yàn)樘砑尤芤褐写嬖?妄。在"紅細(xì)胞保存的研究-8。在含有甘油的添加溶液中紅細(xì)胞的液態(tài) 貯存，，中,Vox. Sang. 67:139-143 (1994), Greenwalt等，記載了能在九 周后復(fù)原73%濃縮紅細(xì)胞的添加溶液(指定為EAS-25)。然而，所得
的RBC單元包含約1%的甘油，這對于大劑量的人體輸注是不安全的。 在"4。C下延長紅細(xì)胞貝i存，，中，Tmnsfus. Sci. 15:105-115 (1994), Meryman等，證明了貯存在非常淡的懸液中以低紅細(xì)胞比容存在27周 RBCs有可接受的存活力。然而，這種貯存RBC的懸液不能被直接輸注 所接受因?yàn)樗鼈兊拟浐桶焙扛咔襌BCs體積部分低。用于貯存 200mLRBC且需要產(chǎn)生實(shí)測有益效果的5L溶液在臨床上是不可^f亍的。就能纟皮批準(zhǔn)和可商購的產(chǎn)品而言，目前美國批準(zhǔn)的添加溶液4又起效 6周，平均復(fù)原約80%。目前歐洲批準(zhǔn)的兩種添加溶液起效約7周，平 均復(fù)原77 % (ErythroSol from Baxter Healthcare, La Chatre, France)和75 % (PAGGS mannitol from Maco Pharma)。 Kump eta 1. (Vox Sang 2003: 85:253-261)目前記載的新溶液預(yù)期可能有更短的貯存期，因?yàn)锳TP濃度 低。針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了含有低容積磷酸氬 二鈉的堿性實(shí)驗(yàn)添加溶液(EASs),其能部分中和收集血對酸性抗凝劑溶 液例如CPD (檸檬酸鹽-磷酸鹽-右旋糖)的作用，并顯示這些EASs能改 善RBCATP濃度，降低溶血，并降低RBC膜的形態(tài)變化和損失(參見 美國專利6, 150,085和6,447,987, Hess and Greenwalt,在此通過參考的 方式將其公開內(nèi)容全部引入)。各種EASs都支持9到12周的貯存期。 盡管這些EASs產(chǎn)生了較高的性能結(jié)果，但是它們包含氯化鈉并被制成 相對大的體積致使被貯存RBC被更多地稀釋，這樣在輸注到患者受體 時(shí)就增加了血液被稀釋的危險(xiǎn)性。此外，氯化鈉的存限制了緩沖鹽和磷 酸鹽的溶解量使該系統(tǒng)能維持預(yù)期的體積。當(dāng)有較高的時(shí)間要求而且還是間斷的時(shí)間要求時(shí)，例如戰(zhàn)爭時(shí)，以 及在間斷地、分散地需要輸注血液的地理區(qū)域中， -提高RBC的貯存時(shí) 間就顯得非常重要。事實(shí)上，假設(shè)據(jù)報(bào)道目前的損耗水平是由于RBCs 通常在實(shí)際應(yīng)用以前就過了安全貯存期，因此提高RBCs的安全貯存時(shí) 間就是人們目前普遍關(guān)心的問題。因此，需要在低體積常規(guī)添加溶液中能保持或提高RBC復(fù)原及性 能的RBC貯存組合物。在血液貯存和輸注領(lǐng)域中仍然有改善RBC貯存 的需求，這能使貯存時(shí)間延長，復(fù)原百分率更高，且改善了輸注RBC 的生理功能。因此，仍然需要改進(jìn)RBC貯存的組合物以及生產(chǎn)方法。 還需要添加組合物，這種組合物能4吏加入該組合物的RBC懸液可纟皮直
接輸注到人體中，并能允許活性RBCs在輸注后有可接受的復(fù)原性，其 中活性RBCs擁有增強(qiáng)的生理功能并且降低了在被輸注患者循環(huán)中的清除率。發(fā)明簡述因此，本發(fā)明提供了適于貯存和保存被收集紅細(xì)胞的新的組合物。 本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，從這種組合物中基本上除去氯化鈉(之前 這被認(rèn)為是正確制備^存組合物所必須的)能提供用于增強(qiáng)的pH調(diào)節(jié) 系統(tǒng)的高性能組合物，這對貯存紅細(xì)胞以及隨后的再輸注紅細(xì)胞的完整 性和生理功能性質(zhì)都是有益的，而且鑒于時(shí)間的延長，RBCs在貯存時(shí) 就可以保持符合相關(guān)法律規(guī)定的復(fù)原性和溶血水平。此外，本發(fā)明組合 物在常規(guī)體積下保持了較好的性能，這使得它們特別適于ti存紅細(xì)胞， 其中紅細(xì)胞可以是多次或大量輸注給患者的。本發(fā)明的 一 個(gè)實(shí)施方案提供了用于在約1到約6 。 C下貯存紅細(xì)胞的 組合物。該組合物主要由以下物質(zhì)組成腺。票呤、右旋糖、至少一個(gè)不 可代謝的膜保護(hù)劑糖，和pH緩沖系統(tǒng)。pH緩沖系統(tǒng)含有碳酸氬鈉和磷 酸氫二鈉并以足夠使pH為約8到約9的量存在。該組合物能保持紅細(xì) 胞(RBC)懸液的pH,其中該組合物以在貯存期間足夠在紅細(xì)胞中建立并 保持下述反應(yīng)平衡的量被加入到懸液中，所述平衡是一種抑制從1,3-DPG合成2,3-二磷酸甘油酯(DPG)而有助于糖酵解的平衡，由此在貯存 期間的反應(yīng)平衡中產(chǎn)生了三磷酸腺苷(ATP)的凈收益。本發(fā)明的另 一個(gè) 實(shí)施方案提供了基本上不含氯化鈉的組合物。本發(fā)明更具體的實(shí)施方案是提供特定的組份及其含量，摩爾滲透壓 濃度范圍和組合物的pH。其它具體實(shí)施方案是針對能使紅細(xì)胞的pH保 持在特定數(shù)值范圍內(nèi)的本發(fā)明組合物。本發(fā)明的另 一個(gè)實(shí)施方案是提供含有本發(fā)明組合物的紅細(xì)胞懸液。還提供了方法實(shí)施方案。 一個(gè)這樣的實(shí)施方案是針對在貯存期間保 存紅細(xì)胞(RBCs)的方法。該方法包含(a)將含有需有待貯存的RBCs和 血漿的被收集全血樣品與抗凝血?jiǎng)┤芤夯旌?，由此形成所收集的全血?懸液；(b)對所收集的全血的懸液進(jìn)行處理以除去血漿并濃縮RBCs,由 此形成濃縮RBCs; (c)將袋裝RBCs與一定量的組合物混合，該量足以 形成有約35%到約70%體積RBCs的RBCs懸液；(d)冷卻RBCs懸液到 約1至約6°C;以及(e)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)存儲步驟貯存冷卻的RBCs懸液。該組 合物主要由以下物質(zhì)組成腺嘌呤；右旋糖；至少一個(gè)不可代謝的膜保 護(hù)劑糖；和pH緩沖系統(tǒng)。該pH緩沖系統(tǒng)包含碳酸氫鈉和磷酸氫二鈉并 以足夠使組合物的pH為約8到約9的量存在。該組合物能保持紅細(xì)胞 (RBC)懸液的pH,其中該組合物以在貯存期間足夠在紅細(xì)胞中建立并保 持反應(yīng)平衡的量被加入到懸液中，這種平衡是一種抑制從1,3-DPG合成 2,3-二磷酸甘油酯(DPG)而有助于糖酵解的平衡，由此在貯存期間的反應(yīng) 平衡中產(chǎn)生了三磷酸腺苷(ATP)的凈收益。還提供了更具體的實(shí)施方 案。還提供了另外的實(shí)施方案，它是針對使用本發(fā)明組合物以在貯存期 改進(jìn)紅細(xì)胞(RBC)的膜維持和抑制RBC凋亡的方法，以降低貯存期紅細(xì) 胞(RBC)的脆弱性并抑制RBC溶血，以及提高隨后進(jìn)入貯存期和輸注到 需要這種輸注的患者體內(nèi)后紅細(xì)胞(RB C)的存活力，并降低患者輸注后 對RBC的清除率。根據(jù)本發(fā)明生成的組合物和RBC懸液為RBCs提供了這樣一種貯存 期，即在整個(gè)貯存期內(nèi)，有充足治療量的RBCs是可復(fù)原的并且能直接 輸注到患者體內(nèi)而無需用建立和-驗(yàn)證RBCs輸注的已知標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行處 理。本發(fā)明的這些和其它實(shí)施方案以及各個(gè)方面將通過參考附圖簡 述、對以下提供的優(yōu)選實(shí)施方案和實(shí)施例的詳述而得到更充分的理解。附圖簡述


圖1:是表示RBCs貯存效果的混合(pooling)研究結(jié)果的圖解表 示，以時(shí)間(星期)為函數(shù)，涉及4個(gè)不同的添加溶液組合物1)AS-3， 體積110mL, (- -); EAS-61,體積170 mL(畫")；EAS-78, 170 mL, (- -); 和EAS-81, 110mL, (-o-)。含有碳酸氫鹽的組合物，以圓圈表示，與不 含碳酸氬鹽的等體積組合物(以菱形表示)相比，產(chǎn)生了較高的ATP 濃度，如圖A所示。這些組合物還涉及較高的乳酸鹽濃度(圖D),較 高的胞外和胞內(nèi)pH(圖E和F)，以及較高的碳酸氳鹽和PC02濃度(圖 E和F )。體積較大的組合物，以實(shí)心圖表示，說明溶血降低和貝i存的 紅細(xì)胞比容降低，這分別在圖B和C中予以說明。
圖2:說明將貯存在EAS-81中6周0=6), EAS-81中8周(n-6)的 RBCs再輸注到受試者體內(nèi)后24小時(shí)取樣的紅細(xì)胞在體內(nèi)的復(fù)原性，與 以往的對照進(jìn)行比較，對AS-3的許可實(shí)-驗(yàn)由Simon等在1985年公布。 這兩個(gè)研究均使用了 51Cr單-標(biāo)簽法(single-label method)。 Licensure study優(yōu)選實(shí)施方案的描述本發(fā)明涉及與紅細(xì)胞(RBC)貯存有關(guān)的組合物和方法。特別涉及新 的的添加溶液組合物和與貯存RBCs相關(guān)的方法，其中RBCs已經(jīng)從全 血中分離出來，其中全血在檸檬酸鹽磷酸鹽右旋糖(CPD)溶液中，其變 體，擰檬酸磷酸鹽雙重右旋糖(CP2D)溶液中收集，或在酸性檸檬酸鹽右 旋糖(ACD)或類似溶液中通過提取(Aphaeresis)(從患者或供體中除去全 血)收集。就本發(fā)明的目的來說，在此使用的術(shù)語"復(fù)原"指在再灌注到最初 的人供體后，在循環(huán)中保留24小時(shí)的貯存RBCs部分。在此使用的"氯化物"指的是陰離子氯化物。因此，術(shù)語"氯化物" 包括陰離子氯化物及其鹽形式，例如可以由氯化物陰離子和生理上可接 受的陽離子形成。術(shù)語"氯化物"不包括其中氯原子是以共價(jià)鍵聯(lián)接到 例如有機(jī)分子中碳原子上的化合物。在此使用的短語"生理上可接受的緩沖劑，，指的是能產(chǎn)生陽離子和 陰離子的緩沖劑，其中該離子一般可見于人的血、血漿或血清中，或當(dāng) 引入人體時(shí)能被耐受。適宜的陽離子包括質(zhì)子、銨陽離子和金屬陽離 子。適宜的金屬陽離子包括但不限于鈉、鉀、4丐和鎂陽離子形式，其中 優(yōu)選鈉和鉀，更優(yōu)選鈉。銨陽離子，即式R4N+化合物，其中R是氬或 有機(jī)基團(tuán)，只要是生理上可接受的就能被使用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中， 陽離子選自氫(即質(zhì)子)、鈉、鉀、鈣、鎂及其組合。在此使用的"緩 沖劑"指的是能調(diào)整和調(diào)節(jié)組合物pH的試劑。在此公開的本發(fā)明組合物是含水的，即它們在水中形成。本發(fā)明優(yōu) 選的水是被處理的以便基本上不含熱原(即滅菌)。在此使用的"mEq/L，，指的是與水存在量成比例存在的特定成分(溶 質(zhì))的濃度。更具體為，mEq/L指的是每升水中溶質(zhì)的毫當(dāng)量數(shù)。每升 的毫當(dāng)量通過以下方法計(jì)算，將溶質(zhì)的每升摩爾數(shù)與每分子溶質(zhì)的電荷 種類(組)數(shù)相乘，然后乘以因子1,000。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了用于在約1到約6。C下貯存紅細(xì)胞的 含水組合物。該組合物主要由以下物質(zhì)組成腺。票呤；右旋糖；至少一 個(gè)不可代謝的膜保護(hù)劑糖，和pH緩沖系統(tǒng)。該pH緩沖系統(tǒng)含有生理上 可接受緩沖劑的組合物，并且必須包括至少一個(gè)能提供碳酸氫根陰離子 的試劑，至少一個(gè)能提供磷酸根陰離子的試劑和至少一個(gè)能提供鈉陽離 子的試劑。本發(fā)明預(yù)期，單個(gè)緩沖鹽可以滿足這些要求中的一個(gè)以上。已知在紅細(xì)胞的保存領(lǐng)域中，紅細(xì)胞懸液系統(tǒng)中的ATP濃度是與身 體健康最相關(guān)的。紅細(xì)胞經(jīng)糖酵解通過d-葡萄糖(右旋糖)的糖分解轉(zhuǎn)化 最終產(chǎn)生乳酸鹽，由此產(chǎn)生ATP。因此，乳酸鹽的濃度曲線也就是ATP 合成的良好指示劑。不管系統(tǒng)的保存力如何，紅細(xì)胞的壽命都是有限的 而且收集的紅細(xì)胞包括紅細(xì)胞年齡的正態(tài)分布并接近于自然死亡。由于 沒有新的RBCs進(jìn)入保存系統(tǒng)，因此對最大貯存期就產(chǎn)生了限制，其中 該最大貯存期將提供再灌注后必要的復(fù)原百分比。因此，盡管系統(tǒng)在整 體上產(chǎn)生ATP的能力將隨時(shí)間下降；但是一般能看到加入添加液體后最 初是升高的因?yàn)樗峁┝吮茸匀粷舛雀叩臓I養(yǎng)素，而且RBC最初經(jīng)歷 了 "溶脹"，這也與ATP利用下降有關(guān)。不囿于任何理論，我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)貯存在根據(jù)本發(fā)明的添加溶液中 時(shí)，營養(yǎng)素溶液的體積增加能使底物數(shù)量增加以便能以可接受的濃度被饋抑制。更進(jìn)一步假定，本發(fā)明添加溶液的另一個(gè)特征是它們最初能產(chǎn) 生溶脹的RBCs隨后在貯存期間紅細(xì)胞體積逐漸降低。這個(gè)過程已經(jīng)被 稱為"調(diào)節(jié)性體積降低"。假定在這個(gè)過程中，RBC中酪氨酸磷酸酶的 活性被抑制，或者酪氨酸激酶被激活。已證明這兩個(gè)酶在這些細(xì)胞的膜 中是很大量的(Zipser, Y. and Kosower, N. S. (1996) Biochem. J. 314:881; MallozziC.等(1997)FASEB J. 11 :1281)。預(yù)期RBC膜上帶3蛋白的純磷 酸化將導(dǎo)致從其與帶3的結(jié)合狀態(tài)中釋放細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的磷酸果糖激酶、醛 縮酶和甘油醛-3-磷酸脫氪酶(Hamson, M. L.等(1991) J. Biol. Chem. 266:4106; Cossins, A. R. and Gibson J. S. (1997) J. Exper. Biol. 200:343; Low, P. S.等(1993) J. Biol. Chem. 268:14627; Low, P. S.等(1995) Protoplasma 184:1961)。糖酵解途途徑中這三個(gè)酶的有效性將預(yù)期能提 高RBC的葡萄糖代謝，由此促進(jìn)了 ATP的合成水平和RBCs中ATP的
濃度。因此，制備添加溶液組合物的目的是將ATP的合成在盡可能長的時(shí)間內(nèi)保持在較高的速率上。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將系統(tǒng)的ATP合成保持在最大化的關(guān)鍵是將 胞內(nèi)RBC的pH保持在盡可能接近7.2的水平上，盡可能達(dá)到而不必完 全達(dá)到。在貯存期間，ATP濃度的特點(diǎn)是保持在一定水平上或甚至是在 貯存的早期升高然后下降。當(dāng)RBC ATP濃度下降到2pmol/gHb以下時(shí)， RBC的復(fù)原一般就低于75%。 RBC在貯存早期損失2,3-DPG。起始濃 度的特點(diǎn)是為約15pmol/gHb或約1.1pmol/gHb。在7到10天內(nèi)，濃度 一般下降到起始量的十分之一。2,3-DPG的合成速率是pH的函數(shù)，在 pH大于7.2時(shí)出現(xiàn)但在低于這個(gè)pH時(shí)就下降。通過增加貯存系統(tǒng)的pH 來提高2,3-DPG合成的嘗試已經(jīng)被限制了 ，因?yàn)榘殡S每個(gè)2,3-DPG分子 的形成都會一摩爾一摩爾地?fù)p失ATP的合成。因此，增加RBC的2,3-DPG濃度，這在以前就被認(rèn)為是所期望的，事實(shí)上是傾向于降低RBC 的貯存時(shí)間。更偏酸性的環(huán)境降低了 RBC的代謝。7.2的pH是關(guān)鍵，其中觸發(fā) 了 一種機(jī)理，其已知是R叩p叩ort旁路(參見Hess等"堿性CPD和紅細(xì)胞 2,3-DPG的保存"(2002) Transfusion, 42:747-752,在此通過參考全部引 入)，其中2,3-DPG由1,3-DPG合成，消耗了合成ATP所需的磷酸鹽， 另外還有糖酵解步驟，該步驟生成了由糖酵解產(chǎn)生的兩個(gè)ATPs。系統(tǒng) 的純作用是損耗ATP。如果胞內(nèi)pH能保持在7.2以下，那么該旁路就 被有效地關(guān)閉，ATP合成也就被最大化。在自然狀態(tài)下，該旁路發(fā)揮了 一定程度的作用， 一些2,3-DPG的產(chǎn)生和保持相對于其它細(xì)胞事件是重 要的。然而，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)以外的環(huán)境中貯存時(shí)，出于 對紅細(xì)胞保護(hù)的目的，期望能將這種旁路作用最小化。因此，本發(fā)明組合物的實(shí)施方案就提供了以足夠滿足以下條件的量 存在的pH緩沖系統(tǒng)其中該組合物以在貯存期間足以在紅細(xì)胞中建立 并保持下述反應(yīng)平衡的量被加入到懸液中，上述平4軒是一種抑制從1,3-DPG合成2,3-二磷酸甘油酯(DPG)而有助于糖酵解的平衡，由此在貯存 期間的反應(yīng)平衡中產(chǎn)生了三磷酸腺苷(ATP)的凈收益。本發(fā)明組合物的 具體實(shí)施方案提供了能保持RBC懸液pH的組合物，其中該組合物已經(jīng) 以約6.4到7.4的pH值被加入到懸液中。在更具體的實(shí)施方案中，該組 合物能保持紅細(xì)胞(RBC)懸液的pH值，其中該組合物已經(jīng)以7.0到低于
約7.2的pH被加入到懸液中。在更具體的實(shí)施方案中，該組合物能保 持紅細(xì)胞(RBC)懸液的pH值，其中該組合物已經(jīng)以大于約7.1到小于7.2 的pH 4皮加入到懸液中。本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)制備了基本上不含氯化物的添加溶液組合 物，其令人驚奇地沒有對系統(tǒng)產(chǎn)生負(fù)性作用并允許額外增加緩沖系統(tǒng)的 量以提供額外的pH緩沖。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是針對用于在約1到 約6°C下!&存紅細(xì)胞的含水組合物。這個(gè)組合物包含腺。票呤；右旋糖； 至少一個(gè)不可代謝的膜保護(hù)劑糖，和pH緩沖系統(tǒng)。該pH緩沖系統(tǒng)含有 生理上可接受緩沖劑的組合，其中緩沖劑包括至少一個(gè)能提供碳酸氫根 陰離子的試劑，至少一個(gè)能提供磷酸根陰離子的試劑，和至少一個(gè)能提 供鈉陽離子的試劑。其中，所述的pH緩沖系統(tǒng)以足以使有待加入上述 組合物的紅細(xì)胞(RBC)懸液的pH維持在下述水平的量存在，所述的 水平足以在貯存期間，在所述紅細(xì)胞中建立并維持一種抑制1,3-DPG合 成2,3-二磷酸甘油酯(DPG)而有利于糖酵解的反應(yīng)平衡，由此在貯存期 間的反應(yīng)平衡中產(chǎn)生三磷酸腺苷(ATP)凈收益。該組合物基本上不含外 源性的氯離子。在此使用的"基本上不含外源性的氯離子"的定義是不 論氯離子是否是被提供的，都沒有氯離子被加入到組合物中。另外的實(shí)施方案是針對含有任何本發(fā)明組合物的紅細(xì)胞懸液，以及 其中懸液適于直接輸注到需要這種輸注的患者中的實(shí)施方案。本發(fā)明組合物的其它實(shí)施方案提供的是，至少一個(gè)能提供鈉陽離子 的試劑，其選自碳酸氬鈉、磷酸氫二鈉及其組合。在更具體的實(shí)施方案 中，能提供碳酸氪根陰離子的至少一種試劑是碳酸氫鈉。另外的實(shí)施方 案提供了能提供磷酸根陰離子的至少一種試劑，其選自磷酸鈉、磷酸氬 二鈉、磷酸鈉及其組合。在更具體的實(shí)施方案中，能提供磷酸根陰離子 的至少一種試劑是磷酸氬二鈉。在本發(fā)明組合物的其它實(shí)施方案中，生 理上可接受緩沖劑的組合還含有至少一個(gè)能提供生理上可接受陽離子 的試劑，其中陽離子選自H+、鉀、銨、鎂及其組合。在本發(fā)明組合物的另 一 個(gè)實(shí)施方案中，至少 一 個(gè)非代謝的膜保護(hù)劑 糖是甘露糖醇。 一些糖醇，特別是衍生自單糖的糖醇(例如山梨醇、甘 露糖醇、木糖醇、赤藻糖醇)，是能容易地?cái)U(kuò)散過一些類脂屏障并可能 在細(xì)胞穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用的親水性小分子。特別是甘露糖醇，它是 已知的在體內(nèi)作為羥基清除劑的抗氧劑。它在維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性中發(fā)揮
了主要作用并被認(rèn)為是膜保護(hù)劑糖。其它的小多元醇也可以作為膜保護(hù) 劑糖。值得注意的是，葡萄糖和甘露糖醇有相同的分離量，即180g/摩 爾。糖醇不會被紅細(xì)胞代謝。在此使用的所謂摩爾滲透壓濃度是來自經(jīng)驗(yàn)的數(shù)值。摩爾滲透壓濃 度是穿過完全半透膜(允許水自游通過并完全阻斷溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的一種膜) 的溶液產(chǎn)生的滲透壓與純水相比的測量值。摩爾滲透壓濃度取決于溶液 中的粒子數(shù)但不依賴于粒子的性質(zhì)。單純?nèi)芤旱哪枬B透壓濃度等于摩爾濃度乘以每分子的粒子數(shù)。真溶液可能更加復(fù)雜。具有許多當(dāng)量/L的蛋白質(zhì)，可能對摩爾滲透壓濃度僅有很小量的貢獻(xiàn)，因?yàn)樗鼈冇缮贁?shù)非 常大的"粒子"組成。不是所有的離子在溶液中都是游離的。陽離子可 能與其它陰離子或蛋白質(zhì)結(jié)合。不是所有的溶液容量都是含水的。真實(shí) 準(zhǔn)確地說，所有這些因素都應(yīng)該被計(jì)算在內(nèi)。張力，與摩爾滲透壓濃度 高度相關(guān)并且對描述生物細(xì)胞環(huán)境更加有用的值，是能通過細(xì)胞膜物質(zhì) 的滲透壓與血漿相比的測量值。摩爾滲透壓濃度衡量了水的有效梯度， 假定所有的滲透性溶質(zhì)都完全沒有滲透。計(jì)算溶解的粒子數(shù)是很簡單的。例如，300 mM的葡萄糖溶液和150mM的NaCl溶液有相同的摩爾 滲透壓濃度。然而，置于任何這些溶液中的細(xì)胞其行為卻是非常不同 的。張力是描述溶液抵抗細(xì)胞內(nèi)容量擴(kuò)張趨勢的功能性術(shù)語。其它實(shí)施方案提供的是具有約200到約310mOsm摩爾滲透壓濃度 的本發(fā)明組合物。在更具體的實(shí)施方案中，組合物具有約221到約280 mOsm的摩爾滲透壓濃度。在非常具體的實(shí)施方案中，摩爾滲透壓濃度 為約270 mOsm。如所述的那樣，RBCs將葡萄糖((1-葡萄糖="右旋糖")代謝為 ATP。廢物是乳酸鹽和質(zhì)子。質(zhì)子堆積，壓低了 pH并抑制進(jìn)一步的代 謝。碳酸氬鹽已經(jīng)被建議作為緩沖系統(tǒng)，其中它能與質(zhì)子結(jié)合，在存在 RBC碳酸酐酶的情況下轉(zhuǎn)化為水和二氧化碳。在允許二氧化碳擴(kuò)散的貯 存容器中，逆反應(yīng)被抑制了，該反應(yīng)朝著生成C02的方向進(jìn)行?；谔?酸氳鹽的緩沖系統(tǒng)已經(jīng)具有相當(dāng)可觀的容量。添加溶液中生理濃度的碳 酸氳鹽能在溶液中產(chǎn)生pC〇2,其驅(qū)使每周從600 mL PVC袋中擴(kuò)散高達(dá) l到2mmol的C02。然而，就增加ATP合成和延長有效的貯存期來說， 先前嘗試制備含有碳酸氳鹽的RBC貯存添加溶液已經(jīng)是失敗的。例如， Beutler (BAG-PM)記載將碳酸氳鹽加入到RBC貯存溶液中，但是沒能控
制4支高的pH致使ATP凈皮迅速耗盡。由于發(fā)現(xiàn)鹽水不是RBC添加溶液組合物的必須成分，而且右旋糖 的濃度能被降低而對ATP合成沒有負(fù)面作用，因此本發(fā)明的發(fā)明人能利 用溶液參數(shù)中所產(chǎn)生的增強(qiáng)"作用"去提高并調(diào)整pH緩沖系統(tǒng)。本發(fā) 明公開的緩沖系統(tǒng)不僅對添加溶液組合物提供了最初的適宜pH,而且 還能賦予RBC懸液一個(gè)pH,并依次將RBC的胞內(nèi)pH調(diào)節(jié)到能最大化 合成ATP的值。緩沖系統(tǒng)在貯存期內(nèi)實(shí)現(xiàn)了這些pH調(diào)節(jié)目標(biāo)。因此， pH緩沖系統(tǒng)的緩沖力或強(qiáng)度能被有意地控制。本發(fā)明組合物的一個(gè)實(shí) 施方案提供了 pH為約8到約9的組合物。在更具體的實(shí)施方案中，pH 為約8.2到約8.8。在更具體的實(shí)施方案中，組合物的pH為約8.4到約 8.6,在非常具體的實(shí)施方案中，組合物的pH為約8.5。另一個(gè)實(shí)施方 案針對的是這樣的本發(fā)明組合物，其中緩沖系統(tǒng)在紅細(xì)胞(RBC)中具 有這樣的緩沖力，組合物被加入后在6周的貯存期內(nèi)提高到至少約2mEq 且pH為6.5到7.2。本發(fā)明公開的緩沖系統(tǒng)應(yīng)該提供至少為這個(gè)值的緩 沖力，也應(yīng)該能對RBC懸液提供更好的緩沖力由此使貯存期進(jìn)一步延 長。本發(fā)明的發(fā)明人確定了組合物所必須成分的范圍，其中成分的優(yōu)點(diǎn) 隨后公開。在本發(fā)明組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含約1-3 mM 的腺噤呤，約20到約115 mM的右旋糖，約15到約60 mM的非可代謝 膜保護(hù)劑糖，約20到約130 mM的碳酸氬鈉和約4到約20 mM的磷酸 氫二鈉。在更具體的實(shí)施方案中，組合物包含約2mM的腺。票呤，約60 到約100 mM的右旋糖，約40到約60 mM的非可代謝膜保護(hù)劑糖，約 22到約40 mM的-友酸氫鈉和約7到約15 mM的-粦酸氫二鈉。在更具體 的實(shí)施方案中，組合物包含約2mM的腺噤呤，約80mM的右旋糖，約 55 mM的非可代謝膜保護(hù)劑糖，約26 mM的碳酸氫鈉和約12 mM的石粦 酸氳二鈉，組合物的pH為約8.5。本發(fā)明還提供了方法實(shí)施方案。在一個(gè)這種實(shí)施方案中，提供了保 存紅細(xì)胞(RBCs)經(jīng)過一段貯存期的方法。該方法包含(a)將包含有待貯 存的RBCs和血漿的經(jīng)收集的全血樣品與抗凝劑溶液混合，由此形成所 收集的全血的懸液；(b)對收集的全血懸液經(jīng)行處理以除去血漿并濃縮 RBCs，由此形成濃縮的RBCs; (c)將濃縮的RBCs與一定量的含水組合 物混合以形成具有約35%到約70%體積的RBC的懸液；(d)冷卻RBCs
懸液至約rC到6°C,以及(e)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)貯存步驟貯存冷卻的RBCs懸液。 含水組合物主要由以下物質(zhì)組成腺噤呤；右旋糖；至少一種非可代謝 膜保護(hù)劑糖，和pH緩沖系統(tǒng)。該pH緩沖系統(tǒng)含有生理上可接受緩沖劑 的組合，其包括至少一個(gè)能提供碳酸氫根陰離子的試劑，至少一個(gè)能提 供磷酸根陰離子的試劑，和至少一個(gè)能提供鈉陽離子的試劑，其中，所 述的pH緩沖系統(tǒng)以足以使有待加入上述組合物的紅細(xì)胞(RBC)懸液 的pH維持在下述水平的量存在，所述的水平足以在貯存期間，在所述 紅細(xì)胞中建立并維持一種抑制1，3-DPG合成2,3-二磷酸甘油酯(DPG)而 有利于糖酵解的反應(yīng)平衡，由此在貯存期間的反應(yīng)平衡中產(chǎn)生三磷酸腺 苷(ATP)凈收益。該溶液在制備時(shí)就被分開以便在加熱滅菌期間使右旋 糖和磷酸鹽以及碳酸氬鹽分隔開。用在本發(fā)明中的RBCs是在制備組份的正常過程中已經(jīng)從血漿中分 離并在抗凝劑溶液中重懸的RBCs。簡言之，就是將包含RBCs和血漿 的標(biāo)準(zhǔn)全血樣品(450.+/-.45 ml)與抗凝劑溶液(約63 ml)混合以形成全血 懸液。也可以成比例地增加或降低溶液體積以反映出不同供體血液的體 積，例如400.+/-.40 ml-500.+/-.50 ml。然后將全血懸液離心以便從血漿 中分離RBCs,由此形成濃縮的RBCs。整個(gè)過程的進(jìn)行能使用常規(guī)技術(shù) 通過減少白血球來改進(jìn)。適宜的抗凝劑包括已知用于P!i存RBCs的常規(guī)抗凝劑。優(yōu)選的抗凝 劑包括pH為5.5到8.0的種檬酸鹽抗凝劑，例如CPD,半濃度的CPD 等。最優(yōu)選的抗凝劑是CPD。然后通常使用標(biāo)本袋或PVC轉(zhuǎn)運(yùn)包裝將RBC懸液P&存在標(biāo)準(zhǔn)的聚 氯乙烯(PVC)貯血袋中，其中轉(zhuǎn)運(yùn)包裝的大小隨被貯存部分的體積而變 化。根據(jù)輸血的臨床實(shí)踐記載的步驟，編者Petz & Swisher, Churchill-Livingston publishers, N. Y., 1981,將RBC懸液貯存在約1'C到6'C下。法的一個(gè)具體實(shí)施方案中，RBCs的懸液適于直接輸注到需要這種輸注 的患者體內(nèi)。而PVC貯血袋是工業(yè)上認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)貯血袋；本發(fā)明預(yù)期 能使用適于貯存RBC懸液的眾多不同的袋子，例如包括所需的適宜 plastisizers。與袋子有關(guān)或與RBC貯存技術(shù)的容器組份有關(guān)的成分沒有 在此進(jìn)行討論，但本領(lǐng)域技術(shù)人員將能很容易地使用許多容器技術(shù)來實(shí) 現(xiàn)本發(fā)明。
本發(fā)明的添加溶液還能用于使凍干的RBC再水合，或?qū)⒃谌刍?的貯存冷凍血或血成分例如RBC再水合。在本發(fā)明保存RBCs方法的具體實(shí)施方案中，至少一種非可代謝膜 保護(hù)劑糖是來自糖醇的單糖，在更具體的實(shí)施方案中，非可代謝膜保護(hù) 劑糖是甘露糖醇。在另外的方法實(shí)施方案中，能提供鈉陽離子的至少一 種試劑選自碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉及其組合。在具體的實(shí)施方案中，能 提供碳酸氫根陰離子的至少一種試劑是碳酸氫鈉。進(jìn)一步的實(shí)施方案是 針對保護(hù)RBCs的本發(fā)明方法，其中能提供磷酸根陰離子的至少一種試 劑選自磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉及其組合，在更具體的實(shí)施方案中， 能提供磷酸根陰離子的至少一種試劑是磷酸氫二鈉。在本發(fā)明方法的其 它實(shí)施方案中，生理上可接受緩沖劑的組合含包含至少一個(gè)能提供生理 上可接受陽離子的試劑，其中陽離子選自H+、鉀、銨、鎂及其組合。進(jìn)一步的實(shí)施方案針對的是本發(fā)明保存RBCs的方法，其中組合物 的摩爾滲透壓濃度為約200到約310 mOsm。在具體的實(shí)施方案中，摩 爾滲透壓濃度為約221到約280 mOsm,在非常具體的實(shí)施方案中，摩 爾滲透壓濃度為約270 mOsm。在另 一個(gè)實(shí)施方案中提供了本發(fā)明的方 法，其中組合物的pH為約8到約9。在具體的實(shí)施方案中，pH為約8.2 到約8.8,在更具體的實(shí)施方案中，組合物的pH為約8.4到約8.6。在 非常具體的實(shí)施方案中，組合物的pH為約8.5。本發(fā)明保存RBCs方法 的另一個(gè)實(shí)施方案提供的是，緩沖系統(tǒng)在紅細(xì)胞(RBC)懸液中有這樣 的緩沖能力，其中在加入組合物后在6周的貯存內(nèi)提高到2mEq,且pH 在6.5到7.2之間。本發(fā)明還提供了保存RBCs的本發(fā)明方法，其中，所述的組合物可 操作地保持加入了所述組合物的紅細(xì)胞(RBC)懸液的pH為約6.4到 約7.4。在具體的方法實(shí)施方案中，組合物能保持紅細(xì)胞(RBC)懸液 的pH,其中組合物在pH為約7.0到約小于7.2時(shí)被加入到懸液中，在 更具體的方法實(shí)施方案中，組合物能保持紅細(xì)胞(RBC)懸液的pH, 其中組合物在pH為大于約7.1且小于7.2時(shí)^皮加入到懸液中。還提供了針對組合物必須組份具體范圍的根據(jù)本發(fā)明的方法。在一 個(gè)方法實(shí)施方案中，組合物包含約1-3 mM的腺噪呤，約20到約115 mM 的右旋糖，約15到約60 mM的非可代謝膜保護(hù)劑糖，約20到約130 mM 的碳酸氫鈉和約4到約20 mM的磷酸氫二鈉。在更具體的實(shí)施方案中，
組合物包含約2 mM的腺嘌呤，約60到約100 mM的右旋糖，約40到 約60 mM的非可代謝膜保護(hù)劑糖，約22到約40 mM的碳酸氫鈉和約7 到約15mM的磷酸氫二鈉，在非常具體的實(shí)施方案中，組合物包含約2 mM的腺噪呤，約80 mM的右旋糖，約55 mM的非可代i射膜保護(hù)劑糖， 約26 mM的石友酸氫鈉和約12 mM的^N臾氬二鈉，更進(jìn)一步地，其中組 合物的pH為約8.5。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，將添加溶液加入到濃縮的RBC懸液中， 其量為在細(xì)胞懸液中能足以提供治療有效量的可復(fù)原RBCs。優(yōu)選的 是，添加溶液的加入量為約60ml到約400mg,優(yōu)選約100到約150ml, 最優(yōu)選約llOml。該溶液一般的用量是與收集全血的體積比為1:4.5 (450mL收集全血對lOOmL, 500mL收集全血對lllmL,或等量)。在 保護(hù)RBCs的本發(fā)明方法的具體實(shí)施方案中，組合物與收集全血的體積 比為約1:4.5。在更具體的實(shí)施方案中，組合物的體積為約llOmL,收集 全血的體積為約500mL。細(xì)胞懸液中RBC的體積分?jǐn)?shù)，即在加入添加溶液后，為總懸液的 約27到70%。更優(yōu)選的是，細(xì)胞懸液中RBC的體積分?jǐn)?shù)為約35到約 50% 。最優(yōu)選的是，細(xì)胞懸液中RBC的體積分?jǐn)?shù)為總懸液的約43 % 。在貯存期間，本發(fā)明的發(fā)明人監(jiān)測并收集了與紅細(xì)胞健康有關(guān)的數(shù) 據(jù)。如圖l和2所示，根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的貯存使紅細(xì)胞在小容量下和較 長的貯存期內(nèi)有更好的質(zhì)量。如上所述，血貯存"損傷"是凋亡事件， 紅細(xì)胞膜經(jīng)歷了生理和形態(tài)改變，這相當(dāng)于程序性細(xì)胞死亡。在貯存期 間，已知紅細(xì)胞膜的表面積在下降，由此其形狀就變?yōu)殡p凹形，這能使 每體積下的表面積最大，使氣體和營養(yǎng)素容易擴(kuò)散，以致到更加呈球型 的形狀，這是一種死亡特征。紅細(xì)胞膜最初是柔軟和可變形的，易于通 過小毛細(xì)管。全部的形狀變化伴隨著擠壓微泡(microvesicles )的膜， 在紅細(xì)胞外表面形成針突(spicules),由此，據(jù)觀察，細(xì)胞在這個(gè)過程的 末期就類似于刺狀的刺猬(因此這個(gè)過程指的是棘狀紅細(xì)胞增多性變 化，在細(xì)胞溶解前的最終形狀被稱為棘紅細(xì)胞)。隨之而來的脆弱最終 導(dǎo)致細(xì)胞溶解和死亡。確定溶血速率能作為這個(gè)活動(dòng)范圍和嚴(yán)重度的指 標(biāo)。除在貯存期間引起無法接受的溶血水平外，這些形態(tài)變化都在再灌 注了被貯存紅細(xì)胞的受體患者內(nèi)觸發(fā)了清除機(jī)制，這降低了輸注后的復(fù) 原并降低了輸注效率。使用根據(jù)本發(fā)明的組合物和使用了該組合物的保 存紅細(xì)胞的方法，使得滲透脆性降低以及溶解速率降低。這相應(yīng)地提高 了細(xì)胞膜表面積的保持力和形態(tài)狀況，并因此提高了活性紅細(xì)胞的復(fù)原 并降低了輸注后被再灌注的紅細(xì)胞從受體患者體內(nèi)的清除。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了在貯存期間改善紅細(xì)胞(RBC)膜的保持力和抑制RBC凋亡的方法。該方法包含在貯存期間于懸液中貯存 RBCs,其中懸液內(nèi)已經(jīng)加入了本發(fā)明的組合物。在具體的實(shí)施方案中， 微泡的濃度，與在含有AS-3的RBC懸液中貯存相同時(shí)間的紅細(xì)胞所觀 察到的濃度相比，降低了約75 % 。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了在貯存期間降低紅細(xì)胞(RBC)脆 性并抑制RBC溶血的方法。該方法包含在貯存期間于懸液中貯存 RBCs,其中懸液內(nèi)已經(jīng)加入了本發(fā)明的組合物。另一個(gè)實(shí)施方案針對的 是在貯存后和輸注到需要這種輸注的患者體內(nèi)后能提高紅細(xì)胞(RBCs ) 的成活力，并降低患者RBCs輸注后清除率的方法。該方法包含在貯存 期間于懸液中貯存RBCs,其中懸液內(nèi)已經(jīng)加入了本發(fā)明的組合物。本發(fā)明的添加溶液組合物與現(xiàn)有#支術(shù)的添加溶液相比有幾個(gè)優(yōu) 點(diǎn)。貯存在其中的紅細(xì)胞可以貯存更長時(shí)間，至少為8周，與目前許可 的溶液相比，在體內(nèi)24小時(shí)復(fù)原中有更好的放射鉻-標(biāo)記的RBC。使 用本發(fā)明的組合物能明顯地減少貯存損傷的范圍和嚴(yán)重度。在貯存期 間，紅細(xì)胞出現(xiàn)了可接受的溶血范圍在6周時(shí)為0.2%,在8周時(shí)為 0.4%,在許可的貯存末期所有的都在FDA限制的1%以下。貯存在本 發(fā)明添加溶液中的紅細(xì)胞在貯存期間表現(xiàn)出更少的膜損失，如膜微泡的 濃度降低和滲透脆性降低所證明的那樣。貯存期間對膜的保護(hù)預(yù)期能有 助于貯存在溶液中的RBC以使其與失去更多膜的細(xì)胞相比具有更好的 流動(dòng)性。保持正常膜的生理性也抑制了存在于受體患者體內(nèi)的機(jī)制，這 個(gè)機(jī)制觸發(fā)了循環(huán)中的選擇性清除和紅細(xì)胞的破壞。因此，受體患者中 的再灌注紅細(xì)胞就能維持更長時(shí)間，并提高了再灌注紅細(xì)胞的長期復(fù) 原。此外，輸注紅細(xì)胞的存活時(shí)間提高應(yīng)該會減少重復(fù)輸注的需要由此 對患者來說降低了與之相關(guān)的危險(xiǎn)。本發(fā)明的溶液還能允許在貯存晚期 有較高的RBC ATP濃度，這預(yù)期能使RBC ATP更好地分泌并因此在細(xì) 胞被輸注后改善其流動(dòng)性和存活力。實(shí)際上，本發(fā)明的溶液能在與常規(guī) 收集系統(tǒng)一起工作時(shí)一皮爿使用，其中該系統(tǒng)在CPD或CP2D中收集全血以 生成新鮮的冷凍血漿和隨機(jī)的供體血小板，或在緊急關(guān)頭收集新鮮的全
以下提供的實(shí)施例僅用于說明目的，其不應(yīng)該被解釋為是對本發(fā)明 范圍的限制，范圍如權(quán)利要求所確定。實(shí)施例 表1受試的添加溶液組合物AS-3EAS-61EAS-76v6EAS-81NaCL702630NaHC033026NaH2P0423Na2HP0412912腺噪呤2222檸檬酸鈉18右旋糖551105080甘露糖553055體積110170170110pH5,88.38.48.5實(shí)施例1這個(gè)實(shí)施例說明了本發(fā)明添加溶液組合物的 一 個(gè)實(shí)施方案的性能特征和優(yōu)點(diǎn)，其中組合物稱為EAS-81 (見表1) 。 EAS-81和比較實(shí)施 例AS-3(Nutricel, Pal Biomedical)都為常規(guī)量，而比較實(shí)施例EAS-61和 EAS-76v6以更加稀釋、更大的體積被提供。EAS-81和EAS-76v6都包 含碳酸氳鹽。參見
圖1,其中包含碳酸氫鹽的組合物以圓圈表示，而沒 有碳酸氫鹽的以菱形表示。體積較大的組合物以實(shí)心圖表示，而常規(guī)體 積的組合物以空心圖表示。在此公開的添加溶液組合物的所有體積均一皮 理解為相對于每500 mL單位全血的體積，其體積比例約為1: 4.5。進(jìn)行第一個(gè)實(shí)施例作為混合(Pooling)研究，以便評價(jià)貯存溶液的 成分對RBC代謝的作用和在PVC袋中貯存10周后的完整性。混合 (Pooling)大大降低了常規(guī)血貯存研究的差異性，也就是降低了來自不
同供體RBCs的遺傳差異性?；旌鲜菍⒚總€(gè)供體的一些細(xì)胞在每個(gè)研究 組放置一些同時(shí)保持常規(guī)單元大小。在間接抗球蛋白試驗(yàn)(IAT)中沒有活 性的RBC單元，被分成4個(gè)ABO-相同的單元。然后合并各個(gè)組，混合 并等分以形成四個(gè)相同的合并單元。每個(gè)混合中的一個(gè)單元用于四項(xiàng)研 究中的一項(xiàng)。組合物AS-3和EASs公開于表1中。EASs在實(shí)-驗(yàn)室中由USP腺嘌 呤、糖和Sigma Chemicals, St. Louis, MO提供的鹽制成，并被無菌過濾 到一升^存袋中(Code 4R2032, Baxter Healthcare, Deerfield, IL)。參見 Hess等"磷酸鹽、pH和AS體積對貯存在鹽水-腺。票呤-葡萄糖-甘露 糖醇溶液中的RBCs的作用。"Transfusion, vol. 40: 1000-1006, 2000年8 月，詳述的那樣，在此通過參考全部引入本文。貯存袋在37°C下保持 兩周。然后對該溶液進(jìn)行培養(yǎng)，并將培養(yǎng)物再孵育兩周。無菌通過沒有 細(xì)菌和真菌生長7-14天來確定(SeptiCheck, Becton-Dickinson Microbiology Systems, Sparks, MD),并將溶液以重量等分置于600 mL PVC袋中(Code 4R2023, Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL)。所有的 連接都使用無菌連接裝置(SCD 312, Terumo Medical Corp. Elkton, MD) 進(jìn)行。RBC單元的制備標(biāo)準(zhǔn)的血單元(500 ± 55mL)使用三聯(lián)-袋(triple-bag )收集系統(tǒng)(Item code #127-23, Pall Corporation, East Hills, NY)收集到70 mL CP2D溶液。 單元用完整的白細(xì)胞縮減(leukoreduction )過濾器進(jìn)行白細(xì)胞縮減 (leukoreduced )。濃縮的RBCs通過離心5分鐘然后除去幾乎65 mL 血漿而制成，之后，無菌地加入所列體積的AS或EAS。將單元貯存在 1-6。C下10周，約每周混合并除去15 mL樣本。體外測定白細(xì)胞縮減(從全血產(chǎn)品中除去白細(xì)胞)通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)確 認(rèn)。總血紅素(Hb)的濃度通過臨床血液分析器(Hematology Cell Counter System Series 9110+, Baker, Allentown, PA)測定。平均細(xì)月包容積(MCV 由RBC計(jì)數(shù)和貯存懸液的微量血細(xì)胞比容確定)。上清中的Hb使用改 良的Drabkin測定法由分光光度計(jì)測定，如Moore等"用于測定5到2000mg/dl范圍內(nèi)血漿血紅素的Drabkin血紅素測定的孩i小改進(jìn)。 Biochem Med 26:167 -173 (1981)論述的那樣，在此通過參考全部引入。 溶血百分?jǐn)?shù)通過測定游離與總Hb的比例以及紅細(xì)胞比容來確定。RBC ATP濃度在上清中的脫蛋白PRBCs中測定。將細(xì)胞等分與冷 的10%三氯乙酸混合以沉淀血蛋白，在2700 xg下離心IO分鐘，并將 無蛋白上清在-80。C下冷凍直至實(shí)驗(yàn)開始。ATP使用可商購的試劑盒 (Procedures 366-UV, Sigma Diagnostics, St. Louis, MO)通過酵'法測定。血?dú)狻⑻妓釟潲}和pH在血?dú)夥治銎?Coming 855, Ithica, NY)中測定 或計(jì)算。這樣，pH測定就在37。C下進(jìn)行。細(xì)胞外的鈉、鉀、氯、磷酸 鹽、乳酸鹽和葡萄糖在程序化的化學(xué)分析器(Hitachi 902 Analyzer, Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN)中觀'J定。RBC的形狀 由盤狀細(xì)胞向棘紅細(xì)胞到球型紅細(xì)胞轉(zhuǎn)變的平均程度根據(jù)Usry, Moore, and Manolo的方法進(jìn)4亍,該方法i己載于"Morphology of stored, rejuvenated human erythrocytes" Vox Sang 28:176-183 (1975)中，在此通過參考全文引 入。微泡在貯存末期的上清液中測定。血漿經(jīng)超離心，小泡沉淀用鹽水 洗滌三次，然后用Bradford法(BioRad, Richmond, CA)定量蛋白總量。4種RBC貯存溶液的比較試驗(yàn)結(jié)果列于
圖1和2中。在所有的貯存 溶液中，RBC ATP濃度在貯存的第一周內(nèi)都有提高(
圖1A)。在EASs 中，ATP濃度在第二周內(nèi)持續(xù)升高，并在研究期間內(nèi)一直保持比AS-3 高。在貯存八周和超過八周時(shí)，EAS-81中ATP的濃度與容積增加的 EAS-61的濃度相同，而EAS-78,其具有增加的容積和碳酸氫鹽緩沖系 統(tǒng)，其ATP的濃度要稍高。在貯存期間，所有貯存溶液中的溶血(紅細(xì)胞的破壞)都有所提高 (圖lb)。然而，AS-3中的溶血更高。EAS-81中稍有降4氐，在其它的 EASs中有進(jìn)一步的降低。在含有碳酸氬鹽的高容積溶液中，溶血沒有 額外降低。如所預(yù)計(jì)的在貯存期間所有的溶液均是AS容積越低貯存的 血細(xì)胞比容和RBCs損失體積就越大(圖lc)。在包含碳酸氬鹽的EASs中乳酸鹽濃度在所有時(shí)間點(diǎn)都比較高(圖 Id)。貝i存8周后乳酸鹽的總產(chǎn)量在AS-3中為9mM,在EAS-61中為 12mM，在EAS-81中為13 mM，在EAS-78中為15 mM。細(xì)胞內(nèi)外pH 在所有的時(shí)間點(diǎn)也都比較高，但是細(xì)胞內(nèi)pH的差別沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)顯著 性(圖le和If)。圖lg和lh顯示了提供懸液中緩沖的碳酸氳鹽損耗 以及PC02增加和降低的時(shí)間段。本發(fā)明EAS-81與AS-3貯存細(xì)胞的比較進(jìn)行的比較揭示了前者對所 得的高ATP濃度有更好的能量利用，更少的溶血和更好的形態(tài)，更少的 微泡化和微小的pH升高。現(xiàn)有的EAS，s，尤其是EAS-76v6，在某些方 面甚至表現(xiàn)更好，但是它們較大的體積導(dǎo)致對被貯存RBC產(chǎn)生了更大 的稀釋，這能引起多重輸血患者受體的血液稀釋。實(shí)施例2這個(gè)實(shí)施例說明了本發(fā)明EAS制劑能在常規(guī)體積的添加溶液中貯 存RBC8周，其在已知的6周貯存方案期間具有更好的復(fù)原，更低的溶 血性和增強(qiáng)的膜保護(hù)性。選寸奪了 12名符合美國食品和藥品管理局(FDA)以及美國耳關(guān)合血 庫供體標(biāo)準(zhǔn)的志愿者。受試者捐贈(zèng)了 500 mL (unite)全血，其被收集于 CP2D初級(primary )袋中(Item code # 127-23, Pall Corporation, East Hills, NY),并且是白細(xì)胞縮減的，其幾乎除去了約65 mL血漿。加入EAS-81 ， 110 mL,并將濃縮的RBC溶液直立貯存在1-6。C下，其中一半樣本貯 存6周(n=6), —半貯存8周(n=6)。在貯存結(jié)束的前一周，對單元 進(jìn)行無菌取樣和培養(yǎng)。如果培養(yǎng)不表現(xiàn)出生長，那末就用51-Cr對少量 等分試樣進(jìn)行標(biāo)記，并使用Moroff方法(protocol)將其返回到供體內(nèi) 以用于RBC復(fù)原的單標(biāo)記測量。生成平均及標(biāo)準(zhǔn)誤差圖，貯存組的其它描述統(tǒng)計(jì)使用表格程序軟件 (Excel, Microsoft, Redmond, WA)計(jì)算。每個(gè)貯存系統(tǒng)中乳酸鹽的產(chǎn)量由 開始和終末濃度計(jì)算，并對貯存系統(tǒng)的體積進(jìn)行調(diào)節(jié)以血紅素和血清蛋 白含量。RBC復(fù)原值的長方圖(box plots)用SyStat Ver. 6 (SPSS Inc., Chicago, IL)生成。貯存在CP2D/EAS-81中6周的白細(xì)胞縮減的RBC其自體24小時(shí)體 內(nèi)復(fù)原85±5%, 8周后體內(nèi)復(fù)原87±2% (圖2)。這種長時(shí)間明顯異 常的高復(fù)原率可能是研究規(guī)模小和不同個(gè)體血型可貯存性差異大的原 因。然而，這些復(fù)原都普遍優(yōu)于被許可的貯存溶液，而且能符合美國和 歐洲的許可(對于美國是表現(xiàn)出大于75%的復(fù)原和溶血小于1%,或者 對于歐洲是大于75%的復(fù)原和溶血小于0.8% )。在這個(gè)研究中RBC溶 血部分在六周實(shí)驗(yàn)中是0.2土0.2,在8周實(shí)驗(yàn)中是0.4土0.2。 RBC微泡 蛋白濃度在6周時(shí)是8土4 mg/dL,在8周時(shí)是12 ± 6 mg/dL，這是因?yàn)?僅有約5 %的RBC血紅素?fù)p失。本發(fā)明的EAS-81在貯存持續(xù)時(shí)間和改善輸注產(chǎn)品生理功能方面的 優(yōu)良貯存性能有如下幾個(gè)依據(jù)。第一，新的pH調(diào)節(jié)系統(tǒng)能在實(shí)驗(yàn)貯存 期間對混懸溶液產(chǎn)生持續(xù)的緩沖，這足以將細(xì)胞內(nèi)區(qū)域的pH保持在足 以推動(dòng)胞內(nèi)平衡向糖酵解方向進(jìn)行并向遠(yuǎn)離2,3-DPG產(chǎn)生ATP消耗方 向進(jìn)行的范圍內(nèi)。此外，這個(gè)制劑中胞外磷酸鹽濃度高歸因于對胞外 Ca+、農(nóng)度的限制，這依次抑制了幾個(gè)凋亡過程例如磷脂混亂 (scrambling)和膜變形以及損失。這致使;故輸注RBCs在輸注后的復(fù)原 有所改善，并提高膜的性能，這進(jìn)一步縮減了在被輸注患者中對體內(nèi)清 除機(jī)制的快速誘發(fā)并致使在輸注期以外的延長時(shí)間內(nèi)可復(fù)原的^f皮輸注 RBCs百分比提高。EAS-81制劑，其不含NaCl以有助于提高特定緩沖 化合物的數(shù)量而保持適宜的摩爾滲透壓濃度，其有更好的效果，對添加 RBC溶液懸液有更長的pH調(diào)節(jié)性，以及更多的磷酸鹽，其能使與提高 Ca+、農(nóng)度和降低ATP濃度有關(guān)的不利細(xì)胞事件最小化。此外，常規(guī)體積 的制劑EAS-81特別適于用在多次和大量輸注的患者中。
權(quán)利要求
1.在約1℃到約6℃下貯存紅細(xì)胞的含水組合物，該組合物主要由以下物質(zhì)組成腺嘌呤；右旋糖；至少一種非可代謝膜保護(hù)劑糖和pH緩沖系統(tǒng)，其中pH緩沖系統(tǒng)含有生理上可接受的緩沖劑的組合，其中緩沖劑包括能提供碳酸氫根陰離子的至少一種試劑，能提供磷酸根陰離子的至少一種試劑和能提供鈉陽離子的至少一種試劑，其中，所述的pH緩沖系統(tǒng)以足以使有待加入上述組合物的紅細(xì)胞(RBC)懸液的pH維持在下述水平的量存在，所述的水平足以在貯存期間，在所述紅細(xì)胞中建立并維持一種抑制1，3-DPG合成2，3-二磷酸甘油酯(DPG)而有利于糖酵解的反應(yīng)平衡，由此在貯存期間的所述反應(yīng)平衡中產(chǎn)生三磷酸腺苷(ATP)凈收益。
2. 在約1到約6℃ 下5&存紅細(xì)胞的含水組合物，該組合物包含 腺噤呤；右旋糖；至少 一種非可代謝膜保護(hù)劑糖和 pH緩沖系統(tǒng)，其中pH緩沖系統(tǒng)含有生理上可接受的緩沖劑的組合，其中緩沖劑 包括能提供碳酸氬根陰離子的至少一種試劑，能提供磷酸根陰離子的至 少一種試劑和能提供鈉陽離子的至少一種試劑，其中，所述的pH緩沖 系統(tǒng)以足以使有待加入上述組合物的紅細(xì)胞(RBC)懸液的pH維持在 下述水平的量存在，所述的水平足以在貯存期間，在所述紅細(xì)胞中建立 并維持一種抑制1,3-DPG合成2，3-二磷酸甘油酯(DPG)而有利于糖酵解 的反應(yīng)平衡，由此在貯存期間的所述反應(yīng)平#f中產(chǎn)生三磷酸腺苷(ATP) 凈收益，其中，所述的組合物基本上不含外源的氯離子。
3. 含有如權(quán)利要求1所述的組合物的紅細(xì)胞懸液。
4. 如權(quán)利要求3所述的懸液，其中所述的懸液適于直接輸注到需 要這種輸注的患者中。
5. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中能提供鈉陽離子的至少一種試劑選自碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉及其組合。
6. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中能提供碳酸氫根陰離子的至 少一種試劑是碳酸氫鈉。
7. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中能提供磷酸根陰離子的至少 一種試劑選自磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸三鈉及其組合。
8. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中能提供磷酸根陰離子的至少一種試劑選自磷酸氬二鈉。
9. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中生理上可接受的緩沖劑的組合還包含能提供生理上可接受陽離子的至少一種試劑，其中陽離子選自 氬、鉀、銨、鎂及其組合。
10. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中至少一種非可代謝膜保護(hù)劑糖是甘露糖醇。
11. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其摩爾滲透壓濃度為約200到約 310 mOsm。
12. 如權(quán)利要求11所述的組合物，其中摩爾滲透壓濃度為約221 到約280 mOsm。
13. 如權(quán)利要求12所述的組合物，其中摩爾滲透壓濃度為約270 mOsm。
14. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其pH為約8到約9。
15. 如權(quán)利要求14所述的組合物，其中pH為約8.2到約8.8。
16. 如權(quán)利要求15所述的組合物，其中組合物的pH為約8.4到約8.6。
17. 如權(quán)利要求16所述的組合物，其中組合物的pH為約8.5。
18. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述緩沖系統(tǒng)在有待加入所 述組合物的紅細(xì)胞(RBC)懸液中具有如下的緩沖能力，即在6周的貯 存期內(nèi)，在pH6.5到pH7.2之間至少提高2 mEq。
19. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述的組合物可操作地保 持加入了所述組合物的紅細(xì)胞(RBC)懸液的pH為約6.4到約7.4。
20. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述的組合物可操作地保 持加入了所述組合物的紅細(xì)胞(RBC)懸液的pH為約7.0到約7.2。
21. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述的組合物可操作地保 持加入了所述紅細(xì)胞(RBC)的懸液的pH為約7.1到小于約7.2。
22. 如權(quán)利要求5所述的組合物，其中含有約1-3 mM的腺噪呤， 約20到約115 mM的右旋糖，約15到約60 mM的非可代謝膜保護(hù)劑糖， 約20到約130 mM的-友酸氪鈉和約4到約20 mM的;粦酸氪二鈉。
23. 如權(quán)利要求22所述的組合物，其中含有2mM的腺嘌呤，約 60到約100 mM的右旋糖，約40到約60 mM的非可代/謝膜保護(hù)劑糖， 約22到約40 mM的石友酸氬鈉和約7到約15 mM的》壽酸氬二鈉。
24. 如權(quán)利要求23所述的組合物，其中含有約2 mM的腺。票呤， 約80mM的右旋糖，約55mM的非可代謝膜保護(hù)劑糖，約26 mM的碳 酸氫鈉和約12mM的-壽酸氳二鈉，其中，所述組合物的pH為約8.5。
25. 保存紅細(xì)胞(RBCs)經(jīng)過一段貯存時(shí)間的方法，其包含(a) 將包含有待貯存的RBCs和血漿的經(jīng)收集的全血樣品與抗凝 劑溶液混合，由此形成所收集的全血的懸液；(b) 對收集的全血懸液經(jīng)行處理以除去血漿并濃縮RBCs,由此形 成濃縮的RBCs;(c) 將濃縮的RBCs與一定量的含水組合物混合以形成具有約35 %到約70 %體積的RBC的懸液；(d) 冷卻RBCs懸液至約1 °C到6 °C ,以及(e) 才艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)貯存步驟貯存冷卻的RBCs懸液 其中所述的含水組合物主要由以下物質(zhì)組成腺噤呤； 右旋糖；至少 一種非可代謝膜保護(hù)劑糖和 pH緩沖系統(tǒng)，其中pH緩沖系統(tǒng)含有生理上可接受的緩沖劑的組合，其中緩沖劑 包括能提供碳酸氳根陰離子的至少一種試劑，能提供磷酸根陰離子的至 少一種試劑和能提供鈉陽離子的至少一種試劑，其中，所述的pH緩沖 系統(tǒng)以足以使有待加入上述組合物的紅細(xì)胞(RBC)懸液的pH維持在 下述水平的量存在，所述的水平足以在貯存期間，在所述紅細(xì)胞中建立 并維持一種抑制1,3-DPG合成2,3-二磷酸甘油酯(DPG)而有利于糖酵解 的反應(yīng)平衡，由此在貯存期間的所述反應(yīng)平#f中產(chǎn)生三磷酸腺苷(ATP) 凈收益。
26. 如權(quán)利要求25所述的保存RBCs的方法，其中RBCs懸液適于直接輸注到需要這種輸注的患者中。
27. 如權(quán)利要求25所述的保存RBCs的方法，其中至少一種非可代 謝膜保護(hù)劑糖是甘露糖醇。
28. 如權(quán)利要求25所述的保存RBCs的方法，其中能提供鈉陽離子 的至少 一種試劑選自碳酸氬鈉、磷酸氫二鈉及其組合。
29. 如權(quán)利要求25所述的保存RBCs的方法，其中能提供碳酸氫根 陰離子的至少一種試劑是碳酸氳鈉。
30. 如權(quán)利要求25所述的保存RBCs的方法，其中能提供磷酸根陰 離子的至少一種試劑選自磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸三鈉及其組合。
31.如權(quán)利要求25所述的保存RBCs的方法，其中能提供磷酸根陰 離子的至少 一種試劑選自磷酸氬二鈉。
32. 如權(quán)利要求25所述的保存RBCs的方法，其中生理上可接受的 緩沖劑的組合還包含能提供生理上可接受陽離子的至少 一種試劑，其中 陽離子選自氳、鉀、銨、鎂及其組合。
33. 如權(quán)利要求25所述的保存RBCs的方法，其中組合物的摩爾滲 透壓濃度為約200到約310 mOsm。
34. 如權(quán)利要求33所述的保存RBCs的方法，其中摩爾滲透壓濃度 為約221到約280 mOsm。
35. 如權(quán)利要求34所述的保存RBCs的方法，其中摩爾滲透壓濃度 為約270 mOsm。
36. 如權(quán)利要求25所述的保存RBCs的方法，其中組合物的pH為 約8到約9。
37. 如權(quán)利要求36所述的保存RBCs的方法，其中pH為約8.2到 約8.8。
38. 如權(quán)利要求36所述的保存RBCs的方法，其中pH為約8.4到 約8.6。
39. 如權(quán)利要求36所述的保存RBCs的方法，其中組合物的pH為 約8.5。
40. 如權(quán)利要求25所述的保存RBCs的方法，其中所述緩沖系統(tǒng)在 有待加入所述組合物的紅細(xì)胞(RBC)懸液中具有如下的緩沖能力，即 在6周的貯存期內(nèi)，在pH6.5到pH7.2之間至少提高2 mEq。
41. 如權(quán)利要求25所述的保存RBCs的方法，其中，所述的組合物可操作地保持加入了所述組合物的紅細(xì)胞(RBC)懸液的pH為約6.4 到約7.4。
42. 如權(quán)利要求25所述的保存RBCs的方法，其中，所述的組合物 可操作地保持加入了所述組合物的紅細(xì)胞(RBC)懸液的pH為7.0到 小于約7.2。
43. 如權(quán)利要求25所述的保存RBCs的方法，其中，所述的組合物 可操作地保持加入了所述紅細(xì)胞(RBC)的懸液的pH為約7.1到小于 約7.2。
44. 如權(quán)利要求28所述的保存RBCs的方法，其中組合物含有約 l-3mM的腺噪呤，約20到約115 mM的右旋糖，約15到約60mM的 非可代謝膜保護(hù)劑糖，約20到約130 mM的碳酸氫鈉和約4到約20 mM 的磷酸氫二鈉。
45. 如權(quán)利要求44所述的保存RBCs的方法，其中組合物含有2 mM 的腺噤呤，約60到約100 mM的右旋糖，約40到約60 mM的非可代謝 膜保護(hù)劑糖，約22到約40 mM的碳酸氬鈉和約7到約15 mM的;粦酸氫 二鈉。
46. 如權(quán)利要求45所述的保存RBCs的方法，其中組合物含有約2 mM的腺噤呤，約80 mM的右旋糖，約55 mM的非可代謝膜保護(hù)劑糖， 約26 mM的碳酸氬鈉和約12 mM的磷酸氫二鈉，更進(jìn)一步地，其中組 合物的pH為約8.5。
47. 如權(quán)利要求45所述的保存RBCs的方法，其中組合物與所述收 集全血的體積比為約1: 4.5。
48. 如權(quán)利要求45所述的保存RBCs的方法，其中組合物的體積為 約110 mL，收集全血的體積為約500 mL。
49. 在貯存期間改善紅細(xì)胞(RBC)膜的保持力和抑制RBC凋亡 的方法，該方法包含在貯存期間將RBCs貯存在加入了如權(quán)利要求1 所述的組合物的懸液中。
50. 如權(quán)利要求49所述的在貯存期間改善RBC膜的保持力和抑制 RBC凋亡的方法，其中膜保持力的一種指示是測定貯存末期RBC中微 泡的濃度，其中微泡的濃度下降了約50到75%。
51. 在貯存期間降低紅細(xì)胞(RBC)脆性并抑制RBC溶血的方法， 該方法包含在貯存期間將RBCs貯存在加入了如權(quán)利要求1所述的組合物的懸液中。
52.提高貯存后和輸注到需要這種輸注的患者體內(nèi)后紅細(xì)胞 (RBCs)的成活力，降低患者RBCs輸注后清除率的方法，該方法包含 在貯存期間將RBCs貯存在加入了如權(quán)利要求1所述的組合物的懸液 中。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于貯存紅細(xì)胞的方法，其基本上由以下物質(zhì)組成腺嘌呤；右旋糖；至少一種非可代謝膜保護(hù)劑糖和具體定義的pH緩沖系統(tǒng)。還提供了保存紅細(xì)胞的改進(jìn)方法和增加貯存紅細(xì)胞存活力，膜保存力和復(fù)原性并抑制凋亡、溶血和再輸注后清除率的方法，其中使用了新穎的組合物。
文檔編號A01N1/00GK101166420SQ200580049506
公開日2008年4月23日 申請日期2005年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月17日
發(fā)明者J·R·赫斯, T·G·格林沃爾特 申請人:辛辛那提大學(xué)